JPS63501402A - 広範囲の哺乳動物末端デオキシヌクレオチド転移酵素に対するモノクロナ−ル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ７、上記細胞がウシ胸腺細胞からのＴｄＴで免疫感作したマウスから誘導される 請求の範囲第６項記載の雑種細胞系。

８、　更に、上記細胞がネズミ形質細胞と上記免疫感作したマウスからの牌細胞 との融合により誘導される請求の範囲第７項記載の雑種細胞系。

９、ＨＢ９１７８　（ＴｄＴ　１）　；　ＨＢ９１７９　（ＴｄＴ　２）　；　 ＨＢ９１８０　（ＴｄＴ　３）　；および）ｌＢ９１８１　（ＴｄＴ　４）の番 号でアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託している試料の群から選ば れる少なくとも１個の識別特性を有する請求の範囲第１項記載の雑種細胞系。

明細書 本発明は、ネズミモノクロナール抗体に関するものであり、特にヒトを包含する 種々の哺乳動物のリンパ球細胞における末端デオキシヌクレオチド転移酵素（Ｔ ｄＴ）に特異的に結合する新規なモノクロナール抗体の産生に関するものである 。

ＴｄＴは極めて小さな割合の正常なリンパ芽球、特にを椎動物の免疫系の早期発 生において見出されるが、高い割合のＴｄＴがヒト白血病の診断に使用されてい る。ＴｄＴはリンパ芽球新生物、例えば急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）、慢性 顆粒球白血病（ＣＧＬ）およびリンパ芽球リンパ腫のための貴重な標識酵素とな ってきた。従って正常なおよび白血病の哺乳動物のＴｄＴに陽性であるリンパ球 の周波数の測定方法を開発するために研究が導かれた。米国特許第４，３０７， １８９号には標識したデオキシヌクレオシド三リン酸を用いるＴｄＴの定量方法 が開示されており、標識デオキシヌクレオシド三リン酸はＴｄＴによって蛍光ま たは放射性ポリデオキシヌクレオチドに転化され、該ヌクレオチドを生物試料中 に存在するＴｄＴＯ量の反映として定量することができる。

しかし、この方法ではＴｄＴに対するモノクロナール抗体を使用していない。

シ・オーグル（Ｃ，Ａｕｇｌ）らによって発表された研究論文〔フェト・ブロク ・（Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、）４２　：　２１４７１９８３　）　（要約）におい ては、ウシＴｄＴに対するモノクロナール抗体の産生が、該抗体の結合の詳細な 認識の記載なく報告されている。

種々の哺乳動物のＴｄＴの免疫化学研究は、調製した血清で調べた場合、この酵 素のペプチドがエフ・ジエ・ボラム（Ｆ、Ｊ、　Ｂｏｌｌｕｍ）によって報告さ れている〔ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（Ｊｏｒｎａｌ　ｏｆ　 ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２５６　：　８７６８．１９８１ ）ようにウシ胸腺からの分解された酵素と関連があることを示した。

エフ・ジェ・ポラムらにより発表された研究論文（ジャーナルオブバイオロジカ ルケミストリ−２５９：　５８４８．１９８４）には、ヒトＴｄＴに対するモノ クロナール抗体の産生が記載されている。これら抗−ヒトモノクロナール抗体は 、ヒトおよび仔ウシ細胞のＴｄＴのエピトープまたは決定基を認識する性能にお いて広く様々である。

ＴｄＴの独特な抗原決定基またはエピトープに特異的なネズミモノクロナール抗 体が産生される。これらのモノクロナール抗体は、ヒト、マウス、ラット、ウサ ギおよびウシを包含する広範囲の哺乳動物細胞のＴｄＴを特異的に認識する。３ 個の特定の抗体は競争置換アッセイ　（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ・ｄｉｓｐｌａ ｃｅｍｅｎｔ　ａｓｓａｙ）によって決定したようにＴｄＴで同じエピトープと 交差反応を生じ、４番目の特定な抗体は別個のエピトープと反応する。モノクロ ナール抗体は、ヒトおよび仔ウシのＴｄＴ並びにＴｄＴ−陽性細胞を含むウサギ 、マウスおよびラットの胸腺の抽出物に反応的に結合し、ＴｄＴ−陽性細胞を含 まないネズミ肺臓には反応的に結合しない。

モノクロナール抗体は、ネズミ形質細胞腫細胞とウシ胸腺細胞からのＴｄＴで免 疫感作されたマウスからの肺細胞との融合により誘導される新規なハイブリドー マ細胞系によって分泌される。

これらの特異性によって、これらモノクロナール抗体は種々の哺乳動物のＴｄＴ 酵素に共通な保存された領域（Ｃｏｎｓｅｒνｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ）を特定する のに有効である。流動細胞計測法技術によって少数のＴｄＴ−陽性細胞を検出す るための、これらモノクロナール抗体の誘導体で抱合されたフルオロクロムの性 能は、発生しているリンパ球の分析およびヒトを包含する多数の種におけるＴｄ Ｔ−陽性白血病およびリンパ腫の検査に特に有効である。

第１図は可溶性仔ウシＴｄＴおよびウサギ、マウスおよびラット胸腺の抽出物に よって固定化したウシＴｄＴによる本発明の３個のモノクロナール抗体に対する 別個の競争置換アッセイを示す組合せ比較グラフである。

本発明は、正常なおよび新形成の哺乳動物細胞におけるＴｄＴの独特な抗原決定 基に特異的なネズミモノクロナール抗体を提供する。広範囲のＴｄＴ−陽性細胞 に対するモノクロナール抗体を産生ずることができる雑種細胞またはハイブリド ーマの例は、以下の如く生産した：感　工王　： 生後５週令の１０匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、グルタルアルデヒドで架橋し 同容量の完全フロインドアジュバントで乳化した１５〜２５μｇの精製したＴｄ Ｔで免疫感作した。

ＴｄＴはチャック（Ｃｈａｎｇ）およびボラムの方法（ジャーナルオプバイオロ ジカルケミストリー２４６　：　９０９．１９７１）を少し変形することによっ てウシ胸腺から精製した。ドデシル硫酸ナトリウムを有するポリアクリルアミド ゲルにおける減じられた最終（水酸化リン灰石）分層の分析は、Ｍｒ　４３，０ ００．３２、０００および１０．０００と評価された主要なペプチドを示した。

懸濁液を４個の等しい部分に分け、次いで腋および鼠径領域に皮下注射した。第 １の融合のために、マウスを４週間の間隔で３回免疫惑作した。第２より後の全 ての免疫感作には不完全フロインドアジュバントを用いた。第３免疫感作の５日 後マウスを出血させ血清をＴ（ＩＴに対する抗体に対して２つの方法で試験した 。第１では、血清を稀釈しＴｄＴの酵素活性の抑制に対して試験した。ＴｄＴの 酵素活性の抑制は１０　ｍＭのＫＰＯａ、　１５０　ｍＭのＮａ　Ｃｆ　ｐ８７ ．４（ＰＢＳ）および１０ｍｇ／ｍのウシ血清アルブミンにおける血清の稀釈液 と精製した酵素（約０．３単位）を２５°Ｃの温度において１時間混合すること 岬よって測定した。次いで、標準アッセイ条件を確立し、１単位の酵素活性は３ ７°Ｃの温度において１時間当りに混入する１ｎＨのｄＧＴＰに等しい。負の制 御は正常なマウス血清および精製したＭＯＰＣ２１ｒｇｃ、であった。第２では 、血清の稀釈液を急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）を有するヒト供給体からのＴ ｄＴ−陽性前Ｂ細胞系ＮＡＬＭ−６の核に対する結合に関する間接免疫蛍光法に よって試験した。

血清をＥＢＶを含有する丁ｄＴ−陰性正常ヒ）Ｂリンパ芽球質細胞系ＲＰＭＩ　 １７８８においても同じ方法で試験した。これらの試験を基礎として、１匹の動 物を犠牲にし肺臓摘出する前に高度免疫法のために選択した。第３皮下免疫感作 の２週間後このマウスに未処理ＴｄＴの一連の腹腔内接種を行った；肺臓摘出前 ６，４，３．２および１日に７．５．２５．６２゜６２および６２ｄｇをアジュ バントなしで腹腔的注射した。最後の注射の１日後、ｍ臓を細胞融合のために取 り出した。

苅り二色 肺細胞、ファゼヵス　デ　エステ・グロス（Ｆａｚｅｋａｓ　ｄｅＳｔ、Ｇｒｏ ｔｈ）ら〔ジェ・イミュノル・メソッド（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ］。

Ｍｅｔｈｏｄｓ）　３５　：　１．１９８０）　）の最適条件を少し変形して５ Ｐ２１０ネズミ形質細胞腫細胞に融合した。肺細胞および形質細胞腫細胞を４： ５の割合で混合した。

五■迭 バイプリドーマ上澄みをＴｄＴ−陽性ＮＡＬＭ−６細胞の核で反応性に対する間 接免疫蛍光法によって試験した。陽性上澄みをＴｄＴ−陰性系であるＲＰＭＩ　 １７８８細胞で反応性に対して試験した。ＮＡＬＭ−６と反応性であるがＲＰＭ Ｉと反応性でない抗体を産生ずるハイブリドーマは他の特性決定のために保持し た。凝縮した中期染色体なしで済ませＩ？ＰＭ１１７８８細胞に存在しない軽い 核染色は特異質的な反応を特徴づけた。ＮＡＬＭ−６およびＲＰＭＩ　１７８８ 細胞に共通なある特異的でない結合形式は、細胞質染色体およびパンセルラー（ ｐａｎｃｅｌｌｕｌａｒ）染色反応を包含する。かがる抗体を産生ずるハイブリ ドーマは棄てた。

この融合で４４９個のハイブリドーマを産生じ、このうちの３個はＮＡＬＭ−６ と反応性でＲＰ？ＩＴ　１７８８細胞と反応性でない抗体を産生じた。これらハ イブリドーマを稀釈を制限することによってクローン（ｃｌｏｎｅ）　Ｌ、、こ れらハイブリドーマのうちの２個はクローニングにおいて不安定であった。

「ＴｄＴ４ハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）　」と称する残りのハイブリ ドーマは、ＩｇＧ、免疫グロブリンを分泌し、モノクロナール抗体はｒＴｄＴ４ Ｊと称した。４．５ケ月の静置期間の後、残り９匹のマウスの免疫感作を、不完 全フロインドアジュバントに乳化した架橋されたＴｄＴを用いて月１回の割合で 再び始めた。定期的な間隔で、マウス血清を免疫蛍光）　法および酵素抑制アン セイで試験し、第８回目の免疫感作の後、１匹のマウスを高度免疫法のために選 んだ。最後の皮下免疫感作の最初の１週間後、この動物に肺臓摘出前７゜４．３ ．２および１日に２５．５０．５０．５０および５０ｄｇの生ＴｄＴを腹腔内的 に与えた。

肺細胞の融合は前述した肺細胞とＳＰ　２　／　Ｏネズミ形質細胞腫細胞との融 合方法によって行った。

総計５２４個のハイブリドーマを得、このうちの４個をＮＡＩＪ＋−６細胞の分 束に基づく他の特性決定のために選択した。

これら４個のハイブリドーマのうちの３個はクローニングの後において安定であ りｒＴｄＴ　ｌ　、　ＴｄＴ　２およびＴｄＴ　３ハイブリドーマ」と称し；３ 個全てはＩｇＧ＋免疫グロブリンを分泌し、各モノクロナール抗体はｒＴｄＴ　 １．　ＴｄＴ　２およびＴｄＴ３Ｊと称した。

各モノクロナール抗体を分泌する４個のハイブリドーマの試料はＮｏ、　）ＩＢ 　９１７８　（ＴｄＴ　１）　；　ｌ（Ｂ　９１７９　（ＴｄＴ　２）　；）Ｉ Ｂ９１８０　（ＴｄＴ　３　”）および）１８９１８１（ＴｄＴ　４　）として アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）　）に寄託している。

疫”　（Ｉｍｍｕｎｏ　ｒｅｃｉ　１ｔａｔｉｏｎ）抗体を、培養したヒ）　Ｔ ｄＴ−陽性ＮＡＩＪＩ　−６細胞を用い免疫蛍光反応性に基づいて選択したので （３５Ｓ）−メチオニンで代謝的に標識した同じ細胞の抽出物は免疫沈降によっ て分析した。ＮＡＬＭ−６細胞（１０７）を洗浄し、透析した１０％のウシ胎児 血清を含有しメチオニンを含まない１０ｄのＲＰＭｉ１６４０培地において３７ °Ｃの温度で１時間温置しく３５３）−メチオニン（１００ｕ　Ｃｉ　／　ｍＲ ）　（Ｉ　スピ・７　り）　＜ｓｒ、　−ｃｔ＋　／１１４０ｃ＝／ｍ１、アメ ースハム、アーリントンハイツ、アイエル（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＡｒｌｉＡｒ ｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ）　）を転化し細胞を４時間培養した。洗浄後 、細胞を２−の１３ｍＭのトリス）ｌｃｊ２ｐＨ７，４，２１ｍＭノＭｇＣ４２ ｚ、３００ｍＭ（７）ｋＣｊ！、　０．５％ノドリドンＸ　１００．１　ｍＭの フェニルメチルスルボニルフルオライド。

および１００カリクレイン抑制性単位／ｄアプロチニンに溶解した。１００，０ ００ｘ　ｇで３０分間遠心分離した後、抽出物を４０ｔｔＥのウサギ抗−マウス ＩｇＧ　（ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）　（ペルーフリーズ　バイオ 　ロジカルズ５　ロジャース　エヶ（Ｐｅｔ−Ｆｒｅｅｚｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｌｓ、　Ｒｏｇｅｒｓ　ＡＫ）　）および４９ｇのＭＯＰＣ２１１８Ｇ＋で処 理した４００ｕ１．のコヮンエイ（Ｃｏｗａｎ　Ａ）系統ニス・アウレウス　Ｓ 、　ａｕｒｅｕｓ）Ｑ濁液（ＳＡＳ）を用いて温置した。遠心分離した後、抽出 物を４００μ２の未処理のニス・アウレウス懸濁液を用いて温置した。若干の実 験においては、抽出物をＳＡＳを用いて第１の処理と同様の方法で３回処理した 。抽出物の１００μ２のアリコート（約１０１０７ＣＰを５０μ２の１／１００ 　ｆｉ水症流体稀釈液、１ｍｇ／ｍｌの精製したＭＯＰＣ−２１ｒｇｃｌ、ウサ ギ抗−ＴｄＴ異種抗血清（ｈｅｔｅｒｏａｎｔｉｓｅｒｕｍ）または正常なウサ ギ血清を用いて４°Ｃの温度で１時間温置した。ウサギ抗−マウスＩｇＧ（５μ りをマウス抗体を含有するすべての試料に１時間で添加し、ＳＡＳ　（２５μｌ ）を添加し０．０５Ｍのトリス−（ｌ　ｐＨ８，０，０，５ＭのＮａＣＥ、０． ５％のＮＰ　−４０，０，２％のデオキシコール酸ナトリウム、および０．１％ のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）で４回洗浄した。次いでペレットを５０μ ｌの１０　ｍＭのトリス−Ｃ２゜１４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、０． ５％のＳＯ５，０，２５Ｍのスクロース、０．００２％のブロモフェノールブル ー、ｐＨ８，０中に再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｄ）　Ｌ、３分間沸騰させ、ラエ ムリ　（Ｌａｅｍｍｌｉ）ら〔ネイチャ（Ｎａｔｕｒｅ）　２２７　：６８０． １９７０　〕のＳＯＳを含有する１０％のポリアクリルアミドゲルを介して電気 泳動した。ダブリュ・エム・ポナー（Ｗ、Ｍ、Ｂｏｎｎｅｒ）　らによって記載 されている方法〔ニア・ジエ・バイオケム・（Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ）　４６　：　８３．１９７４）によってフルオログラムを作製した。４個のモ ノクロナール抗体全て、並びにＴｄＴに対するウサギ異種抗血清は、かかる抽出 物からＭｒ６０　、０００ドルトンのペプチドを特異的に免疫沈降した。これま での処理はＴｄＴに対する異種抗血清が培養したリンパ芽球からＭｒ　６０，０ ００　ドルトンのシングル（ｓｉｎｇｌｅ）ポリペプチドを免疫沈降するという ことを示した。

のウシＴｄＴの　ンパク　ノ＼”フーグメント（ｆｒａｍｅｎｔ）よｆｆｉ改咀 これら抗体が７６７分子の類似のエピトープまたは別個のエピトープと反応する か否かを決定するために、ウシＴｄＴをクリープランド（Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ） メソツズエンチモル（ＭｅｔｈｏｄｓＥｍｚｙｍｏｌ）　９６　：　２２２．１ ９８３　）に記載されている如＜　１２５ｍＭのトリス−Ｃ４ｐ）ｌ　６．８　 、１０％のＳＯ３および１００ｍＭのＥＤＴＡの存在下でニス・アウレウス■８ プロテアーゼによって部分的に分解した。未処理の酵素または６０．９０および １２０μｇ／戚の■８プロテアーゼを含有する酵素を３７℃の温度で３０分間温 温度た。試料を５％の２−メルカプトエタノールおよび２％のＳＯＳに調製し、 ２分間煮沸し、１７．５％のラエムリ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを介して 電気泳動させた。

ペプチドおよび分子量標識を、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）らによって記載されて いる如く〔ブロク　ナトル　ア力ド　ソサイユーエスエー（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ 　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ）７６　：　４３５０．１９７９）０．１　ミクロ ン孔径のニトロセルロース紙に電気泳動的に移動させた。０．０５％トウィーン ー２０　（Ｔｗｅｅｎ−２０）　ＰＢＳ中でブロック（ｂｌｏｃｋｉｇ）　シた 後、紙片をＩμｓ／ｍ　の精製したモノクロナール抗体ＴｄＴ　１．　ＴｄＴ　 ２．　ＴｄＴ　３またはＴｄＴ　４で処理しｉ　ＭＯＰＣ２１ｒｇに、を対照と して用いた。洗浄後、紙片を西洋ワサビペルオキシダーゼ−抱合ヤギ抗−ウサギ ＩｇＧ次いでペルオキシダーゼ−抱合ウサギ抗−ヤギ−１ｇＧで展開した。次い でモノクロナール抗体を結合した酵素フラグメントを過酸化水素の存在下におい て４−クロロ−１−ナフトールを用いて温度することによって視覚化した。

抗体ＴｄＴ　１．　２および３各々は分解していないウシＴｄＴの標本中の評価 分子量４３，８００および１１　、０００の２個のペプチドと反応した。抗体Ｔ ｄＴ　４はこれらペプチドの大きい方と反応したが、染色はわずかであった。６ ０μｇ／ｍＡのプロテアーゼで調製した部分的分解物中で抗体ＴｄＴはＴｄＴ　 ２が結合したと同じ１４個のペプチドに結合した。これらペプチドは４３．８０ ０〜９．０００の大きさの範囲であった。抗体ＴｄＴ　３はこれら同じ１４個の ペプチドのうちの９個に結合した。これら９個のペプチドの評価Ｍｒは４３，８ ００　；　４２，８００　；　３７．７００　；３６．６００　；　３５．６０ ０　、３４，７００　；　３２，６００　；　３１，５００　ｉおよび２９．９ ００であった。抗体ＴｄＴ　１および２によってわずかに染色されたＭｒ１８． ０００の１個のペプチドは抗体ＴｄＴ　３によっては認識されなかった。あるペ プチドの抗体ＴｄＴ　３によるわずかな染色のため、ＴｄＴ　１および２によっ て結合された他の５個のペプチドへのＴｄＴ　３の結合の欠如を説明することが 困難である。一般にこれらの結果は抗体ＴｄＴ　１．　２および３がウシＴｄＴ 分子の同じ決定基に結合することを示唆するものと説明される。

同様の免疫染色（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）実験において、抗体ＴｄＴ　 １．　２．および３は酵素的に活性なＴｄＴ　（ＮＡＬＬ　−１。

ＮＡＬＭ−６、ＲＰ旧８４０２およびＲＥＨ）を含有する培養したヒト細胞系の 抽出物から誘導されたＭｒ　６０，０００のペプチドとは特異的に結合した。こ のペプチドは酵素的に活性なＴｄＴ（Ｄａｕｄｉ、ＲＰＭＩ　８３９２およびＲ ＰＭＩ　１７８８）を含有しないヒト細胞系の抽出物から誘導された免疫染色（ ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｓ）では見出されなかった。

工止企交１反良立 これら４個の抗体が７６７分子の類似または別個のエピトープを認識するか否か を評価するために、抱合されていない抗体を、固定化したウシＴｄＴに対する（ １２５１　）−標識抗体の結合を置換するこれら４個の抗体の性能に関して試験 した。抗体をこれら競争アッセイにおいてアフィーゲルプルプロテインＡ　（Ａ ｆｆｉ−Ｇｅｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ）　（バイオ−ラドラボラトリーズ、リッ チモッド、シエイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｒ４ｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）　）を用いた腹水症流体から精製し、抗体ＴｄＴ　 １．　２および３を相互に置換したところ同一または立体的に近接して配置する （ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ　ｃｌｏｓｅｌｙ　５ｐａｃｅｄ）決定基との交差反応 性を示した。抱合されていないＴｄＴ　１および２はＣＩｚ’　Ｉ　）　−ｒｄ ｔ　１　、　２および３と完全に置換したが〔ｌｚｓ　１　）　−ＴｄＴ　１お よび２のＴｄＴ　３による置換は抱合されていない抗体の高い投入量において完 全ではなかった。明らかにＴｄＴ　４はＴｄＴ　１．　２および３によって認識 される決定基と異なる決定基に結合した。この理由は前者の抗体は抱合されたお よび抱合されていない抗体の任意の混合物においてウシＴｄＴへの結合を後者の ３個と競争しなかったからである。

胸腺の抽出物を競争ラジオイムノアッセイで試験しマウス、ラット、ウサギおよ び精製したウシＴｄＴで抗体ＴｄＴ１゜２および３の交差反応性を評価した。第 １図に示す如く、各胸腺抽出物を固定化したウシＴｄＴからの３個の抗体全てと 置換した。一般的な輪郭および置換の程度はウシＴｄＴとウサギ胸腺抽出物では 同様であり、これら抗体によって認識される如く含まれる抗原決定基の量の類似 性を示している。置換の程度はウサギ抽出物による場合、特に抗体ＴｄＴ３によ る場合よりマウスおよびラット抽出物による場合の方が完全でなかった。ネズミ 抽出物におけるＴｄＴＯ比活性は他の抽出物における場合より低かった。しかし ラット酵素の３個の抗体全てとの交差反応性はウサギ酵素の場合より程度が低い と思われた。ＴｄＴ−陽性細胞を含有しないネズミの肺臓から調製した抽出物は 任意のモノクロナール抗体に対する結合に対して競争しなかった。明らかにこれ らの結果は抗体ＴｄＴ　１．　２および３がウシ以外にマウス、ラット、ウサギ 、およびヒトＴｄＴに結合するが、抗体ＴｄＴ　４は少なくともヒトおよびウシ 酵素に結合することを示す。

可溶性酵素による抗体ＴｄＴ　４の有効でない置換は胸腺抽出物による試験を妨 げた。

第１図において、Ａは抗体ＴｄＴ　１　；　ＢはＴｄＴ　２　；　ＣはＴｄＴ　 ３を示す。ウサギ、マウスおよびラット抽出物におけるＴｄＴの比活性は各々３ ．６．０．７８および４．９Ｕ／ｍｇであった。ネズミ肺臓の抽出物による置換 （△）はＡ、Ｂ、Ｃ各々の下辺の右側に示した。

細胞系および組織の付加的な抽出物を競争ラジオイムノアッセイで、（Ｉｔｓ　 ｌ　）−抱合抗体の固定化した仔ウシＴｄＴに対する結合を置換する性能に対し て試験した。酵素的に活性なＴｄＴを含有することが知られている全ての細胞系 のみがこれら抗体と有効に置換する抽出物を生じた。前骨髄球細胞系ＨＬ　−６ ０およびＢ細胞系ダウディ（Ｂ　ｃｅｌｌｌｉｎｅｓ　Ｄａｕｅｉ）およびＲＰ ＭＩ　１７８８から調製した抽出物は抗体結合に対して競争しなかった。

、アッセイ： ＴｄＴの酵素活性の抑制は１０ｍＨのＫＰＯ４，１５０ｍＭのＮａＣｊ！ｐＨ７ ，４（ＰＢＳ）および１０ｍｇ／ａｌｌのウシ血清アルブミン（ＰＢＡ）で精製 した抗体を稀釈した液を精製した酵素（約０．３単位）と２５°Ｃの温度で１時 間混合することによって評価した。次いで標準アッセイ条件を確立した；酵素活 性の１単位は３７°Ｃの温度において１時間当りに混入する１ｎＨのｄＧＴＰに 等しい。負の制御は正常なマウス血清および精製したＭＯＰＣ２１１ｇＧ、であ った。抗体ＴｄＴ　１．　２および３は各々ウシＴｄＴの触媒活性を抑制するが 、抗体が約７倍モル過剰で存在する場合でさえ不完全であった。ＴｄＴ　４によ る抑制は高い投入量の試験でさえ最小であった。これら抗体は仔ウシ胸腺ＤＮＡ ポリメラーゼの活性を抑制しなかった。

−の　：　疫゛°　法 ＴｄＴの含有量を酵素的に測定した種々の培養した新鮮なヒトリンパ球を間接免 疫蛍光法によってＴｄＴ免疫反応について評価した。細胞を固定したスライド上 にペレット化し、カペル　ラボラトリーズ　オブ　マルベーン、ビエイ（Ｃａｐ ｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　ｏｆ　Ｍａｌｖｅｒｎ、　ＰＡ）により供 給されるフルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）抱合ヒツジ抗−マウスＩｇ Ｇで染色し検出した。細胞の分層と４個の各モノクロナール抗体で染色し十分に 特徴づけたウサギ異種抗血清Ｃ５３７を比較した。酵素的に活性な多量のＴｃ１ Ｔを含有することが知られている４個の細胞系の全てを第１表に要約する如く各 モノクロナール抗体およびウサギ抗血清によって同程度に染色した。ＴｄＴの酵 素活性が検出されなかった５個の系の４個はこれらの抗体のいずれによっても染 色されなかった。プレーＢ　ＡＬＬ系５ＭＳ−３Ｂ（ｐｒｅ−Ｂ　ＡＬＬ　１ｉ ｎｅ　ＳＭＳ　−５Ｂ）の細胞の小分層（２〜６％）はモノクロナール抗体並び にウサギ異種抗血清によって染色された。この細胞系が免疫蛍光法によっては検 出され得るが標準条件のアッセイ感度下の酵素アッセイによって検出され得ない 少数のＴｄＴ−陽性細胞を示すことが知られている。

第　１　表 ＴｄＴに対する培養したヒト造血細胞系の免疫蛍光染色ＮＡＬＭ−６４ＬＬ　４ ４ ＮＡＬＬ−１八ＬＬ　５６ ＲＰＭＩ　８４０２　Ｔ−ＡＬＬ　＜１０５Ｍ５−ＳＢ　ＡＬＬ　＜　１０ Ｒ，ＰＭｌ　８３９２　Ｂリンパ芽球　＜１０ＲＰＭＩ　１７８８　Ｂリンパ芽 球　〈１０抗　体 ＴｄＴ　Ｉ　ＴｄＴ　２　ＴｄＴ　３　ＴｄＴ　４　Ｃ５３７−細−一胞一　力 色された　（・　るｖＡ　％）ＲＥＨ９９９６９９９５９７ ＮＡＬＭ−６！Ｉｌｌ　９０　９５　９５’　９１ＮＡＬＬ−１９９９９９９９ ５９９ ＲＰＭＴ８４０２　．９９　９５　９５　９５　９９５Ｍ５−ＳＢ　４　４　２ 　６　２ １（Ｌ−６０〈０．１　＜０．１　＜０．１　＜０．１　＜０．ＩＤａｕｄ　ｉ 　ぐ０．１　＜０．１　＜０．１　＜０．１　＜０．ＩＲＰＭＩ　８３９２　ぐ Ｏ−，１＜０．１　＜０．１　＜０．１　＜０．ＩＲＰＭ１１７８８　＜０．１ 　＜０．１　＜０．１　＜０．１　＜０．１酵素アツセイの感度は１０単位／１ ０８細胞であった。略語；ＡＬＬ、象、性リンパ芽球白血病；　Ｔ−ＡＬＬ、　 Ｔ細胞ＡＬＬ　ｉ　ＡＭＡＭＬ、象、性骨髄性白血病 更に、種々の白血病を有する患者の血液からのリンパ球を間接免疫蛍光法によっ て試験し、４個のモノクロナール抗体の全ては酵素的に活性なＴｄＴを含有する これらの細胞のみを染色した。これら白血病は角、性リンパ芽球白血病（４人の 患者）、リンパ芽球トランスフォーメーションの慢性顆粒球白血病（１人の患者 ）、急性骨髄性白血病（２人の患者）、慢性リンパ球白血病（３人の患者）を含 む。

抗体ＴｄＴ　１．　２および３はウサギ抗血性が染色したように細胞の同じ分層 を染色した。抗体ＴｄＴ　４は他の抗体が染色するより若干の細胞集団のわずか に少ない分層を染色した。

４個の抗体の全てはリンパ芽球トランスフォーメーションの慢性顆粒球白血病（ ＧＬ）細胞の９９％を染色し、これは著しく高い量の酵素的に活性なＴｄＴを表 わす。

抜勤通惣計１−法三一 直接免疫蛍光法のために、精製したモノクロナール抗体をモノクロナール抗体： 原理および実践（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ）　、ニュー ヨーク、アカデミツク　プレス（ＮｅｉｎＹｏｒｋ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ ｅｓｓ）＋　１９８３第２２７頁の「免疫蛍光法」（第７章）にボンディング（ Ｇｏｄｉｎｇ）によって記載されている如＜　ＦＩＴＣで抱合した。ＴｄＴ−陽 性ＮＡＬ門−６およびＴｄＴ−陰性ＲＰＭＩ　１７８８細胞の混合物１０ｍＭの ＫＰＯ４，１５０ｍＭのＮａＣ１゜ｐＨ７，４（ＰＢＳ）における４％のバラホ ルムアルデヒド中で固定した。細胞混合物は１００％、９９％、９７％、９０％ 、７０％および０％の　ＲＰＭＩ　１７８８細胞を伴う０，１．３，１０．３０ および１００％のＮＡＬＭ−６細胞を含有する。次いで細胞を０℃の温度の水の ５０％、１００％および最後に５０％のアセトン溶液の順で固定した。細胞を１ ０ｍｇ／ｍｆｉのウシ血清アルブミンおよび０．１％のＮａＮ５　（ＰＢＡ）を 含有するＰＢＳ中で洗浄した。

固定した細胞（１０６）を正常なマウス血清中に１０分間温装し次いでＦＴＴＣ −抱合モノクロナール抗体ＴｄＴ　１．　２．　３および４の等量の混合物を１ ００μ２のマウス血清で１７３２稀釈した液を用いて室温において１２時間温装 した。最終抗体タンパク質濃度は１３Ｈｇ／ｒｔｄｌであった。染色した細胞を ＰＢＡで２回洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＡで洗浄し、 オルソ５０Ｈサイトフルオログラフ（Ｏｒｔｈｏ　５０ＨＣｙｔｏｆｌｕｏｒｏ ｇｒａｐｈ）で分析した。負の制御として、マウス血清のＦＩＴＣ−ヤギ抗−ウ サギＩｇＧ　１／４０稀釈液またはＦＩＴＣＭＯＰＣ２１ｒｇｃ、で染色した。

ＮＡＬ？Ｉ−６およびＲＰＭＴ　１７８８細胞の染色は、ＴｄＴ−陽性および陰 性細胞で得られるミーンフルオレセンス　チャンネルズ（ｍｅａｎ　ｆｌｕｏｒ ｅｓｃｅｎｃｅｃｈａｎｎｅｌｓ）の広い分離を伴う単峰形であった。流動細胞 計測法によって検出したＴｄＴ−陽性細胞の分層はＲＰＭＩ　１７８８細胞と混 合したＮＡＬＭ−６細胞の測定した分層と近似した。

ＦＩＧ、１ １且ゑ弐ｌｌ１ｌｌ出特（／１）） 国際調査報告 １＋＋″Ｍ＋＋ａａａｌ　Ａｏｅｋａ＋°”　”’　ＰＣＴ／１１５８６／Ｑ２ Ｓ２

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびウシ属の動物の各種細胞の夫々からの 末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）のエピトープに反応的に結合する ことを特徴とするネズミモノクロナール抗体。
2. ２．ウシ胸腺細胞からのＴｄＴで免疫感作したマウスから誘導した請求の範囲第 １項記載のモノクロナール抗体。
3. ３．ネズミ形質細胞腫と免疫感作したマウスからの脾細胞との融合により誘導し た雑種細胞によって産生した請求の範囲第１項記載のモノクロナール抗体。
4. ４．　上記細胞がＨＢ９１７８（ＴｄＴ１）；ＨＢ９１７９（ＴｄＴ２）；ＨＢ ９１８０（ＴｄＴ３）；およびＨＢ９１８１（ＴｄＴ４）の番号でアメリカンタ イプカルチャーコレクションに寄託している試料の群から選ばれる少なくとも１ 個の試料の識別特性を有する請求の範囲第３項記載のモノクロナール抗体。
5. ５．ＮＡＬＭ−６細胞に結合する特異性によって特徴づけられる請求の範囲第１ 項記載のモノクロナール抗体。
6. ６．ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびウシ属の動物の各種細胞夫々からのＴ ｄＴのエピトープに特異的に結合するモノクロナール抗体を産生するネズミ属か ら誘導された雑種細胞系。
7. ７．上記細胞がウシ胸腺細胞からのＴｄＴで免疫感作したマウスから誘導される 請求の範囲第６項記載の雑種細胞系。
8. ８．更に、上記細胞がネズミ形質細胞と上記免疫感作したマウスからの脾細胞と の融合により誘導される請求の範囲第７項記載の雑種細胞系。
9. ９．　ＨＢ９１７８（ＴｄＴ１）；ＨＢ９１７９（ＴｄＴ２）；ＨＢ９１８０（ ＴｄＴ３）；およびＨＢ９１８１（ＴｄＴ４）の番号でアメリカンタイプカルチ ャーコレクションに寄託している試料の群から選ばれる少なくとも１個の識別特 性を有する請求の範囲第１項記載の雑種細胞系。