JPS633788A - 耐塩性カタラ−ゼおよび過酸化水素の分解法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なカタラーゼに関し、さらに詳細には耐
塩性の大きいカタラーゼならびにその用途に関するもの
である。

カタラーゼは、生体内の種々の酵素反応などによって生
成する過酸化水素を水と酸素とに分解する酸素であり、
動物、植物および微生物などの体内に広く存在すること
が良く知られている。

また、カタラーゼは、食品加工および臨床検査等に、従
来から広く実用に供されている酵素である。

〔従来技術、発明が解決しようとする問題〕従来のカタ
ラーゼとしては、特開昭５５−１３５５８８、特開昭６
０−８３５７９および時分１１［４９−４９５６などの
ように、微生物からのカタラーゼや、たとえば豚、牛の
肝臓などの動物臓器由来のカタラーゼなどが知られてい
る。

しかし、従来のカタラーゼは耐塩性が比較的小さいもの
しか知られておらず、高い塩濃度の環境下で過酸化水素
を分解するためにカタラーゼは使用されず、カタラーゼ
の用途は限定されていた。

ところで、たとえば、数の子などは塩蔵に先立って過酸
化水素による漂白、残留過酸化水素の分解除去などの一
連の処理が行なわれているが、これらの処理は数の子の
風味を保つために高い塩濃度の水性液中で行なわれるの
が一般である。しかしながら、従来、市販されて〜・る
カタラーゼは一般に耐塩性が小さいために残留過酸化水
素の分解除去が困難であり乃至は多量のカタラーゼが必
要とされていた。このような見地から耐塩性の大き〜・
カタラーゼ（・ｒ）出現が期待されていた。

〔問題を解決するための手段、作用〕

本発明者らは、耐塩性カタラーゼについて鋭意検討を行
なってきた。その結果、耐塩性の大きい新規なカタラー
ゼを発見し、ざらζここの新規なカタラーゼの用途を開
発するに至った。

すなわち、本発明は食塩濃度が７Ｗ／Ｖ％以上の水性溶
液中においても相対活性が５０チ以上である耐塩性の大
きい新規なカタラーゼである。

本発明の耐塩性カタラーゼは、従来のカタラーゼと比較
して耐塩性が著しく大きいほかは大きく異る処はない。

すなわち、 ■　作用および基質特異性 高食塩濃度の水性溶液中に存在する過酸化水素を水と酸
素とに分解する。

■　耐塩性 食塩濃度が７Ｗ／Ｖ％以上の水性溶液−たとえば高濃度
食塩水および高濃度食塩含有緩衝液−中で相対活性（食
塩濃度零の水性溶液中におけるカタラーゼの活性に対す
る割合−以下同様）は５０チ以上である。なお本発明の
耐塩性カタラーゼは、たとえば、食塩濃度が５Ｗ／Ｖ４
の水性溶液中では、相対活性８０チ程度の極めて高い活
性を示すが、食塩濃度１ｏｗ／ｖｓの水性溶液中でも相
対活性が約６０チ程度の高い活性を示し、食塩濃度１３
〜１ｓｗ／ｖｓで相対活性が約５０チ程度を示す。勿論
、食塩濃度が７　Ｗ／Ｖ％未清では食塩濃度７Ｗ／Ｖ％
以上のときよりも活性が大きく、この活性の大きさは市
阪品の活性よりもはるかに大きい。

■　至適ｐＨ りん酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液およびくえん酸緩衝
液を用いて調製したｐ）１３〜９の各ｐＨ１ｌ衝液中で
の活性を３０℃にて測定した。

■　至適温度　３０〜５０℃ １）Ｈ７で測定した。

■　ｐＨ安定性　ｐＨ６〜９ りん酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液およびくえん酸緩衝
液を用いて調製したｐ）（３〜９の各測定し、最大の活
性に対して９５％以上の活性を示すｐＨをあられす。

ラーゼを　　　　　°　溶解した溶液を所定の温度で３
０分間加熱した後、冷却した。最大活性に対して５０チ
になる温度を表示した。なお、活性は３０℃で測定した
。

■　分子量　　約２０万〜２６万 トヨパールＨＷ−６０８（東洋醪造■製〕を用いたゲル
ろ適法で測定した。

なお、カタラーゼの活性はエッチ・アエビらによる方法
（Ｈ、Ａｅｂｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｅｎｚ
ｙ−ｍｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｖｏｌ、２　ｐ、６７５
（１９７４）　］によって測定した。すなわち、基質で
ある過酸化水素がカタラーゼ番とよって分解されて減少
する程度を２４０４Ｉ３１−の吸光度の変化によって追
跡した。なお、カタラーゼの活性は、１分間に分解され
る過酸化水素の１マイクロモルを１単位（Ｕ）とした（
以下同様）。

本発明の耐塩性カタラーゼは、−般に、耐塩性カタラー
ゼ生産能を有する微生物を、好気的に培養して得られた
菌体から、採取される。すなわち、耐塩性カタラーゼ生
産能を有する微生物としては、たとえば酵母がある。酵
母きしてはハンセヌラ属、キャンデイダ属およびトルロ
プシス属などのそれぞれに属する酵母が好ましく、就中
、ハンセヌラ属屹属する酵母が好ましい。ハンセヌラ属
に属する酵母の代表例としてハンセヌラ・ポリモルファ
およびハンセヌラ・フイロデンドラなどを挙げるこさが
できる。ハンセヌラ・ポリモルファに属する代表的な保
存菌株としてはＦＥＢＭ　　Ｐ−２３３７、ＴＦＯ１０
２４、ＣＢＳ　　１９７７およびＡＴＣＣ１４７５５な
どが挙げられる。また、ハンセヌラ・フイロデンデラに
属する代表的な保存菌株としては、ＣＢＳ　　６０８８
、ＣＢＳ　　６１１１およびＣＢＳ　　６０７５などが
挙げられる。

これらの微生物は、これらの微生物が活発に増殖しつる
条件下で、常法により培養される。

たとえば、炭素源としてこれらの微生物が資化し得るも
のであればいずれでも良いが、メタノールが最も好まし
い。炭素源のほかに、ちつ素源や、ミネラル類およびビ
タミン類などを培地に含有せしめることが好ましい。ち
つ素源としては、たきえばアンモニウム塩類、ペプトン
、酵母エキス、コーン・ステイープ・リカーおよびカザ
ミノ酸などが好適に利用される。ミネラル類としては、
たとえばりん酸塩類、マグネシウム塩類、カリウム塩類
、カルシウム塩類、コバルト塩類、亜鉛塩類および鉄塩
類などを使用することができる。

培養方式としては回分培養、連続培養の入・ずれも可能
である。

培養温度は微生物の種類によって異なり、−概には特定
しえないが、通常２０〜４５℃、好ましくは３０〜４０
℃である。培養ｐＨは通常は２〜６、好ましくは３〜５
である。実際の培養においては培養液のｐＨを一定に保
つのが好ましく、ｐ）（の調製には苛性ソーダ、アンモ
ニア水などのアルカリが用いられる。

培養終了後、培養液から耐塩性カタラーゼを採取するに
は、通常の方法を用いることができる。すなわち、培養
液から、たとえば遠心分離またはろ過などにより培養液
から酵母菌体を濃縮分離する。得られた酵母菌体は超音
波、フレにより自己消化させてカタラーゼを菌体外に排
出、可溶化させることにより粗酵素標品が得られる。

これを、さらに精製するには、たきえばＤＦｊＡＥ−セ
ルロースなどによるイオン交換クロマトグラフィー、ハ
イドロキシアパタイトによるクロマトグラフィーまたは
各種のゲルを用いるゲル−濾過あるいは硫安などによる
塩析、エタノールおよびアセトンなどによる有機溶媒沈
殿などの通常の酵素精製技術から適宜選択した精製法を
単独でまたは組みあわせることにより、精製採取が可能
である。また、用途によっては精製を行なわない粗酵素
標品も、そのままカタラーゼ含有物としても使用が可能
である。

このようにして得られた耐塩性カタラーゼは、食塩濃度
の高い水性溶液に含有されている過酸化水素を分解させ
るために使用される。具体的には、たとえば、塩蔵前に
過酸化水素で漂白された数の子ｆｆ１ｌｌに付着残存し
ている過酸化水素の分解除去に使用される。この処理は
、通常は漂白後の数の子亡食塩水で洗浄しまたは洗浄し
ないでそのま＼、耐塩性カタラーゼ水性溶液に浸漬して
行なわれる。このときの耐塩性カタラーゼの濃度および
使用量は、浸漬液の食塩の濃度、温度、ｐＨなどにより
異り、適宜選択される。

また、使用条件は本発明の耐熱性カタラーゼ〔実施例〕 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。なお、
本発明は実施例に限定されるものではない。

実施例　１ （ＮＴ（４）２８０４５１１／１％ＩＧ（２ＰＯ４ａｆ
／／１１ＭｇＳＯ４・ｙＨｘｏ　ｏ、ａ９／ｌ、酵母エ
キス　０　、２９／１．ビオチン　１０μ９／ｌ、チア
ミン　５■／１１　くえ。

ん酸鉄（含水物）　　５０１１Ｐ／／、ＣａＣｌ２　・
２Ｈ２０５０８９／ｌ、Ｚｎ８０＜・７ＨｚＯ１鴎Ｖｌ
、ＭｎＣ１２・４１（ｚＱ　１ＣＮ／ｌ。

ＣｕＳＯ４−５ＨｚＯ０，５１１Ｐ／Ｊ　　およびメタ
ノール１０ｍ１／、ｇ含む培地を１１三角フラスコに１
５０ＷＬｌ張りこみ、１２０℃で２０分間加圧滅菌した
後、冷却した。同様な培地組成でハンセヌラ・フイロデ
ンデイラ　ＣＢＳ　　６０８Ｂを１００　　　　　　゛
耐容三角フラスコで２日間、３０℃で振とう培養し、予
め調製した種母をこの１１三角フラスコにフラスコあた
り２−ずつ植菌した。培養温度３０℃で、回転振とう培
養機で培養し、培養開始後約６０時間経過し、基質のメ
タノールをほぼ消費しつくした時点で培養を終了した。

培養液１ｊを遠心分離機にかけて集菌した。

この菌体をｐ）ｉ　７　、０．０　、０５Ｍりん酸緩衝
液で１回洗浄した後、フレンチプレス（アミコン製）で
菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離にかけ
、不溶物を除去して、カタラーゼの粗酵素液を得た。仁
の粗酵素液中には、カタラーゼが約７０万単位含まれて
いた。

この液を５℃に保ちつ＼、この液にエタノール濃度が６
０　Ｖ、／ｖｓになるように、エタノールを徐々に添加
してカタラーゼを沈殿させた。このカタラーゼ含有沈殿
区分をｐＨ７，０，０゜０５Ｍりん酸緩衝液に再溶解し
た後、不溶物を遠心分離で除き、上清液を採取して、ア
ミコン社製ＹＭ−１００の限外ろ過膜で濃縮して部分精
製カタラーゼを調製した。部分精製カタラーゼは２８０
０単位／ｗ９蛋白の比活性を有し、菌体破砕液からの回
収率は約８５チであった。

得られたカタラーゼの耐塩性を第１図に、またそれ以外
の性質を第１表に示す。

実施例　２ 実施例１七同様にしてノ１ンセヌラ・ポリモルファ　Ｆ
ＥＢＭ　　Ｐ−２５５７を１ノ容三角フラスコで５０℃
で約５０時間培養し、メタノールをほぼ消費した時点で
培養を終了した。得られた培養液１１を遠心分離機にか
けて集菌した。

実施例１と同様に菌体を破砕し、粗酵素液を得た。この
粗酵素液中にカタラーゼは約１２０万単位が含まれてい
た。

この液を５℃に保ちつ＼、この液にエタノール濃度が６
０ｖ／■チになるようにエタノールを徐々に添加してカ
タラーゼを沈殿させ、さらにＰＨ７，０，０、０５Ｍり
ん酸緩衝液に再溶解後、不溶残渣を遠心分離により除去
して上清液を採取した。この上清液をアミコン社製ＹＭ
−１００の限外ろ過膜で濃縮し、部分精製カタラーゼを
調製した。

部分精製カタラーゼ液から精製カタラーゼ液の調製は次
のように行なった。すなわち、部分精製カタラーゼ約８
０万単位を、ｐＨ７、０，０，１Ｍりん酸緩衝液であら
かじめ平衡化しであるＤＥＡＥ−セファデックス（Ａ−
２５）（ファルマシア社製品）に吸着せしめた後、０〜
０．５Ｍの塩化カリウムの直線濃度勾配にてカタラーゼ
を溶出させた。溶出させたカタラーゼを、ＹＭ＝１００
限外ろ過膜で濃縮した後、セファデックス　Ｇ−２００
で１回目のゲルろ過にかけた。カタラーゼ区分を再度セ
ファデックスＧ−２００でゲルろ過して活性中心区分を
集めたところ、蛋白質としては２．８■、酵素活性１３
万単位が得られ、その回収率は１６％であった。

得られたカタラーゼの耐塩性を第１図に、また他の性質
を第１表に示す。

なお、比較のために市販の豚肝臓由来のカタラーゼの耐
塩性も第１図に示した。

第１表 実施例　１　　　　　実施例　２ 至適ｐＨ７〜８７〜８ 至適温度　　　３５℃　　　４０’Ｃ ｐＨ安定性　　　　　７７ 耐　　熱　　性　　　　　　５０℃　　　　　　　５５
℃分　子　量　　　約２４万　　　　約２４万酎　　塩
　性　　　　１ａＷ／Ｖ％以下　　１５Ｗ／Ｖ％以下オ
相対活性５０％以上を示す食塩濃度で示す。

使用例 塩蔵用数の子原卵５　Ｋｑずつを篭に入れて水洗した後
、１　、　ＯＶ／Ｖ％の過酸化水素を含む１゜Ｗ／ｖ％
の食塩水に３日間浸漬して漂白した。この数の子を取出
して６Ｗ／Ｖ％の食塩水でさらに洗浄した後、実施例１
および実施例２のそれぞれで得られた耐塩性カタラーゼ
を約１号値になる様に添加して、とかしたカタラーゼ水
溶液に浸漬した。なおこの液の食塩濃度は約１０Ｗ／Ｖ
％　　であった。浸漬は３日間行ない、２４時間後に１
回、４８時間目に１回、カタラーゼを万 それぞれ５Ｊｆ／ｄになる様に追加した。カタラーゼ処
理数の子を液から取り出し約５％食塩水で洗浄し、カタ
ラーゼを十分洗い流した。さらにこの数の子を飽和食塩
水に浸漬し、塩固めを行なった。塩固めをした数の子牛
の残留過酸化水素を衛生試験法（日本薬学会）のヨウ素
法で分析したが、過酸化水素は検出されなかった。

〔発明の効果〕

本発明のカタラーゼは耐塩性が極めて大きく、従ってそ
の用途は拡大される。本発明の耐塩性カタラーゼを使用
することにより、たとえば、過酸化水素で漂白した後の
数の子に付着残留している過酸化水素の分解除去が容易
になる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の耐塩性カタラーゼおよび市販品の豚の
肝臓由来のカタラーゼのそれぞれの耐塩性を示す。なお
図面において、曲線ＡＳ　ＢおよびＣはそれぞれ、ハン
セヌラ・ポリモルファ　ＦＥＩＩＭＰ−２３３７、ハン
セヌラ・フイ゛ロデンドラ　ＣＢＳ　　６０８８および
市販カタラーゼの耐塩性を示す。 特許出願人　　三菱瓦斯化学株式会社 代表者　長野和書

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　食塩濃度が７Ｗ／Ｖ％以上の水性溶液中においても
   相対活性が５０％以上である耐塩性カタラーゼ ２　食塩含有水性溶液に含有されている過酸化水素に、
   食塩濃度が７Ｗ／Ｖ％以上の水性溶液中においても相対
   活性が５０％以上である耐塩性カタラーゼを接触させる
   ことを特徴とする過酸化水素の分解法