JPS6336758B2 - - Google Patents
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Landscapes
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は生体試料中の胆汁酸測定法に関する。
ヒト胆汁中に存在する主な胆汁酸塩はグリココ
ール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコ
ール酸、タウロケノデオキシコール酸、グリコデ
オキシコール酸、タウロデオキシコール酸であ
り、肝臓で合成され胆のうにて濃縮され消化管内
に排泄されている。その生理的意義としては脂肪
の乳化等に関与していると考えられている。しか
しながら何らかの原因で肝障害、胆管閉塞によ
り、消化管内への排泄およびその合成が増大した
場合には血清中に胆汁酸の増大が認められるので
臨床診断の立場より、肝臓および胆管の状態を把
握することが可能である。現在のところこれらの
過程は必らずしも医学的に明確にされていない
が、従来の肝胆道系検査法とは異なつた知見を提
供するものであり、今後その測定の必要性は増加
するものと考えられる。 胆汁酸の定量に関しては近年種々報告されてい
るがとくに臨床検査法としては3α−ハイドロオ
キシステロイドデヒドロゲナーゼを用いる方法が
非常によく検討されており、上記酵素によつて胆
汁酸量に比例して増大するNADHまたは
NADPHの増加を検出する方法はキツト化され
市販されている。しかしこの方法はビリルビンの
影響を相当にうけるため、あらかじめ胆汁酸の分
離が必要であること、および使用検体量が大きい
という欠点を有していた。 本発明者らは、これら従来法による欠点の原因
として検出系での感度に問題があり、その改良が
必須であるという点に着目し、最終検出系に酵素
的サイクリング反応を組み合わせて感度の増大を
計り、迅速かつ正確、簡便な方法を確立し本発明
を完成した。 本発明の反応原理を説明すると、生体試料中の
胆汁酸が3α−ハイドロオキシステロイドデヒド
ロゲナーゼによりケト胆汁酸に変化するに際し、
NAD+（又はNADP+）がNADH（又はNADPH）
に変化するのを酵素的サイクリング反応を利用し
て測定しようとするものである。 以下に本発明の原理を記載する。 ここに、Ａ（又はＢ）は酵素Ea（又はEb）の基
質であり、A′（又はB′）はその生成物を示す。 胆汁酸の酸化により比例して増大するNADH
又はNADPHを酵素的サイクリング反応にて増
幅してすなわちA′またはB′の量より胆汁酸量を
求めることができる。 酵素的サイクリングとしては、例えばNADサ
イクリング、NADPサイクリングなどがあげら
れる。従来法の使用も可能である。（例えばF.M.
Matschinsky：Methods in（Enzymology）、vol、
18、part B.P.3 Academic press（1971）：阿南功
一、紺野邦夫、田村善蔵、松橋通生、松本重一郎
編、加藤尚彦、基礎生化学実験法６、生化学的測
定P101、丸善株式会社、加藤尚彦、生化学実験
構座、第５巻、酵素研究法（上）、P121等） NADサイクリングの例としては、前記反応に
おいて、 Ａ：オキザロ酢酸、A′：リンゴ酸 Ea：リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、 Ｂ：エチルアルコール B′：アセトアルデヒド Eb：アルコールデヒドロゲナーゼ、 NADPサイクリング反応の例としては、前記
反応において、 Ａ：α−ケトグルタル酸 A′：グルタミン酸 Ea：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ Ｂ：グルコース−６−リン酸 B′：６−ホスホグルコン酸 Eb：グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ 等が挙げられる。 本法によれば、使用検体量は微量でかつ3α−
ハイドロオキシステロイドデヒドロゲナーゼ量も
少量である。 以下本発明の実際例を具体的に例示する。 実施例 １ 血清50μｍに0.1NNaOHを入れ室温5min放置
後、3α−ハイドロオキシステロイドデヒドロゲ
ナーゼ12ｍＵ、0.3Mヒドラジンヒドレート、２
ｍＭ EDTAおよび１ｍＭ NAD+を含む0.2M
トリスー塩酸緩衝液（PH8.9）１mlに溶解した溶
液50μを添加し37℃10分間放置後、1M炭酸緩
衝液（PH10.1）50μを入れ60℃30分間加温した。
その後その50μに３−（Ｐヨードフエニル）−２
−（ｐ−ニトロフエニル）−５−フエニル−2Hテ
トラゾリウムクロライド10.11mg、エタノール1.5
mgおよび牛血清アルブミン20mgを0.1Mトリスー
塩酸緩衝液（PH8.0）100mlに溶解した液1.9mlを
入れ25℃にて３分加温したのちジアフオラーゼ
1.5U、アルコールデヒドロゲナーゼ6U酵素混液
50μを入れ、25℃にて500nｍでのレイトアツセ
イまたはエンドポイントアツセイを行なつた。又
同時にブランク値として3α−ハイドロオキシス
テロイドデヒドロゲナーゼの代りに無添加緩衝液
を用い又、検量線用として20μMのゴリココール
酸溶液を用いた。エンドポイントアツセイの場合
には0.1N塩酸１mlにて反応停止した。レイトア
ツセイの場合の検量線は第１図である。また平均
添加回収率は100.0％、再現性、日差変動はおの
おの１−３％、4.7％（変動係数％）であり市販
キツトステログノストー3α（第一化学薬品株式会
社）との相関性は第２図防害物質の影響は第１表
の何くである。 なお、肝疾患時での肝機能検査値との相関性は
第２表である。
ール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコ
ール酸、タウロケノデオキシコール酸、グリコデ
オキシコール酸、タウロデオキシコール酸であ
り、肝臓で合成され胆のうにて濃縮され消化管内
に排泄されている。その生理的意義としては脂肪
の乳化等に関与していると考えられている。しか
しながら何らかの原因で肝障害、胆管閉塞によ
り、消化管内への排泄およびその合成が増大した
場合には血清中に胆汁酸の増大が認められるので
臨床診断の立場より、肝臓および胆管の状態を把
握することが可能である。現在のところこれらの
過程は必らずしも医学的に明確にされていない
が、従来の肝胆道系検査法とは異なつた知見を提
供するものであり、今後その測定の必要性は増加
するものと考えられる。 胆汁酸の定量に関しては近年種々報告されてい
るがとくに臨床検査法としては3α−ハイドロオ
キシステロイドデヒドロゲナーゼを用いる方法が
非常によく検討されており、上記酵素によつて胆
汁酸量に比例して増大するNADHまたは
NADPHの増加を検出する方法はキツト化され
市販されている。しかしこの方法はビリルビンの
影響を相当にうけるため、あらかじめ胆汁酸の分
離が必要であること、および使用検体量が大きい
という欠点を有していた。 本発明者らは、これら従来法による欠点の原因
として検出系での感度に問題があり、その改良が
必須であるという点に着目し、最終検出系に酵素
的サイクリング反応を組み合わせて感度の増大を
計り、迅速かつ正確、簡便な方法を確立し本発明
を完成した。 本発明の反応原理を説明すると、生体試料中の
胆汁酸が3α−ハイドロオキシステロイドデヒド
ロゲナーゼによりケト胆汁酸に変化するに際し、
NAD+（又はNADP+）がNADH（又はNADPH）
に変化するのを酵素的サイクリング反応を利用し
て測定しようとするものである。 以下に本発明の原理を記載する。 ここに、Ａ（又はＢ）は酵素Ea（又はEb）の基
質であり、A′（又はB′）はその生成物を示す。 胆汁酸の酸化により比例して増大するNADH
又はNADPHを酵素的サイクリング反応にて増
幅してすなわちA′またはB′の量より胆汁酸量を
求めることができる。 酵素的サイクリングとしては、例えばNADサ
イクリング、NADPサイクリングなどがあげら
れる。従来法の使用も可能である。（例えばF.M.
Matschinsky：Methods in（Enzymology）、vol、
18、part B.P.3 Academic press（1971）：阿南功
一、紺野邦夫、田村善蔵、松橋通生、松本重一郎
編、加藤尚彦、基礎生化学実験法６、生化学的測
定P101、丸善株式会社、加藤尚彦、生化学実験
構座、第５巻、酵素研究法（上）、P121等） NADサイクリングの例としては、前記反応に
おいて、 Ａ：オキザロ酢酸、A′：リンゴ酸 Ea：リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、 Ｂ：エチルアルコール B′：アセトアルデヒド Eb：アルコールデヒドロゲナーゼ、 NADPサイクリング反応の例としては、前記
反応において、 Ａ：α−ケトグルタル酸 A′：グルタミン酸 Ea：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ Ｂ：グルコース−６−リン酸 B′：６−ホスホグルコン酸 Eb：グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ 等が挙げられる。 本法によれば、使用検体量は微量でかつ3α−
ハイドロオキシステロイドデヒドロゲナーゼ量も
少量である。 以下本発明の実際例を具体的に例示する。 実施例 １ 血清50μｍに0.1NNaOHを入れ室温5min放置
後、3α−ハイドロオキシステロイドデヒドロゲ
ナーゼ12ｍＵ、0.3Mヒドラジンヒドレート、２
ｍＭ EDTAおよび１ｍＭ NAD+を含む0.2M
トリスー塩酸緩衝液（PH8.9）１mlに溶解した溶
液50μを添加し37℃10分間放置後、1M炭酸緩
衝液（PH10.1）50μを入れ60℃30分間加温した。
その後その50μに３−（Ｐヨードフエニル）−２
−（ｐ−ニトロフエニル）−５−フエニル−2Hテ
トラゾリウムクロライド10.11mg、エタノール1.5
mgおよび牛血清アルブミン20mgを0.1Mトリスー
塩酸緩衝液（PH8.0）100mlに溶解した液1.9mlを
入れ25℃にて３分加温したのちジアフオラーゼ
1.5U、アルコールデヒドロゲナーゼ6U酵素混液
50μを入れ、25℃にて500nｍでのレイトアツセ
イまたはエンドポイントアツセイを行なつた。又
同時にブランク値として3α−ハイドロオキシス
テロイドデヒドロゲナーゼの代りに無添加緩衝液
を用い又、検量線用として20μMのゴリココール
酸溶液を用いた。エンドポイントアツセイの場合
には0.1N塩酸１mlにて反応停止した。レイトア
ツセイの場合の検量線は第１図である。また平均
添加回収率は100.0％、再現性、日差変動はおの
おの１−３％、4.7％（変動係数％）であり市販
キツトステログノストー3α（第一化学薬品株式会
社）との相関性は第２図防害物質の影響は第１表
の何くである。 なお、肝疾患時での肝機能検査値との相関性は
第２表である。
【表】
【表】
グリコール酸（20μモル／）の標準液に各成
分を加えた。
分を加えた。
【表】
実施例 ２
血清10μに0.2N NaOH30μを添加し室温３
分放置したのち3α−ハイドロオキシステロイド
デヒドロゲナーゼ10ｍＵ、0.4Mヒドラジンヒド
レート、１ｍＭ EDTAおよび１ｍＭ NADP
を0.2Mトリス塩酸緩衝液（PH9.0）１mlに溶解し
た溶液100μを添加し30℃５分間加温後0.5N
NaOH50μを入れ70℃15分間加温した。その後
２ｍＭ ３−（ｐ−ヨードフエニル）−２−（Ｐ−
ニトロフエニル）−５−フエニル−2Hテトラゾリ
ウムクロライド１ｍＭグルコース−６−フオスフ
エート0.02％牛血清アルブミンを含む0.1Mトリ
ス−塩酸緩衝液（PH8.0）2.0mlを入れ30℃にて３
分間加温し酵素混液ジアフオラーゼ1.5Uおよび
グルコース−６−フオスフエートデヒドロゲナー
ゼ3Uを含む50μを入れ30℃にて実施例１と同様
に行なつた。ブランク法は3α−ハイドロオキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼの代わりに無添加緩
衝液および検量線用に20μMグリココール酸ナト
リウム液を用いた。本法の検量線は原点を通る
100μMまで直線であり平均回収率99.8％および防
害物質の影響および疾患時の他の肝機能検査との
相関は実施例１と同様の結果であつた。 実施例 ３ 血清1μに0.1N KOH1μを入れ室温５分間
放置後実施例１と同様な3α−ハイドロオキシス
テロイドデヒドロゲナーゼ溶液50μを加え37℃
にて２分間放置した、その後1M炭酸緩衝液（PH
10.0）20μを添加し、60℃にて25分間加温した
のち、300ｍＭエタノール、２ｍＭオキザル酢酸
２ｍＭメルカプトエタノール、0.02％牛血清アル
ブミン、0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）２ml
を入れアルコール脱水素酵素（100mg13.5ml）2μ
、リンゴ酸脱水素酵素（10mg１ml）2μを加
え25℃にて10分間放置後100℃にて３分間加熱し
て反応を止め２ｍＭ NAD+および50Uリンゴ酸
脱水素酵素を含む0.5Mヒドラジン塩酸緩衝液
（PH9.5）１mlを入れ30℃にて15分間加温した。そ
の後340nｍでの吸光度またはNADHの螢光測定
を行なつた。検量線は原点を通る直線を示し
50μMの胆汁酸測定が可能であり再現性（変動係
数（％）3.0）も良好であつた。
分放置したのち3α−ハイドロオキシステロイド
デヒドロゲナーゼ10ｍＵ、0.4Mヒドラジンヒド
レート、１ｍＭ EDTAおよび１ｍＭ NADP
を0.2Mトリス塩酸緩衝液（PH9.0）１mlに溶解し
た溶液100μを添加し30℃５分間加温後0.5N
NaOH50μを入れ70℃15分間加温した。その後
２ｍＭ ３−（ｐ−ヨードフエニル）−２−（Ｐ−
ニトロフエニル）−５−フエニル−2Hテトラゾリ
ウムクロライド１ｍＭグルコース−６−フオスフ
エート0.02％牛血清アルブミンを含む0.1Mトリ
ス−塩酸緩衝液（PH8.0）2.0mlを入れ30℃にて３
分間加温し酵素混液ジアフオラーゼ1.5Uおよび
グルコース−６−フオスフエートデヒドロゲナー
ゼ3Uを含む50μを入れ30℃にて実施例１と同様
に行なつた。ブランク法は3α−ハイドロオキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼの代わりに無添加緩
衝液および検量線用に20μMグリココール酸ナト
リウム液を用いた。本法の検量線は原点を通る
100μMまで直線であり平均回収率99.8％および防
害物質の影響および疾患時の他の肝機能検査との
相関は実施例１と同様の結果であつた。 実施例 ３ 血清1μに0.1N KOH1μを入れ室温５分間
放置後実施例１と同様な3α−ハイドロオキシス
テロイドデヒドロゲナーゼ溶液50μを加え37℃
にて２分間放置した、その後1M炭酸緩衝液（PH
10.0）20μを添加し、60℃にて25分間加温した
のち、300ｍＭエタノール、２ｍＭオキザル酢酸
２ｍＭメルカプトエタノール、0.02％牛血清アル
ブミン、0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）２ml
を入れアルコール脱水素酵素（100mg13.5ml）2μ
、リンゴ酸脱水素酵素（10mg１ml）2μを加
え25℃にて10分間放置後100℃にて３分間加熱し
て反応を止め２ｍＭ NAD+および50Uリンゴ酸
脱水素酵素を含む0.5Mヒドラジン塩酸緩衝液
（PH9.5）１mlを入れ30℃にて15分間加温した。そ
の後340nｍでの吸光度またはNADHの螢光測定
を行なつた。検量線は原点を通る直線を示し
50μMの胆汁酸測定が可能であり再現性（変動係
数（％）3.0）も良好であつた。
第１図は本測定方法の検量線を示し、第２図は
市販品による測定方法と本発明による測定方法の
相関性を示す。
市販品による測定方法と本発明による測定方法の
相関性を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 試料中の胆汁酸測定において、 (イ) 試料をアルカリ処理し、 (ロ) 試料中の胆汁酸を、3α−ハイドロオキシス
テロイドデヒドロゲナーゼ、NAD＋または
NADP＋にてケト胆汁酸に酸化し、 胆汁酸の酸化より比例して増大する還元型
NAD（NADH）または還元型NADP
（NADPH）を生成させた後、残存するNAD＋
またはNADP＋をアルカリにて破壊し、 (ハ) 生成したNADHまたはNADPHを補酵素と
する酵素（Ea）ならびにEaの基質(A)を該
NADHまたはNADPHと反応させてNAD＋ま
たはNADP＋および基質(A)の生成物（A′）を
生成せしめ、 (ニ) 生成したNAD＋またはNADP＋を補酵素と
する酵素（Eb）ならびにEbの基質(B)を該NAD
＋またはNADP＋と反応させて、NADHまた
はNADPHおよび生成物（B′）を生成せしめ、 (ホ) 上記反応(ハ)および(ニ)の酵素的サイクリング反
応を繰り返し行わしめ、 (ヘ) 生成した生成物（A′）または（B′）を測定
することよりなる試料中の胆汁酸の測定法。 ２ 特許請求の範囲第１項において、 Ea：リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、 Ａ：オキザロ酢酸、 A′：リンゴ酸 Ｂ：エチルアルコール B′：アセトアルデヒド Eb：アルコールデヒドロゲナーゼ、 よりなる特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ３ 特許請求の範囲第１項において、 Ea：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ Ａ：α−ケトグルタル酸 A′：グルタミン酸 Eb：グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ Ｂ：グルコース−６−リン酸 B′：６−ホスホグルコン酸 よりなる特許請求の範囲第１項記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12721180A JPS5754598A (en) | 1980-09-16 | 1980-09-16 | Measurement of bile acid, measuring reagent, and measuring reagent kit |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12721180A JPS5754598A (en) | 1980-09-16 | 1980-09-16 | Measurement of bile acid, measuring reagent, and measuring reagent kit |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5754598A JPS5754598A (en) | 1982-04-01 |
| JPS6336758B2 true JPS6336758B2 (ja) | 1988-07-21 |
Family
ID=14954466
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12721180A Granted JPS5754598A (en) | 1980-09-16 | 1980-09-16 | Measurement of bile acid, measuring reagent, and measuring reagent kit |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5754598A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0635720B2 (ja) * | 1987-12-11 | 1994-05-11 | 神崎製紙株式会社 | 剥離紙 |
| JP2811319B2 (ja) * | 1989-04-18 | 1998-10-15 | 旭化成工業株式会社 | 胆汁酸の高感度測定法および測定用組成物 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5284796A (en) * | 1976-01-07 | 1977-07-14 | Osuga Toshiaki | Microanalysis of bile acid |
| JPS53136893A (en) * | 1977-05-04 | 1978-11-29 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Measurement of bile acid |
-
1980
- 1980-09-16 JP JP12721180A patent/JPS5754598A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5284796A (en) * | 1976-01-07 | 1977-07-14 | Osuga Toshiaki | Microanalysis of bile acid |
| JPS53136893A (en) * | 1977-05-04 | 1978-11-29 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Measurement of bile acid |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5754598A (en) | 1982-04-01 |
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