JPH0431678B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はデヒドロゲナーゼ及び／又はオキシダ
ーゼの濃度の増加を検出する診断具、及び該診断
具の使用に関する。ヒト，動物又は植物に病理学
的な変化が生じた場合に細胞外液へ移行するサイ
トソルの（cytosolic）デヒドロゲナーゼに関し
て、これら細胞外液中の病理学的閾値を経験的に
決めることができる。病理学的変化を試験する時
は、診断系の物理的化学的パラメータを、デヒド
ロゲナーゼ又はオキシダーゼ活性の病理学的閾値
が診断条件下で指示薬たとえばレドツクス色素の
変色点と一致するように定められるべきである。
細胞膜の性質の病理学的変化の場合には、様々な
ピリジン依存性（pyridine−dependent）デヒド
ロゲナーゼ、たとえば乳酸塩デヒドロゲナーゼ
（LDH）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）、
グリセルアルデヒド・３−フオスフエート・デヒ
ドロゲナーゼ、イソシトレート・デヒドロゲナー
ゼ、グルタメート・デヒドロゲナーゼ、グルコー
ス・デヒドロゲナーゼ及びグルコース・６−フオ
スフエート・デヒドロゲナーゼ、及び／又はフラ
ビン依存性（flavin−dependent）デヒドロゲナ
ーゼ及び／又はフラビン依存性オキシダーゼ、た
とえばコハク酸塩デヒドロゲナーゼ、グリセロー
ル・３−フオスフエート・デヒドロゲナーゼ及び
グルコース・オキシダーゼが血清やその他の細胞
外液へ移行すること、ならびに診断のための病理
学的閾値がそれぞれの場合について各デヒドロゲ
ナーゼ又はオキシダーゼについて見出されること
が当然予想される。 本明細書において、病理学的変化にはたとえば
悪性腫瘍の形成が含まれる。この診断系の物理的
化学的パラメータは、レドツクス色素の変色点を
特定の病理学的閾値に合わせるためにたとえば次
のように設定できる。 ａ 特定のデヒドロゲナーゼの基質を使用する、
たとえばLDHのために乳酸塩。 ｂ 用いられる基質の量と同時に使用されるピリ
ジン・ヌクレオチドの量を調節する。 ｃ pH値、したがつて反応が平衡になる位置を、
必要ならば緩衝系によつて調節する。 ｄ 診断条件下でピリジン・ヌクレオチド系の酸
化還元電位よりも大きい酸化還元電位を有する
レドツクス色素（たとえば無色から有色へ変化
するLeuco色素）を選ぶ。 ｅ ピリジン・ヌクレオチド系の酸化還元電位と
選択したレドツクス色素の酸化還元電位の間の
酸化還元電位を有する電子供与体を選択する。 ｆ デヒドロゲナーゼ反応の平衡がまだ達成され
ていないかぎり、反応時間が長い程還元されて
いないかぎり、反応時間が長い程還元されたピ
リジン・ヌクレオチドの濃度が高くなる。した
がつてレドツクス色素の変色閾値ならびに診断
系の検出感度は、反応の持続時間を介して設定
することができる。 ｇ 診断系には種々の支持体を選択できる。 西ドイツ特許明細書第2443741号はLDHの同位
酵素４及び５を一緒に測定する方法であつて、乳
酸塩とニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチ
ド（NAD）の混合物を検査すべき体液と接触さ
せる方法を開示する。LDHの量が多いと、それ
は反応式に従つて乳酸塩とジヌクレオチドとの反
応を触媒し対応するピルビン酸塩と還元されたニ
コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド
（NADH）を生ずる。 乳酸塩＋NAD LD ―――――→ ←――――― ピルビン酸塩＋NADH＋Ｈ LDHはヒトの細胞内に同位酵素１，２，３，
４及び５の形で存在する。ある特定の病理学的変
化の場合、LDH量の増加が起こる。たとえば女
性の生殖器における悪性腫瘍の場合同位酵素４と
５が増加する。 前記刊行物によると乳酸塩とNADの間の反応
はpH6〜6.5で行なわれなければならない。この
目的のために、体液及び／又は乳酸塩及びNAD
を含む試薬がこのPH領域に調節され、必要ならば
緩衝系が用いられる。体液たとえば膣分泌物が相
対的に低いPHたとえばPH４である場合には、前記
試薬を6.5を越えるPHに調節して、試験反応にお
いて６〜6.5の範囲の所要のPHが得られるように
することができる。 上の反応色において左辺から右辺への反応は二
次反応によつて視覚される。この目的のために、
ニトロブルーテトラゾリウム・クロリド（NBT）
及び適当であればフエナジン・メトサルフエー
ト、（Ｎ−メチル−フエナゾニウム・メチルサル
フエート，５−メチルフエナゾニウム・メチルサ
ルフエート、PMS）も、水素供与体又は電子供
与体として前記試薬に加える。反応式に従つて生
成したNADHがNBTによつて水素供与体又は電
子供与体の存在下でNADに酸化され、NBTは青
色色素ニトロブル−ホルマザン〔４，4′−（３，
3′−ジメトキシ−ビフエニレニル）−ビス−2N−
（2N′−ｐ−ニトロフエニル−ｃ−フエニル−ホ
ルマザン）〕に添加され、その結果LDH又はそれ
の同位酵素の酵素活性及び存在が視覚化される。 女性の膣分泌物を検査するのに公知の方法が使
用されてきた。この分泌物と診断試薬との間の反
応持続時間は15〜30分が好ましかつた。女性の生
殖器部における病理学的変化、たとえば子宮頸部
の癌（carcinoma colli uteri）子宮体部の癌種
（carcinoma corporis）及び上皮内癌
（carcinoma in situ）が検出された。 診断結果の平均30％のオーダーである、膣頸癌
の誤つた陰性診断は、他の公知の方法例えば細胞
学（cytology）や膣鏡検査（colposcopy）によ
る例えば女子の生殖器癌についてのスクリーニン
グに帰着する。 英国特許の明細書第893301号には、血清酵素用
の発色試験が記載されている。乳酸の塩、ジホス
ホピリジン・ヌクレオチド（ニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチド）、ジアフオラーゼ及び
２，６−ジクロロインドフエノールを含有する混
合物が生物学的液体中の乳酸塩デヒドロゲナーゼ
の測定用に記載されている。この混合物のPHは５
〜９の間になければならない。 しかし、この刊行物によると、0.7未満のPHは
本気で考慮されていないことは明白であり、好ま
しいものとして示された範囲はPH７〜８であり、
具体的な実施例はPH7.4で行なわれている。該刊
行物に記載された別の点は、この試験はPH７の緩
衝液で注意深く緩衝化された溶液中で行なわれる
ことである。最後に、実際問題この試験はPH６で
は行なうことができないことが判明した。LDH
の測定に関連してテトラゾリウム塩を使用するこ
とはこの刊行物には述べられていない。 さらにこん公知の試験は血清酵素の測定を目的
として全く一般的に計画されたもので、もつぱら
病理学的に増加したデヒドロゲナーゼ濃度を検出
することを目的としていない。したがつてこの公
知の試験は非常に低い酵素濃度で応答すべきもの
であつて、デヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼの
正常な増加と病的な増加を区別することはできな
い。 本発明は、ヒト，動物又は植物の体液あるいは
分泌物中の病理学的なデヒドロゲナーゼ濃度の増
加を検出する診断具を提供するという目的に基づ
いている。この診断具は高い診断精度を保障し、
特に悪性腫瘍の診断に適する必要がある。さらに
診断はできるだけ短時間で行なうことができなけ
ればならない。 本発明によると、この目的は、レドツクス色素
を結合する支持体と、特定のデヒドロゲナーゼに
対応する基質の物質混合物であつて酸性領域のPH
に調節されたものと、水素供与体化合物と、少な
くとも一種のレドツクス色素からなる診断具によ
つて達成される。この診断具は、支持体が極性基
を有することと、特定のデヒドロゲナーゼのもつ
ぱら病理学的な濃度の増加を検出する物質混合物
がPH5.0未満に調節されていることに特徴がある。 この診断具は、細胞外液中のデヒドロゲナーゼ
の濃度の増加に伴う病理学的変化を診断するのに
特に適する。このような濃度の変化は悪性腫瘍の
初期の段階においてさえ起こり、この段階では治
療が成功する見込みがなお一層特に大きい。この
診断具は全く別の器官における悪性腫瘍を知らせ
る。とりわけ女性の典型的な器官，たとえば女性
の生殖器部における癌を検出できる。細菌、寄生
虫及び菌類の感染もこの診断によつて検出するこ
とができる。 この診断具の特別の利点は診断の予後値が高い
ことである。たとえば、生殖器部に組織的に定着
した癌を有する婦人についての一連の実験におい
て、全診断のほんの10％未満しか段階１〜４につ
いて誤つた陰性診断をしないことがわかつた。 また、この診断具を体内に使用する時、たとえ
ば膣に入れるタンポンとして使用する時、非常に
耐性があり粘膜に対して全く刺激を与えないとい
う利点がある。このことは特に驚くべきことであ
る、というのはあらゆる予想に反して、生成する
色素の粘膜への移行が全く検出されないからであ
る。 この色素生成に関して、具体的な検査（これに
はたとえば組織部分も含まれている）を行なつた
が、意外なことに、色素はそれが生成する間及び
生成後に支持体材料上に残存し、そのため検査さ
れる患者の体内及び体の上で有害な二次反応を引
き起こさないことがわかつた。 これらの利点により本発明の診断具は保健施策
の望ましいスクリーニングテストに特に有用とな
つている。というのは、診断上の最大限の信頼性
だけでなく、診断法の有害な二次反応からの最大
限の安全性が必要であり、かつその方法はできる
だけ簡単でなければならないからである。 この診断具の特筆すべき特性は、極性基を有す
る支持体と支持体上の物質混合物の低いPHとの特
別の組み合わせに帰着されるべきものである。こ
の組み合わせにより病理学的諸ケースを高い正確
さで記録する区別的な診断が可能になることは驚
くべきことである。 この診断具を働かせる上で支持体の大きな重要
性は、仮に支持体を全く使用しないならば、物質
混合物とデヒドロゲナーゼ濃度が病的に増加する
溶液との発色反応が上述の低いPH領域においては
起こらない、という事実から明らかである。 診断に用いられる液はヒト，動物又は植物の非
常に様々な部分に由来することができる。たとえ
ば、膣分泌物は女性の生殖器官の領域における悪
性腫瘍を試験するのに用いることができる。しか
しこの診断具は、たとえば血清，胃袋や腸液、胆
汁、気管支、前立腺及び尿道の分泌物、ならびに
つばにも使用できる。 検出すべきデヒドロゲナーゼがLDHである場
合には、乳酸ナトリウムを使用するのが好まし
い。しかしその他の対応する化合物たとえば乳酸
カリウム又は乳酸カルシウムも使用できる。 水素供与体化合物はレドツクス色素たとえばテ
トラゾリウム塩の還元を助ける物質である。この
ような水素供与体化合物の例には、NAD，ニコ
チンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・フオス
フエート（NADP）、フラビン・アデニン・ジヌ
クレオチド（FAD）及びフラビン・モノヌクレ
オチド（FMH）がある。しかし、当業者には周
知の化合物であつて、前述の反応式によつて示さ
れた乳酸塩のピルビン酸塩への添加において
NADに対応する還元状態へ転化されることがで
きる他の化合物をも使用できる。 支持体上の物質混合物は、検査する液体中の病
理学的閾値を超えるデヒドロゲナーゼ濃度を視覚
化するために、少なくとも一種のレドツクス指示
薬、好ましくはレドツクス色素を含有する。 適切な色素成分には、たとえばテトラゾリウム
塩、ベンジジン色素、インドフエノール類たとえ
ば２，６−ジクロロインドフエノール又はジブロ
モインドフエノール、及びABTSがある。特に
適切なテトラゾリウム塩は次のとおりである。
NBT，TNBT，MTT，INT，BT，TV，TT，
NT，トリニトロTT，ジニトロTT，テトラニト
ロNT，テトラニトロBT，ニトロBT−メチル
（メチル基で置換されたメトキシ基），ジニトロ
TV，３−（４−ビフエニリル）−２，５−ジ−ｐ
−ニトロフエニル−テトラゾリウム・クロリド，
ニトロNT，テトラニトロBT1/2（対称的に分割
されたテトラニトロBT），ニトロBT，３−（３，
3′−ジメトキシ−４−ビフエニリレン）−２−ｐ
−ニトロフエニル−５−フエニルテトラゾリウ
ム・クロリド，ニトロTV，ニトロTT，３−ｐ
−インドフエニル−５−ニトロフエニル−２−フ
エニル−テトラゾリウム・クロリド，５，5′−ジ
ニトロNT，５，5′−ジニトロBT，５−ニトロ
TV，５−ニトロTT，及び２−（３−メトキシ−
４−フエニル）−５−ｐ−ニトロフエニル−３−
フエニルテトラゾリウム・クロリド。 上記リストにおいて： NBT＝３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，
4′−ビフエニレン）−ビス−（２−ｐ−ニトロフエ
ニル−５−フエニル−2H−テトラゾリウム・ク
ロリド TNBT＝３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，
4′−ビスフエニレン）−ビス−（２，５−ｐ−ニト
ロフエニル−2H−テトラゾリウム・クロリド） MTT＝３−（４，５−ジメチル−２−チアゾ
リル）２，５−ジフエニル−2H−テトラゾリウ
ム・ブロミド INT＝２−ｐ−ヨードフエニル−３−ｐ−ニ
トロフエニル−５−フエニル−2H−テトラゾリ
ウム・クロリド BT＝３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−
ビフエニレン）−ビス−（２，５−ジフエニル−
2H−テトラゾリウム・クロリド） TV＝3α−ナフチル−２，５−ジフエニル−
2H−テトラゾリウム・クロリド TT＝２，３，５−トリフエニル−2H−テト
ラゾリウム・クロリド NT＝３，3′−（４，4′−ビフエニレン）−ビス−
（２，５−ジフエニル−2H−テトラゾリウム・ク
ロリド） ABTS＝２，2′−アジノ−ビス（３，3′−エチ
ル−ベンゾチアゾリン−６，6′−スルホン酸） 上記のテトラゾリウム塩を使用すると、該診断
具の変色を、検出すべきデヒドロゲナーゼの病理
学的閾値に調節することが特に容易である。した
がつて、テトラゾリウム塩、特にNBTはレドツ
クス色素として好ましい。 該診断具の支持体上の物質混合物は、5.0未満
のPH値、好ましくは3.0以上5.0未満、特には4.5PH
値を有する。 該診断具を使用して、例えばLDHによつて触
媒された反応が上記の低PHでなお進行することは
意外なことである。というのは、前述の反応式か
らわかるように、乳酸塩のプルビン酸塩への転化
においては水素イオンが放出されるからである。
即ち、水素イオン濃度がPH6.0を越えてさらに増
加した場合には、西ドイツ特許明細書第2443741
号で知られるように、前述の反応の進行はさらに
緩慢になるかもしくは全く進行しないか、又は上
記反応式で示された平衡が左へ移行することが予
想されたからである。しかしこの予想に反して、
反応は視覚的に緩慢化することなく望ましく進行
し、さらに前述のように本発明による診断具の診
断精度は公知方法に比較して改良されてさえいる
のである。 物質混合物の望ましいPH値は、通常のように、
例えば塩酸及び／又はリン酸を添加することによ
り設定できる。 本発明の好ましい実施態様によると、物質混合
物はこのPH値を設定し及び／又は維持する緩衝系
を含有する。該診断具を使用すると、たとえ検査
される液がこの範囲からずれているPHであつて
も、その反応触媒は好ましいPH値の範囲に保たれ
る。 緩衝系は、トリエタノールアミン塩酸塩の形
態、又はトリエタノールアミンと塩化水素の非当
量的混合物の形態にあるのが好ましい。塩化水素
は、例えば塩酸の状態で使用される。 しかし、その他の緩衝系例えばリン酸塩緩衝液
も、望ましくない副反応をもたらさない限り使用
できる。適切な緩衝系は当業者には知られてい
る。 本発明診断具の有利な改良により、物質混合物
は、水素供与体または電子供与体として働く化合
物をさらに含んでいる。この化合物は、例えばテ
トラゾリウム塩の対応する着色ホルマザンへの還
元を触媒する。このために、水素供与体又は電子
供与体の酸化還元電位は、本発明にしたがつて用
いられるレドツクス系（例、NAD／NADH系）
の酸化還元電位とレドツクス色素（例、テトラゾ
リウム塩）の酸化還元電位との間になければなら
ない。 このような作用をもつ化合物の具体例が、フエ
ナジン・メトサルフエート（PMS）、ジアホラー
ゼ、メルドーラ・ブルー（meldola's blue）及び
メナジオンである。その他の適当な化合物は当業
者に公知である。 次の反応式は、レドツクス系NAD／NADH、
電子供与体としてのPMS、そしてテトラゾリウ
ム塩NBTを使用した場合に、診断具を使用した
ときに起る反応を例示する。 セルロース繊維のタンポン状の支持体が、女性
の生殖器部の癌検出用診断具に特に適することが
わつた。使用するときはタンポンが膣内へ挿入さ
れ、タンポン上の物質混合物と膣分泌物との間の
反応が可能になる。しかし、この試験を体外で、
例えば膣分泌物の試料を体外において物質混合物
が含浸されているタンポンと接触させることによ
り、行うこともできる。 一方、原則として、他の形態の支持体、例えば
小棒又はフイルムを使用することもできる。 支持体の材料は天然及び／または合成のもので
よく、例えば繊維構造、粒状構造又は別種の構造
でもよい。いずれの場合でも、支持体は極性基を
有する。 診断具の支持体が例えばタンポンである場合、
診断具は体内診断だけでなく体外診断にも適す
る。後者の場合、被検液即ち検査する身体分泌物
は単にタンポンの前述の物質混合物を含んでいる
部分と接触させられるだけである。 本発明は、ヒト，動物及び植物における病理学
的変化、特に悪性疾病の早期診断用診断具の使用
にも関する。 この診断具は、ヒト，動物又は植物の細胞外液
中におけるデヒドロゲナーゼ濃度の病理学的な増
加を体内において又は体外において検出するのに
使用するのが好ましい。そのとき、支持体上の物
質混合物は被検液と反応させられるが、ただし、
物質混合物の該液との反応は多くとも10分間行わ
れる。最良の結果は、５〜７分である場合に得ら
れる。 このことは、診断具の支持体が、タンポン、例
えば検査される婦人の膣内へ挿入されるタンポン
である場合に特に当てはまる。このとき、タンポ
ンの膣内滞留時間が上述の時間に相当する。滞留
時間が10分を超えると、検査される婦人に病理学
的変化が存在しない場合でもタンポン上で発色反
応が起ることがある。したがつて、滞留時間が長
過ぎないように選ぶことが重要である。 本発明において最良とされる５〜７分の滞留時
間は、西ドイツ特許明細書第2443741号により好
ましいとされる15〜30分という滞留時間よりかな
り短い。このことは、試験を実際に行う上での簡
単さにとり特に重要である。 このことは、タンポンと膣内粘膜との間の接触
をより親密に行わせるために、タンポン滞留の間
患者が歩き回る場合には特に有利であることもわ
かつた。 デヒドロゲナーゼ濃度の病理学的増加を検査さ
れる液は実に様々なPH値を持ち得ることもわかつ
た。例えば、3.9から７を超えるPH値が生殖器部
に病理学的変化を有する婦人の膣分泌物について
測定された。驚くべきことに、本発明の診断具は
このような反応条件に容易に調整され得、しかも
診断の正確さを失わない。例えば、被検液がPH５
以上である場合、診断具に含まれている物質混合
物中の緩衝系であつて、比較的低PHに調節されて
いるものによつて、前記PHは診断の間に反応に適
するように低下させられる。 次の実施例により本発明を説明する。 実施例 様々な病院において、生殖器部に癌を有するこ
とが診断により確認されている486人の女子につ
いて支持体としてタンポンを有する診断具の精度
を、一連の希釈度で調べた。次の表１には、種々
の年令群中の各診断グループの分布が絶対値と百
分率で示されている。“N.D.”（no date）の欄
は、調査を行つた病院がその年令分布についてデ
ータを提供しなかつた場合である。

【表】

【表】 ％＝絶対数に対応するパーセント

【表】 各診断グループの説明： 子宮頸癌：これには頸部（collum，cervix）
及び体部（portio）の癌についての診断上の用語
が含まれる。 他の部位における癌及び肉腫：尿道癌，胸部肉
腫，悪性奇形腫，子宮肉腫，リンパ肉腫，線維肉
腫，砂腫，悪性黒色腫，胃癌，Ｓ字結腸癌，直腸
癌，膀胱癌及び肺癌。これら新生物
（neoplasms）を研究に主に含ませた、というこ
とはこれらは生殖器を侵襲的に又は転位によつて
侵すからである。 良性腫瘍：卵巣線維腫，卵巣のう胞腫，副卵巣
のう腫，子宮筋腫症，ポリープ体，腹部のう胞，
及び上皮様平滑筋腫。 炎症：卵管炎，卵管卵巣膿瘍，子宮頸炎，膣炎
（colpitis）、膣炎（vaginitis），外陰炎，及び慢性
腎盂腎症。 残る診断グループ：下腹部血腫，閉経期出血
（診断法の表示がなく，病理学的結果がない）こ
の調査においては、患者の膣のPH値も測定され
た。結果を次表に要約する。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒト、動物又は植物の体液中の特定のデヒド
   ロゲナーゼ及び／又はオキシダーゼの濃度増加を
   検出するもので、 検出する特定のデヒドロゲナーゼ及び／又はオ
   キシダーゼがピリジン依存性デヒドロゲナーゼ、
   フラビン依存性デヒドロゲナーゼ、フラビン依存
   性オキシダーゼから選ばれてなる少なくとも１種
   の特定のデヒドロゲナーゼ及び／又はオキシダー
   ゼであり、 レドツクス色素を結合する極性基含有支持体
   と、 前記特定のデヒドロゲナーゼに対応する基質の
   物質混合物であつてpHが３≦pH＜５に調節され
   たものと、 水素供与体化合物と、 少なくとも１種のレドツクス色素と、 からなることを特徴とする診断具。 ２ 前記検出する特定のデヒドロゲナーゼ及び／
   又はオキシダーゼが乳酸塩デヒドロゲナーゼ、ア
   ルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒ
   ド・３−フオスフエート・デヒドロゲナーゼ、イ
   ソシトレート・デヒドロゲナーゼ、グルタメー
   ト・デヒドロゲナーゼ、グルコース・デヒドロゲ
   ナーゼ、グルコース・６−フオスフエート・デヒ
   ドロゲナーゼ、コハク酸塩デヒドロゲナーゼ、グ
   リセロール・３−フオスフエート・デヒドロゲナ
   ーゼ、グルコース・オキシダーゼから選ばれてな
   る少なくとも１種の検出する特定のデヒドロゲナ
   ーゼ及び／又はオキシダーゼであることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載の診断具。 ３ 該診断具に於いて、物質混合物が、pHを設
   定し及び／又は維持する緩衝系を含有することを
   特徴とする特許請求の範囲第１項あるいは第２項
   に記載の診断具。 ４ 該診断具に於いて、該緩衝系がトリエタノー
   ルアミン塩酸塩の状態であるか、またはトリエタ
   ノールアミンと塩化水素の非当量的混合物の状態
   であることを特徴とする特許請求の範囲第３項に
   記載の診断具。 ５ 該診断具に於いて、物質混合物が、水素供与
   体又は電子供与体として作用する化合物を更に含
   んでいることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   から第４項のいずれかに記載の診断具。 ６ 該診断具に於いて、支持体がセルロース繊維
   を含むタンポンからなることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の診
   断具。