JPH01171498A - Ｄ−乳酸の高感度測定量法 - Google Patents
Ｄ−乳酸の高感度測定量法Info
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- JPH01171498A JPH01171498A JP33138087A JP33138087A JPH01171498A JP H01171498 A JPH01171498 A JP H01171498A JP 33138087 A JP33138087 A JP 33138087A JP 33138087 A JP33138087 A JP 33138087A JP H01171498 A JPH01171498 A JP H01171498A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、体液中に微量に存在するＤ−乳酸の高感度定
量法に関する。
量法に関する。
本発明者らは体液即ち血液、尿等でヒトの健康時に微量
に存在するＤ−乳酸は糖尿病、或いはリンパ腫等の疾病
時において著しく増加することを発見した。従って本発
明のＤ−乳酸の高感度定量法はこれら疾病の診断を目的
とする臨床検査の分野で有用である。
に存在するＤ−乳酸は糖尿病、或いはリンパ腫等の疾病
時において著しく増加することを発見した。従って本発
明のＤ−乳酸の高感度定量法はこれら疾病の診断を目的
とする臨床検査の分野で有用である。
これまでにも体液中のＤ−乳酸をＤ−乳酸脱水素酵素（
以下Ｄ−ＬＤＨという。）を用いて測定する試みがなさ
れており〔例えばＭｅｔｈｏｄｓ １ｎＥｎｚ）＋＋＋
ｏｌｏｇｙ ８９巻、 ３５〜４０ （１９８２）
］ 、その反応式は以下に示される。
以下Ｄ−ＬＤＨという。）を用いて測定する試みがなさ
れており〔例えばＭｅｔｈｏｄｓ １ｎＥｎｚ）＋＋＋
ｏｌｏｇｙ ８９巻、 ３５〜４０ （１９８２）
］ 、その反応式は以下に示される。
しかしながら、従来の測定法においてはその反応式にお
いて生成したＮＡＤＨを紫外部（例えば波長３４０ｎｍ
）にて直接測定するか又はＮＡＤＨを種々の発色剤（例
えばホルマザン色素）にて発色させ可視部にて測定する
ことが試みられてきた。
いて生成したＮＡＤＨを紫外部（例えば波長３４０ｎｍ
）にて直接測定するか又はＮＡＤＨを種々の発色剤（例
えばホルマザン色素）にて発色させ可視部にて測定する
ことが試みられてきた。
しかしながら、このような測定法による体液中のＤ−乳
酸を定量する方法では感度が低すぎるため、極（微量の
Ｄ−乳酸の定量を行うためには体液の測定試料を多くせ
ねばならず、これでは、極少量の試料を用い、短時間に
測定することを要する臨床検査の分野において列置使用
することが不可能であった。
酸を定量する方法では感度が低すぎるため、極（微量の
Ｄ−乳酸の定量を行うためには体液の測定試料を多くせ
ねばならず、これでは、極少量の試料を用い、短時間に
測定することを要する臨床検査の分野において列置使用
することが不可能であった。
そこで本発明者らは、微量のＤ−乳酸を感度よ（定量で
きる方法を見出すべく鋭意検討した結果、生成するピル
ビン酸に蛍光化合物をカップリングさせ、カップリング
化合物の蛍光強度を定量することによりＤ−乳酸を感度
よく定量できる方法を見出したのである。これにより健
常人の体液中に極微量存在するＤ−乳酸を精度よく測定
することが可能になり、各種疾病により体液中のＤ−乳
酸量が増加した場合健常人の値と比較することにより診
断することが可能となった。即ち本発明は、体液にＮＡ
Ｄ存在下、Ｄ−ＬＤＨを作用させ、ピルビン酸とＮＡＤ
Ｈを生成せしめ、次いで生成したピルビン酸と蛍光化合
物とを反応させることによってカップリング化合物を形
成せしめた後、該カップリング化合物の蛍光強度を測定
することにより、体液中のＤ−乳酸量を求めることを特
徴とするところのＤ−乳酸の高感度定量法である。この
場合において、さらに本発明者らは、反応系にジアホラ
ーゼとチオクタミドとを存在せしめ、ＮＡＤＨを酸化さ
せることによってＤ−ＬＤ）（によるＤ−乳酸からピル
ビン酸生成反応即ち逆反応を阻止し、ピルビン酸からＤ
−乳酸を生成する反応を促進せしめたのである。
きる方法を見出すべく鋭意検討した結果、生成するピル
ビン酸に蛍光化合物をカップリングさせ、カップリング
化合物の蛍光強度を定量することによりＤ−乳酸を感度
よく定量できる方法を見出したのである。これにより健
常人の体液中に極微量存在するＤ−乳酸を精度よく測定
することが可能になり、各種疾病により体液中のＤ−乳
酸量が増加した場合健常人の値と比較することにより診
断することが可能となった。即ち本発明は、体液にＮＡ
Ｄ存在下、Ｄ−ＬＤＨを作用させ、ピルビン酸とＮＡＤ
Ｈを生成せしめ、次いで生成したピルビン酸と蛍光化合
物とを反応させることによってカップリング化合物を形
成せしめた後、該カップリング化合物の蛍光強度を測定
することにより、体液中のＤ−乳酸量を求めることを特
徴とするところのＤ−乳酸の高感度定量法である。この
場合において、さらに本発明者らは、反応系にジアホラ
ーゼとチオクタミドとを存在せしめ、ＮＡＤＨを酸化さ
せることによってＤ−ＬＤ）（によるＤ−乳酸からピル
ビン酸生成反応即ち逆反応を阻止し、ピルビン酸からＤ
−乳酸を生成する反応を促進せしめたのである。
本発明において使用する体液には血液、尿等があり、血
液は通常血清、血漿等に分画したものが用いられる。又
本発明において使用するＤ−ＬＤＨは微生物起源のもの
であれ動物起源のものであれ、いずれでもよいがＬ−乳
酸に作用せずＤ−乳酸のみに特異的に作用するものが望
ましい。具体的にはスタフィロコッカス属菌から得られ
るＤ−ＬＤＨ（例えば天野製薬製ＬＤＩ（” ＡＭＡＮ
Ｏｏｏ）等が挙げられる。
液は通常血清、血漿等に分画したものが用いられる。又
本発明において使用するＤ−ＬＤＨは微生物起源のもの
であれ動物起源のものであれ、いずれでもよいがＬ−乳
酸に作用せずＤ−乳酸のみに特異的に作用するものが望
ましい。具体的にはスタフィロコッカス属菌から得られ
るＤ−ＬＤＨ（例えば天野製薬製ＬＤＩ（” ＡＭＡＮ
Ｏｏｏ）等が挙げられる。
本発明のピルビン酸と蛍光化合物とのカップリング反応
は塩酸酸性化で行われ、形成されたカップリング化合物
の蛍光強度を測定することによって体液中のＤ−乳酸量
が求められる。蛍光化合物として好ましいのは０−フェ
ニレンジアミン。
は塩酸酸性化で行われ、形成されたカップリング化合物
の蛍光強度を測定することによって体液中のＤ−乳酸量
が求められる。蛍光化合物として好ましいのは０−フェ
ニレンジアミン。
４．５−ジメトキシ−１，２−ジアミノベンゼン等であ
り、形成されるカップリング化合物としては２−メチル
キサール、ジメトキシ２−メチルキサール等が挙げられ
る。
り、形成されるカップリング化合物としては２−メチル
キサール、ジメトキシ２−メチルキサール等が挙げられ
る。
以下に本発明を実施例にて具体的に説明する。
試験例１ 人尿中のＤ−乳酸量とＤ−乳酸の添加回収実
験 正常な人尿０．１５ａｆを２倍量の０．５Ｍ過塩素酸で
除蛋白し、上清をＩＭ ＫＯＨにて中和した試料０．５
ｄに１５ｕｍｏ１．３Ｏｎｍｏｌ、 ６０ｕｍｏ１．９
０ｕｍｏｌ量のＤ−乳酸を添加したもの及びＤ−乳酸無
添加のものを検体とした。
験 正常な人尿０．１５ａｆを２倍量の０．５Ｍ過塩素酸で
除蛋白し、上清をＩＭ ＫＯＨにて中和した試料０．５
ｄに１５ｕｍｏ１．３Ｏｎｍｏｌ、 ６０ｕｍｏ１．９
０ｕｍｏｌ量のＤ−乳酸を添加したもの及びＤ−乳酸無
添加のものを検体とした。
各検体に２１ｓ＋Ｍ硫酸ヒドラジン５０ｕ ｆｆｉ、、
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）０．２ｄを加え
、３７℃、３０分反応させ、内因性ピルビン酸を除去し
、次いで１０ｍＭＮＡＤ ５０ｕ ｊ！ 、 １００
ｕ／ｒｒｄｌのＤ−ＬＤＨ５０μｍ 、 ２６ｍＭ Ｄ
Ｌ−６８チオクタミド１００μｌ、 ２５ｕ／ｍｌのジ
アホラーゼ５０μｌにて３７℃、２時間反応を行い、生
じたピルビン酸をＩＭ ＩＣＩ Ｏ，３ａｆ、 ７０ｍ
Ｍ ｏ−フェニレンジアミンと５０°Ｃ１１時間反応さ
せることにより２−メチルキサノールとし、このものを
ＨＰＬＣにて定量することにより検体中のＤ−乳酸量を
求めた。
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）０．２ｄを加え
、３７℃、３０分反応させ、内因性ピルビン酸を除去し
、次いで１０ｍＭＮＡＤ ５０ｕ ｊ！ 、 １００
ｕ／ｒｒｄｌのＤ−ＬＤＨ５０μｍ 、 ２６ｍＭ Ｄ
Ｌ−６８チオクタミド１００μｌ、 ２５ｕ／ｍｌのジ
アホラーゼ５０μｌにて３７℃、２時間反応を行い、生
じたピルビン酸をＩＭ ＩＣＩ Ｏ，３ａｆ、 ７０ｍ
Ｍ ｏ−フェニレンジアミンと５０°Ｃ１１時間反応さ
せることにより２−メチルキサノールとし、このものを
ＨＰＬＣにて定量することにより検体中のＤ−乳酸量を
求めた。
その結果は表１に示される。
表１
表１より明らかのように人尿中に含まれるＤ−乳酸量は
２９．９ｎｍｏ１１０．５ Ｉｌｌであり、又本発明の
測定法によるＤ−乳酸の人尿への添加回収は良好であっ
た。
２９．９ｎｍｏ１１０．５ Ｉｌｌであり、又本発明の
測定法によるＤ−乳酸の人尿への添加回収は良好であっ
た。
実施例１ 血清中のＤ−乳酸の定量性
健常人４人の食前１食後における血液を採取し、その各
血清０．１５ｄを２倍量の０．５Ｍ過塩素酸で除蛋白し
、上清をＩＭ ＫＯＨにて中和した試料０．５ｄに２１
ｍＭ硫酸ヒドラジン５０μｊｉ！、 ０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０） ０．２ ｄを加え３７°Ｃ９３
０分反応させて内因性ピルビン酸を除去し、次に１０−
Ｍ ＮＡｏ ５０μ２゜１００ｕ／ｍｌ！のＤ−ＬＤＨ
５０ｕＩｔ 、 ２６ｍ？Ｉ ＤＬ−６，８チオクタミ
ド１００μＩｔ 、 ２５ｕ／ｌｌ１１のジアホラーゼ
５０μｌを添加し、３７°Ｃ，２時間反応を行い生じた
ピルビン酸をＩＭ ＨＣＩ ０．３ｍｌ！、 ７０ｍＭ
ｏ−フェニレンジアミンとサノールとし、このものを
ＨＰＬＣにて定量することにより各血清中のＤ−乳酸量
を求めた。ＨＰＬＣの分析条件は次の通りである。
血清０．１５ｄを２倍量の０．５Ｍ過塩素酸で除蛋白し
、上清をＩＭ ＫＯＨにて中和した試料０．５ｄに２１
ｍＭ硫酸ヒドラジン５０μｊｉ！、 ０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０） ０．２ ｄを加え３７°Ｃ９３
０分反応させて内因性ピルビン酸を除去し、次に１０−
Ｍ ＮＡｏ ５０μ２゜１００ｕ／ｍｌ！のＤ−ＬＤＨ
５０ｕＩｔ 、 ２６ｍ？Ｉ ＤＬ−６，８チオクタミ
ド１００μＩｔ 、 ２５ｕ／ｌｌ１１のジアホラーゼ
５０μｌを添加し、３７°Ｃ，２時間反応を行い生じた
ピルビン酸をＩＭ ＨＣＩ ０．３ｍｌ！、 ７０ｍＭ
ｏ−フェニレンジアミンとサノールとし、このものを
ＨＰＬＣにて定量することにより各血清中のＤ−乳酸量
を求めた。ＨＰＬＣの分析条件は次の通りである。
移動相 １０ｍＭ ＫＨｚＰＯ４（ｐＨ２，１）（２
０％ＣＨ２ＣＮを含む） 流速 Ｉ Ｊ１１１１／１１２１！ カラム ＵＮＩＳＩＬ−００５−ＱＴ Ｓケ温度 ４
１°Ｃ 波長 λ−３４１ｎｓ＋ λ−４１６ｒ＋ｍその結果
は表２に示される。
０％ＣＨ２ＣＮを含む） 流速 Ｉ Ｊ１１１１／１１２１！ カラム ＵＮＩＳＩＬ−００５−ＱＴ Ｓケ温度 ４
１°Ｃ 波長 λ−３４１ｎｓ＋ λ−４１６ｒ＋ｍその結果
は表２に示される。
（以下余白）
表 ２
Ｄ−乳酸量（ｎｍｏｌ／ａｄり
試料 年令 食 前 食 後１ ２６
１２．７ ４２．５２ ３３
３６．９ Ｂ２．１３ ２３ ２
９．３ ７１．３４ ２４
３３．３ ６８．５表２より明らかのように
食後に血清中のＤ−乳酸量が増加することが分かる。
１２．７ ４２．５２ ３３
３６．９ Ｂ２．１３ ２３ ２
９．３ ７１．３４ ２４
３３．３ ６８．５表２より明らかのように
食後に血清中のＤ−乳酸量が増加することが分かる。
実施例２
ラットにストレプトシトシンを腹腔内投与し、普通食で
１７日間飼育し慢性糖尿病にした後、採血を行い血清を
分取したのち実施例１の方法に準じてＤ−乳酸の定量を
行った。
１７日間飼育し慢性糖尿病にした後、採血を行い血清を
分取したのち実施例１の方法に準じてＤ−乳酸の定量を
行った。
その結果を表３に示す。
表 ３
正常ラット 糖尿ラット
表３から明らかのように糖尿ラットでＤ−乳酸の値の高
い投与が得られた。
い投与が得られた。
本発明のＤ−乳酸の高感度定量法は、体液中に微量に存
在するＤ−乳酸を正確に定量することができる。それ故
、本発明の方法は糖尿病、リンパ腫等の疾病の診断を目
的とする臨床検査の分野に使用することが可能である。
在するＤ−乳酸を正確に定量することができる。それ故
、本発明の方法は糖尿病、リンパ腫等の疾病の診断を目
的とする臨床検査の分野に使用することが可能である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 体液にＮＡＤ存在下、Ｄ−乳酸脱水素酵素を作用さ
せ、ピルビン酸とＮＡＤＨを生成せしめ、次いでピルビ
ン酸又はＮＡＤＨと蛍光化合物とを反応させることによ
って得られるカップリング化合物の蛍光強度を測定する
ことにより体液中のＤ−乳酸量を求めることを特徴とす
るＤ−乳酸の高感度定量法。 ２ 反応系にジアホラーゼとチオクタミドとを存在せし
め、ＮＡＤＨを酸化させることによってＤ−乳酸からピ
ルビン酸の生成を促進せしめることを特徴とする特許請
求の範囲第１項記載のＤ−乳酸の高感度定量法。 ３ 蛍光化合物がｏ−フェニレンジアミン又は４，５−
ジメトシキ１，２−ジアミノベンゼンであるところの特
許請求の範囲第１項記載のＤ−乳酸の高感度定量法。 ４ カップリング化合物が２−メチルキサノール又はジ
メトシキ２−メチルキサノールであるところの特許請求
の範囲第１項記載のＤ−乳酸の高感度定量法。 ５ 体液中のＤ−乳酸を特許請求の範囲第１項記載の方
法によって高感度に測定するための混合系を含むところ
の対外診断薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33138087A JP2739473B2 (ja) | 1987-12-26 | 1987-12-26 | Ｄ−乳酸の高感度測定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33138087A JP2739473B2 (ja) | 1987-12-26 | 1987-12-26 | Ｄ−乳酸の高感度測定量法 |
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| JP2739473B2 JP2739473B2 (ja) | 1998-04-15 |
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|---|---|---|---|---|
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| US6030802A (en) * | 1998-05-29 | 2000-02-29 | Roche Diagnostics Corporation | Liquid reagent set for L-lactate determination |
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1987
- 1987-12-26 JP JP33138087A patent/JP2739473B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| EP0821069A1 (en) * | 1996-07-23 | 1998-01-28 | Unitika Ltd. | Test strip using fluorescent chromogen |
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| US6030802A (en) * | 1998-05-29 | 2000-02-29 | Roche Diagnostics Corporation | Liquid reagent set for L-lactate determination |
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