JPS63313594A

JPS63313594A - シチジンジリン酸コリンの製造方法

Info

Publication number: JPS63313594A
Application number: JP14715087A
Authority: JP
Inventors: Satoru Yamashita; 哲山下; Kenichi Komatsu; 小松　謙一
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1987-06-15
Filing date: 1987-06-15
Publication date: 1988-12-21
Anticipated expiration: 2013-03-09
Also published as: JP2724825B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の属する技術分野〕本発明は、シチジンシリン酸コリン（以後、“ＣＤＰ−
コリン”と略称する。）の製造方法に関する。より詳し
くは、本発明は、コリンホスフェートシチジルトランス
フェラーゼ（ＣｈｏｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｅＣｙｔ
ｉｄｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の遺伝子を含む組
換え体ＤＮＡで形質転換されたサツカロミセス・セレビ
シー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）の株（以後、これを“ＣＰＣＴクローン”と略称
する。）を用いた、高収率で、経済的に有利にＣＤＰ−
コリンを製造する方法に関する。

〔従来技術の説明〕

ＣＤＰ−コリン（シチジンシリン酸コリン）は、生体内
におけるレシチン合成の前駆物質としてリン脂質の合成
に関与する重要な物質であり、医薬として、頭部外傷や
脳手術に伴う意識障害の回復剤や脂質代謝の異常や障害
の予防及び治療などに有用な物質として知られているも
のである。

そして、ＣＤＰ−コリンの取扱いが比較的容易で且つ入
手が容易な酵母を使用しての製造については、下達する
微生物学的手法による製造方法が知られている。

＋１１　　サツカロミセス属の酵母の国体又はその処理
物をシチジン−５′−モノリン酸（以後、“ＣＭＰ”と
略称する。）とコリン又はホスフォリルコリンを含有す
る反応液中に加えて、ＣＤＰ−コリンを反応液中に生成
蓄積させる方法（特公昭４８−４０７５７）、（２）　　ロドトルラ・ムシラギノサに属する酵母の生
菌体又は乾燥菌体を用いて、ＣＭＰとホスフォリルコリ
ンを基質とし、ＣＤＰ−コリンを反応液中に生成蓄積さ
せる方法（特公昭４８−２３５９）、及び、（３）サツカロミセス・セレビシ−のＣＰＣＴクローン
からコリンホスフェート　シチジルトランスフェラーゼ
を精製し、この酵素によってシチジン−５′　−トリリ
ン＃（以後、”ＣＴＰと略称する。）とホスフォリルコ
リンからＣＤＰ−コリンを生成する方法（脂質生化学研
究第２６巻、第２２０−２２３頁）。

しかし、上記（１１の方法は、ＣＤＰ−コリンの生成率
が低く、ＣＭＰに対し５０％以下のモル収率であって、
その上副生物が多いことから、製品のコストを高くして
しまうことの他、工程にも問題を伴うものである。

次に上記（２）の方法については、対ＣＭＰモル収率８
５〜９５％でＣＤＰ−コリンが生成されると記載されて
はいるものの、実験室規模でのものに他ならなく、工業
的規模ではかかる収率は到底達成されるものではない、
そして該方法によってＣＤＰ−コリンを得たところで、
いずれにしろその製品コストはかなり高いものになって
しまう。

上記（３）の方法については、使用する基質のＣＴＰが
不安定で取り扱い上問題のものであることの他、高価で
あることから、工程操作に格別の配慮が必要とされ、こ
の方法によってもやはりＣＤＰ−コリンの製品コストは
かなり高いものになってしまう。

一方、ＣＤＰ−コリンは、上述したように医薬品として
有用なものであることから、その安価な提供が社会的要
求としである。

〔発明の目的〕

本発明の主たる目的は、安価な原料を使用して、高収率
でＣＤＰ−コリンを生産し、その製品コストの低減を可
能にし、上記社会的要求に応じることのできるＣＤＰ−
コリンの製造方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、ＣＭＰとコリン又はホスフォリル
コリンを基質に使用しても上述の従来法における副生物
生成等の問題がなく、工業的規模において定常的に高収
率で目的物質たるＣＤＰ−コリンを与え且つ工程管理の
容易な、コリンホスフェート　シチジルトランスフェラ
ーゼの活性を高めたＣＰＣＴクローンを使用するＣＤＰ
−コリンの製造法を提供することにある。

〔発明の構成・効果〕

本発明は、本発明者らが、ＣＤＰ−コリン（シチジンシ
リン酸コリン）の従来の製造方法における前述の問題点
を解決して上記本発明の目的を達成すべく鋭意研究を重
ねた結果、上述する知見を得、該知見に基づいて更なる
研究を続は完成するに至ったものである。

即ち本発明者らは、後述するようにして、ＣＰＣＴクロ
ーン（即ち、コリンホスフェート　シチジルトランスフ
ェラーゼの遺伝子を含む組換え体ＤＮＡで形質転換され
たサツカロミセス・セレビシー）を調整し、該ＣＰＣＴ
クローンを所定の培地で培養して得た生菌体を解糖系の
エネルギーを利用し、ＣＭＰ　（シチジン−５′−モノ
リン酸とコリンの組合せ及びＣＭＰとホスフォリルコリ
ンの組合せのそれぞれと反応せしめたところ、いずれの
場合にあっても従来の方法において見られる副生物の生
成がほとんどなくしてＣＤＰ−コリンが極めて高い収率
で常時安定して得られることがわかった。

また、前記ＣＰＣＴクローンは、その培養液、培養して
得た菌体の摩砕物、抽出物、そして溶媒処理物のいずれ
であっても、生菌体を使用する場合と同様に副生物の生
成がほとんどなくしてＣＤＰ−コリンが極めて高い収率
で常時安定して得られることがわかった。

然るに本発明は、ＣＰＣＴクローンの培養液、菌体もし
くはその処理物を用いてＣＭＰとコリンまたはホスフォ
リルコリンを反応基質として反応液中にＣＤＰ−コリン
を生成蓄積せしめ、それを採取することからなるＣＤＰ
−コリンの製造方法に関するものである。

本発明のＣＤＰ−コリンの製造方法にあって使用するＣ
ＰＣＴクローンは、脂質生化学研究第２６第２２０−２
２３頁（１９８４年）に記載された方法により取得でき
るものである。すなわち、＋１１　　サツカロミセス・
セレビシーＸ２１８０−ＩＢ（米国カリフォルニア大学
イーストゼネティソクストックセンター（Ｙｅａｓｔ　
Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋＣｅｎ　ｔｅｒ）より入手
できる）よりクライヤー（Ｃｒｙｅｒ）らの方法（メソ
フズ・イン・セルバイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　１２　＠、３９−４４
゜１９７５）に従って全ＤＮＡを抽出する。このＤＮＡ
に制限酵素５ａｕＢＡＩを作用させて、平均約１０キロ
ベース（以後′″ｋｂ″と略称する。）程度の断片にな
るまで切断する。この反応液をカラムで分画し、５〜１
５ｋｂの長さのＤＮＡ断片を集める。

一方、ベクターＹＥｐ１３（アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクシラン（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐ＠Ｃｕ
１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　）よりＡＴＣＣｌ
’ｈ３７１１５の寄託番号の下で容易に入手できる。〕
を制限酵素ＢａｍＨＩで開裂させ、これにＴ４リガーゼ
の作用により上記ＤＮＡ断片を結合させて組換え体ＤＮ
Ａを作製する。

組換え体ＤＮＡでエシェリヒア・コリに１２株（なお、
通常の形質転換に用いるに１２株ならばいずれでもよい
、）を形質転換し、アンピシリン耐性を示すコロニーを
取得する。得られたコロニーをすべて混合して培養し、
その菌体よりウィルキー（Ｗｉｌｋｉｅ）らの方法にニ
ークレイツク・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）第７＠、第８５９−８７７
頁（１９７９）　）に従ってプラスミドＤＮＡを調整す
る。（これを、１サフカロミセス・セルビシーの遺伝子
ライブラリー”と称する。）（２）す７カロミセス・セレビシーＤ３１９−８Ａ株は
ホスファチジルセリン合成能を欠損している上に、３７
℃ではコリンホスフェート　シチジルトランスフェラー
ゼ活性が欠損するため生育できなくなる変異株である。

なお、この株は工業技術院微生物工業技術研究所に徽工
研菌寄第９２１７号として寄託されていて、容易に入手
することのできるものである。

該サツカロミセス・セレビシ−０３１９−８Ａ株を、ペ
ックス（Ｂｅｇｇｓ）の方法（ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）第２７５巻第１０４−１０９頁（１９７Ｂ）　）に
従って、サツカロミセス・セルビシーの遺伝子ライブラ
リーで形質転換し、３７℃で培養を行い、生育してくる
コロニーをＣＰＣＴクローンとして取得する。

（３）かくして取得したＣＰＣＴクローンの一株を培養
し、得られる菌体よりディベニッシ工（Ｄｅｖｅｎｉｓ
ｈ）らの方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）第１８巻第２７７−
２８８頁（１９８２））に従ってプラスミドＤＮＡを調
製する。このプラスミドＤＮＡでエシェリヒア・コリに
１２を形質転換し、アンピシリン耐性を示すコロニーを
取得する。

か（して得られるコロニーを培養し、これよりプラスミ
ドＤＮＡを抽出精製し、種々の制限酵素による切断を行
って解析する。

この結果、組換え体ＤＮＡの制限酵素地図を第１図のよ
うに特定し、このＤＮＡをｐｃｃｌと命名した。

こうして得られた組換え体ＤＮＡｐＣＣ１で再びＤ３１
９−８Ａ株を形質転換すれば、容易にＣＰＣＴクローン
を得ることができる。

また、ＰＣＣＩで形質転換する株は、上記のＤ３１９−
８Ａ株に限定されるものではなく、形質転換体を検出す
るための遺伝的形質、すなわちロイシン要求性をそなえ
ていればいずれのサツカロミセス・セレビシーでもよい
、すなわち、例えば、サツカロミセス・セレビシ−（Ａ
ＴＣＣｌｋ３８６２６）を上記と全（同様の方法に従っ
てｐｃｃｌで形質転換し、ロイシン要求性の消失したコ
ロニーを分離することによりＣＰＣＴクローンを取得す
ることができる。

本発明の方法にあって、ＣＰＣＴクローンの培養は、グ
ルコース、稠密などの炭素源、硫酸アンモニウム、尿素
などの窒素源、リン酸塩、硫酸マグネシウムなどの無機
塩、ビタミン類、微量金属塩等を適宜選択してなる通常
の酵母用培地を使用して行うことができる。培養は振と
う、通気攪拌等の培養方法により行うことができる。培
養条件は培地の温度を２０〜４０℃とし、ｐＨ値を３〜
８の範囲にして行う０反応に用いる菌体は、菌体それ自
体、または培養液、あるいは菌体摩砕物、菌体抽出物、
溶媒処理物などいずれであってもよい。

本発明の方法におけるＣＰＣＴクローンを使用してのＣ
ＤＰ−コリンを生成せしめる反応は、ＣＭＰとコリンま
たはホスフォリルコリンを反応基質とし、糖及び無機塩
類を使用し、反応液のｐＨ値を好ましくは、４．５〜９
．０、より好ましくは５．５〜７．５に！ＩＩＩＬ、反
応温度を好ましくは５〜５０℃、より好ましくは２５〜
３５℃にして行われる。

反応液中のＣＰＣＴクローンの上述の菌体量は、乾燥菌
体として約０．１〜約５０％の範囲とすることができる
が、５〜２５％の範囲が望ましい。

なお、本発明の方法において使用するＣＰＣＴクローン
は、上述の菌体、菌体処理物等を例えばカラギーナン、
アルギン酸カルシウム等を用いる固定化法に従って固定
化して使用することができる。

使用する糖としては、グルコース、フラクトース、マル
トース、シュクロース等の糖類物質が使用できる。そし
てそうしたｔＵａ物質は、好ましくは、０．Ｏ１〜５モ
ル濃度、より好ましくは０．１５〜０．７モル濃度で反
応液中に存在せしめる。

反応基質にはＣＭＰとコリンの組合せ、またはＣＭＰと
ホスフォリルコリンの組合せを使用する。

ＣＭＰとコリンの組合せの場合、ＣＭＰの濃度を好まし
くは０．０１−１．０モル濃度、より好ましくは０．０
１〜０．２モル濃度に、又コリンは好ましくは０．Ｏ１
〜３．０モル濃度、より好ましくは０．０３〜０．６モ
ル濃度にする。

また、ＣＭＰとホスフォリルコリンの組合せの場合、Ｃ
ＭＰの濃度を好ましくはｏ、ｏｉ〜１．０モル濃度、よ
り好ましくは０．Ｏ１〜０．２モル濃度に、また、ホス
フォリルコリンは、好ましくは０．０１〜１．０モル濃
度、より好ましくは０．０２〜０．４モル濃度にする。

また、コリンとホスフォリルコリンをまぜ合わせて使用
してもよ（、その場合上記のＣＭＰ濃度に対して、コリ
ンとホスフォリルコリンの混合物を、好ましくはｏ、　
ｏ　ｏ　ｉ〜３．０モル濃度、より好ましくは０．０３
〜０．６モル濃度にする。

また、使用する無機塩類としてはリン酸塩、塩化マグネ
シウム等が使用でき、リン酸塩は好ましくは０．０１〜
１．０モル濃度、より好ましくは０．０５〜０．５モル
濃度に、塩化マグネシウムは好ましくは０．００１〜０
．５モル濃度、より好ましくは０．０１〜０．１モル濃
度にする。

反応液中に生成したＣＤＰ−コリンの分離、精製は、公
知のイオン交換樹脂法、活性炭吸着法、溶媒抽出沈澱法
等を任意に選択し、組合せるなどして行うことができる
。

以上説明の本発明の方法によると、後述の実施例の結果
からしても明らかなように、常時安定してＣＭＰに対し
９０％以上のモル収率でＣＤＰ−コリンが得られる。そ
して後述の参考例や比較例に示される、もとのサツカロ
ミセス・モルビシーによる反応の収率と比較すると、本
発明の効果はきわめて顕著なものであることが理解され
る。

また、本発明は、使用するＣＰＣＴクローンの菌体の活
性が高いため、反応を短時間で完了させる利点をもち、
さらにＣＴＰやホスフォリルコリンが反応液中に蓄積す
ることなく　ＣＤＰ−コリンに極めて効率的に変換され
るので、従来法の下で、ホスファターゼやデアミネース
活性によって生じるシチジンやシトシン、ウリジン、ウ
ラシル等がほとんど生成されない。

（実施例〕以下、実施例を挙げて本発明の方法を更に詳細に説明す
るが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるもの
ではない。

入車史上サツカロミセス・モルビシー（徽工研菌寄第９２１７号
）を組換え体ＤＮＡｐＣＣ１で形質転換して得られたＣ
ＰＣＴクローンをｗ密３．９％、グルコース７％、尿素
０．５％、硫酸アンモニウム０．２５％、リン酸１カリ
ウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０９％からなる境
地で、２０時間通気攪拌しながら培養して得られた乾燥
菌体２０ｇ相当の生菌体に蒸留水２３ｍ１とトルエンｌ
　Ｑｍｌを加え、攪拌したものと、ＣＭＰ２．４ｇ、グ
ルコース１５ｇ、ホスフォリルコリン１．６ｇ、塩化マ
グネシウム０．３８ｇを０．１５モル濃度リン酸緩衝液
（ｐＨ７，５）に溶かして２４　Ｑｍｌとし、３０℃で
５時間反応させたところ、反応液中にＣＤＰ−コリンが
３．３５ｇ生成した。

これは、対ＣＭＰモル収率９２．３％である。また、こ
の時シチジン、シトシン、ウリジン、ウラシルなどの副
生成物は、１％以上の生成はみとめられなかった。

〔参考例〕

す、カロミセス・モルビシ−（徽工研菌寄第９２１７号
）を実施例１と同じ条件で培養し、同じ反応条件で２０
０時間反応せたところ、ＣＭＰに対し、０．４％のモル
収率でＣＤＰ−コリンが生成した。

また、この時副生成物としてシチジン６．８％、ウリジ
ン１３．１％、ウラシル４０．３％が生成した。

叉１史ｌサツカロミセス・モルビシ−（Ａ　Ｔ　ＣＣ３８６２６
）を組換え体りＣＣＩで、上記に説明した方法で形質転
損し、ＣＰＣＴクローンを得た。

このＣＰＣＴクローンを、実施例１と同じ条件で培養し
、反応を行ったところ、反応液中にＣＤＰ−コリンが３
．３ｇ生成した。これは対ＣＭＰモル収率９０．８％で
ある。

また、この時シチジン、シトシン、ウリジン、ウラシル
などの副生成物は、１％以上の生成は認められなかった
。

（比較例〕サツカロミセス・モルビシ−（Ａ　Ｔ　ＣＣ３８６２６
）を、実施例２と同じ条件で培養し、同じ反応条件で２
００時間反応行ったところ、ＣＭＰに対し、２１．６％
のモル収率でＣＤＰ−コリンが生成した。

また、この時副生成物としてシチジン４．０％、ウリジ
ン６、１％、ウラシル２０．６％が生成した。

大泉史主実施例１において、ＣＭＰを７．２ｇ、ホスフォリルコ
リンを４．８ｇ用いる他は、実施例１と同様にして１２
時間反応を行ったところ、反応液中にＣＤＰ−コリンが
９．８１ｇ生成した。これは対ＣＭＰモル収率９０．２
％である。

叉旌舅生実施例１において、ＣＭＰを０．８８、グルコースの代
わりにフラクトースを１５ｇ、ホスフォリルコリンを０
．６ｇ用いる他は、実施例１と同様に実施したところ、
反応液中にＣＤＰ−コリンが１．１ｇ生成した。これは
対ＣＭＰモル収率９０．８％である。

【図面の簡単な説明】

第１図は組換え体ＤＮＡｐＣＣ１の制限酵素開裂地図を
示す。第１図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）コリンホスフェート　シチジルトランスフェラー
ゼの遺伝子を含む組換え体ＤＮＡで形質転換されたサッ
カロミセス・セレビシーの培養液、菌体もしくはその処
理物を用いて、シチジン−５′−モノリン酸とコリンま
たは／及びホスフォリルコリンを反応基質として反応液
中にシチジンジリン酸コリンを生成蓄積させ、それを採
取することを特徴とするシチジンジリン酸コリンの製造
方法。
（２）前記反応液に糖類物質を存在せしめる特許請求の
範囲第１項に記載のシチジンジリン酸コリンの製造方法
。