JPS63258489A - 環状ペプチド及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 全ての先進国においては、肥満症は健康管理における出
費増加の一要因である。最近のＮ　Ｉ　Ｈ合意協議で到
達した結論によれば、例えば３億４千万のアメリカ人の
中、少なくとも２０％以上がその望ましい体重のために
処置を必要としている［ナショナル・インステイチュー
テイズ・オブ・ヘルス争コンセンザス・パネル拳リポー
ト（Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｉ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　　
ｏｆ　　ＨｅａｌＬｈ　　ｃｏｎｓｅｎｓｕｓＰ　ａｎ
ａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ）、１９８５年２月１３日；まだサ
イエンス（Ｓ　ｃ　１ｅｎｃｅ）、２２７，１０１９−
１０２０（１９８５）参照］。

これらの個人において、肥満症は心臓血管病、高血圧症
、過コレステロール症、非インシユリン依存糖尿病［ｎ
ｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｄｉａｂ
ｅｔｅｓ（ＮＩＤＤ）］並びに子宮、乳房、胆のう、結
腸、直腸及び前立腺の癌の影響となる要因である。加λ
て、肥満症は死亡率に衝撃的に関連しまた負の体重を有
する；極端なまたは病的肥満症においては、死亡率は正
常の１２００％以十である。

体重減少かＮ　Ｔ　ＤＤ、高血圧症、過コレステロール
症、冠状動脈心臓病、痛風及び骨関節炎にかかった患者
に対する最初の行為として推挙される。

しかしながら、医師が体重減少を達成させるために使用
し得る治療的手段は比較的に少ない。ダイエツト相談に
対して補助剤として最近用いられる薬剤は短期間治療に
は有効であるが、しかし、長期間使用には不適当であり
、その理由は、耐性の進展、そのＣＮＳ活性及び望まし
くない副作用のためである。かくして、減量に成功した
患者の約９５％は１２〜８４個月以内にその初期体重に
もどる。

身体自体の末梢の飽満徴候を模倣して食物摂取を減少さ
せる薬剤は長期にわたる治療により成功が期待され、悪
い副作用が少なく、ＣＮＳ活性をもたない。

コレンストキニン（ＣＣＫ）はブタの胃腸管から３３−
アミノ酸ペプーｙドとして最初に単離されたポリペプチ
ドホルモンである［マツｈ（Ｍｕｔｔ）等、バイオケミ
カル・ジャーナル（Ｂ　ｉｏｅｈｅｍ　Ｊ　、）（Ｐｒ
ｏｃｅｄ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、）、↓λ」
−１５７〜５８（１９７１）；　Ｍｕｔｔ等、クニリカ
ル・エンドクリノロシイ（ＣＩｉｎ、　Ｅ　ｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌ、）、増刊、垣、１７５ｓ−１８３ｓ（１９７
６））　。末梢的に投与したＣＣＫはラット、ヒツジ及
びザルにおいて飽満感を与えることが示された［ジョル
ペス（Ｊ　ｏｒｐｅｓ）等、アクタ・ヘミ力・スカンジ
ナビ力（Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ、　Ｓ　ｃａｎｄ−）、１
８．２４０８−２／Ｊｉｏ（１９６４）：デラーフエラ
（Ｄ　ｅｌｌａ−Ｆ　ｅｒａ）等、Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ。

２０６．４７１〜４７３（１９７９）；ギブス（Ｇｉ１
〕１）ｓ）等、ジャーナル・オブ・コンパラテイーブ・
アンド・フイジイオロジカル・ザイコロジイ（Ｊ　、Ｃ
ｏｍｐ、　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｓｙｃｈｏｌ、
）、８４．４８８〜４９５（１９７３）］。ＣＣＫのオ
クタペプチド同族体のＣＣＫ−８の注入はやせた及び肥
満−１１＝ 人間における食物摂取を減少させることがわかった［ス
ミス（Ｊ　、　Ｓ　ｍ１ｔｈ）、インターナショナル・
ジャーナル・オブ・オペシイティ（Ｉｎｔ、　Ｊ　、　
ｏｆＯｂｅｓｉｔｙ）、１１増刊Ｌ３５−３８（１９８
４）］。

ＣＣＫは飽満−誘発効果を有し、かくして、人間におけ
る食物摂取を減少または抑制させるために有用であるこ
とがわかった。

ポリペプチドホルモン、ＣＣＫ−３３、は次の１１ｅ−
３ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）
−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｃｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−
ＮＨ２ ＣＣＫの７ラグメン］・、例えばＣＣＫ−８及びＣＣＫ
−７はまた飽満−誘発効果を有することがわかっている
。ＣＣＫ−８は次のアミノ酸配列を有Ａｓｐ−Ｔｙｒ（
ＳＯ３Ｈ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ
−Ｐｂｅ−ＮＨ２ＣＣＫ−７はＣＣＫ−８よりも１個ア
ミノ酸が少ない、即ち、このものはＣＣＫ−８から２６
−位置のＡｓｐを差し引いたものである。

公知のペプチドは線状の立体配置である。

一般に、線状ペプチドは極めてしなやかな分子であり、
配座が十分に限定されていない。線状ペプチドにおける
各アミノ酸は周りの環境にさらされ、その結果として、
ペプチドは、十分に限定された配座を有するものよりも
酵素的及び化学的減成を受けやすい。

ＣＣＫ−３３、ＣＣＫ−８及びその種々な同族体並びに
ＣＣＫ−７の線状型は飽満−誘発効果を有することが知
られているが、しかｌ／　、これらのペプチドは作用が
短期間である。更に、例えば線状ＣＣＫ−８は人間の胃
液にさらされた際に極めて速かに減成される。従って、
飽満−誘発化合物の有効経口投与は除外される。これら
の飽満−誘発化合物の長期間作用型ならびらに経口投怪
の効果的経路の発見が当然重要である。

環式ペプチドは、ペプチド鎖中の１個のアミノ酸のβま
たはγカルボキシ末端がアミド結合の形成を介してペプ
チド鎖中の他のアミノ酸のび、β、Δまたはεアミノ酸
末端に結合したペプチドである。３鎖中の２個のアミノ
酸間の結合か環構造を与える。

環式ペプチドの生物学的特性はその線状同族体の特性に
関してかなり変えられる。環式ペプチドは、十分に定義
された形状及び周りの環境から封しられる内部アミノ酸
残基をもつより精確なものである。これらの変化はペプ
チドの生物学的特性に反映される。環式ペプチドの作用
持続期間は、緻密な構造が化学的及び酵素的減成に影響
されにくくするために、より長いであろう。環式ペプチ
ドの生物利用性（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）は
封じられた内部アミノ酸残基に起因する組織分布におけ
る変化のために増加するであろう。更に、環式ペプチド
の十分に限定された形状は目標受容体に対するより大き
な特異性をケ、え、かくして、所望の活性に相伴う望ま
しくない生物学的活性の可能性を少なくする。線状ペプ
チドと対比して、一般に与えた線状ペプチドに対して中
枢及び末梢の双方の受容体があり、そして、他のペプチ
ドに対する受容体と与えたペプチドとのかなり逆の反応
性がある。

本発明は本明細書に示した特定配列の線状ペプチド、こ
れらのペプチドの環式型及びその製薬学的に許容し得る
塩に関する。また本発明は、本発明のペプチドまたはそ
の製薬学的に許容し得る塩の食物摂取抑制に有効な量を
動物に投与することからなる該動物における食物摂取を
抑制する方法に関する。

本発明に関しては、環式ペプチドは、ペプチド鎖中の１
個のアミノ酸のβまたはγカルボキシ末端がペプチド鎖
中の他のアミノ酸のα、Δまたはεアミノ末端に結合し
たペプチドとして定義される。本発明のペプチドにおい
て、特記ゼぬ限り、次の配置を適用する。

Ｌｙｓ　　　　　　　　　εアミノ（ε−イプシロン）
Ｏｒｎ　　　　　　　　　Δアミノ（Δ＝デルタ）Ｔｙ
ｒ（Ｓ　Ｏ３）（）　　　（ｒアミノ（α−アルファ）
Ａｓｐ　　　　　　　　βカルボキシル（β−ベータ）
Ｇｌｕ　　　　　　　　βカルボキシル（γ−ガンマ）
１５一 本発明の特定の環式ペプチドは、鎖中の環式結合を望ま
ぬアミノ酸の官能基を保護し、共に結合するアミノ酸を
残し、未保護環式構造を形成させることによって製造さ
れる。固相合成法においては、種々なアミノ酸部分の反
応性側鎖基を、この部位で起こる化学反応を防止する適
当な保護基で、該保護基を最後に除去するまで、典型的
に保護する。鎖中の各アミノ酸を、液相合成においてそ
れぞれのアミノ酸に対して普通に用いられる保護基で保
護することができる。次に鎖中の未保護アミノ酸が結合
して本発明の環式ペプチドを生成する。

次の省略または記号をアミノ酸、活性基、保護基等を表
わすために用いた。

敬黛　　　　　　　　　　該 ＡＡ　　　　　　　　アミノ酸 Ａｃ　　　　　　　アセチル Ｏｒｎ　　　　　　　オルニシン ２−クロロ−２２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル Ｚ　　　　　　　ベンジルオキシカルボニルＤＭＦ　　
　　　　ジメチルホルムアミドＢｏｃ　　　　　　　ｔ
ｅｒｔ、、−ブチルオキシカルボニルＴＦＡ　　　　　
　　）リフルオロ酢酸ＣＨ３ＣＮ　　　　アセトニＩ・
リル Ｏ Ｏ アミノ酸を、本明細書に特記せぬ限り、その普通に了解
された３文字表示で示し、Ｌ−異性体を意味する。

本発明は式 ■　。

式中、Ｘ＝Ｃ０−低級アルギル Ｒ＝　Ｌｙｓ、　０ｒｎ Ｒ’−ＭｅｔＳＮｌｅ Ｒ２＝Ｐｂｅ、Ｎ−メチル−Ｐｈｅ Ｙ　−Ｎ　Ｉ−■２、Ｎ　ＨＣＨ３ の環式ペプチドに関する。

式 ％式％ のペプチドが殊に好ましい。

また本発明は式 式中、Ｒ＝　Ｍｅｔ、　Ｎ　ｌｅ Ｒ’＝ＭｅｔＳＮｌｅ Ｒ２＝　Ｔｈｒ（Ｓ　Ｏ３Ｈ）、５ｅｒ（ＳＯ３Ｈ）、
Ｈｙｐ（Ｓｏ３Ｈ） Ｙ　＝　Ｎ　Ｈｘ、Ｎ　ＨＣＨｓ のペプチドに関する。

式 ％式％ のペプチドが殊に好ましい。

また本発明は式 ％式％ 式中、Ｒ＝　Ｍｅｔ、　Ｎ　ｌｅ Ｒ’　−Ｔ　ｈｒ（Ｓ　Ｏ３Ｈ）、５ｅｒ（ＳＯ３Ｈ）
、Ｈｙｐ（Ｓｏ３Ｈ） Ｙ＝ＮＨ２、ＮＨＣＨ３ のペプチドに関する。

式 Ｔ（ｒ干！ゾυソｙλ二ｉヅニ８ｊウ−二！−）“づ計
（８０・修ト■ルーＰｈｅ−ＮＨ２ のペプチドが殊に好ましい。

式■のペプチドに関して、Ｒ＝Ｌｙｓである場合、この
ものは環式ペプチドをつくるためにＡｓｐのβ（ベータ
）カルボキシ末端に結合するＬｙｓのε（イプシロン）
アミノ末端である。式■において、Ｒ＝Ｏｒｎである場
合、このものは環式ペプチドをつくるためにＡｓｐのβ
（ベータ）カルボキシ末端に結合するＯｒｎのΔ（デル
タ）アミノ末端である。

式■に関しては、環式ペプチドをつくるためにＧｌｕの
γ（ガンで）カルボキシ末端に結合するＴｙｒ（ＳＯ３
Ｈ）のび（アルファ）アミノ末端がある。

式Ｉ１１に関しては、環式ペプチドをつくるために一２
０＝ Ｇｌｕのγ（ガンマ）カルボキシ末端に結合するＴｙｒ
（ＳＯ３Ｈ）のα（アルファ）アミノ末端がある。

また本発明は式 ％式％ 式中、Ｘ＝Ｃ０−低級アルキル Ｒ−］Ｉｙｓ、０ｒｎ Ｒ’＝　Ｍｅｔ、　Ｎ　１ｅ Ｒ２＝Ｐｈｅ、Ｎ−メヂルーＰｈｅ Ｙ−ＮＨ２、ＮＨＣＨ。

■。

Ｔｙｒ（ＳＯ，Ｈ）−Ｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｒ’−Ｒ２
−Ｎ−メチル−Ｐｈｅ−Ｙ式中、Ｒ＝Ｍｅむ、Ｎ１ｅ Ｒ’＝Ｍｅｔ、　Ｎ１ｅ Ｒ２＝　Ｔｈｒ（Ｓ　Ｏ３Ｈ）、Ｓ　ｅｔ（Ｓ　Ｏ、Ｈ
）、Ｈｙｌ）（Ｓｏ３Ｈ） Ｙ　＝　Ｎ　Ｈ□、ＮＨＣＨ３ ■。

Ｔｙｒ（Ｓ０３Ｈ）−Ｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｒ
’−Ｎ−メヂルー円１ｅ−Ｙ式中、Ｒ＝　Ｍｅｔ、　Ｎ
　Ｉｅ Ｒ’　＝　　Ｔ　ｈ　ｒ　（Ｓ　　Ｏ３Ｈ）　、　　Ｓ
　ｅｒ（Ｓ　　Ｏ３Ｈ）　、Ｈｙｌ）（Ｓ　Ｏ３１（） Ｙ＝ＮＨ２、Ｎ　ＨＣＨ３ の線状ペプチドに関する。

本発明のペプチドは動物において飽満−誘発効果を有し
、食物摂取を抑制するために有用である。

本ベプヂドは動物の体重を調節または減少させる計画に
用いることかできる。

本発明は式１．　　ＩＩ、ＩＩＩに示したアミノ酸配列
の環式ペプチドまたはその製薬学的に許容し得る塩及び
これらのペプチドを含有する組成物に関する。

また本発明は式■、■及び■に示したアミノ酸配列の線
状ペプチドまたはその製薬学的に許容し得る塩に関する
。

また本発明は、本発明のペプチドの食物摂取抑制有効量
を動物に投与することからなる該動物における食物摂取
を抑制する方法に関する。

本明細書に用いた如き「食物摂取抑制量」なる用語は食
物摂取を抑制するために投与しなければならない動物体
重１ｋｇ当りのペプチド（重量基準）の量を示す。投与
方法、特定の動物及び動物の体重を考慮してかかる量を
計算することは当該分野に精通せる者の範囲内にある。

飽満剤どしてＣＣＫ−８の使用に関する当該分野におけ
る巧妙なレベルはモルレイ（Ｍｏｒｌｅｙ、　Ｌ　、　
Ｅ　、）により、ライフ・サイエンス（Ｌ　ｉｆ６３　
ｃｉｅｎｃｅｓ）、３０．４７９〜４９３（１９８２）
中、４８５〜４８８頁において、［ミニレビュー、胃腸
管から脳へのコレシストキニン（ＣＣＫ）の上昇Ｊ　［
”Ｍ　ｉｎｉｒｅｖｉｅｗ　Ｔ　ｈｅＡ　５ｃｅｎｙ　
ｏｆ　Ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ　（ＣＣＫ　）
Ｆ　ｒｏｍＧｏｔ　ｔｏ　Ｂｒａｉｎ″′１に要約され
た文献によって説明される。

本発明のペプチドの合成方法は次の工程からなる： ａ）固相樹脂に結合した対応するブロッキングされた線
状ペプチドの製造。

１〕）樹脂から線状ペプチドを除去し、そしてＨＰ　Ｌ
　Ｃによる精製。

Ｃ）アミド結合の形成及びＨＰＬＣによる精製を通して
環式ペプチドを得るために、線状ペブチドの環形成剤に
よる処理。

ｄ）環式ペプチドの硫酸化、及びＨＰＬＣによる精製。

ａ）固相樹脂に結合した対応するブロッキングされた線
状ペプチドの製造： ペプチドを固相合成法を用いて、メリフィールド（Ｍｅ
ｒｒｉｆｉｅｌｄ）により、ジャーナル・オブ・アメリ
カン・ケミカル・ソザエテイ（Ｊ　、Ａｍ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、）、−影擾一、２１４９２１５４（１９６３）
に一般的に記載された方法によって製造することができ
るが、また当該分野において公知の他の同等の化学的合
成法を用いることもできる。固相合成法は、適当な樹脂
、例えばベンジルヒドリルアミン（ＢＨＡ）またはメチ
ルベンジルヒドリルアミン樹脂（ＭＢＨＡ）にアミド結
合によって、保護されたα−アミノ酸をカップリングさ
せて合成するペプチドのカルボキシ末端から開始する。

ＢＨＡ及びＭ　Ｂ　ＨＡ樹脂担体は市販品であり、合成
する所望のペプチドがカルボキシ末端で未置換アミドを
有する場合に、一般に用いられる。

２４一 本明細書に述べた製造に用いる全ての溶媒、例えば塩化
メヂレン（ＣＨ２ＣＱ２）、２−７’ロバノール及びジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ）はバーデイク・アンド・
ジャクソン・　「ディステイールド・イン・グラスＪ　
（Ｂ　ｕｒｄｉｃｋ　＆　　Ｊ　ａｃｋｓｏｎ　”　Ｄ
　１ｓｔｉｌｌｅｄ　ｉｎＧ　１ａｓｓ”　）級であり
、追加蒸留せずに用いた。トリフルオロ酢酸（ＴＥＡ）
、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＮ）及びジシ
クロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）はケミカル・サ
イアナミド・コーポレーション（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ
ｙａｎａｍｉｄ　Ｃｏｒｐｏｒａ−ｔ　１ｏｎ）から購
入し、スイクエンシャル（”５ｅｑｕｅｎ−ｔｉａｌ”
　）級純度である。エタンジチオール（ＥＤＴ）はシグ
マ・ケミカル・カンバニイ（Ｓ　ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　　Ｃｏ、）から購入し、更に精製せずに用いた
。

全ての保護されたアミノ酸は、特記せぬかぎり、Ｌ立体
配置であり、バツケム（Ｂ　ａｃｈｅｍ）から得た。

固相合成法においては、種々なアミノ酸部分の反応性側
鎖基を、保護基が最終的に除去されるまで、この部位で
起こる化学反応を防止する適当な保護基で典型的に保護
する。特定の保護基が固相合成に関して開示されている
が、各アミノ酸を液相合成における各アミノ酸に普通に
用いられる保護基で保護し得ることに注意すべきである
。かがる保護基の中には例えばエステル、例えばアリー
ルエステル、殊にフェニルまたは低級アルキル、ハロ、
ニトロ、チオもしくは塩化スチレン（炭素原子１〜７個
）チオで置換されたフェニルから選ばれるカルボキシル
基に対する普通の保護基が含まれる。全てのα−アミノ
酸はｔｅｒｔ、−ブヂルオキシ力ルボニル（Ｂｏｃ）官
能基でブロッキングされる。

側鎖基（１次の如く置換される：ベンジルによるＡ　８
９％　Ｇ　ＩｕＳＴ　ｈｒ　；ホルミルにょるＴｒｐ及
び２゜４−ジクロロベンジルにょるＴｙｎ；２−クロロ
−ＺまたはＺによるＬｙｓ、これらの化合物の純度は薄
層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及び光学的回転によっ
て確かめた。ベンジルヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂は
ベックマン・インスッルメンツ（Ｂ　ｅｃｋｍａｎ　　
Ｉ　ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）から得られたビード型（２
００〜４００メツシユ）におけるスチレン−１％シヒニ
ルベンゼンの共重合体である。総窒素含量は０゜６５４
ｍｇ／ｇであった。

次の装置を用いた。薄層クロマトグラフィーは適当な溶
蝶系を用いて、ガラス・パックド・プレコーチエツト・
シリカゲル６０Ｆ２５４プレート［メルク（Ｍｅｒｃｋ
）］上で行った。スポットの検出はＵＶケイ光消尽（２
５４ｎｍ吸収）、ヨウ素染色またはニンヒドリン・スプ
レー（第−及び第二アミンに対して）によって行った。

アミノ酸を分析するために、ペプチドを真空にしたりア
クチーザーム（Ｒｅａｃｔｉ−Ｔ　ｂｅｒｍ）加水分解
管［ホイートン・サイエンティフィク・カンバニイ（Ｗ
ｈｅａｔｏｎ　Ｓ　ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏｍｐａｎ
ｙ）、Ｍｉｌｖｉｌｌｅ。

Ｎ、Ｊ　、０８３３２］中にて、フェノールを含む６Ｎ
Ｈ（ｌ中で１１５℃にて２４時間加水分解した。分析は
ベックマン（Ｂ　ｅｅｋｍａｎ）　１２１　Ｍアミノ酸
分析器で行った。

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、コンスタ
メトリック（Ｃｏｎｓｔａｍｅｔｒｉｃ）　Ｉポンプ、
コンスタメトリック■ポンプ、グラジェント・マスター
・ソルベント・プログラマ−（Ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ｍａ
ｓｔｅｒ　５ｏｌｖｅｎｔ　ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒ）及
びミギサー、並びにＵＶ検出器の波長可変スペクトロモ
ニター■からなるラボラトリイ・デート・コントロール
［ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ　ｄａｔｏ　ｃｏｎｔｒｏｌ　（Ｌ　Ｄ　
Ｃ）］装置で行った。

分析ＨＰＬＣをウォーターズ・マイクロ・ポンダパック
（Ｗａｔｅｒｓ　Ｍ　１ｃｒｏ　Ｂ　ｏｎｄａｐａｃｋ
）Ｃ＋ａ逆相カラム（０，４Ｘ　２５ｃｍ）によって行
った。分取ＨＰＬＣ分離はワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ
Ｘ　２　、５　Ｘ　５０　ｃｍ）パーティシル（Ｐ　ａ
ｒｔｉｓｉｌ）Ｍ　２０　１０　／　５００ＤＳ−３カ
ラム、または（２，３Ｘ　３０ｃｍ）マイクロ・ポンダ
バック０１８カラムを用いて行った；双方の場合、ワッ
トマン・コニペル（ＷｈａｔｍａｎＣｏ：　Ｐｅ１ｆ）
ＯＤＳペリキュラル・バッキング（ｐｅｌｌｉｃｕｌａ
ｒ　ｐａｃｋｉｎｇ）のプレカラムを用いた。

ペプチドをベガ（Ｖｅｇａ）２５０ペプチド合成器を用
いて固体担体上で段階的方法で合成した。化学重加群を
ベガ・バイオケミカルズ（Ｖｅｇａ　　Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によるモデル３００マイクロプロ
セッサ−（Ｍ　１ｃｒＯｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）によって
、工程１６及び２０を手動操作によって調節した。

Ｂｏｃ−Ｎ−メチル−Ｐｈｅ　５ｇ（１７ミリモル）を
、ＤＣＣｌ、８ｇ（９ミリモル）を用いてＯ′Ｃで、ベ
ンジルヒドリルアミン樹脂（５ｇ）にカップリングさせ
た。付加はアミノ酸分析器によって０．２０ミリモル／
ｇ樹脂であることを測定した。未反応アミノ基を無水酢
酸及びピリジンの各々６当量で処理してキャッピングし
た。

合成を樹脂によって開始し、典型的な合成循環に対する
工程は次の通りであった： Ｉ＠　　　Ｅ眠　　　　　　　　　　稈１　　　１％Ｅ
ＤＴ／Ｃｌｌ２（Ｊｚ　　　　　Ｉ　Ｘ　３０秒２　　
５０％ＴＦＡ／ＣＨｚＣＬ　　　　　Ｉ　Ｘ　１分１％
ＥＤＴ ３　　　　工程１をくり返す ４　　　５０％ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２！　　　　　Ｉ　
Ｘ　１５分１％ＥＤＴ ５ＣＨ２ＣＱ２■×３０秒 ６２−プロパツール　　　　　ｌＸ３０秒７−８　　　
　工程５及び６をくり返ず９　　　　　ＧＨｚＣＩ２２
　　　　　　　　　２Ｘ　３０秒ｔｏ　　　　８％　Ｄ
ＩＰＥＡ　　　　、　　　　　２Ｘ２分１１−１５　　
　工程５をくり返す １６　　５当量Ｂｏｃ−ＡＡ無水物　　１×３０分１７
　　　１％ＤＩＰＥＡ　　　　　　　　ｌｘ５分１８−
１．９　　工程６及び９をくり返す２２２−プロパツー
ル　　　　ｌ×３０秒２３−２４　　工程５及び６をく
り返す２５　　　　ＣＨ２Ｃｆｆ２　　　　　　　　　
１　Ｘ　３０秒２６　　　　ＤＭＦ　　　　　　　　　
　　２Ｘ３０秒２７ＣＨ２ＣＱ、２３×３０秒 全ての洗浄及びカップリングに対する溶媒は１０〜２０
ｍＱ／ｇ樹脂の容量であった。カップリングをＢｏｃ−
アミノ酸の対称性無水物として行った。

カップリングを、Ｂｏｃ−アミノ酸１０当量及びＤＣＣ
５当量を用いて、Ｃ１１２ＣＱ、２中にてｏ　０ｃで行
った。

カップリング反応をカイザー・ニンヒドリン試験によっ
て、工程１９後にカップリングが終了したかを測定する
ことによって監視した［　Ｋ　ａｉｓｅｒ。

Ｅｌ等、アナリテイカル・バイオケミストリイ（Ａｎａ
ｌ、　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、）、旦、５９５−５９８（
１９７０）］。全循環時間は残分当り５４〜１６０分の
範囲であった。

ｂ）樹脂から線状ペプチドを除去し、そしてＨＰ　Ｌ　
Ｃによる精製： 十分に組合せたペプチド樹脂を高真空下で一夜乾燥した
。脱ブロッキング及び開裂条件は、一般にＣＣＫ−８同
族体に対して最適にするタム（Ｔａｍ）等により、テト
ラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌ　
ｅｔｔｅｒｓ）、旦、４４３５〜４４３８（１９８２）
に記載の改変法であった。ペプチド−樹脂をテフロンＨ
Ｆ装置［ベニンスラ（ｐｅｎｉｎｓｕｌａ）］中にて０
°Ｃで１時間、ＨＦ　、ジメチルスルファイド及びｐ−
クレゾール（５：１３：２）ｎ＋Ｑで処理し、少容量に
蒸発させた後、新しい無水ＨＦ（１８ｎｏ２）を反応容
器中に蒸留し、０°Ｃで１．５時間第二の処理を行った
。蒸発後、乾燥樹脂をＥ　ｔ２０及びＥｔＯＡｃの各々
３容量で洗浄し、３０％酢酸４Ｘ１５ｍ（２で滴定し、
そして濾過した。水性濾液を凍結乾燥し、粗製の線状ペ
プチドを得た。

＝３１− 粗製のペプチドを（２，３ｘ　３０ｃｍ）マイクロポン
ダパックＣＩ８または（２，５Ｘ　５０ｃｍ）ワットマ
ン０ＤＳ−３カラムでＨＰＬＣによって直接分取精製し
た。ペプチドを最少容量の５０％ＡｃＯＨに加え、流速
８　、０　ｍ（１／分で０．０２２％ＴＦＡ／ＣＨｓ　
ＣＮの５〜６５％の遅いグラジェントで溶離した。フラ
クションを３分間隔で捕集し、分析ＨＰ　Ｌ　Ｃによっ
て検査後、カットを行った。９７％以上の純度であると
判定したフラクションをプールし、そして凍結乾燥した
。

ペプチドの純度をＨＰＬＣによってチェックし、全ての
場合に９９％であった。個々のペプチドのアミノ酸分析
を行い、各々の場合に予想された値が得られた。またペ
プチドの化学的完全性を確かめる方法どしてＵ、Ｖ、、
１．Ｒ，及びＭ、Ｓ　、測定を行った。

Ｃ）アミド結合の形成及びＨＰ　Ｌ　Ｃによる精製を通
して環式ペプチドを得るために、線状ペプチドの環形成
剤による処理： 線状ペプチドをＤＭＦに溶解し、塩酸塩とじて遊離アミ
ノ基をプロトン化するために３ＮＨＣＩ２／ジオキサン
で処理した。このものをジフェニルホスフェニルアシド
で処理し、−２０°Ｃで１時間活性化した。次に反応混
合物をＤＭＦで希釈しく１５容量）、Ｎ−メチル−モル
ホリンを加えてｐＨ７゜５にした。環形成反応を＋５°
Ｃで２日間行い、この間、ｐＨ値をチェックし、Ｎ−メ
チル−モルホリンの添加によって中性（ｐＨ７，４）に
保持した。有機溶媒中のｒｐＨ］は溶液試料を湿った狭
い範囲のｐＨペパーに塗布して測定した。

環形成の進行をＨＰ　Ｌ　Ｃを用いて、反応混合物の試
料を分析することによって追跡した。通常、１〜２日後
に、出発線状ペプチドは線状ペプチドの環式単量体また
は重合体型に転化された。

得られた粗製の環式ペプチドを（２，３Ｘ３０ｃｍ）マ
イクロ・ポンダパックＣＩ８カラムで分析ＨＰＬＣによ
って精製した。ペプチドを最少容量の酢酸に加え、８　
、　ＯｍＱ１分の流速で、０．０２２％ＴＦＡ／ＣＨ３
ＣＮの５〜６５％の遅いグラジェントで溶離した。フラ
クションを３分間隔で捕集し、分析ＨＰ　Ｌ　ＣＴ検査
後、カントを行った。環式ペプチドの純度を分析ＨＰ　
Ｌ　Ｃ、アミノ酸分析及びＭ　Ｓ、によってヂエソクし
た。

ｄ）環式ペプチドの硫酸化及びＨＰ　Ｌ　Ｃによる精製
： ペプチドを含む硫酸−２ステル−基を、ピリジンアセデ
ル硫酸試薬を用いて、ヒドロキシル（ヂロシン、セリン
、スレオニルまたはと１！ロキシプロリン）基の二重硫
酸化によって製造した。典型的な硫酸化を次の如くして
行った：ピリジニウムアセチル７．　ルア１−ト（ＰＡ
　Ｓ）　６０−２４０ｍｇをピリジン５ｍ（２に溶解し
、６０’Ｃ！で１０分間混合した。Ｎ　−７セヂル−Ｃ
ＣＫ　−８同族体（１０ｍｇ）を、ＰＡＳ試薬を加えた
ピリジン５ｍＱに溶解シた。

６０℃に加熱し、そして４５〜６０分間混合した後、こ
のものを０．０５Ｍ重炭酸アンモニウト２容量で中和し
、凍結乾燥し、モしてＨＰＬＣによって精製した。

硫酸化したペプチドを、流速５ｍ１２／分及び波長２４
０ｎｍで、０−０Ｍ重炭酸アンモニウム中のアセトニト
リルの２時間グラジゴント（１０〜４０％）を用いて、
Ｃ１８〜１０μ［イー・ニス・インダストリイズ（Ｅ　
Ｓ　　Ｉ　ｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）　］　　（１，２５Ｘ
　３０　ｃｍ）カラムで分取型逆相ＨＰＬＣによって精
製した。プールするフラクション及びペプチドの純度を
、ボンタパックＣＩ８・１０μウオーターズカラム（０
，３０Ｘ　３０ｃｍ）を用いて、流速２ｍρ及び波長２
１５ｎｍで重炭酸アンモニウム中のアセト二ｌ・リルグ
ラジエン１−で分析ＨＰ　１．、　Ｃによって測定した
。

硫酸化したペプチドの純度を分析１１ＰＬＣ，７ミノ酸
分析、ＴＪＶ、ＩＲｌＭＳ及びＮＭＲで測定しｌこ。

以下の実施例は上記方法を利用して本発明の食欲調節活
性ペプチドの製造を更に詳細に説明するものである。以
下の実施例において、特記せぬ限り、ペプチドをアミノ
酸分析、分析ＨＰＬＣ，ＵＶＸ　ＩＲ及びＭＳを用いて
同定し、そしてその純度を測定した。

実施例　ｌ Ｐｂｅ−ＮＨｚの製造 Ｂｏｃ　−Ｎ−メヂルーＰｈｅ（５ｇ、１７．８ミリモ
ル）を０°Ｃに冷却した塩化メチレン５０＋＋＋１２及
びジメチルホルム、アミド５０ｍＱの混合物に溶解し、
撹拌しなからジシクロへキシルカルボジイミド（１，８
ｇ５９ミリモル）を加え、混合物を０°Ｃで６０分間撹
拌した。

別個に、ペンシリルヒドリルアミン樹脂（０゜５６ミリ
モルＮ／ｇ）（スチレンと１％ジヒニルベンゼンとの交
差結合した共重合体）５ｇを塩化スチレン中の１０％ジ
イソプロピルエチルアンで３０分間洗浄し、濾過し、塩
化スチレン、ジメチルホルムアミド及び塩化メチレンで
洗浄した。この樹脂に上記の冷却した混合物を加え、室
温で２４時間撹拌した。樹脂を濾別し、塩化メチレン、
ジメチルホルムアミド、イソプロパツール、塩化メチレ
ン、ジメチルホルムアミド、インプロパツール及び塩化
スチレンで洗浄し、高真空下で乾燥した。

アミノ酸分析により、樹脂１ｇ当りＮ−メチルフェニル
アラニン０．２０ミリモルを含有する樹脂であることが
わかった。未反応アミノ基を、該樹脂を塩化メチレン中
の無水酢酸５ｍα及びジイソプロピルエチルアミン５＋
＋ｏ２と共に６０分間振盪することによって、キャッピ
ングした。樹脂を濾過し、塩化メチレン、イソプロパツ
ール、ジメチルホルムアミド及び塩化メチレンで洗浄し
た。Ｂｏｃ　−Ｎ−メチル−フェニルアラニンｔｌ脂４
．８ｇ（０，９６ミリモル）を上記方法を用いて、引き
続き固相合成に付した。全てのカップリングを述べた如
きＢｏｃ−アミノ酸の対称性無水物を用い行った。工程
１６及び２０で、活性化したアミノ酸を次の如く対応す
る反応時間によって加えた：６回の個々の循環を次のも
のを用いて行った：　Ｂｏｃ−アスパラギン酸−β−ベ
ンジェステル（１，６ｇ、５ミリモル、６０分、ｌ−６
ｇ５５ミリモル、６０分）、Ｂｏａ−メチオニン（１，
２５ｇ、５ミリモル、３０分、１．２５ｇ、５ミリモル
、３０分）　、Ｂｏｃ−Ｎ’−ホルミル−トリプトファ
ン ル、３０分、１．７０ｇ，５ミリモル、３０分）、Ｂｏ
ｃ−グリシン（９００ｍｇ．５ミリモル、３０分、９０
０ｍｇ，５ミリモル、３０分）、ＢＯＣ−ε−２−クロ
ロ−Ｚ−リジン（２．ｌＯｇ，５ミリモル、３０分、２
．ｌＯｇ，５ミリモル、３０分）及びＢｏｃ　−２、６
−シクロロベンジルーチロシン（２．２ｇ。

５ミリモル、３０分、２．２ｇ、５ミリモル、３０分）
。

Ｂｏｃ−保護基の開裂、及び塩化メチレン中で無水酢酸
２０ｍｆｆ，ピリジン２０ｍ（ｌによる樹脂）６０分間
アセチル化により、アセチル化されたヘプタペプチジル
樹脂５．２ｇを得た。

ヘフチジル樹脂１．９ｇをジメヂルスルファイド（２ｍ
ｆｆ）、アニソール（　１　＋ｎＱ）及びジチオエタン
（０−７ｍ（１）を含むＨＦ２５ｍ０．で０°Ｃにて１
時間処理して開裂させた。蒸発後、樹脂を酢酸エチル２
容量で洗浄し、次に３０％酢酸４Ｘ１５ｍＱで滴定し、
凍結乾燥し、粗製のペプチド３００ｍｇを得ｌこ。

粗製のベプチＦ１５０ｍｇを（２　、３　Ｘ　３　０ｃ
ｍ）マイクロ・ポンダパックＣ１８カラムで分取Ｈ　Ｉ
）ＬＣによって精製した。ペプチドを流速８　ｍｏ．／
分、波長２８０ｎｍで、０．０２２％ＴＦＡ／ＣＨ３Ｃ
Ｎの５〜６５％の直線グラジェントで溶離した。主ピー
クを捕集Ｌ２、凍結乾燥しＡｃ　−　Ｔｙｒ　−　Ｌｙ
ｓ−Ｇｌｙ　−Ｔｒｐ　−　Ｍｅｔ　−　Ａｓｐ　−　
Ｎ−メチル−円１ｅ−ＮＨ２　　２　０ｍｇ　（　１１
％を得た）。この物質はＨＰＬＣによって均等であり、
正確なアミノ酸分析及びＭＳを示した。

線状ペプチド１９ｍｇ（０．０２ミリモル）をＤＭＦｌ
ｍＱに溶解し、３ＭＨＣ０．／ジオキサン０　、　１　
ｍＱを加えた。反応混合物を蒸発乾固させ、ＤＭＦ　１
ｍＱに再溶解させた。混合物を一２０°Ｃに冷却した後
、ジフェニルホスホリルアジド（０．１３ｍＱ。

０、００５ミリモル）を加え、混合物を一２０°Ｃで１
時間撹拌した。その後、反応混合物をＤＭＦ１５ｍＬ２
で希釈し、ｐ■イをＮ−メチルモルホリンで７、５に調
節した（湿ったｐＨステイアで測定）。

反応混合物を５°Ｃに加温し、この温度にてｐＨ７。

４で２日間放置した。このｐＨ値を少量のＮ−メチルモ
ルホリンの添加によって保持した。

反応混合物を真空下で濃縮し、残渣を酢酸１ｍＱに溶解
し、（２．３Ｘ３０ｃｍ）マイクロ・ボンダバックｃｏ
ｇカラムに加えた。カラムを流速８．０ｍ０１分で、０
．０２２％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮの５〜６５％の遅いグラ
ジェント（４時間）で溶離した。

検出は２８０ｎｍで行った。フラクションを３分間隔で
捕集し、分析ＨＰＬＣによって検査後、カットを行った
。環式ペプチドに対応するピークを捕集し、凍結乾燥し
、式 ％式％ ＮＨ□のペプチド８ｍｇ（４５％）を得た。

この物質はＨＰＬＣにより均等であり、次のアミノ酸分
析を示した： Ａｓｐｌ　、０　０（１）；　Ｇｌｙｌ　、０　７（１
）；　Ｍｅｔｌ　、００（１）；　Ｔｙｒｌ　、１　２
（１）；　Ｌｙｓｌ　、０　０（１）；　Ｔｒｐ及びＮ
−メチル−Ｐｈｅは測定されず、正確なＭＳを有してい
た。

実験式　Ｃ＋ｓＨａ□Ｎ＋ｏＯ＋ｏＳ　　　ＭＷ９８２
．１４。

ピリジンアセチルスルフェート（ＰＡＳ）１９Ｑｍｇに
乾燥蒸留したピリ９フｌｏｍＱヲ加えた。得られた混合
物を撹拌しながら６０°Ｃに１０分間加熱した。溶液を
冷却し、この溶液に、ピリジンｌメチル−Ｐｈｅ　８　
、　Ｏ　ｍｇを加え、反応混合物を６０℃で１時間撹拌
した。その後、反応混合物を重炭酸アンモニウム２容量
で中和し、そして凍結乾燥した。精製をイー・ニス・イ
ンダストリイズＣ＋ａ−１　０　ｐ−カラム（１．２５
Ｘ３０ｃｍ）で、流速５ｍ１２／分及び検出、波長２４
０ｎｍで、１２０分間で０。

０５Ｍ　　ＮＨ．ＨＣＯ，／ＣＨ．ＣＮのｌＯ−４０％
直接グラジェントを用いて行った。収量は式％式％ のペプチド７、Ｏｍｇ（８７％）であった。アミノ酸分
析：　Ａｓｐｌ　、０　０（１）；　Ｇｌｙｌ　、００
（１）；Ｍｅｔｌ　、０　０（１　）；　Ｔｙｒｌ　、
１　２（１　）；　Ｌｙｓｌ　、００（１）；Ｔｒｐ及
びＮ−メヂルーＰｈｅは測定されなかった。

実験式　Ｃ４９Ｈ６２Ｎ１００１３Ｓ２　　　ＭＷ１０
６３．２１実施例　２ Ｔｙｒ（ＳＯ２Ｆ）−Ｍａｔ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ
（ＳＯ２Ｆ）−Ｎ−メチル−Ｐｈｅ−ＮＯ３の製造 実施例１と同様の方法で得られたＢｏｃ−Ｎ−メチルフ
ェニルアラニン樹脂１０ｇ（０，８ミリモル）を実施例
１と同様の方法を用いて引き続き固相合成に付した。前
記の如く、全てのカップリングをＢｏｃ−アミノ酸の対
称性無水物を用いて行った。

工程１０及び２０で、活性化したアミノ酸を次の如く対
応する反応時間によって加えた＝６回の個々の循環を次
のものを用いて行った；Ｂｏｃ−０−ベンジル−スレオ
ニン（１，５ｇ、５ミリモル、６０分、１．．５ｇ、５
ミリモル、６０分）　、Ｂｏｃ−メチオニン（］、、２
５ｇ、５ミリモル、３０分、１．２５ｇ、５ミリモル、
３０分）　、Ｂ−Ｎ’−ホルミルトリプトファン（１，
７ｇ、５ミリモル、３０分、１゜７ｇ１５ミリモル、３
０分）、Ｂｏｃ−グルタミン酸−γ−ベンジルエステル
（１，６ｇ、５ミリモル、３０分、１．６ｇ、５ミリモ
ル、３０分）、Ｂｏｃ−メチオニン（１，２５ｇ、５ミ
リモル、３０分、１゜２５ｇ、５ミリモル、３０分）及
びＢＯＣ−２，６−シクロロペンジルーヂロシン（２，
２ｇ、５ミリモル、３０分、２．２ｇ、５ミリモル、３
０分）。ＢＯＣ−保護基の脱保護を実施例１に述べた如
くして行い、ヘプタペプチジル樹脂４．９ｇを得た。こ
の樹脂１ｇを、ジメチルスル７アイド（１２ｍ１２）　
、ｐ　−クレゾール（２，０ｍ＜７）及びジチオエタン
（ｌ　ｍ４）を含むＨＦ　５　ｍＱで、０°Ｃにて１時
間処理して開裂させた。歩容量に蒸発させた後、反応容
器中に新しい無水ＨＦ（１８ｍＯ）を蒸留によって加え
、ＯｏＣで２時間第二の処理を行った。蒸発後、樹脂を
酢酸エチルで洗浄し、次に３０％酢酸で処理し、濾過し
、凍結乾燥し、粗製のペプチド２１０ｍｇを得た。この
粗製のペプチドｌＱＯｍｇを（２，３Ｘ３００ｍ）マイ
クロ・ポンダパックＣ１ａカラムで分取ＨＰ　Ｌ　Ｃに
よって精製した。ペプチドを流速８ｍＱ１分で、０．０
２２％Ｔ　Ｆ　Ａ　／　ＣＨ３ＣＮの５〜６５％の直線
グラジェントで溶離し、検出は２８０ｎｍであった。主
なピークを捕集し、凍結乾燥し、Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌ
ｕ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｎ−メヂルーＰｈｅ−Ｎ
Ｈ２１５ｍｇ（１９％）が得られ、この物質にＨＰ　Ｌ
　Ｃによれば均等であり、正確なアミノ酸分析及びＭＳ
を示した。

この線状ペプチド１５ｍｇ（０，０２ミリモル）を実施
例１１こ詳細に述べた如くして、ジフェニルホスボリル
アジドを用いて環形成させ、式％式％ のペプチド６ｍｇ（収率４Ｉ％）が得られ、この物質は
ＨＰ　Ｌ　Ｃによれば均等であり、次のアミノ酸分析を
示しｌ−：　Ｔｈｒｏ、９０（１）；　ＧＩｕｌ、Ｏ０
（１）；　Ｍａｔ２．Ｏ０（２）；　Ｔｙｒｌ　、００
（１）；　ＴｒｐＯ，８０（１）；　Ｎ−メチル−Ｐｈ
ｅは測定されず、そして正確なＭＳを有していた。

実験式　Ｃ４９Ｈ６３Ｎ９０１０Ｓ２　　　　ＭＷ　１
００２．０ピリジンアセチルスルフエート（ＰＡＳ）８
０ｍｇに乾燥蒸留したピリジン６ｍ（ｔを加えた。生じ
た混合物を撹拌しながら６０°Ｃに１０分間加熱した。

この溶液を冷却し、この溶液にピリジン３ｍＱに溶ＮＨ
２３ｍｇを加え、反応混合物を６０°Ｃで１時間撹拌し
た。その後、反応混合物を重炭酸アンモニウム２容量で
中和し、そして凍結乾燥した。精製をイー・ニス・イン
ダストリイズＣ１８−１０μカラム（１，２５Ｘ３０ｃ
ｍ）で、流速５ｍＱ／分及び検出波長２４０ｎｍで、１
２０分間において０．０５ＮＨ４ＨＣＯ３／ＣＨ１ＣＮ
の１０〜４０％直線グラジェントを用いて、分取型逆相
ＨＰＬＣによって行った。収量は式 ％式％ のペプチド１．４ｍｇ（４５％）であった。アミノ酸分
析：　ＴｈｒＯ，８５（１）；　Ｇｌｕｌ　、００（１
）；　Ｍｅｔｌ、８０（２）；　Ｔｙｒｌ、Ｏ０（１）
；　Ｔｒｐｏ、７５（１）；Ｎ−メチル−Ｐｈｅは測定
されなかった。

実験式　Ｃ４５Ｈａ３ＮｓＯ＋ｓＳａ　　　　ＭＷ　１
１６２．３２実施例　３ メヂルーＰｈｅ−ＮＨｚの製造 実施例１と同様の方法で得られたＢｏｃ−Ｎ−メチルフ
ェニルアラニン５．０ｇ（１ミリモル）ヲ、実施例１に
述べた如き同一方法を用いて、引き続き固相合成に付し
た。全カップリングを前記の如くＢｏｃ−アミノ酸の対
称性無水物を用いて行った。

工程１６及び２０で、活性化したアミノ酸を次の如対応
する反応時間によって加えた２６回の個々の循環を次の
ものを用いて行った；Ｂｏｃ−０−ベンジル−スレオニ
ン（１，５ｇ、５ミリモル、６０分、］、５ｇ、５ミリ
モル、６０分）；Ｂｏｃ−グルタミン酸−γ−ペンシル
エステル（１，６ｇ、５ミリモル、３０分、１．６ｇ、
５ミリモル、３０分）；ＢＯｃ−Ｎ’−ポルミル−トリ
プトファン（１，７ｇ、５ミリモル、３０分、１．．７
ｇ、５ミリモル、３０分）；　Ｂｏｃ−ダリンン（９０
０ｍｇ、５ミリモル、３０分、９００ｍｇ、５ミリモル
、３０分）；Ｂｏｃ−メチオニン（１，２５ｇ、５ミリ
モル、３０分、１゜２５ｇ、５ミリモル、３０分）及び
Ｂｏｃ−２，６−シクロロペンジルーチロシン（２，２
ｇ、５ミリモル、３０分、２．２ｇ、５ミリモル、３０
分）。

Ｂｏｃ−保護基の脱保護を実施例１に述べた如くして行
い、ヘプタペプチジル樹脂５．８０ｇを得た。

この樹脂２．４ｇを実施例２と同一方法を用いて、ジメ
チルスルファイド、ｐ−クレゾール及びジチオエタンを
含むＨＦで開裂させた。樹脂を酢酸エチルで洗浄し、次
に３０％酢酸で滴定し、濾過し、凍結乾燥し、粗製のペ
プチド４５２ｍｇを得た。

粗製のペプチド１００ｍｇを（２，３Ｘ３０ｃｍ）マイ
クロ・ボンダパック０１８カラムで分取ＨＰ　ＬＣによ
って精製した。ペプチドを流速８ｍ（ｉ／分で０．０２
２％Ｔ　Ｆ　Ａ　／　ＣＨ３ＣＮの５〜６５％の直線グ
ラジェントで溶離した。検出波長は２８０ｎｍであった
。主なピークを捕集し、凍結乾燥し、Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−
Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｎ−メチル−Ｐｈｅ
−ＮＨ２２０ｍｇ（２３％）を得た。この物質はＨＰＬ
Ｃによれば均等であり、正確なアミノ酸分析及びＭＳを
示しｌこ。

この線状ペプチド２０ｍｇ（０，０２ミリモル）を実施
例１に述べた如くして、ジフェニルホスホリルアジドを
用いて環形成させ、式 のペプチド４ｍｇ（収率２１％）を得た。

この物質はＨＰＬＣによれば均等であり、次のアミノ酸
分析を示した； ＴｈｒＯ，９０（１）；　Ｇｌｕｌ　、００（１）；　
Ｇｌｙｌ　、０Ｑ（１）；　ＭｅｔＯ−９０（１）；　
Ｔｙｒｏ、９７（１）；Ｔｒｐｏ、６３（１）；　Ｎ−
メチル−Ｐｈｅは測定されず、そして正確なＭＳを有し
ていた。

実験式　ＣｉａＨ５７ＮｇＯ１ｏＳ　　　　ＭＷ　９２
ＬＯ７４ｍｇをピリジン５ｍＱ、に溶解し、実施例１に
述べた方法と同様にして製造したピリジン５ｍ１２中の
ピリジニウムアセチルスルフェート（ＰＡＳ）８０ｍｇ
の溶液に加えた。反応混合物を６０°Ｃで１時間撹拌し
、次に重炭酸アンモニウム２容量で中和し、−４８＝ そして凍結乾燥した。精製を実施例１に述べた同一条件
を用いて分取ＨＰＬＣによって行った。収量は式 ％式％ のペプチド３−８ｍｇ（９４％）であった。アミノ酸分
析：Ｔｈｒｏ、９０（１）；ＧＩｕｌ、０４（１）；Ｇ
ｌｙｌ　、０１（１）；Ｍｅｔｏ、８５（１）；　Ｎ−
メチル−Ｐｈｅ及びＴｒｐは測定されなかった。

実験式　Ｃ４６Ｈ５７Ｎ９０１６Ｓ３　　　　ＭＷ　１
０８８．２０実施例　４ 試験管内受容Ｉ合評側分析 脂肪を清浄した凍結したウシ線条体（約５ｇ）及び新鮮
なラットの膵臓（約５ｇ）並びに他の組織をヘツプス（
ＨＥＰＥＳ）緩衝剤＃１　（１０ｍＭ　　ＨＥＰＥＳ、
１３０ｍＭ　　ＮａＣ１，５ｍＭＭｇＣｌ□、ｐＨ７，
４）中で、湿った重量／容量を基準にして組織１部当り
緩衝剤３５部（約１７５ｍＱ）を用いて均等化した。組
織をポリトロン・ホモジナイザ＝（Ｐ　ｏｌｙＬｒｏｎ
　ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）を用いて６にセットシて、
０℃で２×約１５秒間均等化した。組織をＱ　’Ｃにて
１０分間、４８，０００Ｘｇで遠心分離した。生じた組
織ベレットをヘツプス綬衝剤＃２　（１０ｍＭ　　ＨＥ
ＰＥＳ、１３０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、
フェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）１
ｍｇ／Ｌバシトラミン（Ｂ　ａｃｉｔｒａｃｉｎ　２０
０　ｍｇ／　Ｑ）に懸濁させた：緩衝剤８０部当り線条
体組織１部及び緩衝剤７０部当り膵臓組織（初期の湿っ
た重量）１部。

種々な濃度の天然のＣＣＫ−８または３Ｈ−ＣＣＫ−８
−（Ｓｏ３Ｈ）による式Ｉのペプチド（最終濃度−０，
１５ｍＭ）及び組織均等体（最終容量２ｍ（＋中線条体
の蛋白質０．２６ｍｇ；最終容量１＋＋Ｊ中膵臓蛋白質
０゜１６５　ｍｇ）を合わせて培養を開始した。試料を
２５°Ｃで３０分間培養し、ザンドベック・バキュム・
フィル１−レイジョン・マニフォルド（Ｓ　ａｎｄｂｅ
ｃｋ　Ｖａｃｕｕｍ　Ｆ　１ｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｍａｎ
ｆｉｏｌｄ）上であらかじめ湿らぜたワトマンＧＦ／Ｂ
フィルターに混合物を注ぐことによって、培養を止めた
。培養管を氷冷１７たヘツペス緩衝剤＃２の２部３ｍＱ
で洗浄し、洗液をＧＦ／Ｂフィルターを通して濾過しし
た。フィルターを１０分間風乾し、ベックマンＨＰ　／
　ｂレディー・ソルダ・シンチレーション・カティル（
Ｂ　ａｃｋｍａｎ　ＨＰ　／　ｂ　Ｒｅａｄｙ　−５ｏ
１ｖ　５ｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　ｃｏｃｋｔａｉｌ
）　１２ｍ（＋を有するシンチレーションがらずびんに
入れた。このビンを２〜１２時間振盪し、ベックマン・
モデル７８００液体シンチレーシ３ン分光計を用いて計
数した。

非特異的結合を１ＨＭ天然ＣＣＫ−８の存在下において
測定し、全ての試料から引いて特異結合を決定シタ。全
特異的３Ｈ−ＣＣＫ−８−（ＳＯ３Ｈ）結合の５０％を
抑制するために必要なペプチドの濃度（ＩＣｓｏ値）を
ロッグーブロビット（ｌｏｇ−ｐｒｏｂｉｔ）分析によ
って決定した。

その結果を次の第１表に要約した。

実施例　５ ２−食事供給評価分析 体重１８０〜２００ｇの雄スプラーグードウレイ　［Ｓ
ｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ　　（ＣＤ）　］　ラット
　［チャールス・リバー・ブリーティング・ラボラトリ
イズ（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒ１ｖｅｒ　Ｂ　ｒｅｅｄｉｎ
ｇ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）］を２２℃に保持さ
れた室中で１２時間、光／暗循環（６ａ、ｍ、〜６　ｐ
、ｍ、）に順応させた。次にラットを２日間断食させ、
秤量し、個々のかごに入れ、４日間の食事訓練を始めた
。この期間中、ラットに９＋００ａ、ｍ、から１０　：
ＯＯａ、ｍ、までの１時間びん中の粉砕した実験食［ブ
リナ・ラブ・チアウ（Ｐｕｒ　ｉｎａ　Ｌ　ａｂ　Ｃｈ
ｏｗ）　］　を与え、Ｉ　Ｏ：００ａ、ｍ、からｌ　２
　：ＯＯｐ、ｍ、までびんを除去し、１２：００から１
＋００ｐ、ｍ、までかごにもどした。この［１−２−Ｎ
給餌法の下で、はとんどのラットは１日ｋ）たり２４時
時間音自由に食べるラットとほぼ同程度の１日あたりの
餌を、餌に近つくこの２時間の間に食べるようになる。

第４日日に、ラントを再び秤量し、体重５ａ以」二を失
ったラブＩ・は試験から除外した。次に動物を実験群（
ｎ−５〜６）及び対照群（ｎ−６〜１２）に区分したか
、但し、体重は釣り合っていなかった。

本発明のペプチドを３２０μｇ／ｍρ／ｋｇ体重の濃度
で、可溶性ならば、塩水に、または不溶性ならば、１％
アラヒアゴム中に懸濁させ、５日日の植物供給の第−食
の１５分前に腹腔内投与した。

次いでラットに前の４日間中のように食物を与え、食物
消費を測定するために、食物カップを各食事の前後の双
方で秤量した。食物摂取を、種々な群に対する対照群の
百分率として、平均及び平均の標準誤差として表わした
。処置した群の値をｔ−試験分析評価によって対照群の
価と比較した。その結果を第１表に要約した。

実施例　６ 胃液４００ｐＱ並びに実施例１のペプチドＰｈｅ−Ｎｌ
（２］　２００　／’　ｇ及びＣＣＫ　−８［Ｈ−Ａｓ
ｐ−Ｔｙｒ（Ｓ０、Ｈ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍ
ｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２］を３７°Ｃで種々な時
間培養した。減成をマイクロ・ポンダバックＣＩ８カラ
ム（０，４Ｘ３０ｃｍ）で流速２　ｍ１２／分及び検出
波長２２５ｎｍにて４０分間、Ｏ，ＯＩＭＮＨ４ＡＣ／
ＣＨ３ＣＮの１０−４０％直線グラジェントを用いて分
析ＨＰ　Ｌ　Ｃで監視した。

実施例１に対する速度は硫酸化さなていないの推定され
た生成に基すき、そしてＣＣＫ−８に対しては、ＣＣＫ
−８に対応するピークの消失に基ずいている。

凶グ迭」　１肌くテΩ　頭」（軒Ｊ３ヴ４鵠実施例１　
　　　０　　　　　　　　０６０１゜４ １８０　　　　　　　３．６ １３８０　　　　　　１２．８ ＣＣＫ−８００

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ I 式中、Ｘ＝ＣＯ−低級アルキル Ｒ＝Ｌｙｓ、Ｏｒｎ Ｒ＾１＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ Ｒ＾２＝Ｐｈｅ、Ｎ−メチル−Ｐｈｅ Ｙ＝ＮＨ＿２、ＮＨＣＨ＿３ のペプチドまたはその製薬学的に許容し得る塩。 ２、Ｘ＝ＣＯ−ＣＨ＿３、Ｒ＝Ｌｙｓ、Ｏｒｎ；Ｒ＾１
   ＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ；Ｒ＾２＝Ｎ−メチル−Ｐｈｅまたは
   Ｐｈｅ；及びＹ＝ＮＨ＿２である特許請求の範囲第１項
   記載のペプチド。 ３、Ｒ＝Ｌｙｓ；Ｒ＾１＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ；Ｒ＾２＝Ｐ
   ｈｅ、Ｎ−メチル−Ｐｈｅである特許請求の範囲第２項
   記載のペプチド。 ４、Ｒ＾１＝Ｍｅｔ；及びＲ＾２＝Ｎ−メチル−Ｐｈｅ
   が式▲数式、化学式、表等があります▼ を有する特許請求の範囲第３項記載のペプチド。 ５、Ｒ＾１＝Ｍｅｔ；Ｒ＾２＝Ｐｈｅが式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する特許請求の範囲第３項記載のペプチド。 ６、Ｒ＾１＝Ｎｌｅ；Ｒ＾２＝Ｎ−メチル−Ｐｈｅが式
   ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する特許請求の範囲第３項記載のペプチド。 ７、Ｒ＝Ｏｒｎ及びＲ＾１＝Ｍｅｔ；Ｒ＾２＝Ｎ−メチ
   ル−Ｐｈｅが式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する特許請求の範囲第２項記載のペプチド。 ８、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｒ＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ Ｒ＾１＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ Ｒ＾２＝Ｔｈｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｓｅｒ（ＳＯ＿３Ｈ）
   、Ｈｙｐ（ＳＯ＿３Ｈ） Ｙ＝ＮＨ＿２、ＮＨＣＨ＿３ のペプチドまたはその製薬学的に許容し得る塩。 ９、Ｒ＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ；Ｒ＾１＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ；Ｒ
   ＾２＝Ｔｈｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｓｅｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、
   Ｈｙｐ（ＳＯ＿３Ｈ）；及びＹ＝ＮＨ＿２である特許請
   求の範囲第８項記載のペプチド。 １０、Ｒ＝Ｍｅｔ；Ｒ＾１＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ；Ｒ＾２＝
   Ｔｈｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｓｅｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｈｙｐ
   （ＳＯ＿３Ｈ）である特許請求の範囲第９項記載のペプ
   チド。 １１、Ｒ＾１＝Ｍｅｔ及びＲ＾２＝Ｔｈｒ（ＳＯ＿３Ｈ
   ）が式▲数式、化学式、表等があります▼ を有する特許請求の範囲第１０項記載のペプチド。 １２、式 ▲数式、化学式、表等があります▼III 式中、Ｒ＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ Ｒ＾１＝Ｔｈｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｓｅｒ（ＳＯ＿３Ｈ）
   、Ｈｙｐ（ＳＯ＿３Ｈ） Ｙ＝ＮＨ＿２、ＮＨＣＨ＿３ のペプチドまたはその製薬学的に許容し得る塩。 １３、Ｒ＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ；Ｒ＾１＝Ｔｈｒ（ＳＯ＿３
   Ｈ）、Ｓｅｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｈｙｐ（ＳＯ＿３Ｈ）及
   びＹ＝ＮＨ＿２である特許請求の範囲第１２項記載のペ
   プチド。 １４、Ｒ＝Ｍｅｔ；Ｒ＾１＝Ｔｈｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｓ
   ｅｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｈｙｐ（ＳＯ＿３Ｈ）である特許
   請求の範囲第１３項記載のペプチド。 １５、Ｒ＾１＝Ｔｈｒ（ＳＯ＿３Ｈ）が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する特許請求の範囲第１４項記載のペプチド。 １６、式 Ｘ−Ｔｙｒ（ＳＯ＿３Ｈ）−Ｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｒ＾
   １−Ａｓｐ−Ｒ＾２−Ｙ　IV式中、Ｘ＝ＣＯ−低級アル
   キル Ｒ＝Ｌｙｓ、Ｏｒｎ Ｒ＾１＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ Ｒ＾２＝Ｐｈｅ、Ｎ−メチル−Ｐｈｅ Ｙ＝ＮＨ＿２、ＮＨＣＨ＿３ のペプチドまたはその製薬学的に許容し得る塩。 １７、式 Ｔｙｒ（ＳＯ＿３Ｈ）−Ｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｒ＾１−
   Ｒ＾２−Ｎ−メチル−Ｐｈｅ−ＹＶ 式中、Ｒ＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ Ｒ＾１＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ Ｒ＾２＝Ｔｈｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｓｅｒ（ＳＯ＿３Ｈ）
   、Ｈｙｐ（ＳＯ＿３Ｈ） Ｙ＝ＮＨ＿２、ＮＨＣＨ＿３ のペプチドまたはその製薬学的に許容し得る塩。 １８、式 Ｔｙｒ（ＳＯ＿３Ｈ）−Ｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−
   Ｒ＾１−Ｎ−メチル−Ｐｈｅ−ＹVI 式中、Ｒ＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ Ｒ＾１＝Ｔｈｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｓｅｒ（ＳＯ＿３Ｈ）
   、Ｈｙｐ（ＳＯ＿３Ｈ） Ｙ−ＮＨ＿２、ＮＨＣＨ＿３ のペプチドまたはその製薬学的に許容し得る塩。 １９、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｘ＝ＣＯ−低級アルキル Ｒ＝Ｌｙｓ、、Ｏｒｎ Ｒ＾１＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ Ｒ＾２＝Ｐｈｅ、Ｎ−メチル−Ｐｈｅ Ｙ＝ＮＨ＿２、ＮＨＣＨ＿３ のペプチドまたはその製薬学的に許容し得る塩の食物摂
   取抑制有効量を動物に投与することを特徴とする該動物
   における食物摂取の抑制方法。 ２０、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｒ＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ Ｒ＾１＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ Ｒ＾２＝Ｔｈｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｓｅｒ（ＳＯ＿３Ｈ）
   、Ｈｙｐ（ＳＯ＿３Ｈ） Ｙ＝ＮＨ＿２ＮＨＣＨ＿３ のペプチドまたはその製薬学的に許容し得る塩の食物摂
   取抑制有効量を動物に投与することを特徴とする該動物
   における食物摂取の抑制方法。 ２１、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｒ＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ Ｒ＾１＝Ｔｈｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｓｅｒ（ＳＯ＿３Ｈ）
   、Ｈｙｐ（ＳＯ＿３Ｈ） Ｙ＝ＮＨ＿２、ＮＨＣＨ＿３ のペプチドまたはその製薬学的に許容し得る塩の食物摂
   取抑制有効量を動物に投与することを特徴とする該動物
   における食物摂取の抑制方法。 ２２、式 （ａ）Ｘ−Ｔｙｒ（ＳＯ＿３Ｈ）−Ｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
   −Ｒ＾１−Ａｓｐ−Ｒ＾２−Ｙ式中、Ｘ＝ＣＯ−低級ア
   ルキル Ｒ＝Ｌｙｓ、Ｏｒｎ Ｒ＾１＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ Ｒ＾２＝Ｐｈｅ、Ｎ−メチル−Ｐｈｅ Ｙ＝ＮＨ＿２、ＮＨＣＨ＿３ （ｂ）Ｔｙｒ（ＳＯ＿３Ｈ）−Ｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｒ
   ＾１−Ｒ＾２−Ｎ−メチル−Ｐｈｅ−Ｙ 式中、Ｒ＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ Ｒ＾１＝Ｍｅｔ、Ｎｌｅ Ｒ＾２＝Ｔｈｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｓｅｒ（ＳＯ＿３Ｈ）
   、Ｈｙｐ（ＳＯ＿３Ｈ） Ｙ＝ＮＨ＿２、ＮＨＣＨ＿３ （ｃ）Ｔｙｒ（ＳＯ＿３Ｈ）−Ｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇ
   ｌｕ−Ｒ＾１−Ｎ−メチル−Ｐｈｅ式中、Ｒ＝Ｍｅｔ、
   Ｎｌｅ Ｒ＾１＝Ｔｈｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｓｅｒ（ＳＯ＿３Ｈ）
   、Ｈｙｐ（ＳＯ＿３Ｈ） Ｙ＝ＮＨ＿２、ＮＨＣＨ＿３ からなる群より選ばれるペプチドまたはその製薬学的に
   許容し得る塩の食物摂取抑制有効量を動物に投与するこ
   とを特徴とする該動物における食物摂取の抑制方法。 ２３、治療的活性物質として用いる特許請求の範囲第１
   〜１８項のいずれかに記載のペプチドまたはその製薬学
   的に許容し得る塩。 ２４、食物摂取を調節または抑制する物質として用いる
   特許請求の範囲第１〜１８項のいずれかに記載のペプチ
   ドまたはその製薬学的に許容し得る塩。 ２５、対応する未硫酸化ペプチドを硫酸化剤で処理し、
   そして必要に応じて、得られるかかるペプチドを製薬学
   的に許容し得る塩に転化することを特徴とする特許請求
   の範囲第１〜１８項のいずれかに記載のペプチドまたは
   その製薬学的に許容し得る塩の製造方法。 ２６、特許請求の範囲第１〜１８項のいずれかに記載の
   ペプチドまたはその製薬学的に許容し得る塩及び無毒性
   の不活性な治療的に許容し得る担体物質を含有する製薬
   学的組成物。 ２７、特許請求の範囲第１〜１８項のいずれかに記載の
   ペプチドまたはその製薬学的に許容し得る塩及び治療的
   に不活性な担体物質を含有する食物摂取を調節または抑
   制するための製薬学的組成物。 ２８、病気の抑制または予防において特許請求の範囲第
   １〜１８項のいずれかに記載のペプチドまたはその製薬
   学的に許容し得る塩の使用。 ２９、食物摂取の調節または抑制において特許請求の範
   囲第１〜１８項のいずれかに記載のペプチドまたはその
   製薬学的に許容し得る塩の使用。 ３０、特許請求の範囲第２５項記載の方法で製造した特
   許請求の範囲第１〜１８項のいずれかに記載のペプチド
   またはその製薬学的に許容し得る塩。