PT87780B

PT87780B - Processo para a preparacao de analogos da colecistoquinina apropriados para o controlo do apetite

Info

Publication number: PT87780B
Application number: PT87780A
Authority: PT
Inventors: Vincent Stewart Madison; Waleed Danho; Joseph Triscari
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1987-06-22
Filing date: 1988-06-21
Publication date: 1992-10-30
Also published as: YU119088A; NO882745D0; AU1822688A; IL86796A0; DK340288A; EP0296574A2; ZA883929B; PT87780A; MC1964A1; NO882745L; FI883009A; EP0296574A3; FI883009A0; JPS6416798A; DK340288D0; KR890000515A; NZ225090A

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANÃLOGOS DA COLECISTOQUININA

APROPRIADOS PARA O CONTROLO DO APETITE

Em todos os países em que tem sido alcançada alguma propesi dade a obesidade é um dos factores que influência o aumento do custo dos cuidados de saúde. Existem, por exemplo, aproximadamente 34 milhões de americanos, com, pelo menos, mais do que 20% do seu peso adequado para o qual é aconselhável um tratamento de acordo com as con clusões alcançadas em consenso na recente conferência do NIH. (National Institutes of Health consensus Panei Report, February 13, 1985; Ver também Science, 20 7, 1019-10 20, 1985).

Nestes indivíduos a obesidade é um factor que contribui para o aumento da incidência da doença cardiovascular, hipertensão, hipe£ colesterolemia, diabetes não dependentes da insulina (NIDD) e cancro do útero, da mama, da bexiga, do cólon, do recto e da próstata. Além disso, a obesidade tem um peso negativo relativamente ao seu impacto na mortalidade; tal como na obesidade extrema ou obesidade mórbida a proporção da mortalidade pode ser 1200 % acima do normal. A redução do peso é muitas vezes recomendada como a primeira acção para os doentes que sofrem de NIDD, hipertensão, hipercolesterolomia, doenças das coronárias, gota e osteoartrite. Contudo, existem relativamente poucos instrumentos terapêuticos que os médicos possam utilizar para

-2realizarem esta perda de peso. Agentes farmacêuticos que são corren temente utilizados como adjuvantes no conselho de dieta, são efica zes para um curto tempo de terapêutica, mas são inaceitáveis para utilização a longo prazo devido ao desenvolvimento de tolerância, actividade sobre o sistema nervoso central e efeitos secundários indesejáveis. Assim, aproximadamente 95% dos doentes que têm perdi do com sucesso peso voltam ao seu peso inicial dentro de período de 12 a 84 meses. Um agente que reduz a ingestão de alimentos, simulan do os sinais de saciedade periféricos do corpo, espera-se que exiba maior sucesso para a utilização em terapêutica crónica com menores efeitos adversos e isento de actividade sobre o CNS.

A colecistoquinina (CCK) é uma hormona polipeptídica que foi primeiramente isolada sob a forma de um péptido com 33 amino-ácidos a partir do trato gastrointestinal porcino /Mutt et al., Biochem.J. (Proced. Biochem.Soc.) 1971,125,57p; Mutt et al., Clin. Endocrinol. supplement ,5_, 175 , 1976/ . -CCK administrada perifericamente mostrou produzir saciedade no rato e no macaco e infusões de CCK-8, o octapéptido análogo de CCK, mostrou diminuir a ingestão de comida no ho mem obeso e magro (Smith J., Int. J. Obesity 8_, 1984, Supplement 1,35; Jorpes et al., Acta Chem. Scand. ,18,2408-1964; Della-Fera et al. , Science,20 6,471-1979; Gibbs et al.,1973, J. Comp. Physiology and Psychology,84,488). Presentemente aceita-se que a CCK produz efeitos que induzem à saciedade e portanto pode ser utilizado para reduzir ou suprimir a ingestão de alimentos no homem.

_ljs<

/ {

-3A hormona polipeptídica, CCK-33, tem a sequência de aminoácidos seguinte

10

Lys-Ala-Pro-Ser-Gly-Arg-Val-Ser-Met-IIe15 20 “Lys-Asn-Leu-Gin-Ser-Leu-Asp-Pro-Ser-His25 30 “Arg-Ile-Ser-Asp-Arg-Asp-Tyr (SO^ H)-Met-Gly-Trp33

-Met-Asp-Phe-Nl·^ .

Fragmentos de CCK, p.ex., CCK-8 e CCK-7, também mostraram efeitos que induzem à saciedade. A CCK-8 tem a sequência de amino ácidos seguintes:

27 28 29 30 31 32 33

Asp-TyrlSO^Hl-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH^.

A CCK-7 tem menos um aminoácido que CCK-8, isto é, como se fosse CCK-8 menos Asp na posição 26. São conhecidos diversos aná logos de CCK-8. Por exemplo, a patente de invenção norte-americana NP. 4.400.377 descreve a utilização de análogos de CCK-8 para o tratamento da dor.

Δ patente de invenção norte-americana NQ.4.490.364 descreve os análogos de CCK-8 que estimulam a extracção da bexiga e que reforçam a secreção do suco gástrico. A utilização de análogos de CCK-8 como psicodepressores está descrita na patente de invenção norte-americana NQ.4.517.180 .

Ainda que sejam conhecidos diversos análogos de CCK-8, os derivados de CCK da presente invenção não são conhecidos nem a sua utilização, para suprimir a ingestão de alimentos nos animais. Além disso, ainda que os péptidos de ocorrência natural, CCK-33 , CCK-8 e CCK-7 possuam efeitos indutores da saciedade, esses péptidos têm uma acção curta. Assim, é um objectivo da presente invenção prepa_ rar análogos de CCK que exibam efeitos que induzem à saciedade, que são iguais ou superiores aos produzidos por CCK-8 de ocorrência na tural , mas que possuem efeitos mais duradoiros.

As abreviaturas e símbolos que se seguem são utilizados para representar os aminoácidos , grupos activos , grupos de protecção e outros.

Símbolo

AA

Ac

Suc

Mal

For

Aeg

Boc

Significado

Aminoácido

Acetilo

Succinilo

Malonilo

Formilo

Aminoetilglicina terc. Butiloxicarbonilo t

Os aminoácidos que aqui são indicados pela sua designação comum de três-letras, a menos que especifiçados de outro modo, re presentam sempre a fórmula do L-isómero.

A presente invenção diz respeito a péptidos de fórmula geral X-(R)_n-Tyr(SO₃H)-(R¹)_p-R²-R³-R⁴-R⁵-N-metil-Phe-Y I na qual

X representa um grupo de fórmula geral

-CO-R⁶ . -CO-OR⁶ . -CO-(CH„) -CH-,. -CO-CO-OR⁷ ou .

' -' _2 m 3 ' '

-CO-(CH_n) -CO-OR⁸2 q

Y representa um grupo de fórmula geral-0R⁸ ou NR^R^⁸

R representa Asp ou Aeg

R^ representa Met, Nlc, Leu ou lie 2

R representa Gly, Ala, D-Ala, ou J3-Ala

R representa Trp ou Trp(For)

R representa Met, Nlc. ou Nva

R⁸ representa ThríSO^H). SeríSO^H) ou HypCSO^H) θ

R representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo C^

R representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo C^_₃ou halogeno-alquilo C^_₃

R representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo C^_₃

R representa um átomo de hidrogénio ^Cl-3

R^O representa um átomo de hidrogénio ^Cl-3 n representa 0 ou 1 p representa 0 ou 1 m representa um número inteiro de 3 a q representa um número inteiro de 1 a ou um grupo alquilo ou um grupo alquilo com a condição de pelo menos um dos símbolos sentarem um resíduo que é significativo: e s ou de 4 a 14

X, R , p e q repreais respectivos aceitáveis,sob o ponto de vista farmacêutico.

Tal como aqui se utiliza a designação alquilo g refere -se a grupos metilo, etilo, n-propilo e isopropilo. A designação halogéneo refere-se a cloro, bromo, flúor e iodo. A designação halogeno-alquilo refere-se a grupos tais como clorometilo, bromometilo, trifluorometilo, cloroetilo, dicloroetilo , cloropropilo, bromoetilo, iodometilo e outros.

Os péptidos da presente invenção particularmente preferidos

Ac-Tyr(SOgH)-Nle-Gly-Trp-Nle-Thr(SOgH)-N-metil-Phe-NHg e

Ac-Tyr(SOgH)-Gly-Trp-Met-Thr(SOgH)-N-metil-Phe-NHg.

-7A presente invenção também se refere a composições para suprimir a ingestão de alimentos nos animais, que consistem numa quantidade que suprime a ingestão de alimentos de péptidos de fór mula geral I, ou dos seus sais aceitáveis em farmácia.

Tais composições podem ser preparados por métodos convencio nais e podem conter veículos ou/e agentes diluentes. Ainda outro aspecto da presente invenção diz respeito a um método para suprimir a ingestão de alimentos nos animais que compreende a administra, ção ao referido mamífero duma quantidade supressora da ingestão de alimentos de péptidos de fórmula geral I ou dos seus sais aceitáveis em farmácia. Por mamífero entende-se qualquer animal de sangue quente incluindo os seres humanos.

Tal como utilizado aqui, a designação quantidade supresso ra de ingestão de alimentos refere-se à quantidade do péptido (com base no peso) por kg corporal do animal que deve ser adminis trada para suprimir a ingestão de alimento. É atributo dos técnicos nesta matéria calcularem essas quantidades considerando o método de administração, o animal em causa e o peso do mesmo. A taxa, relacionada com a técnica, para a utilização de CCK-8 como agente de saciedade, está ilustrada pelas referência resumida por MORLEY, J.

E. /Minireview-The Ascent of Cholecystokinin (CCK) From Ent to Brain, Life Sciences ,30 ,479,19827.

-8Os polipéptidos de fórmula geral I podem ser administrados sob a forma de sais solúveis em água, geralmente como sais de metais alcalinos. Tais como os sais de sódio ou de potássio, os sais de alquilamina, de preferência dietilamina ou os sais de adição de ácidos, de preferência os cloridratos.

Os péptidos de fórmula geral I podem ser administrados a m_a míferos numa diversidade de formas de dosagem p.ex. por via endovenosas, intraperitoneal, sublingual, rectal, intranasal, bucal ou transdérmica.

Quando utilizados em composições para injecção, os péptidos da presente invenção e os seus sais são de preferência apresentados sob a forma de um pó estéril que será reconstituído com água ou ou tro veículo adequado imediatamente antes da administração. Por exem pio, para injecção endovenosa, podem-se utilizar soluções isotónicas aquosas estéreis de preferência soluções aquosas isotónicas de cloreto de sódio. O pó estéril é obtido de um modo conveniente por 1 iofilização; neste caso, o ingrediente activo é misturado convenientemente com um veículo inerte, tal como a lactose.

péptidos da presente invenção podem ser preparados utisínteses de fase sólida de acordo com o método descrito por Merrifield, J.Am. Chem. Soc.,85,2149 (1963) ainda

Os lizando-se geralmente sínteses químicas conhecidas equivalentes na técnica, am ser utilizadas. A síntese de fase sólida é iniciada extremidade do C-terminal do péptido que irá ser sint£ que outras também poss a partir da tizado por ligação a um aminoácido protegido por uma ligação ainda

-9a uma resina adequada, p.ex., benzilidrilamina (BHA) ou resina de metil benzidrilamina (MBH). As resinas de suporte BHA e MBHA são comercializadas e utilizadas de um modo geral quando o péptido a ser sintetizado tem uma amida não substituída no terminal carboxi.

Todos os dissolventes utilizados nas preparações aqui descritas, p.ex., cloreto de metileno (CH₂C1₂ ), 2-propanol , e dimetiJL formamida (DMF) eram do tipo Burdick and Jackson Distilled in Glass e utilizados sem qualquer outra destilação.

ácido trifluoracético (TFA), diisopropiletilamina (DIPEA) e diciclohexilcarbodiimida (DCC) foram obtidas da Chemical Dynamics Corp. e tinham o grau de pureza sequencial. 0 1,2-etanoditiol (EDT) foi adquirido da Sigma Chemical Co. e utilizado sem purifica ção ulterior. Todos os aminoácidos protegidos tinham a configuração L a menos que indicado de um outro modo e foram obtidos da Bja chem.

Nos métodos de síntese de fase sólida, os grupos de cadeia lateral reactiva de diversos radicais aminoácidos são protegidos tipicamente com grupos protectores apropriados que impedem a ocor rência de reacção química nesse local até que o grupo de protecção seja posteriormente eliminado.

Enquanto os grupos de protecção relativamente ao aspecto da síntese de que cada aminoácido pode ser protegido específica são descritos fase sólida, deve-se realçar por qualquer grupo protector

-10utilizado convencionalmente para o respectivo aminoácido na síntese da fase em solução. Entre os grupos de protecção incluem-se p.ex., grupos de protecção convencionais para grupos carboxilo es colhidos entre ésteres, tais como ésteres arílicos , particularmen te fenílicos ou fenílicos substituídos com grupos alquilo inferior halogéneo, nitro, tio ou tio-alquilo (C^ ?) inferior. Todos os grupos o(-amino foram bloqueados com funções Boc. Os grupos de cadeia lateral foram substituídos como se segue: Asp, Ser, Thr com benzilo; Trp com formilo e Tyr com 2,6-diclorobenzilo; Aeg com o grupo benziloxicarbonilo. A pureza destes compostos foi confirmada por cromatografia em camada fina (CCF) e rotação óptica. A resina de benzidrilamina (BHA) era um copolimero de estireno com 1% de d/ vinilbenzeno sob a forma de pérolas de 200 a 400 malhas, obtidas de Beckman Instruments. O conteúdo em azoto total era de 0,654 meg/g

Utilizaram-se os aparelhos seguintes: A cromatografia em camada fina (CCF) foi realizada em placa de vidro revestida com gel de sílica 60 F254 (Merck) utilizando-se sistemas de dissolventes apropriados. A detecção das manchas fez-se por irradiação de fluorescência no UV (absorção a 254 nm), coloração com iodo ou ninidrina (para aminas primárias e secundárias).

Para análise de aminoácidos os péptidos foram hidrolisados em ácido clorídrico 6N gue continha fenol à temperatura de 115°C durante 24 horas em tubos de hidrólise Reacti-Therm (Wheaton Scieri tific Company, Milville, N.J. 08332) As análises foram realizadas num analisador de aminoácidos Beckman 12ΪΜ.

A cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) foi condu zida num aparelho de controlo de dados laboratorial (LDC) constituído por uma bomba Constametric I, uma bomba Constametric III, um misturador programador dissolvente Gradient Master e um detector de UV de comprimento de onda variável Spectromonitor III. A análi se por HPLC foi realizada com colunas Waters Micro Bondapack C._θde fase inversa de 0 ,4 x 25 cm. A preparação das separações de HPLC preparativa realizaram-se numa coluna Partisil M20 10/50 ODS-3 de 2,5 x 50 cm, ou micro Bondapack de 2,3 x 30 cm; em ambos os casos foi utilizada uma pré-coluna de Whatman Co: Pell ODS compactada de um modo particular.

Os péptidos foram reunidos por fases num suporte sólido utilizando-se um sintetizador de péptidos Vega 250. O módulo quí mico foi controlado por um micro-processador Model 300 da Vega Biochemicals com operações manuais nas fases 16 e 20.

grupo Boc-N-metil-Phe foi ligado à resina benzi 1 idri 1 a_ mina de acordo com o método conhecido na técnica de preferência por um método que está descrito no exemplo 1. O conteúdo foi de terminado por análise de aminoácidos. Quaisquer grupos de amino ácidos não reactivos foram planeados por reagentes convencionais, de preferência com anidrido acético e diisopropiletilamina.

A síntese foi iniciada com resina e fracções de resina peptídica foram eliminadas de vários pontos para separar as pre parações análogas. O protocolo para o ciclo de síntese típico foi o seguinte:

t

-12Fase

Reagente

Tempo

7-8

11-15

18-19

20-21

23-24

1% EDT/CH₂C1₂ 50% TFA/CH₂C1₂ 1% EDT Repetição da fase 1	1x30 1x1	seg min
50% TFA/CH₂C1₂ 1% EDT	1x15	min
ch₂ci₂	1x30	seg
2-Propanol	1x30	seg
Repetição das fases 5 e 6
ch₂ci₂	2x30	seg
8% DIPEA	2x2	min
Repetição das fases 5-9
5 equiv. Boc-AA anidrido	1x30	min
1% DIPEA	1x5	min
Repetição das fases 6 e 9
Repetição das fases 16 e 17,	se é positivo
o teste de Kaiser
2-Propanol	1x30	seg
Repetição das fases 5 e 6
ch₂ci₂	1x30	seg
DMF	2x30	seg
ch„ci₉	3x30	seg

-13Os volumes dos dissolventes para todas as ções foram de 10 a 20 ml/g de resina. As ligações das como anidridos simétricos de Boc-aminoácidos.

xecutadas em cloreto de metileno à temperatura de 15 minutos e utilizando-se 10 equivalentes de Boc 5 equivalentes de DCC.

lavagens e liga foram realizaEstas foram eO°C, durante -aminoácidos e

As reacções de ligação foram controladas por teste de ninidrina de Kaiser, para determinar se a ligação estava completada após a fase 19. /TCaiser, E. et al., Anal. Biochem., 34 , 595-598. (1970)7. Os tempos de ciclo total variaram entre 54 e 160 minutos por resíduo. No caso de péptidos formilados, a fim de se manter o grupo formilo o referido tratamento pode ser realizado pelo seguin te modo: A 5,3 g da resina-peptídica são adicionados 12 ml de HF, contendo 31 ml de sulfureto de dimetilo e 4,6 ml de para-cresol, à temperatura de O°C durante uma hora. Após evaporação até um volume mínimo, destila-se 42 ml de HF anidro recente, num recipiente de reacção para um segundo tratamento durante duas horas à tejr peratura de O°C. O tratamento continua do mesmo modo que a síntese de péptidos não formilados referido detalhadamente no exemplo 1.

As resinas peptídicas reunidas totalmente foram secas sob vácuo durante a noite. As condições de desbloqueio e clivagem foram os processos modificados de Tam et al., /Tetrahedron Letters 23 , 4435 (1982)7 que são optimizadas para análogos de CCK-8 de um modo geral. A resina peptídica foi tratada com um aparelho de HF

-14teflon (Península) de um modo referido detalhadamente nos exemplos. No caso de péptidos formilados a fim de se manter o grupo formilo o referido tratamento foi realizado pelo seguinte modo: A 5,3 g da resina peptídica foram adicionados 12 ml de HF contendo sulfuretode dimetilo (31 ml) e 4,6 ml de p-cresol à temperatura de 0°C durante uma hora. Após evaporação até um pequeno volume, destilou-se HF a nidro recente (42 ml) num recipiente reaccional para um segundo tratamento durante duas horas à temperatura de 0°C. O tratamento continua do mesmo modo que a síntese dos péptidos não formilados referidos detalhadamente no exemplo 1.

A purificação preparativa foi realizada directamente com o péptido não sulfurado sob a forma bruta por HPLC numa coluna de 2,3 x 30 cm micro Bondapack C^g ou numa coluna Whatman ODS-3 de (2,5-50 cm). Os péptidos foram aplicados num volume mínimo de AcOH, a 50% e eluídos com gradiente lento, durante 4 horas, de 5 a 65%, 0,022% de TFA/CHgCN, com um débito de 8,0 ml/min. As fracções for recolhidas com 3 minutos de intervalo e os cortes foram realizados após inspecção por HPLC analítico. As fracções consideradas com uma pureza maior que 97% foram reunidas e liofilizadas.

am

A pureza dos péptidos não sulfurados individuais foi verif/ cada por HPLC e em todos os casos obteve-se 99%. As análises de aminoácido dos péptidos individuais foram realizadas e obtidos por tanto os valores esperados para cada caso. Para confirmar a inte gridade química dos péptidos, também se realizou nos péptidos aná

-15logos o U.V., IV., e E.M.

Os péptidos contendo grupos éster do ácido sulfúrico foram preparados por dupla sulfatação dos radicais hidroxilo (tirosina, serina, treonina e hidroxiprolina) utilizando-se, como reagente, ácido sulfúrico acetilpiridina. Um processo habitual de sulfatação realiza-se do modo seguinte: 60 -240 mg de sulfato de acetilpiridi_ na (PAS) são dissolvidos em 10 ml de piridina e agitados à tempera tura de 60°C durante 10 minutos. O análogo de N-acetil-CCK-8 (lOmg) é dissolvido em 10 ml de piridina e misturado com o reagente PAS. Após aquecimento da mistura entre 45 a 60 minutos à temperatura de 60°C, neutraliza-se com 2 volumes de carbonato de hidrogénio e amónio 0,05M, liofiliza-se e purifica-se por HPLC.

Os péptidos sulfatados foram purificados por HPLC de fase inversa preparativa numa coluna C^g-lO^i, ES Industries, com

1,25 x 30 cm utilizando-se um gradiente de 2 horas (10-40%) de ace tonitrilo em bicarbonato de amónio a 0,05M com um débito de 5ml/m_i nuto e detecção a 240 nm. As fracções foram reunidas e a pureza do péptido foi determinada por análise de HPLC utilizando-se uma colu

tonitrilo em bicarbonato de amónio com um débito de 2 ml e detecção a 215 nm.

A pureza dos péptidos sulfurados foi determinada por HPLC analítica, análise de aminoácidos, UV, IV, MS e NMR.

Os grupos formil podem ser eliminados dos grupos dos derivados de CCK que contêm grupos N^-formil-triptofan da presente in c

-16venção por adição de 1 ml de hidróxido de amónio O,1N de pH 10,5 a 1 mg de péptido durante uma a quatro horas, à temperatura ambien te seguida de liofilização.

Os exemplos que se seguem ilustram detalhadamente a preparação de péptidos com actividade reguladora do apetite da presente invenção, utilizando os processos descritos anteriormente. Nos exemplos descritos a seguir, a menos que estabelecidos de outro modo, os péptidos foram caracterizados e a pureza determinada uti_ lizando-se análise dos aminoácidos, HPLC analíticoU.V . , I.V. e M.S.

EXEMPLO 1

Preparação de Ac-Tyr(SO^H)-Nle-Gly-Trp-Nle-Thr(SO^H)-N-metil-Phe-NH₃

Dissolveram-se 5 g (17,8 mmol) de Boc-N-metil-Phe numa mis tura de 50 ml de cloreto de metileno e 50 ml de dimetilformamida arrefecida à temperatura de O°C e adicionaram-se sob agitação l,8g (9 mmoles) de diciclo-hexilcarbodiimida e agitou-se a mistura durante 60 min. à temperatura de O°C.

Separadamente, lavaram-se 5 g de benzilidrilamina (0,56 mmoles de N/g) (copolímero de ligação cruzada de estireno com 1% ι

-17de divinilbenzeno) foi lavada com 10% de diisopropiletilamina em cloreto de metileno durante 30 minutos, filtrada e lavada com cio reto de metileno, dimetilformamida e cloreto de metileno. A mistu ra arrefecida referida antes foi adicionada à resina e agitada du rante 24 horas à temperatura ambiente. A resina foi filtrada, lavada com cloreto de metileno dimetilformamida, isopropanol, clore to de metileno, dimetilformamida, isopropanol e cloreto de metil£ no e seco sob vácuo.

A análise de aminoácidos revelou que a resina continha 0,20 mmoles de N-metilfenilalanina por grama de resina. Os grupos de _a minoácidos que não reagiram foram planeados, mediante agitação da resina, com 5 ml de anidrido acético e 5 ml de diisopropiletilamina em cloreto de metileno durante 60 minutos. A resina foi filtrada e lavada com cloreto de metileno, isopropanol, dimetilforma mida e cloreto de metileno. Dois gramas (0,4 mmoles) da resina

Boc-N-metil-fenilalanina foram submetidos a síntese de fase sólida sequencial utilizando-se o processo descrito antes. Todas as liga, ções foram realizadas utilizando-se anidridos simétricos de Boc aminoácidos, como descrito. Na fase 16 e 20 os aminoácidos activa dos foram adicionados com os tempos de reacção correspondentes do seguinte modo: seis ciclos individuais foram realizados com

Boc-O-benzil-treonina (610 mg, 2 mmole, 60 min.; 610 mg, 2mmole, min.), Boc-norleucina (460 mg, 2 mmole, 30 min.; 460 mg, 2 mmole, 30 min.), Boc-N^-formil-triptofano (665 mg, 2 mmole, 30 min; 665 mg, 2 mmole, 30 min), Boc-glicina (350 mg, 2 mmole, 30 min.; 350 mg, mmole, 30 min.), Boc-norleucina (460 mg, 2 mmole, 30 min.; 460 mg,

-182 mmole, 30 min.) e Boc-2-6-diclorobenzil-tirosina (880 mg, 2 mmole, 30 min; 880 mg, 2 mmole, 30 min).

A cisão dos grupos de protecção Boc e a acetilação da resina com 10 ml de anidrido acético, 10 ml de piridina em cloreto de metileno durante 60 minutos forneceu 2,93 g da resina heptapeptidil-acetilada.

2,93 g da resina peptidílica foi cindida por tratamento com 6 ml de HF que continham 20 ml de dimetilsulfeto, em 3 ml de anisol e 1 ml de etanoditiol durante 1 hora, à temperatura de O°C. Após evaporação até um pequeno volume foi destilado 15 ml da HF anidro recente no recipiente de reacção para um segundo tratamento durante 1 hora, à temperatura de O°C. Após evaporação cuidadosa, a resina foi lavada com etilacetato, a seguir triturada com 4 x 15 ml de ácido acético a 50%, filtrada e liofilizada para fornecer 480 mg do péptido sob a forma bruta. Purificaram-se 85 mg deste péptido sob a forma bruta por HPLC preparativa numa coluna micro Bondapack C^g com 2,3 x 30 cm. O péptido foi eluído com gradiente linear de 5 a 65%, 0,022% TFA/CHgCN com o débito de 8 ml/min., e detecção a 280 mm. O pico principal foi recolhido e liofilizado pa. ra fornecer 22 mg (rendimento 31%) de Ac-Tyr-Nle-Gly-Trp-Nle-Thr-N

-metil-Phe-NHg. Este material apresentava-se homogéneo por HPLC e forneceu a análise de aminoácidos correcta.

-19A 60 mg de sulfato de acetilpiridina (PAS) adicionaram-se ml de piridina destilada anidra. A mistura resultante foi aquecida à temperatura de 60°C sob agitação durante 10 minutos. A so lução foi deixada arrefecer e adicionou-se 10 mg de Ac-Tyr-Nle-Gly.-Trp-Nle-Thr-N-metil-Phe-NHg dissolvido em 10 ml de piridina agitando-se a mistura reaccional durante uma hora à temperatura de 60°C. Em seguida, a mistura reaccional foi neutralizada com dois volumes de bicarbonato de amónio e liofilizada. Obteve-se a purificação por HPLC da fase inversa preparativa sob uma coluna de 1,25 x 30 cm ES Industries C^g-10 utilizando-se gradiente linear de 10-40% de NH^HCOg/CHgCN 0 ,5M durante 120 minutos, com um débito de 5 ml/minuto e detecção a 240 nm. Obtiveram-se 8 mg (rendimento, 66%) de Ac-Tyr-(SOgH)-Nle-Gly-Trp-Nle-Thr(SOgH)-N-metil-Phe-NHg. Este material exibiu homogeneidade por HPLC e forneceu a análise de aminoácidos seguinte: Asp 0,90 (1);

Gly 1,00 (1); Nle 2,00; Tyr 1,00 (1); Trp 0,60 (1); N-metilPhe. n. d.

-20EXEMPLO 2

Preparação de Ac-Tyr (SO^H)-Gly-Trp-Met-Thr(SO^H)-N-metil-Phe-NHg

1,5 g (0,3 mmoles) de resina Boc-N-metilfenilalanina que foi obtida pelo mesmo modo como descrito no exemplo 1, foram sub metidos a uma síntese de fase sólida sequencial utilizando-se o processo descrito no Exemplo 1 todas as ligações foram realizadas utilizando-se anidridos simétricos de Boc-aminoácidos como descrito antes. Nas fases 16 e 20 os aminoácidos activados foram adicionados com os tempos de reacção correspondentes do seguinte modo : cinco ciclos individuais foram realizados com

Boc-O-benzil-treonina (610 mg, 2 mmole, 60 min.; 610 mg, 2 mmoles, 60 min.), Boc-metionina (500 mg, 2 mmoles, 30 min.; 500 mg, 2 mmo les, 30 min.), Boc-N^-formil triptofano (665 mg, 2 mmoles, 30 min.; 665 mg, 2 mmoles, 30 min.), Boc-glicina (350 mg, 2 mmoles, min.; 350 mg, 2 mmoles, 30 min.), Boc-2,6-diclorobenzil-tiros/ na (880 mg, 2 mmoles, 30 min.; 880 mg, 2 mmoles, 30 min.). A desprotecção do grupo de protecção Boc e acetilação da resina com 8 ml de anidrido acético, 8 ml de piridina em cloreto de metileno duran te 60 minutos forneceu 1,65 g de resina hexapeptídica acetilada.

A resina foi cindida mediante tratamento com HF contendo sulfeto de dimetilo, anisol e etanoditiol, utilizando-se o mesmo

-21processo como descrito no Exemplo 1. A resina foi lavada com éter acetato de etilo e em seguida triturada com ácido acético a 30%, filtrada e liofilizada para fornecer 110 mg do péptido sob a forma bruta.

110 mg deste péptido sob a forma bruta foram purificados por HPLC preparativa numa coluna com 2,3 x 30 cm micro Bondapack ^C18' ⁰ ΡθΡ^ίάο foi eluído com gradiente linear de 5 a 65%, TFA/ /CHgCN 0,022% a um débito de 8 ml/minuto e detecção a 280 nm. O pico principal foi recolhido e liofilizado para fornecer 15 mg (rendimento 11,6%) de Ac-Tyr-Gly-Trp-Met-Thr-N-metil-Phe-NHg. Es te material apresentou-se homogéneo por HPLC e forneceu a análise de aminoácidos correcta.

mg de Ac-Tyr-Gly-Trp-Met-Thr-N-metil-Phe-NHg foram dissolvidos em 15 ml de piridina e adicionados a uma solução de 240 mg de sulfato de acetil piridina (PAS) em 20 ml de piridina prepa rada pelo mesmo modo que o descrito no exemplo 1. A mistura reaccional foi agitada durante uma hora à temperatura de 60°C, em seguida neutralizada com 2 volumes de carbonato de hidrogénio e amó nio e liofilizada. Obteve-se a preparação por HPLC preparativo, utilizando-se as mesmas condições descritas no exemplo 1. Obtiveram-se 11 mg (rendimento de 61%) de Ac-Tyr-(SO^H)-Gly-Trp-Met-Thr -(SOgH)-N-metil-Phe-NHg.

Análise de aminoácidos : Thr 0,86 (1); Glu 1,00 (1); Met 1,0 2 (1)

Tyr 1,01 (1); Trp 0,72 (1); N-metil-Phe n. d.

EXEMPLO 3

Ensaio de ligação ao receptor in vitro

Estriato bovino congelado (aproximadamente 5 g.) e pâncreas de rato fresco (aprox. 5 g) separados de gordura e de tecidos estranhos foram homogeneizados em tampão HEPES nQ 1 (10 mM HEPES,130 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, pH 7,4) utilizando-se 35 partes de tampão pa ra cada parte de tecido tomado em peso molhado/base de volume (aprox. 175 ml). O tecido foi homogeneizado 2 vezes durante aproximadamente 15 segundos, à temperatura de O°C, utilizando-se um homogeneizador Politron na velocidade 6. O tecido foi isolado por centrifugação a 48.000 x g durante 10 minutos, à temperatura de O°C. A porção de tecido resultante foi ressuspensa em tampão HEPES nQ 2 (10 mM HEPES, 130 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, lmg/L de fluoreto de fenilmetano-sulfonilo (PMSF), 200 mg/L de bacitracina) : uma parte de tecido estriatal (peso original molhado) para 80 partes de tampão e uma parte de tecido de pâncreas (peso original não seco) para 70 partes de tampão.

A incubação foi iniciada por associação de várias concentrações de CCK-8 natural ou peptidos de fórmula geral 1 com 3H-CCK-8-(SO^H), com uma concentração final de 0,15 mM, e homogeneizado de tecido (estriatum 0 ,26 mg de proteína em 2 ml de volume final; pâncreas 0,165 mg de proteína em 1 ml de volume final). As amostras foram incubadas durante 30 minutos, à temperatu ί

ra de 25° C e a incubação terminou por colocação da mistura sobre um papel de filtro Whatman GF/B, pre^humif içado num Sandbeck Vacuum Filtration Manifold. Os tubos de incubação foram lavados com x 3 ml de tampão HEPES n° 2 arrefecido com gelo e o resultante filtrado através de um filtro GF/B.

filtro foi seco ao ar durante 10 minutos e em seguida co locado numa ampola de cintilação com 12 ml de cocktail de cintila^ ção Beckman HP/b Ready-Solv. As ampolas foram agitadas durante duas horas e em seguida contadas no espectómetro de cintilação Beckman Model 7800 para líguidos. A ligação não específica foi de; terminadana presença de uma micromole de CCK-8 natural e subtraída de todas as amostras para se determinar a ligação específica.

A concentração do péptido necessário para inibir 50% da 1/ gaçâo 3H-CCK-8-(SO^H) específica total (CIç-θ) foi determinada por análise de log-sonda.

)

Os resultados são resumidos no Quadro I.

-24EXEMPLO 4

Ensaio de alimentação de duas refeições

Aclimataram-se ratos de Sprague-Dawley (CD) com 180 a 200 gramas de peso (Charles River Breeding Laboratories) a um sistema de 12 horas de luz e 12 horas sem luz (6 a.m. a 6 p.m.) numa instalação conservada à temperatura de 22° C. Em seguida foram subsequentemente mantidos em jejum durante dois dias, pesados, co locados em caixas individuais e iniciou-se um treino de um período com quatro refeições por dia. Durante este tempo os ratos rece beram comida do laboratório (Purina Lab Chow) em recipientes durante uma hora das 9 a.m. até às 10 a.m., os recipientes foram re tirados das 10 a.m. às 12 p.m. e colocados novamente nas gaiolas, das 12 até à 1 p.m. Sob este regime de alimentação 1-2-1, a maior parte dos ratos aprenderam a comer aproximadamente tanto por dia durante as duas horas a que tiveram acesso aos alimentos, como os ratos que têm alimentos ad libitum durante as 24 horas do dia No quarto dia, os ratos foram pesados novamente e qualquer perda de peso superior a 5 g de massa corporal fez excluí-los do teste. Os animais foram em seguida distribuídos em grupos experimentais (n= 5 a 6) e grupos de controlo, (n= 6-12), mas são misturados p£ lo peso corporal.

Os péptidos da presente invenção foram suspensos ou em fun

-25ção do cloreto de sódio, se solúveis, ou em goma-arábica a 1%, se insolúveis, em concentrações desde 0 a 320 jig/ml/kg de massa corporal e foram administrados, por via intraperitoneal, 15 minutos antes da lã refeição do 5° dia de alimentação. Os ratos foram em seguida alimentados com as suas refeições como nos 4 dias anteriores e os recipientes com alimentos foram pesados, quer antes, quer depois de cada refeição para se determinar o consumo de alimentos. A ingestão de alimentos foi expressa como uma média e erro padrão da média, em gramas consumidas ou como a percentagem dos valores de controlo para os vários grupos.

Os grupos tratados foram comparados com os grupos de controle mediante a análise de test-t.

Os resultados estão resumidos no Quadro I.

QUADRO I

Ingestão de alimentos 1§ Refeição

Peptido	Exemplo No .	Bovino Estriatom	Rato Pancreas	Dose microgm/kg	2â Refeição % de Controlo
		(nM)	(nM)
CCK-8		1-3.2	1-4.6	32	27+17* 149+6*
Ac-TyríSO^H)- -Nle-Gly-Trp-
-Nle-Ihr-(SO₃H)-
N-metil-Phe-NH	1	245	0 .14	32	21 +12*** .	52 +13*
2
				16	2 7+1 7**	45 +11*
				10	13 + 1 ***	6 2+8
				3	2 3 +13***	59 +6
				1	36 + 4***	71 +13
Ac-Tyr(SO₃H)- -Gly-Trp-Met-Thr
-(SO₃H)-N-metil- -Phe-NH₂	2	1600	70	320	4 + 5*** 121	+3
				32	36 + 8* 141 +9
				3	86 + 16 120	+13

Valores significativamente diferentes dos respectivos controlos ***p <0.001, **p s<0.01, *p_x^0.0 5

Claims

REIVINDICAÇÕES

1- Processo para a preparação de péptidos de fórmula geral

X-(R) -Tyr(SO^H)-(R,) -R„-R_-R.-R_c-N-metil-Phe-Y n 3 lp2345 na gual

X representa um grupo de fórmula geral -CO-R-, -CO-OR,, -CO-(CH-) o _b _2

-CH-, -CO-CO-OR,, ou -CO-(CH-) -CO-OR · _3 7 2 g 8 γ representa um grupo de fórmula geral -ORg ou NR^R^^;

R representa Asp ou Aeg;

R^ representa Met, Nle,Leu , ou Ile;

Rg representa Gly, Ala, D-Ala, ou j3-Ala;

Rg representa Trp ou Trp(For);

R^ representa Met, Nle ou Nv a;

-28₅ representa Thr(SOgH), Ser(SOgH) ou Hyp(SOgH);

Rg representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo g

R.? representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo g ou halogeno-alquilo C

Rg representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo g Rg representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo g Rg0 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo

1-3 n representa zero ou 1;

p representa 0 ou 1;

m representa um número de 3 até 14; e q representa um número de 1 a 3 ou de 4 até 14;

com a condição de pelo menos um dos símbolos X, R^ , p e q representar um resíduo que é importante; e sob o ponto de vista f tratar um péptido não sulfatação, ou de se eventualmente ligado dos seus sais aceitáveis terizado pelo facto de se pondente com um agente de formilado correspondente, armacêutico, caracsulfatado correstratar um péptido a um veículo, com um agente de desformilação e, eventualmente, de se converter o pép

-29tido obtido em um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêu tico
2- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um péptido de fórmula

Ac-Tyr ( SC>₃H ) -Nle-Gly-Trp-Nle-Thr(SO₃H)-N-metil-Phe-NH₂ , caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
3- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um péptido de fórmula

Ac-Tyr ( SC>₃H ) -Gly-Trp-Met-Thr ( SC>₃H )-N-metil-Phe-NH₂ , caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
4- Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz de um péptido de fórmula geral I, preparado pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, como ingrediente activo, ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e, eventualmente, uma ou mais substâncias activas sob o ponto de vista terapêutico, com um ou mais veículos inertes e de os converter em uma forma de administração galénica.