JPS63238022A

JPS63238022A - ＨＢｅ抗原の単離方法

Info

Publication number: JPS63238022A
Application number: JP7365087A
Authority: JP
Inventors: Seisuke Takashima; 征助高島; Keiichi Kurokawa; 圭一黒川; Shuhei Nakaji; 修平中路; Akinori Sueoka; 末岡　明伯; Shinichi Sasaki; 真一佐々木; Kenji Otaka; 大高　憲二; Takeshi Yamane; 健山根; Ryosuke Murayama; 良介村山; Katsuyuki Nakajima; 克行中嶋; Tsutomu Inoue; 勉井上
Original assignee: Kuraray Co Ltd; Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Kuraray Co Ltd; Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1987-03-26
Filing date: 1987-03-26
Publication date: 1988-10-04

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、１ｉＢｅ抗原の単離方法に胸する。ざらに詳
しくは、血漿中のＢ型肝炎ウィルス関連抗原を吸着剤に
吸着させた後、溶離液で処理することによってＭｉｌｅ
抗原を単離する方法に関する。

〔従来の技術〕

今日、Ｂ型肝炎の保菌者は全世界で２億人と推定され、
我が国においても約２００〜３００万人の保菌者がいる
といわ几ている。Ｂ型肝炎は主として輸血（輸血漿）に
より、又時として医療現場における誤操作、例えば注射
針、器具等を介しての忠君の血液や体液への接触により
感染することが知られている。

Ｂ型肝炎はＢ型肝炎ウィルス（以下、１１　Ｂ　Ｖと略
記する）によって惹起されるとされているか、正確には
ｌｉ’ＢＶには肝細胞の障害性はない。肝炎の発症すな
わち肝細胞の壊死はひとえにＨＢｖを排除しようとする
宿主の免疫反応によって起るとするのが現時点の定説で
ある。しかし、免疫反応力トノように肝細胞障害を惹起
するかについてはまだ解明されていない。いずれにして
も）ＩＢＶはかなり感染力か強く、免疫学的にも、臨床
的にも数多くの問題点が指摘されており、未だ確立され
た予防法、治療法はなく、アフリカ、東南アジア地域か
ら我国に至る環太平洋地区の西南部はＩＩＢＶ汚染地帯
と指摘される如く、多数の忠君が存在しているのが現状
である。

かかるＩＩＢＶへの感染防止法として現在ではワクチン
の投与が実用化の段階にあり、現在、ｎＢＶ予防ワクチ
ンを生産する方法として、遺伝子操作によって大腸菌、
枯草菌、ｈるいは酵母菌にＨＢｓＡｇ蛋白質をコードす
るｋｌ　Ｂ　ＶのＤＮＡを導入、発現させることにより
ワクチンの原材料となるｋｌＢｓＡｇのみを大量に生合
成する方法が普及しつつある。

〔発明が解決しようとする問題点〕ｎＢＶ関連抗原としては、ウィルス表面抗原であるＨＢ
　ｓＡｇ、核酸を含有するウィルスの芯の部分の抗原で
ある１１１３　ｃＡｇおよび１（ＢＶの感染性と関係し
ている抗原であるＨＢ　ｅ　Ａｇが存在し、従来、免疫
反応の主たる標的はｔＬｊ３　ｓ　Ａｇと考えらｒして
いたか、現在は否定ざｒしる方向にある。そして、現在
ではｉｌＢ　８　ＡＱにかわって’に３ＢｃＡｇ　％ｕ
ＢｅＡｇ　ＬＩｈるいは１ｉＢＶ−ＬＩＮＡのリージョ
ンブレ８　（ｌｌｅｇｉｏｎ　ｐｒｅ　Ｓ　）の産生ず
るペプチドが主たる標的の候補として挙げられている。

。このように、）ｌ　Ｂ　Ｖの感染はｋｌＢ　ｓ　Ａｇの
みでなく、ＨＪ３　ｃＡｇ及びｌｉＢｅＡｇか関与して
おり、とくにｆｌＢｒＡｇ（＋）の血液はｌ１Ｂｅ抗体
（以下、ＨＢｅＡｂと略記する〕（＋）の血液よりもＩ
ＩＢＶの感染性は１０’倍以上も高いことかチンパンジ
ーの感染実験から明らかにされている。そして、現実に
も、母親がＭＢ　ｅＡｇ　ｊ＋ｌであれば児への感染は
１００％成立し、９２％かｎＢ　ｓ　Ａｇ持続陽性化し
ていることか証明ざｒしている。

これに対して、母親かＺＬ１３　ｅＡｇ　ｆ＋ｌである
と、２８％の児に感染が起っているが、ｌｊＢｓＡｇ持
続陽性化した症例は１例もないとの報告もなざｒしてい
る（白木和夫他＝Ｂ型肝炎ウィルスの母子感染、小児科
臨床、３２：１９９．１９７９　）。また、ＨＢｅＡｇ
は肝病変の進行をよく反映し、油ｓ　Ａｇ　（＋ｌの慢
性肝疾患の活動期に上昇する。といわれる。ざらにＩｉ
ＢｅＡｇ（利の慢性肝疾患は組織学的発展のテンポがｌ
′１ＢｅＡｂ　：＋ｌのものより早いことが報告ざ几て
いる（大場均他：Ｂ型肝炎ウィルス、日本臨床（秋期増
刊）　：　８６９．１９８２Ｊ。

このように）ｌＢｅＡ５ｙ（利の血液は感染性も高く、
臨床的にも病態の増悪傾向と栢接な開運性を有している
ことが明らかにざ几つつあるが、かかるｈＬＢ　ｅ　Ａ
ｇに対するワクチンは得られていないのか現状である。

従って、本発明の目的は、上記ワクチンを得るための前
準備等に有効なｋｌＢｅ　Ａｇを単離する方法を提供す
ることにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、先にリン酸カルシウム系焼結多孔体、固
体酸又は陽イオン交換樹脂等が血漿中のｔｉＢ　ｓ　Ａ
ｇ及びｆｉＢ　ｅＡ　ｇのタイター値（Ｔｉｔｅｒ　　
）を陰性領域（１以丁）にまで低下させることのでさる
ＩＳを肝炎抗原ｔｌＪ３ｓＡｇ及び■ｊｅＡｇ（以下、
ｉｎｓａｇと略す〕の吸着剤であることを見出し、先に
特願昭６０−６７２７０号、６１−９６０２１号及び６
１−１０９２８２号として特許用ｂ；ｈｌ　Ｌだが、ざ
らに１４ＢＡＱの股布、遊離挙動について詳ｈ↓■に研
究を一中ね、吸着剤に股布されたｊｉＬＩＡｇを溶＋＝
ａ＋ｔ：液で処理ＣることによりｕＢｅｈｇが道択的に
遊離して（ることを見出し、本発明に至った。すなわち
本発明は、血漿中のＲＢＡｇを吸着剤に股布させた役、
溶阿敢で処理することによってＬｌ、Ｂ　ｅＡｇを単離
することを特徴とするＨＢｅＡｇの単離方法である。

本発明において、ｋＬ　Ｂ　Ａ　ｙは吸着剤で吸右ざｒ
ｌ、るか、かかる吸着剤としては種々の多孔体等、吸着
剤として使用できるものであれはとくに制限はないか、
リン酸カルシウム系焼結多孔体、固体酸及び陽イオン交
換樹脂はと（にｔｔＢＡｇを股布するので好ましい。

リン酸カルシウム系焼結多孔体としては、ヒドロキシア
パタイト　（Ｕａ（ＯＬＬ）ｚ　ｅ　ａＵａ３（Ｐ（Ｊ
４　）２）、第三リン酵カルシウム（Ｃａ３　（Ｐ（Ｊ
４　）２　）またはこれらのルル合物等が、固体酸とし
てはシリカ−アルミナ、アルミナ等が、又陽イオン交換
樹脂としてはＩＨＵ８４、ＩＩ；−７１８，１ｎｅ−５
０等Ｖ）高品名で市販さ！している揚イオ７交決樹脂が
あげられる。

こ几らの吸着剤の形状はと（に規定されるものでは／、
【いが、２０〜６０メソシユの大きざのものが実用面で
あり、り］ましい。又、こ！しらの吸着剤は必要に応じ
て屁合使用してもよい。

１１　Ｂ　Ａ　Ｑを吸着剤に霞石させるには血漿を吸着
剤とｊ＆触させる必要かあるが、該接触には何ら特別な
条件は必要としない。すなわち、該吸着剤を血漿中に浸
漬するか、該吸着剤を充填したカラムに１ｉｆｔ泉を循
環させｒしはよい。

使用する吸着剤の鼠は、少なくとも１１１３　Ａ　Ｑを
吸右するに十分な量が必要であるか、これは予め血漿中
の１１ＢＡｇのタイター値を測定することによって決め
られる。従って、使用する吸着剤の量は血漿中のＨＢＡ
Ｑの量により一概に決めら几るものではないが、通常は
吸着剤に対する血漿の割合は、、、’５ｍ施ざｒしる。

吸着剤には通常１１Ｂ　ｓ　Ａｇ、ｌｌＢｅＡｇ、　Ｉ
ＪＪＪｅＡｇで代表ざｒしるｌｌＢＡｇか霞石されるか
、ＬｉＢ　ｅＡｇのみあるいはｋｌＢｏＡｇを選択的に
霞石してもよい。

本発明において、吸着剤に吸着ざ几た１１ＢＡＱは次い
で溶離液で処理される。該溶離液はとくに限定さｒしる
ものではないか、塩化ナトリウム水溶液、界面活性剤水
溶液およびデオキシ胆汁酸ナトリウム水溶液は本発明の
効果かよく発現する溶ｂＩ液であり、好ましく用いられ
る。とくに、本発明におラム水溶液で処理するか、又は
固体酸でｕＢＡｇを霞石し、界面活性剤水溶液で処理す
ると１ｉＢｃＡｙの単離効率が昌くなり、好ましい。

ＨＢＡＱを設層した吸着剤を溶離液で処理するには、ｋ
ＬＢｈｇが吸右された後の血漿残液を除き、咳吸着剤を
溶離液に浸漬するか、吸着剤カラムを使用する場合には
、血漿残液を除いた吸着剤をカラムに充填し、溶離液を
循環させればよい。撹１゛ト、振とう等の手段は透宜必
要に応じて実施してもよい。溶離液中に遊離したｎＢ　
ｅ　Ａｇは溶離液と分離ざｒし、必要ならばざらに前処
理を施ざｆした後、ワクチン製造用の原料として供され
る。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本
発明はこ才ｔらによって何ら限定されるものではない。

〔実　施　例〕

実施例１〜１２ｅ　Ｍ　ｆｉｌｌとしてａ）ＩＪン酸カルシウム系焼結
多孔体ン（目３製）及びＣ）陽イオン交換樹脂（日本オ
ルガノ（ｌ（１）装ｊｌ（０８４）各々０．３９を１ｍ
ｌの生理食塩水溶液中に浸漬して減圧した。該吸着剤に
ＭＢ　ｓＡｇ、ｌｌＢｅＡｇのタイター値が各々５１．
９及び４．０の血漿２ｒｒＬｉを添加し、室温にて約３
時間撹拌し、ＩＩＢＡｇを霞石させた。

各上澄液１．５７ｎＪｌを採取し、ダイナポット■社の
放射免疫測定（ｆ２　（Ｒａｄｉｏ　Ｉｍｔｎｕｎｏ　
Ａｓ５ａｙ　、　ＩＩＩＡ　）によってタイター値を測
定した。タイター値は下記吸着剤ａ）の場合のｕｎ　ｓ
Ａｇ及びｌｉＢｅＡｇのタイター値は各々５．７及び０
．８、吸着剤ｂ）の場合のそれらは各々０．６及び０．
８、吸着剤Ｃ）の場合のそれらは各々７．４及び１．４
であり、ＨＢＡｇは充分吸着ざｊしていた。

一万、もとの血漿１．５ｍｌを塩化ナトリウム０．１４
ｎｔｏｌＡ〜３　ｒｎｏｌ／Ｊ水溶液１．５ｍｌで希釈
するとｈＬＢ　ｓＡｇは３０．４、ｌｉＢｅＡｇは１．
５となり、塩化ナトリウム水溶液自体は単なる希釈効果
しかないことを確認した。

次に、上澄液を除去した上記各吸着剤に０．１４．１．
２及び３　ｎ１ｏ１／ｌの塩化ナトリウム水溶液（溶離
液１，２．３．４とする）　１．５７７ＬＡ’を添加し
て１０分間室温にて振とう後、タイター値を測定した。

結果を第１表に示す。

この結果によれば、液相中のｌＬＢｅＡｇの大部分は遊
離してくるがｕｎ　ｓ　Ａｇのそ几はわずかしか遊離ざ
７１、ておらず、本イｌ　ＩＩＪＩの効婁は明らかであ
る−実施例１３〜１６吸着剤として実施例１〜８で用いたものと同様の吸着剤
ａ）及びｂ）を用い、実施例１〜８と同様に１３ｉｌ処
理を行い、血漿を添加し、１ｏ分間室温にて振とうした
。実施例１〜１２と同様に溶離液の希釈効果を調べたと
ころ、吸着剤ａ）及びｂ）の１ＬＩＳｓ　Ａｇ及びｌＬ
１３ｅＡｇは各々１．１．１．５及び０．６．０．８で
あった。ＬＬＩ３　ｓ　Ａｇに対しては希釈効果以外の
効果か認められるが、ｌＩＢ　ｅＡｇについては単なる
希釈効果か認めらルた。各上澄液の川３ｓＡｇ及び）Ｌ
Ｂ　ｃ　Ａｇのタイター値を実施例１〜８と同様にして
測定したところ、各々５．６．０．８及び０．６．０．
８で、カリｌｌｌｌＡｇは充分汲置されていた。上澄液
を除去した役、溶離液として牛丼化学製の１５！５トリ
トンｘ−ｔｏｏ水溶液（溶離液５）、ギシダ化学製の２
９６ドデシル硫酸ナトリウム水溶液（溶離液６）を各々
１　、５　ｒｎｌｌ添加して室温にて１０分間振とうし
、実施例１〜［２と同様にして液相のタイター値を測定
した。

結果を第２表に示す。

実施例１７吸着剤として実施例５〜８で用いたものと同様の吸着剤
ｂ）を用い、実施例５〜Ｂと同様に前処理し、溶離液と
して０．５９６−デオキシ胆汁ｇ−０，５％水酸化ナト
リウム−ｏ、ｏｔｔ口ｏ　Ｉ／ｌホウ酸ナトナトリウム
水溶液いる以外は実施例５〜８と同様にして実験を行っ
た。ＬｉＢｓＡｇ及びＩＩＢ　ｅＡｇのタイター値は各
々１．８及び１．２であり、ＭＢｅＡｇか選択的に遊離
していることか明らかである。

〔発明の効果〕

本発明によｒしは、ＭＢｅ　Ａｇを効率的に単離するこ
とができるので、血漿出来のワクチンを得るための手段
を容易に提供することかでき、本発明の実用ｔｒＪ意義
は大きい。

Claims

【特許請求の範囲】１、血漿中のＢ型肝炎ウィルス関連抗原を吸着剤に吸着
させた後、溶離液で処理することによつてＨＢｅ抗原を
単離することを特徴とするＨＢｅ抗原の単離方法。２、該吸着剤がリン酸カルシウム系焼結多孔体、固体酸
又は陽イオン交換樹脂である特許請求の範囲第１項記載
の単離方法。３、該固体酸がシリカ−アルミナである特許請求の範囲
第２項記載の単離方法。４、該溶離液が塩化ナトリウム水溶液である特許請求の
範囲第１項、第２項又は第３項記載の単離方法。５、該溶離液が界面活性剤水溶液である特許請求の範囲
第１項、第２項又は第３項記載の単離方法。６、該溶離液がデオキシ胆汁酸ナトリウム水溶液である
特許請求の範囲第１項、第２項又は第３項記載の単離方
法。