JPS6321560A

JPS6321560A - 酵素免疫測定法およびそれに使用する測定素子

Info

Publication number: JPS6321560A
Application number: JP16690986A
Authority: JP
Inventors: Tadayasu Mitsumata; 光亦　忠泰; Makoto Takeya; 誠竹谷; Kimimasa Miyazaki; 仁誠宮崎
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1986-07-16
Filing date: 1986-07-16
Publication date: 1988-01-29

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は改良された酵素免疫測定法およびそれに使用す
る測定素子に関する。

酵素免疫測定法は、酵素活性を指標とし、抗原抗体反応
を利用して検体溶液中の抗原（または抗体）の量を測定
する方法であり、生理活性物質のように検体溶液中に微
量に存在する物質の分析法として極めて優れたものであ
り、医療分野など広い産業分野で利用できる。

従来の技術従来、有機化合物の酵素免疫測定法としているいろな種
類が知られているが、高感度のものとしては同相法やサ
ンドインチ法がある。いずれの方法も抗体を支持体に結
合させて固有の状態にしておき、これに被測定物質（抗
原）および酵素等で標識された抗原（または抗体）から
なる被測定物質溶液を加え、抗原抗体反応を行わせた後
、未反応（遊離状態）の抗原を水洗により除去し、結合
した（結合状態）抗原の酵素活性を測定し、濃度既知の
検体溶液を用いて予め作成した検量線から被測定物質の
量を算出する方法である。この方法では、１０　　？／
ｘｌ程度の甑微量から１０　　ｆ／ｍｌ程度のかなり高
い濃度の範囲まで抗原または抗体を測定することが出来
るが、反面、抗原抗体反応後、遊離の抗原を固相から洗
浄により分離除去する操作を必要とする。

なお分離操作を自動的に行って、遊離の抗原を分離する
ことをねらいとする従来技術として、抗体を通水性シー
トに固定し、このシート上に数滴の試料を落下させ、溶
液がこのシートを自然に通るあいだに、抗原抗体反応を
行わせ、フリーの抗原のみがシートを通過し、このシー
トと透明非多孔性シートの間にある基質層で酵素反応さ
せる技術（特開昭５８−１５０８６１号公報）がある。

しかし、この方法では試料を連続的に分析定量すること
は不可能であシ、また被測定物質が抗体と結合すること
によって生じる遊離の標識された抗原は自然拡散によっ
てのみ酵素のある反応層へ移動するので、その速度は遅
く、検知濃度の最低限度は劣り１０−６ｆ／ｌｄ　　程
度であり、まだ応答時間も比較的長く、測定時間は３ｏ
分間である。

発明が解決しようとする問題点本発明は、上記のように水洗による分離操作を行うこと
なく、連続で、高感度でしかも応答特性にすぐれた分析
法、検出法を提供することを目的とする。

問題点を解決するための手段抗原抗体反応と酵素反応を行わせる２種の膜、および分
離膜をすべて多孔膜とし、この一体化膜の抗体膜側より
、被測定物質（抗原）を含む気体あるいは液体を導き、
この一体化膜を間欠的あるいは連続的に移動させながら
連続的に濃度を測定する。

作　　用このような構成とすることにより、たとえば空気中に浮
遊している有機化合物を連続的に高感度でしかも応答性
よく分析・検知することができる。

実施例本発明の測定方法および測定器具を実施例を参照にして
説明する。第１図は本発明の一実施例を示す断面概略図
であり、基質（または酵素）を標識した抗原と結合して
いる抗体が固定化されている抗原抗体反応用多孔膜１、
酵素（または基質）のほかに必要に応じて発光剤１発色
剤、第２の酵素などを含有している酵素反応用多孔膜２
および両多孔膜の直接の接触を防止するための多孔性分
離膜３が一体化されて素子を形成している。抗原抗体反
応用多孔膜１側よシ、たとえば空気中の被測定物質をこ
の素子に導くために試料導入管４を設け、この先端に軟
体物質５を備えて多孔膜との接触をより密とする。

またこの試料導入管４の内部には、送風のためのファン
６がある。また送風による一体化膜の乾燥を防止するた
めに溶媒補給管７を設けている。

そしてこの多孔膜を移動させながら、試料導入管４の逆
側に設けている検知素子たとえば受光素子８により連続
的に大気中の微量の有機物（抗原）を分析・検出するこ
とができる。

カフェインの濃度測定（１）素子の調製基質を標識した抗原としてグルコース標識カフェイン（
２ｘ１０−２ｍＭ　）を作製し、ポリプロピレン不織布
（厚さ０．２５ｍ）に公知の方法で固定化シた抗カフェ
イン・モノクロナル抗体と上記標識抗原を予め結合させ
た。一方酵素であるグルコースオキシダーゼ（２％ｗ／
ｖ　）　、発光剤としてのルミノール（２％Ｗ／Ｖ）お
よび第２の酵素としてペルオキシダーゼ（５％ｗ／　ｖ
　）を含む無色透明性のポリプロピレン織布（厚さ０．
２ｍ）を準備した。この両者を孔径約１μｍの黒色の微
孔性ポリプロピレンフィルム（厚さ約０．１圏）を介し
て、接着して一体化した。この一体化膜の全体に０．２
Ｍトリス緩衝液（ＰＨｓ、ｓ　）を２０ｗｔ％　　含浸
させた。この状態では酵素反応層に基質であるグルコー
スが来ないので、酵素反応に伴う発光は生じない。

（２）　　測定法カフェイン含有標準空気（Ｏｎｇ／ｍＬ　、　１０ｍｇ
／ｍＬ。

２０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ）　
　を順次、各６分間隔で直径５ｆｆｌｌｌ＋の試料導入
管を通して約１ｍ／ｓ　　の速度で上記の一体化膜を通
過させた。グルコースで標識したカフェインが酵素膜へ
移り、中間生成物である過酸化水素を、第２の酵素とし
て加えているペルオキシダーゼで分解し、その時にルミ
ノールが酸化されて発光した。すると試料中に加えてい
たカフェイン量にほぼ比例して約３０秒後に発光強度が
第２図に示すように増加した。

これＫよって検量線を作製することができた。その誤差
は約±５％であった。

つぎに未知量のカフェインを含む空気を同一量通過させ
ると、上記と同様に一定量の発光強度が得られ、上記の
検量線よシ、未知濃度を求めることができた。

上記実施例に用いた抗原抗体及び酵素さらに発光剤・発
色剤、また第２の酵素のほかに、通常の酵素免疫法で用
いられるすべての物質をこの方法に適用する事ができる
。とくに被測定物としては空気中に浮遊している有機化
合物たとえば有機薬品、毒素、生理活性物質などが有効
である。

また多孔体の材質はポリプロピレンに限らず、ポリアミ
ド、セルローズなどの不織布または織布。

紙などを用いることができる。これら細孔の大きさ、多
孔度は試料の流れを大きく妨害することなく、試料中の
被測定物質をほぼ完全に捕捉するように決定すべきであ
る。

さらに空気などの気体または液体中に存在する被測定物
質（抗原）を、収集濃縮する方法として本実施例に示し
た方法の他に、酵素反応を起こさせる多孔膜側からこの
多孔膜を通って気体または溶液を吸引することもできる
。

また酵素反応量を観察する方法として発光強度を測定す
る場合には、バンクグラウンドの値を最小に抑えるため
に、少なくとも多孔性分離膜は黒色であることが好まし
い。

また、あらかじめ抗体と結合させている抗原を被測定物
質と同一とせず、抗体との結合力が被測定物よりもやや
弱い類似化合物を用いることにより、抗原抗体反応の置
換速度を速くし、分析検出の応答性を高めることができ
る。

発明の効果以上のように分離操作を人為的に行うことなく酵素免疫
測定法を行えるとともに、連続的にしかも高感度で応答
性に優れた分析法・検出法とすることが可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例において用いる測定器具の断
面概略図、第２図は本発明による測定方法を用いた分析
結果を示すグラフである。１・・・・・・抗原抗体反応用多孔膜、２・・・・・・
酵素反応用多孔膜、３・・・・・・多孔性分離膜、４・
・・・・・試料導入管、８・・・・・・受光素子。代理人の氏名　弁理士　中　尾　敏　男　ほか１名菓　
１　図ＴＲ２図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）酵素活性を指標とし、抗原抗体反応を利用して抗
原の量を測定する酵素免疫測定法であって、基質（また
は酵素）を標識した抗原とあらかじめ結合させた抗体を
固定化した抗原抗体反応用多孔膜と、酵素（または基質
）さらには必要に応じて発光剤、発色剤、第２の酵素な
どを含む酵素反応用多孔膜とを、多孔性分離膜を介して
一体の素子とし、上記抗原抗体反応用多孔膜側より、被
測定物質（抗原）を含む気体または液体を上記素子を通
過させ、前記抗体を含む抗原抗体反応用多孔膜において
置換反応を生じさせて、基質（または酵素）を標識した
抗原を抗体より遊離させ、これらを圧力によって上記分
離膜を通して酵素（または基質）を含む酵素反応用多孔
膜に移動させ、ここで生ずる酵素反応量によって、上記
の被測定物質を検知・定量することを特徴とする酵素免
疫測定法。
（２）抗体とあらかじめ結合させる抗原として、被測定
物質と同一でなく、抗体との結合力が被測定物質にくら
べてやや小さい類似有機物質を用いることを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の酵素免疫測定法。
（３）酵素（または基質）および発光剤、発色剤、第２
の酵素などを保持するために用いられる酵素反応用多孔
膜が、無色透明な材料で構成されていることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の酵素免疫測定法。
（４）抗体を含む多孔膜に気体または液体中の被測定物
質（抗原）を導くための試料導入管を、軟体物質を介し
て接触させ、この管からの吹き付けあるいは酵素（また
は基質）を含む膜側からの吸引により試料を上記多孔膜
に導くことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の酵
素免疫測定法。
（５）抗体および酵素（基質）を含む両膜、さらにこの
中間に位置している多孔性分離膜のすべてが可とう性で
あり、かつ間欠的あるいは連続的な移動により、試料の
検知・定量を連続的に行うことを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の酵素免疫測定法。
（６）被測定物質を含む気体を多孔膜を通過させる場合
には、被測定物質が可溶性である溶媒を、少なくとも酵
素反応と抗原抗体反応のための必要量以上含有し、かつ
、この溶媒を必要に応じて自動的に多孔膜に補給するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の酵素免疫測
定法。
（７）基質（または酵素）を標識した抗原とあらかじめ
結合させた抗体を固定化した抗原抗体反応用多孔膜と、
酵素（または基質）さらには必要に応じて発光剤、発色
剤、第２の酵素などを含む酵素反応用多孔膜とを、多孔
性分離膜を介して一体とした測定素子。
（８）抗体とあらかじめ結合させる抗原として、被測定
物質と同一でなく、抗体との結合力が被測定物質にくら
べてやや小さい類似有機物質を用いたことを特徴とする
特許請求の範囲第７項記載の測定素子。
（９）酵素（または基質）および発光剤、発色剤、第２
の酵素などを保持するために用いられる酵素反応用多孔
膜が、無色透明な材料で構成されていることを特徴とす
る特許請求の範囲第７項記載の測定素子。