JPS63119686A - クリサンセモ−ル,ラバンデュロ−ルおよび類似アルコ−ルの酸への微生物酵素的変換 - Google Patents
クリサンセモ−ル,ラバンデュロ−ルおよび類似アルコ−ルの酸への微生物酵素的変換Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明はクリサンセミツク酸および類似酸のいくつかの
立体異性体の、クリサンセモールおよび類似アルコール
からの微生物的合成に関するものである。このアルコー
ル基質は微生物源の酸化性酵素により酸へ立体選択的に
変換される。
立体異性体の、クリサンセモールおよび類似アルコール
からの微生物的合成に関するものである。このアルコー
ル基質は微生物源の酸化性酵素により酸へ立体選択的に
変換される。
(従来技術)
植物のいくつかの菌種の構成成分は19世紀初期以来、
殺昆虫剤として用いられてきた。米国特許/%4,52
5.455を参照されたい。その活性成分、例えばピレ
トリン■およびピレトリン■は、+IJ アルコール
類であるビレトロロン、シネロロンまたはジャスモロン
と(2) 酸類であるクリサンセミツク酸(2,2−
ジメチル−3−(2−メチル)−プロペニル))−シク
ロプロパンカルボン酸)およびビレトリック酸(3−(
2−メトキシ−カルボニル)−7’ロペニル)−2,2
−ジメチル)−シクロプロパンカルボン酸)とのそれぞ
れのエステルである。
殺昆虫剤として用いられてきた。米国特許/%4,52
5.455を参照されたい。その活性成分、例えばピレ
トリン■およびピレトリン■は、+IJ アルコール
類であるビレトロロン、シネロロンまたはジャスモロン
と(2) 酸類であるクリサンセミツク酸(2,2−
ジメチル−3−(2−メチル)−プロペニル))−シク
ロプロパンカルボン酸)およびビレトリック酸(3−(
2−メトキシ−カルボニル)−7’ロペニル)−2,2
−ジメチル)−シクロプロパンカルボン酸)とのそれぞ
れのエステルである。
天然のクリサンセミツク酸エステルの合成的類似体が最
近開発され、それはその卓越した殺虫活性と光安定性が
顕著である。ビレトロイドと命名されるこれらの合成的
類似物はクロロブロノ(ンカルボン酸から生じ、その酸
中に(ま3員環が2個の双頭メチル基とB置換ビニル基
とを含んでいる。
近開発され、それはその卓越した殺虫活性と光安定性が
顕著である。ビレトロイドと命名されるこれらの合成的
類似物はクロロブロノ(ンカルボン酸から生じ、その酸
中に(ま3員環が2個の双頭メチル基とB置換ビニル基
とを含んでいる。
重要なビレトロイド酸は、クリサンセミツク酸(X−Y
−−CH,)とビレトリック酸(z−−COOCH,
、Y−−CH,)のほかに、ジクロロクリサンセミツク
酸(X−Y−−CL)およびジブロモクリ丈ンセミツク
酸(X−Y−−Eデ)を言み、それらは式 によって示される。
−−CH,)とビレトリック酸(z−−COOCH,
、Y−−CH,)のほかに、ジクロロクリサンセミツク
酸(X−Y−−CL)およびジブロモクリ丈ンセミツク
酸(X−Y−−Eデ)を言み、それらは式 によって示される。
トランス−クリサンセミツクエステルおよび、特に、(
1R,3R)(+)H−トランス構造をもつ立体異性体
のすぐれた活性は古くから知られている。
1R,3R)(+)H−トランス構造をもつ立体異性体
のすぐれた活性は古くから知られている。
例えば、最も大きい殺虫活性は、天然のビレトロイドア
ルコール成分であるビレトロロン、シネロロンおよびジ
ャスモロンと組合せたクリサンセミツクエステルの(1
R,3R)−トランス異性体並びにビオアレスリ/(ア
ルコール−′L5またはトランスーアレスロレン)およ
びテトラメトリン(アルコールーネオピナミノール)の
ような合成りリサンセメートの中に見出されろ。活性対
立体化学構造の類似の関係が見出された。もう一つの例
として、デカメトリン(K−オルトリン)は、酸成分と
して(IR93R)−シス−3−(2゜2−ジブロモビ
ニ/l/ ) −2、2−ジメチル)−シクロプロパン
力ルボンe<すなわち、デカメトリニック酸またはジブ
ロモクリサンセミツク酸)を含む。クリサンセミツク酸
またはその類似体のさらに他の立体異性体も酸成分とし
て好ましい。
ルコール成分であるビレトロロン、シネロロンおよびジ
ャスモロンと組合せたクリサンセミツクエステルの(1
R,3R)−トランス異性体並びにビオアレスリ/(ア
ルコール−′L5またはトランスーアレスロレン)およ
びテトラメトリン(アルコールーネオピナミノール)の
ような合成りリサンセメートの中に見出されろ。活性対
立体化学構造の類似の関係が見出された。もう一つの例
として、デカメトリン(K−オルトリン)は、酸成分と
して(IR93R)−シス−3−(2゜2−ジブロモビ
ニ/l/ ) −2、2−ジメチル)−シクロプロパン
力ルボンe<すなわち、デカメトリニック酸またはジブ
ロモクリサンセミツク酸)を含む。クリサンセミツク酸
またはその類似体のさらに他の立体異性体も酸成分とし
て好ましい。
一般式
のラバンデュリツク酸およびその誘導体の特定の立体異
性体もまた殺虫活性をもつことが知られており、エリオ
ツドらのPaattc、Sci、 14 : 1−8
(1983)、およびアヤドらのJ、Agria。
性体もまた殺虫活性をもつことが知られており、エリオ
ツドらのPaattc、Sci、 14 : 1−8
(1983)、およびアヤドらのJ、Agria。
Food、Cham、 32 : 85 92 (19
84)により報告されているとおりである。
84)により報告されているとおりである。
殺虫剤成分としてのそれらの用途のほかに、ビレトロイ
ド酸およびラバンデュリツク酸の誘導体のいくつかはあ
る種の立体化学的梅漬において広い工業的用途をもって
いる。
ド酸およびラバンデュリツク酸の誘導体のいくつかはあ
る種の立体化学的梅漬において広い工業的用途をもって
いる。
立体化学的構造対殺虫剤的活性の関係または他の工業的
用途の故に、立体化学的に均一なビレトロイド酸の製造
性の開発に主な努力がなされてぎた。これらの努力のい
くつかは、D、アールトらのANGEWANDTE C
HEMIE)startsational工心すliリ
エ互生リすon、20巻、/f69.703−818頁
(1981年9月)に1とめられている。
用途の故に、立体化学的に均一なビレトロイド酸の製造
性の開発に主な努力がなされてぎた。これらの努力のい
くつかは、D、アールトらのANGEWANDTE C
HEMIE)startsational工心すliリ
エ互生リすon、20巻、/f69.703−818頁
(1981年9月)に1とめられている。
しかしこれらの努力にもかかわらず、ビレトロイド酸お
よびラパンデュリック酸の誘導体のコスト的に有効な立
体選択的および光学対掌還択的な合成方法を求める必要
性が実際問題として感じられている。
よびラパンデュリック酸の誘導体のコスト的に有効な立
体選択的および光学対掌還択的な合成方法を求める必要
性が実際問題として感じられている。
(発明が解決しようとする問題点)
本発明はいくつかの微生物がクリサンセモールおよび類
似アルコールをそれらの相当ビレトロイド酸の立体選択
的に変換し得る一つまたは一つより多くの酵素を含有す
るという発見に関係している。このように、例えば(1
R,3R)…−Σ2乙l−クリサンセモールのような天
然産植物代謝物は、(1R,3R)(+1−トランスー
クリスサンセミツク酸へ変換されることができ、その際
そのアルコール立体異性体の実質上すべてが相当する酸
の立体異性体へ変換される。これは、そのアルコールの
(14,3R)山−トランス立体異性体がそのアルコー
ルの他の立体異性体の混合物中に會1れていても、ある
いはそのアルコールが立体化学的に均一であり、すなわ
ち、その特定の立体異性体のみを含む場合でも、達成で
きる。例えば、(1R,3R)(+l−乙王一ジブロモ
クリサンセモールのような合成的に製造される立体化学
的に均゛ −なアルコール、あるいは立体化学的混合物
中に含まれる同アルコールは、(1R,3R)(+)…
−と五−ジブロモクリサンセミツク酸へ変換させること
ができる。最後に、アルコールの立体異性体混合物は、
そのアルコールのあ1り望ましくない立体異性体を未変
換のま!で残しながら所望の立体異性体を選択的に変換
する酵素の使用によって、その酸の特定の立体異性体ま
たは所望の立体異性体へ分割することができる。その酵
素変換から生ずる酸立体異性体は、未変換アルコール立
体異性体から既知の方法によって分離することができる
。
似アルコールをそれらの相当ビレトロイド酸の立体選択
的に変換し得る一つまたは一つより多くの酵素を含有す
るという発見に関係している。このように、例えば(1
R,3R)…−Σ2乙l−クリサンセモールのような天
然産植物代謝物は、(1R,3R)(+1−トランスー
クリスサンセミツク酸へ変換されることができ、その際
そのアルコール立体異性体の実質上すべてが相当する酸
の立体異性体へ変換される。これは、そのアルコールの
(14,3R)山−トランス立体異性体がそのアルコー
ルの他の立体異性体の混合物中に會1れていても、ある
いはそのアルコールが立体化学的に均一であり、すなわ
ち、その特定の立体異性体のみを含む場合でも、達成で
きる。例えば、(1R,3R)(+l−乙王一ジブロモ
クリサンセモールのような合成的に製造される立体化学
的に均゛ −なアルコール、あるいは立体化学的混合物
中に含まれる同アルコールは、(1R,3R)(+)…
−と五−ジブロモクリサンセミツク酸へ変換させること
ができる。最後に、アルコールの立体異性体混合物は、
そのアルコールのあ1り望ましくない立体異性体を未変
換のま!で残しながら所望の立体異性体を選択的に変換
する酵素の使用によって、その酸の特定の立体異性体ま
たは所望の立体異性体へ分割することができる。その酵
素変換から生ずる酸立体異性体は、未変換アルコール立
体異性体から既知の方法によって分離することができる
。
(問題点を解決するための手段)
従って、本発明は式
%式%
の酸の微生物的合成方法に関するものであり、その場合
、それぞれ式 のアルコール基質と微生物起源の一つまたは一つより多
くの#素とを一緒に添加し、酸化性条件下で培養するも
のであり、ここに、 R8は水素原子、−CHl、−CH,CH,、−QH,
CH,CH,、およびハロゲン原子から成る群から選ば
れ; R2は水素原子、−CH3,−CIl、CH,、−CH
,CH,CH,、およびハロゲン原子から成る群から選
ばれ; そして、上記の左側の式に示されろ化合物について、 R5は−CH,、−CH,CH,、−CHtCH,CH
,、−CH,CHtCH,CH,、−CH,CHtCH
,CH,CH,およびハロゲン原子から成る群から選ば
れ;R3は−CH,、−CH20M、 、CH,CH,
CH,、−CHtCH,CH,CHl、−CHtCH,
CH,CH,CH8およびハロゲン原子、および−CO
OCH,から成る群から選ばれる。
、それぞれ式 のアルコール基質と微生物起源の一つまたは一つより多
くの#素とを一緒に添加し、酸化性条件下で培養するも
のであり、ここに、 R8は水素原子、−CHl、−CH,CH,、−QH,
CH,CH,、およびハロゲン原子から成る群から選ば
れ; R2は水素原子、−CH3,−CIl、CH,、−CH
,CH,CH,、およびハロゲン原子から成る群から選
ばれ; そして、上記の左側の式に示されろ化合物について、 R5は−CH,、−CH,CH,、−CHtCH,CH
,、−CH,CHtCH,CH,、−CH,CHtCH
,CH,CH,およびハロゲン原子から成る群から選ば
れ;R3は−CH,、−CH20M、 、CH,CH,
CH,、−CHtCH,CH,CHl、−CHtCH,
CH,CH,CH8およびハロゲン原子、および−CO
OCH,から成る群から選ばれる。
その酵素によって触媒される、アルコールの酸への変換
は脱水素反応、酸化反応またはその他によるものであっ
てよい。
は脱水素反応、酸化反応またはその他によるものであっ
てよい。
アルコール基質は例えば、次の立体異性体3V−
R,R。
の全部(立体化学的完全混合物)、一つ(立体化学的に
均一なアルコール)または一つより多く(立体化学的部
分混合物)、から成る。
均一なアルコール)または一つより多く(立体化学的部
分混合物)、から成る。
上記立体異性体のどれがアルコール基質中に存在するか
、そして、存在するどれが酵素によって立体化学的類似
酸へ変換されたかに応じて、次のビレトロイド酸の一つ
筐たは一つより多くが生成される。
、そして、存在するどれが酵素によって立体化学的類似
酸へ変換されたかに応じて、次のビレトロイド酸の一つ
筐たは一つより多くが生成される。
ヘー
尚、ハロゲン化ヒレトロイドアルコールおよび酸の絶対
構造(absolute configuratイ0外
)は上記の各構造式で以て示されるとおりである。しか
し、鞄対構造の星漫(すなわち、R対S)は、もしR1
および/またはR1がハロゲンである場合にはC1に8
いて逆転し、R8および/またはR4がハロゲンである
場合にはC3において逆転する。
構造(absolute configuratイ0外
)は上記の各構造式で以て示されるとおりである。しか
し、鞄対構造の星漫(すなわち、R対S)は、もしR1
および/またはR1がハロゲンである場合にはC1に8
いて逆転し、R8および/またはR4がハロゲンである
場合にはC3において逆転する。
例えばR,−R,−R,−R4==CH3f)場合ノ1
−H(L272)−クリサンセミツク酸は1R,3Rと
命名され、−万、R1−R2−/% ロゲン、R,−R
,−CH。
−H(L272)−クリサンセミツク酸は1R,3Rと
命名され、−万、R1−R2−/% ロゲン、R,−R
,−CH。
の場合の出kj−乙?−酸はls、3Rと命名される。
同様に、RlmR,m C1l、 、R,mR4m ハ
ロゲンである田トランスー酸は、かりにこれらの化合物
の三つのすべてが…トラ/スクリサンセミック酸につい
て示されるものと同じ絶対立体化学構造をもっとしても
、1R,3Sと命名される。
ロゲンである田トランスー酸は、かりにこれらの化合物
の三つのすべてが…トラ/スクリサンセミック酸につい
て示されるものと同じ絶対立体化学構造をもっとしても
、1R,3Sと命名される。
本発明は、ラバンデュロールおよび類似アルコールもま
たクリサンセミルアルコールについて上述したのと同じ
く、それらの相当酸へ立体選択的に変換され得るという
発見に関係している。従って、本発明は式 の酵虐生物的会成方法に関するものであり、その場合、
式 のアルコール基質と微生物起源の1個または1個より多
くの酵素とを一緒に添加し、酸化性条件下で温置(イン
キュベート)するものであり、式中、RIlは−CH,
、水素原子およびハロゲン原子から成る群から選ばれ; R6は−CHs、水素原子およびハロゲン原子から成る
群から選ばれ; R1は−CH3、水素原子およびハロゲン原子から成る
群から選ばれ; R,は水素原子、−CH,および−CH2CII、から
成る群から選ばれ; Roは水素原子および一〇H,から成る群から選ばれ; RIoは−CR3、CH2CHs s イソプロピレ
ン基、イソプロピル基、二級ブチル基、インブチル基、
三級ブチル基、シクロペンチに基、シクロプロピル基か
ら成る邸から選ばれる。
たクリサンセミルアルコールについて上述したのと同じ
く、それらの相当酸へ立体選択的に変換され得るという
発見に関係している。従って、本発明は式 の酵虐生物的会成方法に関するものであり、その場合、
式 のアルコール基質と微生物起源の1個または1個より多
くの酵素とを一緒に添加し、酸化性条件下で温置(イン
キュベート)するものであり、式中、RIlは−CH,
、水素原子およびハロゲン原子から成る群から選ばれ; R6は−CHs、水素原子およびハロゲン原子から成る
群から選ばれ; R1は−CH3、水素原子およびハロゲン原子から成る
群から選ばれ; R,は水素原子、−CH,および−CH2CII、から
成る群から選ばれ; Roは水素原子および一〇H,から成る群から選ばれ; RIoは−CR3、CH2CHs s イソプロピレ
ン基、イソプロピル基、二級ブチル基、インブチル基、
三級ブチル基、シクロペンチに基、シクロプロピル基か
ら成る邸から選ばれる。
酵素によって触媒される、アルコールの酸への変換は脱
水素反応、酸化反応あるいはその他であってよい。
水素反応、酸化反応あるいはその他であってよい。
そのアルコール基質は例えば、次に示すラバンデュロー
ル(R,−R,)=I CH,、R,=sR,−R,−
水素原子;R1゜−イソプロピレン基)の立体異性体の
両刀(完全な立体化学的混合物)または一方(立体化学
的均一アルコール)から成る。
ル(R,−R,)=I CH,、R,=sR,−R,−
水素原子;R1゜−イソプロピレン基)の立体異性体の
両刀(完全な立体化学的混合物)または一方(立体化学
的均一アルコール)から成る。
/2−t)−ラバンデュロール S−(ト)−ラバ
ンデュロール上記異性体のどれが゛アルコール基質中に
存在するか、存在するどれか酵素によって立体化学的混
合物へ転化されるかに応じて次の酸の一万または両刃が
生成する。
ンデュロール上記異性体のどれが゛アルコール基質中に
存在するか、存在するどれか酵素によって立体化学的混
合物へ転化されるかに応じて次の酸の一万または両刃が
生成する。
同、本明細書および「特許請求の範囲」の全体にわたっ
て、ラバンデュロールおよびラバンデュリツク酸のR−
()およびS−十訪導体への言及は、C−2(すなわち
、−CH,OHおよび−COOHがそれぞれ結合してい
る炭素)の周りの構造のことをいう。R8および/また
はRoとして各種の基の付加はC−3において第二の不
斉炭素中心をつくり出すが、その種の付加はC−2にお
ける絶対構造を変えるものではない。
て、ラバンデュロールおよびラバンデュリツク酸のR−
()およびS−十訪導体への言及は、C−2(すなわち
、−CH,OHおよび−COOHがそれぞれ結合してい
る炭素)の周りの構造のことをいう。R8および/また
はRoとして各種の基の付加はC−3において第二の不
斉炭素中心をつくり出すが、その種の付加はC−2にお
ける絶対構造を変えるものではない。
一般的には、アルコール基質の立体異性体のいくつかの
みがビレトロイドまたはラバンデュロール酸の立体化学
的類似立体異性体へ痕跡量をこえる量で変換される場合
には、アルコールの立体化学的混合物は酸への変換によ
って実際上分割される。それらの立体異性体は残留する
未変換アルコールv体異件体から既知の方法によって分
離することができる。
みがビレトロイドまたはラバンデュロール酸の立体化学
的類似立体異性体へ痕跡量をこえる量で変換される場合
には、アルコールの立体化学的混合物は酸への変換によ
って実際上分割される。それらの立体異性体は残留する
未変換アルコールv体異件体から既知の方法によって分
離することができる。
アスペルギルス(Aspargil1%a)属の中で、
アルコール基質を相当酸へ変換する三つの種が発見サレ
タ。アスペルギルス・オクラセウス(ochraaa−
sa)(ATCC18500)、アスペルギルス・フラ
ビペス(flavipaa)(ATCC103・0)、
およびアスペルギルス・フラビペス(ATCC1101
3)である。これらの微生物はアルコールを相当酸へ、
恐らくは解毒機構として変換する一つまたは一つより多
くの酵素を含む。これらの微生物はそれらにこれらの酵
素を発現させる遺伝子を含む。これらの酵素をコードす
る遺伝子を分離すれば、他の微生物を既知の手段によっ
て同一または実質上同一 (homelog%S)の酵
素を発現するよう形質転換できろ。
アルコール基質を相当酸へ変換する三つの種が発見サレ
タ。アスペルギルス・オクラセウス(ochraaa−
sa)(ATCC18500)、アスペルギルス・フラ
ビペス(flavipaa)(ATCC103・0)、
およびアスペルギルス・フラビペス(ATCC1101
3)である。これらの微生物はアルコールを相当酸へ、
恐らくは解毒機構として変換する一つまたは一つより多
くの酵素を含む。これらの微生物はそれらにこれらの酵
素を発現させる遺伝子を含む。これらの酵素をコードす
る遺伝子を分離すれば、他の微生物を既知の手段によっ
て同一または実質上同一 (homelog%S)の酵
素を発現するよう形質転換できろ。
活性機生物の細胞系は、連続工程で使用できるより安定
で半減期がより長い生体反応器(バイオリアクター)系
を提供するために固定化されてもよい。細胞は各種の方
式で固定化することができ、その方式は、細胞の共有結
合釣果a結分、固体支持体への共有結合、支持体への非
共有(例えばイオン)結合、不活性支持体の周囲上への
成長による非共有結合、ゲル状マドIJツクス中への細
胞の包み込み、あるいはマイクロカプセル化を含む。
で半減期がより長い生体反応器(バイオリアクター)系
を提供するために固定化されてもよい。細胞は各種の方
式で固定化することができ、その方式は、細胞の共有結
合釣果a結分、固体支持体への共有結合、支持体への非
共有(例えばイオン)結合、不活性支持体の周囲上への
成長による非共有結合、ゲル状マドIJツクス中への細
胞の包み込み、あるいはマイクロカプセル化を含む。
合成ポリマー(ポリウレタン、ポリアクリルアミド)、
Hよび天然ポリマー(寒天、カラギーナン、セルロース
)の中への包みこみが最もよく行なわれる方法を代表す
る。細胞の懸濁体を合成モノマー物質と混合し、そして
重合をおこさせるか、あるいは天然ポリマーを可溶化し
て細胞と混合し。
Hよび天然ポリマー(寒天、カラギーナン、セルロース
)の中への包みこみが最もよく行なわれる方法を代表す
る。細胞の懸濁体を合成モノマー物質と混合し、そして
重合をおこさせるか、あるいは天然ポリマーを可溶化し
て細胞と混合し。
次に細胞の周りに析出(、凝結)させる。細胞を次に、
充填床反応器、連続供給撹拌タンク反応器、流動床反応
器、あるいは中空繊維反応器を含めた、多数の笑験室生
体反応器形態として反応器に詰めることができる。変換
は基質溶液を生体反応器の触媒(細胞)床の上または中
に通し、連続的に生成物を収穫することによって行なわ
れる。
充填床反応器、連続供給撹拌タンク反応器、流動床反応
器、あるいは中空繊維反応器を含めた、多数の笑験室生
体反応器形態として反応器に詰めることができる。変換
は基質溶液を生体反応器の触媒(細胞)床の上または中
に通し、連続的に生成物を収穫することによって行なわ
れる。
あるいはまた、−旦酵素活性が微生物培養によって示さ
れろと、細胞を崩壊させることによって無細胞系を形成
させてよい。無細胞系中に含まれる醇累を精製し単離す
ることができる。細胞の崩壊は、研磨剤と一緒の細胞磨
砕、ブラウンホモジナイサ−(あるいは衝零ホモジナイ
ザー)の使用、超廿波処理、あるいは冷凍または解凍の
繰返し、によって行ない得る。例えば、米国特許A4,
525.455を参照されたい。はじめの粗精製はしば
しば硫酸アンモニウム分画化によつ℃達成することがで
きる。この活性画分は矢にゲルクロマトグラフイ、電気
泳動、および/またはアフィニティクロマトグラフイに
よってハ!11製される。純酵素は、単一成分から成る
ものと仮定すれば、一定の比活性(単位時間あたりで蛋
白質1■あたりに転換される基質のミ’)モル数)と電
気泳動時の単一バンドを生ずるものと期待される。理想
的にはその蛋白質は結晶性であってよい。酵素はまた固
体支持体上で固定化されてよい。
れろと、細胞を崩壊させることによって無細胞系を形成
させてよい。無細胞系中に含まれる醇累を精製し単離す
ることができる。細胞の崩壊は、研磨剤と一緒の細胞磨
砕、ブラウンホモジナイサ−(あるいは衝零ホモジナイ
ザー)の使用、超廿波処理、あるいは冷凍または解凍の
繰返し、によって行ない得る。例えば、米国特許A4,
525.455を参照されたい。はじめの粗精製はしば
しば硫酸アンモニウム分画化によつ℃達成することがで
きる。この活性画分は矢にゲルクロマトグラフイ、電気
泳動、および/またはアフィニティクロマトグラフイに
よってハ!11製される。純酵素は、単一成分から成る
ものと仮定すれば、一定の比活性(単位時間あたりで蛋
白質1■あたりに転換される基質のミ’)モル数)と電
気泳動時の単一バンドを生ずるものと期待される。理想
的にはその蛋白質は結晶性であってよい。酵素はまた固
体支持体上で固定化されてよい。
(11クリサンモールをその酸へ酸化する能力について
の微生物的選別 これらの研究に使用した培養体はすべてサブロー−マル
トース寒天(ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラ
トリーズ)の冷凍(4℃)斜面上で維持し、6ケ月毎に
移植して生存能力を維持させた。培養体の人手源は次の
とおりであった:ATCC(メアリーランド州ロックビ
ル):NRRL(イリノイス州ベオリア) : Ul、
J、P、Roaoatza。
の微生物的選別 これらの研究に使用した培養体はすべてサブロー−マル
トース寒天(ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラ
トリーズ)の冷凍(4℃)斜面上で維持し、6ケ月毎に
移植して生存能力を維持させた。培養体の人手源は次の
とおりであった:ATCC(メアリーランド州ロックビ
ル):NRRL(イリノイス州ベオリア) : Ul、
J、P、Roaoatza。
アイオワ大学薬学部(アイオワ市):CBS。
Cestraalbsrgas Voor Shi
mmgl esl tsr*a、(オランダ、バールy
) : NCYC、NationalCollact
to%of Yeast Cu1tures、醸造工業
研究基金(ナツトフィールド、サリー、英国)。これら
の研究において使った醗酵培地は次の組成から成る:A
−デキストロース、20?;大豆粉末(20メツシュ;
テキサス州オースチンのキャピタル・フイーヅ):5f
:塩化ナトリウム、52;燐酸カリウム(二塩基性)、
5t;酵母抽出物(ディフコ)、52;蒸溜水、1.0
00d:l/11CLrニア、0へ調節したpHo B
−デキストロース、20?;アシディカーゼ(aeid
icasg)ペプトン(EBL MicrobioL
ogy Sytttama* メアリーランド州コック
スビル)、59;燐酸カリウム(二塩基性)、5f;蒸
溜および脱塩水、L 000ml:6N lIC1で7
.0へ調節したpH0A、 Eの両培地は個別フラスコ
中で121℃で15分間滅菌した。
mmgl esl tsr*a、(オランダ、バールy
) : NCYC、NationalCollact
to%of Yeast Cu1tures、醸造工業
研究基金(ナツトフィールド、サリー、英国)。これら
の研究において使った醗酵培地は次の組成から成る:A
−デキストロース、20?;大豆粉末(20メツシュ;
テキサス州オースチンのキャピタル・フイーヅ):5f
:塩化ナトリウム、52;燐酸カリウム(二塩基性)、
5t;酵母抽出物(ディフコ)、52;蒸溜水、1.0
00d:l/11CLrニア、0へ調節したpHo B
−デキストロース、20?;アシディカーゼ(aeid
icasg)ペプトン(EBL MicrobioL
ogy Sytttama* メアリーランド州コック
スビル)、59;燐酸カリウム(二塩基性)、5f;蒸
溜および脱塩水、L 000ml:6N lIC1で7
.0へ調節したpH0A、 Eの両培地は個別フラスコ
中で121℃で15分間滅菌した。
培養は250 rpmで27℃において操作されろNB
SモデルG−25Rエンバイロンメンタル(B@gir
6nmantal )振とう機上の、25ff+7の培
地を含む1251のペルコ・プロング(Ba1le。
SモデルG−25Rエンバイロンメンタル(B@gir
6nmantal )振とう機上の、25ff+7の培
地を含む1251のペルコ・プロング(Ba1le。
Dalong)培養フラスコの中で実施した。
各検討培養物について、第一段フラスコは寒天が1面上
の表面増殖物または胞子をフラスコ中に含1れる培地の
一部の中に懸濁し、その懸濁体をその125Nフラスコ
へ無菌状態下で移すことによって開始させた。72時間
培養後、この第一段培養物の2111tの部分を使って
同組成の第二段階フラスコへ接種し、培養を24時間継
続させた。
の表面増殖物または胞子をフラスコ中に含1れる培地の
一部の中に懸濁し、その懸濁体をその125Nフラスコ
へ無菌状態下で移すことによって開始させた。72時間
培養後、この第一段培養物の2111tの部分を使って
同組成の第二段階フラスコへ接種し、培養を24時間継
続させた。
第二段階に2いて24時間後、基質を添加し、@置(イ
ンキュベーション)を継続させた。試料(1+++l)
を無菌的に採取した。試料をl mlのクラーク緩衝I
VL(0,2M KClの25Nと0.2 M HC
l17) 6.5 m/!0100 mlへW&釈、p
H2,0)と混合し、栓付き管の中で51Ltのエーテ
ルに抽出した。管は30分間、18 rpmで混合し、
5分間遊心分離にかげた(1500Xf)。有機層は真
望下低温で乾個させ、Q、2m6のエーテルでもどした
。試料は、後述するとおりにジアゾエタンでの誘導体合
成後にガスクロマトグラフィによって分析した。
ンキュベーション)を継続させた。試料(1+++l)
を無菌的に採取した。試料をl mlのクラーク緩衝I
VL(0,2M KClの25Nと0.2 M HC
l17) 6.5 m/!0100 mlへW&釈、p
H2,0)と混合し、栓付き管の中で51Ltのエーテ
ルに抽出した。管は30分間、18 rpmで混合し、
5分間遊心分離にかげた(1500Xf)。有機層は真
望下低温で乾個させ、Q、2m6のエーテルでもどした
。試料は、後述するとおりにジアゾエタンでの誘導体合
成後にガスクロマトグラフィによって分析した。
表1に示す菌および酵母の25y!の異なる種による、
(+/−)−−/:5/)ランスークリサンセモールの
相当クリサンセミツク酸への微生物酸化を検討した。
(+/−)−−/:5/)ランスークリサンセモールの
相当クリサンセミツク酸への微生物酸化を検討した。
三種のアスペルギルスがクリサンセメートの立体異性体
混合物をクリサンセミツク酸へ変i−するこ11013
はこの変換を基質添加後72時間で開始した。アスペル
ギルス・オクラセウス ATCC18500は所望の酸
化を基質象加後直ちに開始した。A、オクラセウス(A
TCC18500)は最大の酸化に48時間を必要とし
、一方、二種のA、フラビペス釉は最大の酸化に96)
20時間を必要とした。
混合物をクリサンセミツク酸へ変i−するこ11013
はこの変換を基質添加後72時間で開始した。アスペル
ギルス・オクラセウス ATCC18500は所望の酸
化を基質象加後直ちに開始した。A、オクラセウス(A
TCC18500)は最大の酸化に48時間を必要とし
、一方、二種のA、フラビペス釉は最大の酸化に96)
20時間を必要とした。
(2)微生物選別の際に用いたガスクロマトグラフ法
ガスクロマトグラフ分析は島津GC−4CMクロマトグ
ラフで実施したが、それは、5 m X内径3nの「シ
ラン化」ガラスカラムをもち、クロモソーフG HP・
60/80メツシユ(コネチカット州ノースヘプンのフ
ォックス・アナラボ)上の10重推賞QF)で充填され
ていた。フレーム・アイオニゼーション検出器を使用し
、窒素をキャリヤーガスとした。次の保持時間(分で)
が185℃、キャリヤーガス(CG)流速14w1t/
分、の特定条件下において観察されたニラセミ体乞?−
クリサンセモール、13.3分;ラセミ体トランスーク
リサンセモール、12.4分;ラセミ体シス−クリサン
セミツク酸エチルエステル、15.5分;ラセミ体トラ
ンス−クリサンセミツク酸エチルエステル、16.8分
;ラセミ体シスークリサンセミルアルデヒド、20.2
分;ラセミ体トランスークリサンセミルアルデヒド、1
8.2分。
ラフで実施したが、それは、5 m X内径3nの「シ
ラン化」ガラスカラムをもち、クロモソーフG HP・
60/80メツシユ(コネチカット州ノースヘプンのフ
ォックス・アナラボ)上の10重推賞QF)で充填され
ていた。フレーム・アイオニゼーション検出器を使用し
、窒素をキャリヤーガスとした。次の保持時間(分で)
が185℃、キャリヤーガス(CG)流速14w1t/
分、の特定条件下において観察されたニラセミ体乞?−
クリサンセモール、13.3分;ラセミ体トランスーク
リサンセモール、12.4分;ラセミ体シス−クリサン
セミツク酸エチルエステル、15.5分;ラセミ体トラ
ンス−クリサンセミツク酸エチルエステル、16.8分
;ラセミ体シスークリサンセミルアルデヒド、20.2
分;ラセミ体トランスークリサンセミルアルデヒド、1
8.2分。
+31 (+/−) −−i−</ トランス゛−ク
リサンセモールの調製 (+/−)−シス/トランス−エチルクリサンセメート
(2f)を乾燥エーテル(60m/り中に溶かし、水素
化リチウムアルミニウム(500〜)を小部分に分けて
溶液へ象加した。次に、混合物を4時間還流させた。過
剰の試桑を飽和塩化アンモニウム溶液の滴状添加によっ
て失活させた。沈澱を濾過したのち、溶剤を減圧下で蒸
発させた。
リサンセモールの調製 (+/−)−シス/トランス−エチルクリサンセメート
(2f)を乾燥エーテル(60m/り中に溶かし、水素
化リチウムアルミニウム(500〜)を小部分に分けて
溶液へ象加した。次に、混合物を4時間還流させた。過
剰の試桑を飽和塩化アンモニウム溶液の滴状添加によっ
て失活させた。沈澱を濾過したのち、溶剤を減圧下で蒸
発させた。
合計1.451の(±/−)−ヱ乙/トランスークリサ
ンセモールがさらに異性化を行うことなく得られた。
ンセモールがさらに異性化を行うことなく得られた。
+43 (+/−)−y、z/)ランス−クリサンセ
ミツク酸のジアゾエタンによる誘導体合成。
ミツク酸のジアゾエタンによる誘導体合成。
(+/−)−y−z/ トランス−クリサンセミツク酸
10q)を1−の乾燥エーテル中に溶かした。
10q)を1−の乾燥エーテル中に溶かした。
エーテル中の新しく調製したジアゾエタン(1−エチル
−3−ニトロ)−ニトロソグアニジンから)をこの溶液
へ添加した。5分後溶剤を蒸発させて、21.5n9の
エチルクリサンセメート混合物が得られた(定量的収J
ik)。この方法によって化成したエチルクリサンセメ
ートをガスクロマトグラフ分析用の標準物質としてかつ
代謝結果の確認に使用した。同じ方法をGC分析に先立
つ微生物抽出物の誘導体合成にも使用した。
−3−ニトロ)−ニトロソグアニジンから)をこの溶液
へ添加した。5分後溶剤を蒸発させて、21.5n9の
エチルクリサンセメート混合物が得られた(定量的収J
ik)。この方法によって化成したエチルクリサンセメ
ートをガスクロマトグラフ分析用の標準物質としてかつ
代謝結果の確認に使用した。同じ方法をGC分析に先立
つ微生物抽出物の誘導体合成にも使用した。
(51R−(−)−2−オクタツールによる誘導体合成
に続く、個々のクリサンセミツク酸立体異性体のガスク
ロマトグラフ分析。
に続く、個々のクリサンセミツク酸立体異性体のガスク
ロマトグラフ分析。
(+/−)−シス/トランス−クリサンセミツクrR(
50In9)を2−の乾燥ベンゼン中に浴かした。
50In9)を2−の乾燥ベンゼン中に浴かした。
新たに蒸溜したチオニルクロライド(78,49)とピ
リジン(乾燥、23.5■)とをひき続いて添加し、M
、エリオツドらのPoetic、 Set、 11巻、
p、 513 (1980)およびC,ブルツクスらの
Asal 、 Chmnh、 45巻、p、896(1
973)、の方法に従い、撹拌して、相当する酸クロラ
イドを形成させた。次にR−(−)−2−オクタツール
(3B、7t/)とピリジン(乾燥、23.5■)をこ
の溶液へ添加し、室温でさらに26時間撹拌した。
リジン(乾燥、23.5■)とをひき続いて添加し、M
、エリオツドらのPoetic、 Set、 11巻、
p、 513 (1980)およびC,ブルツクスらの
Asal 、 Chmnh、 45巻、p、896(1
973)、の方法に従い、撹拌して、相当する酸クロラ
イドを形成させた。次にR−(−)−2−オクタツール
(3B、7t/)とピリジン(乾燥、23.5■)をこ
の溶液へ添加し、室温でさらに26時間撹拌した。
溶剤を除去した後、R−(−)−2−オクタツール・ク
リサンセメートのジアステレオマー混合物が黄色油とし
て得られた。この油の一部を上述のとおりGC分析にか
けた。各ジアステレオマーの保持時間(分)は次のとお
りであった: C−)−/δ−R−(−)−2−オフ 63.8゜タ
ノール・クリサンセメート (+)−トランス−R−(−)−2−76,9゜オクタ
ツール・クリサンセメート (6)培地変更実験 (ATCC18500)がクリサンセメートをクリサン
セミツク酸へ変換できたことを示している。
リサンセメートのジアステレオマー混合物が黄色油とし
て得られた。この油の一部を上述のとおりGC分析にか
けた。各ジアステレオマーの保持時間(分)は次のとお
りであった: C−)−/δ−R−(−)−2−オフ 63.8゜タ
ノール・クリサンセメート (+)−トランス−R−(−)−2−76,9゜オクタ
ツール・クリサンセメート (6)培地変更実験 (ATCC18500)がクリサンセメートをクリサン
セミツク酸へ変換できたことを示している。
次にこれらの変換を最適化するために研究を行ない、以
下の因子と成分をその段階で11水準において変更また
は付加した: ■ 微結晶性セルロースまたはセライ)(!M’/l)
を培養体へ添加してペレット形成の核を捉供することに
より最適増殖を求めた。
下の因子と成分をその段階で11水準において変更また
は付加した: ■ 微結晶性セルロースまたはセライ)(!M’/l)
を培養体へ添加してペレット形成の核を捉供することに
より最適増殖を求めた。
■ A、フラビペス(ATCC1030)bよびA、オ
クラセウスCATCC18500)による変換中に、培
養体のpHをより塩基性pH(8,4まで)の方へずら
した。このようにして、初期pH調節の効果なA、フラ
ビペス(ATCC1030)、A、フラビペス(ATC
C11013)お:びA、オクラセウスCATCC18
500)で検討した。この目的に対して、5個の異なる
初期pH値(4,5,6,7および8)を用いた。
クラセウスCATCC18500)による変換中に、培
養体のpHをより塩基性pH(8,4まで)の方へずら
した。このようにして、初期pH調節の効果なA、フラ
ビペス(ATCC1030)、A、フラビペス(ATC
C11013)お:びA、オクラセウスCATCC18
500)で検討した。この目的に対して、5個の異なる
初期pH値(4,5,6,7および8)を用いた。
■ 変換中の強い光の存在の効果を検討した。
■ 培地中の異なる糖水率の効果を検討(また。
調節は4水準にわたっていた( 20 t/lの正規培
地組成のほかに、正規の糖貴の、α:0.5倍;6:1
.5倍二〇:2倍、およびd;4倍)。
地組成のほかに、正規の糖貴の、α:0.5倍;6:1
.5倍二〇:2倍、およびd;4倍)。
これらの実験の各々は125m/(培養体257)の第
二段フラスコ中で実施した。偏置後36時間の時点にお
いて、基質((+/−)−トランス/工?−クリサンセ
モール混合物65:35)(50培養体アリコートを採
取した。各試料について抽出、誘導体合成およびGC分
析を上述のとおりに実施した。
二段フラスコ中で実施した。偏置後36時間の時点にお
いて、基質((+/−)−トランス/工?−クリサンセ
モール混合物65:35)(50培養体アリコートを採
取した。各試料について抽出、誘導体合成およびGC分
析を上述のとおりに実施した。
検討した変更の中で、微結晶性セルロースによる核形成
はすべての培養体に関してきわめて積極的な結果を示し
、例えば、沈戯物粒径の小さい均質で」厚な増殖を提供
し、そして、(恐らくは良好増殖と関連して)変換所要
時間が約3短縮した。
はすべての培養体に関してきわめて積極的な結果を示し
、例えば、沈戯物粒径の小さい均質で」厚な増殖を提供
し、そして、(恐らくは良好増殖と関連して)変換所要
時間が約3短縮した。
さらに、初期pH4への調節はA、フラビペスCATC
C1030)の変換速度を劇的に増し、合計の変換時間
を96)20時間から約50時間へ減らした。糖量の増
減は変換の遅れをおこさせ、我々の初期水準が最適であ
ることを示している。その他の変更は変換にほとんどま
たは全く影響をもたなかった。
C1030)の変換速度を劇的に増し、合計の変換時間
を96)20時間から約50時間へ減らした。糖量の増
減は変換の遅れをおこさせ、我々の初期水準が最適であ
ることを示している。その他の変更は変換にほとんどま
たは全く影響をもたなかった。
(7) クリサンセモールのその酸への立体選択的変
換。
換。
A、オクラセウス(ATCC18500)およびA、フ
ラビペス(ATCC1030)の8個の125ゴ第二段
階フラスコを上述のとおりにつくった。
ラビペス(ATCC1030)の8個の125ゴ第二段
階フラスコを上述のとおりにつくった。
基’jl (+/−) −y、</ トランスークリサ
ンセモールを24時間目において添加し、変換過程をG
Cによって追跡した(185℃等温カラム温度、N、(
CG)流速14ゴ/分;抽出試料はジアゾエタンで誘導
体化した)。基質だ5加後96時間で、各培養体を収穫
し、クラーク緩衝液の等容積で酸性化し、次いでエーテ
ルで抽出した。溶剤を減圧下低温で注意深く除き、残留
物をA・ムラノのAgr、 Btol 、 Cham、
36巻、2203頁(1972)に従って誘導体化し
た:残留物を1−の乾燥トルエン中に再溶解し、40I
I+!7+のピリジン、168〜の5oct、および4
60〜のR−(−)−2−オクタツール(各々、IWI
lの乾燥トルエン中)を添加した。この混合物を100
℃において20分間加熱し、反応物を次に水中に注入し
た。この混合物を分液漏斗中に入れ、有機層を水で洗い
、次[5%#aHCOs溶液で洗い、有機層を無水Mg
5o4上で乾燥した。溶剤を減圧下で低温において除い
た。残留物を上述のとおりGC分析にかけ(5惰X3鰭
。
ンセモールを24時間目において添加し、変換過程をG
Cによって追跡した(185℃等温カラム温度、N、(
CG)流速14ゴ/分;抽出試料はジアゾエタンで誘導
体化した)。基質だ5加後96時間で、各培養体を収穫
し、クラーク緩衝液の等容積で酸性化し、次いでエーテ
ルで抽出した。溶剤を減圧下低温で注意深く除き、残留
物をA・ムラノのAgr、 Btol 、 Cham、
36巻、2203頁(1972)に従って誘導体化し
た:残留物を1−の乾燥トルエン中に再溶解し、40I
I+!7+のピリジン、168〜の5oct、および4
60〜のR−(−)−2−オクタツール(各々、IWI
lの乾燥トルエン中)を添加した。この混合物を100
℃において20分間加熱し、反応物を次に水中に注入し
た。この混合物を分液漏斗中に入れ、有機層を水で洗い
、次[5%#aHCOs溶液で洗い、有機層を無水Mg
5o4上で乾燥した。溶剤を減圧下で低温において除い
た。残留物を上述のとおりGC分析にかけ(5惰X3鰭
。
クロモソーブGHP 60/80 メツシュ上の1゜
%QF))、その際、プログラム化温度は、Q)175
(初期)−210℃(1℃/分)、または6)170−
210℃(2℃/分)でめった。
%QF))、その際、プログラム化温度は、Q)175
(初期)−210℃(1℃/分)、または6)170−
210℃(2℃/分)でめった。
保持時間は次の通りであった(プログラム化温度条件は
括弧内に特定されている)。
括弧内に特定されている)。
(−)−R−オクタニル−(−)−シス−クリサンセメ
ート: 44.5(al 、 35−6(bl。
ート: 44.5(al 、 35−6(bl。
(−)−R−2−オクタニル−(+)−シスークリサ7
*) −) : 46.5tal 、 37.71b
1゜(−)−4−2−オクタニル−(−)−)ランス−
クリサンセメ−) : 47.9+jK1 、39.7
t61゜(−)−7?−2−オクタニル−(+)−トラ
ンス−クリサンセメート: 50.0(at 、 41
.7(61゜A、オクラセウス(ATCC18500)
による生物学的変換結果のGC分析は、この菌が(+)
−シス−お工び(+)−トランスークリサンセモールを
相当する(+)−シス−および(+)iランス−クリサ
ンセミツク酸へ高立体選択率で以て変換したことを明ら
かに示している(第1図)。痕跡蓋のみ、すなわち重量
で10%以下の(−)−シス−および(−)−)ランス
−クリサンセミツク酸が生成した。同様に、類似の立体
退択性がA、フラビ52(ATCC1030) により
(+)−7乙−クリサンセモールについて観察された(
第2図)。
*) −) : 46.5tal 、 37.71b
1゜(−)−4−2−オクタニル−(−)−)ランス−
クリサンセメ−) : 47.9+jK1 、39.7
t61゜(−)−7?−2−オクタニル−(+)−トラ
ンス−クリサンセメート: 50.0(at 、 41
.7(61゜A、オクラセウス(ATCC18500)
による生物学的変換結果のGC分析は、この菌が(+)
−シス−お工び(+)−トランスークリサンセモールを
相当する(+)−シス−および(+)iランス−クリサ
ンセミツク酸へ高立体選択率で以て変換したことを明ら
かに示している(第1図)。痕跡蓋のみ、すなわち重量
で10%以下の(−)−シス−および(−)−)ランス
−クリサンセミツク酸が生成した。同様に、類似の立体
退択性がA、フラビ52(ATCC1030) により
(+)−7乙−クリサンセモールについて観察された(
第2図)。
96時間目において、(+)−トランスおよび(−)−
トランス−アルコールは既に酸へ変換されていた。
トランス−アルコールは既に酸へ変換されていた。
(81アスペルギルス・オクラセウスによるクリサンセ
モールの調製規模のα化。
モールの調製規模のα化。
対掌性8専体化−GC手法以外の方法によりA。
オクラセウス(ATCC18500) の生物学的変
換立体選択性を示すために、変換生成物と残留囚双の各
々を単離し、それらの個々のスペクトル的性質によって
十分に特性つけた。
換立体選択性を示すために、変換生成物と残留囚双の各
々を単離し、それらの個々のスペクトル的性質によって
十分に特性つけた。
(+/−)−)5ンスークリサンセモールと(+/−)
−シス−クリサンセメートとの純粋なラセミ体混合物が
、K、ウェダらの手法、Tatrα−hadron、
27巻、2771頁、(1971)、を修正することに
よって得られた。152の(+/−)−シス/トランス
−クリサンセミツク酸が、商業的に入手できるエチルエ
ステル混合物のアルカリ加水分解によって得られた。こ
れを乾燥ベンゼン31oom)中に溶かし、1.5dの
BF、−エーテレート錯体を添加後、−晩窒素雰囲気下
で撹拌した。反応を氷水混合物の20mを添加すること
によって停止し、2時間撹拌を続けた。上/i9i<ベ
ンゼン)を分離し、無水MgSO4上で乾燥した。減圧
下で溶剤を蒸発後、(+/−)−−72−クリサンセミ
ツクトン(存在するz3異性体から)および(+/−)
−トランス−クリサンセミツク酸との13、El’の混
合物が生成した。この混合物をエーテル中のジアゾエタ
ンの過剰量と反応させて、遊離の(+/−) −)ラン
ス−クリサンセミツク酸をそのエチルエステルへ転化さ
せた。このエステル化に続いて、エーテルを減圧下で除
き、油状残留物をヘキサン中に再溶解し、5%NaOH
水溶液で抽出した。この分配中に、ラクトン環が開き、
次にそのナトリウム塩として水性層中に溶解した。
−シス−クリサンセメートとの純粋なラセミ体混合物が
、K、ウェダらの手法、Tatrα−hadron、
27巻、2771頁、(1971)、を修正することに
よって得られた。152の(+/−)−シス/トランス
−クリサンセミツク酸が、商業的に入手できるエチルエ
ステル混合物のアルカリ加水分解によって得られた。こ
れを乾燥ベンゼン31oom)中に溶かし、1.5dの
BF、−エーテレート錯体を添加後、−晩窒素雰囲気下
で撹拌した。反応を氷水混合物の20mを添加すること
によって停止し、2時間撹拌を続けた。上/i9i<ベ
ンゼン)を分離し、無水MgSO4上で乾燥した。減圧
下で溶剤を蒸発後、(+/−)−−72−クリサンセミ
ツクトン(存在するz3異性体から)および(+/−)
−トランス−クリサンセミツク酸との13、El’の混
合物が生成した。この混合物をエーテル中のジアゾエタ
ンの過剰量と反応させて、遊離の(+/−) −)ラン
ス−クリサンセミツク酸をそのエチルエステルへ転化さ
せた。このエステル化に続いて、エーテルを減圧下で除
き、油状残留物をヘキサン中に再溶解し、5%NaOH
水溶液で抽出した。この分配中に、ラクトン環が開き、
次にそのナトリウム塩として水性層中に溶解した。
ヘキサン層を分離し、無水MgSO4上で乾燥し、減圧
下で蒸発させて、純(+/−) −)ランス−エチルク
リサンセメート(10,59)(純度約99%)が得ら
れた。この化合物は上述のとおり乾燥エーテル中でLA
H還元により(+/−) −トランスークリサンセモー
ルヘ直接に転化された(収量8.6r)。
下で蒸発させて、純(+/−) −)ランス−エチルク
リサンセメート(10,59)(純度約99%)が得ら
れた。この化合物は上述のとおり乾燥エーテル中でLA
H還元により(+/−) −トランスークリサンセモー
ルヘ直接に転化された(収量8.6r)。
純(+/−)−/−’(−クリサンセミツク酸は95%
のシス富化クリサンセミツク酸混合物をBtOA。
のシス富化クリサンセミツク酸混合物をBtOA。
から分別結晶化することによって得られ、次に上述のと
おりLAH還元によって(+/−) −&ルークリサン
セモールへ転化された。
おりLAH還元によって(+/−) −&ルークリサン
セモールへ転化された。
通常の第一段階に続き、10tの第二段階フラスコ(2
00−培地)を各基質変換に使用した。
00−培地)を各基質変換に使用した。
第二段階フラスコ培賽後36時間の時点において、10
0In9の基質((+/−)−72−または(+/−)
−トランスークリサンセモールのいずれか。0.4d
D M F中)を各フラスコへ添加した。24時間毎に
、2−の培養体を無菌的に収穫して上述のとおりGCに
よって生物学的変換を追跡し、基質添加後72時間で変
換が完了したことを示した。各培養体についてのフラス
コ内容物を収穫し、一つに合せ、クラーク緩衝液の等容
積の添加によって酸性化し、エーテル(3X300m/
)で抽出した。
0In9の基質((+/−)−72−または(+/−)
−トランスークリサンセモールのいずれか。0.4d
D M F中)を各フラスコへ添加した。24時間毎に
、2−の培養体を無菌的に収穫して上述のとおりGCに
よって生物学的変換を追跡し、基質添加後72時間で変
換が完了したことを示した。各培養体についてのフラス
コ内容物を収穫し、一つに合せ、クラーク緩衝液の等容
積の添加によって酸性化し、エーテル(3X300m/
)で抽出した。
エーテル層を無水MgSO4上で乾燥し、減圧下低温で
注意深く蒸発させた。油状残留物をヘキサン(200m
/)中で再溶解し、分液漏斗中でNaOH5%水溶液で
抽出した。この抽出は変換されたクリサンセミツク酸か
らの未変換クリサンセメートの分離を可能にする(前者
がナトリウム塩として塩基性水性層中へ抽出される)。
注意深く蒸発させた。油状残留物をヘキサン(200m
/)中で再溶解し、分液漏斗中でNaOH5%水溶液で
抽出した。この抽出は変換されたクリサンセミツク酸か
らの未変換クリサンセメートの分離を可能にする(前者
がナトリウム塩として塩基性水性層中へ抽出される)。
ヘキサン層を分離し、無水MQSO,上で乾燥し、減圧
下低温で注意深く蒸発させて残留クリサンセメートを得
た。6NIIC1で水性層を酸性化したのち、抽出ラニ
ーチルで行ない、エーテル層を分離および乾燥し、溶剤
を減圧下低温で蒸発させてクリサンセミツク酸生成物が
得られた。抽出物はともに緑黄色油状混合物であった。
下低温で注意深く蒸発させて残留クリサンセメートを得
た。6NIIC1で水性層を酸性化したのち、抽出ラニ
ーチルで行ない、エーテル層を分離および乾燥し、溶剤
を減圧下低温で蒸発させてクリサンセミツク酸生成物が
得られた。抽出物はともに緑黄色油状混合物であった。
これらの混合物の各々を、可動相としてヘキサン中の1
0%EtOAaを使って、シリカゲルカラム(1,5x
15cfIL、100−200メツシユ)上で精製した
。クリサンセメート(6るいはクリサンセミツク酸)を
含む画分な組合せ、溶剤を減圧下低温で注意深く蒸発さ
せた。精製された化合物な旋光性、NMRおよびIR分
光測定、および質量分光測定により次のとおり特性つけ
た。
0%EtOAaを使って、シリカゲルカラム(1,5x
15cfIL、100−200メツシユ)上で精製した
。クリサンセメート(6るいはクリサンセミツク酸)を
含む画分な組合せ、溶剤を減圧下低温で注意深く蒸発さ
せた。精製された化合物な旋光性、NMRおよびIR分
光測定、および質量分光測定により次のとおり特性つけ
た。
生成物(+)−)ランス−クリサンセミツク酸:収i9
4!ng;旋光性+11.8 (cm6.1 xi’ノ
ール中);光学的純度83.4%(文献+14.16に
基づく:メルクインデックス、10版、p、2231)
;I R(NaC1: cm−’ ) 3000.29
50.2920.2895.2840.2640.25
30.1675.1425.1363.1335.13
10.1270.1228.1200.1170.11
35.1098.1070.1052.1002.94
0.840,810.690 ; 90 )、fHtN
ME (CDCl3 : ppm:多重度;帰属) 4
.89 (III 、 dq J =1および7,8、
オレフィン性−H)、2.18 (iH,dd、J=6
ま、・よび7.8、C3−Iり、1.69(6II、g
、ビニルCH,)、1.32(IH,d、J=6.C1
−II>、1,28および1.12(6H,2g 、双
頭CHs) : 70 mVにおけるE I−MS(m
/ t 、%rat、 abu%d、 )、M”=16
8(19,8)、153(22,5)、135 (6)
、123(98,9)、107(51,4)、95(2
5,2)、91(39,4)、81(100)。
4!ng;旋光性+11.8 (cm6.1 xi’ノ
ール中);光学的純度83.4%(文献+14.16に
基づく:メルクインデックス、10版、p、2231)
;I R(NaC1: cm−’ ) 3000.29
50.2920.2895.2840.2640.25
30.1675.1425.1363.1335.13
10.1270.1228.1200.1170.11
35.1098.1070.1052.1002.94
0.840,810.690 ; 90 )、fHtN
ME (CDCl3 : ppm:多重度;帰属) 4
.89 (III 、 dq J =1および7,8、
オレフィン性−H)、2.18 (iH,dd、J=6
ま、・よび7.8、C3−Iり、1.69(6II、g
、ビニルCH,)、1.32(IH,d、J=6.C1
−II>、1,28および1.12(6H,2g 、双
頭CHs) : 70 mVにおけるE I−MS(m
/ t 、%rat、 abu%d、 )、M”=16
8(19,8)、153(22,5)、135 (6)
、123(98,9)、107(51,4)、95(2
5,2)、91(39,4)、81(100)。
残留(−)−)ランスークリサンセモール:収量32m
9:旋光性−39,2(cm1.07、シクロヘキサン
中);光学的純度、78.9%((+)−異性体につい
て+49.7と報告されている文献値に基づく、ニアレ
キサンダーとエプスタイン、J、Org。
9:旋光性−39,2(cm1.07、シクロヘキサン
中);光学的純度、78.9%((+)−異性体につい
て+49.7と報告されている文献値に基づく、ニアレ
キサンダーとエプスタイン、J、Org。
CR−偽、、 40、2576(1976));7 R
(NaCL: an−’ ) 3330.2940.2
900.2830.2720.1440.1365.1
150.1112、1012.980,955.842
; 90M11g NMR(CDCL3 ; ppm
;多重度;帰属)4.86(111、dq、 、/=
11?よび7.8Hg、オレフィン性−If )、3.
65 (2H、ABX系のAB中心、J−6,8,4P
よび12 II g 、 −CH2−OR)、1.65
(6H。
(NaCL: an−’ ) 3330.2940.2
900.2830.2720.1440.1365.1
150.1112、1012.980,955.842
; 90M11g NMR(CDCL3 ; ppm
;多重度;帰属)4.86(111、dq、 、/=
11?よび7.8Hg、オレフィン性−If )、3.
65 (2H、ABX系のAB中心、J−6,8,4P
よび12 II g 、 −CH2−OR)、1.65
(6H。
8、ビニル性ci1s)、1.18および1.(16(
6H,2g。
6H,2g。
双頭CHs); 70 mVにおけるEl −MS (
M/ g 、%rg1. abxnd、 )、Ar+1
54 (9)、123(100)、111(1S,2)
、95(10)、3(12,1)、91(9,5)、8
1 (67,8>。
M/ g 、%rg1. abxnd、 )、Ar+1
54 (9)、123(100)、111(1S,2)
、95(10)、3(12,1)、91(9,5)、8
1 (67,8>。
生成物(+)−シス−クリサンセミツク酸:収量89I
n9;旋光性+31.2 (6=4.4 、 エタノー
ル中);文献+39.69(マツイおよびホリチ、に基
いて、光学的純度78.6%; IR(NaC1:cr
f’)3030.2940.2900.2840.26
50.2550.1685.1428.1370.13
28.1292.1229.1215.1148.11
12.1078.1055.995.927.840.
710;Nu R(CDC4; p p惜;多重度;帰
属)5.35(111、by d 、 J=7.5 、
オレフィン性−H)、1.92(IH,t 、J=7.
5.C3−II)、1.70および1.68(6H,2
g、ビニル性CB3)、1.20および1.17(6H
,2g、双頭CHs) : 70 mVにおけるEl−
MS(上記の(+)−トランス−クリサンセミツク酸と
同等)。
n9;旋光性+31.2 (6=4.4 、 エタノー
ル中);文献+39.69(マツイおよびホリチ、に基
いて、光学的純度78.6%; IR(NaC1:cr
f’)3030.2940.2900.2840.26
50.2550.1685.1428.1370.13
28.1292.1229.1215.1148.11
12.1078.1055.995.927.840.
710;Nu R(CDC4; p p惜;多重度;帰
属)5.35(111、by d 、 J=7.5 、
オレフィン性−H)、1.92(IH,t 、J=7.
5.C3−II)、1.70および1.68(6H,2
g、ビニル性CB3)、1.20および1.17(6H
,2g、双頭CHs) : 70 mVにおけるEl−
MS(上記の(+)−トランス−クリサンセミツク酸と
同等)。
残留(−)−22−クリサンセモール:収′1172■
;旋光性−33,4(e=4.8 、ジクロロメタン中
) : IR(NaC1:CR−’ ) 3325.2
960.2895.2855.2835.2720.1
442.1420.1368.1250,1130.1
(160.1010.838 ; NMR(CDCL、
; ppt1&;多重度;帰属) 4.93 (IH
,by d 、 J=7.8 、オレフィン性−H)、
3.6 (2H、d 、 J=6.9 、−CM、−0
H)、1.65(6H,s、オレフィン性CH8)、1
.32(IH。
;旋光性−33,4(e=4.8 、ジクロロメタン中
) : IR(NaC1:CR−’ ) 3325.2
960.2895.2855.2835.2720.1
442.1420.1368.1250,1130.1
(160.1010.838 ; NMR(CDCL、
; ppt1&;多重度;帰属) 4.93 (IH
,by d 、 J=7.8 、オレフィン性−H)、
3.6 (2H、d 、 J=6.9 、−CM、−0
H)、1.65(6H,s、オレフィン性CH8)、1
.32(IH。
t、J=7.6.C3−H)、1.08および0.98
(6H。
(6H。
2g、双頭CI!、) ; 70 eVにおけるEX−
MS(上記の(−)−トランスークリサンセモールト同
等)。
MS(上記の(−)−トランスークリサンセモールト同
等)。
1030によるクリサンセモールの相当クリサンセミツ
ク酸への微生物的酸化の時間的過程の研究。
ク酸への微生物的酸化の時間的過程の研究。
研究1
クリサンセモール基質の時間依存性のジアステレオ選択
的酸化(すなわち、p−立体異性体の前のトランス−立
体異性体の酸化、あるいはその逆)が存在するかどうか
を決定するために時間的過程研究を実施した。
的酸化(すなわち、p−立体異性体の前のトランス−立
体異性体の酸化、あるいはその逆)が存在するかどうか
を決定するために時間的過程研究を実施した。
アスペルギルス・オクラセウス ATCC18500お
よびA、フラビペスATCC1030を、寒天斜面上の
異面増殖体また胞子を、次の醗酵培地の25mの中で無
葭的に懸l蜀させることによって開始させた125一第
一段階フラスコ中で培養した: 酵母抽出物(ディフコ) 5t;NaC1−5
? : に、HPo、 5 t :デ
キストロース 20?;蒸溜水
1,0OOd;6、ON HCl テ以
テロ−0ヘA節した73H072時間培養後、各々の第
一段階フラスコの内容物全体を使って、同組成の1を第
二段階フラスコに接種した。第二段階フラスコを48時
間培養した。上記セクション3に従ってつくられた0、
4 mlのDMF中のクリサンセモール混合物の10
09を各フラスコへ添加した。両方の菌培養体の第一の
全フラスコ試料を、基質添加1時間後に収穫し、クリサ
ンセモールの初期変換を次に、クリサンセミンク酸形成
をはじめに検出した後6時間毎に各フラスコから2dの
培養体アリコートを収獲することによって追跡し、全フ
ラスコは、アスペルギルス・オクラセウス ATCC1
8500については10時間間隔で終υ、A、フラビペ
スATCC1030については16時間間隔で終った。
よびA、フラビペスATCC1030を、寒天斜面上の
異面増殖体また胞子を、次の醗酵培地の25mの中で無
葭的に懸l蜀させることによって開始させた125一第
一段階フラスコ中で培養した: 酵母抽出物(ディフコ) 5t;NaC1−5
? : に、HPo、 5 t :デ
キストロース 20?;蒸溜水
1,0OOd;6、ON HCl テ以
テロ−0ヘA節した73H072時間培養後、各々の第
一段階フラスコの内容物全体を使って、同組成の1を第
二段階フラスコに接種した。第二段階フラスコを48時
間培養した。上記セクション3に従ってつくられた0、
4 mlのDMF中のクリサンセモール混合物の10
09を各フラスコへ添加した。両方の菌培養体の第一の
全フラスコ試料を、基質添加1時間後に収穫し、クリサ
ンセモールの初期変換を次に、クリサンセミンク酸形成
をはじめに検出した後6時間毎に各フラスコから2dの
培養体アリコートを収獲することによって追跡し、全フ
ラスコは、アスペルギルス・オクラセウス ATCC1
8500については10時間間隔で終υ、A、フラビペ
スATCC1030については16時間間隔で終った。
各培養体の20mを125mのエルレンマイヤー・フラ
スコへ移し、それを次に10−のクラーク緩衝液で酸性
化し、ボルネオール(bar%aol )のDMF溶液
を添加した(50μを中で10〜;すなわち、2〇−試
料中のクリサンセモールークリサンセミツク酸の合計混
合物の理論量)。試料をホモゲナイザーにかけ、エーテ
ルで抽出した。
スコへ移し、それを次に10−のクラーク緩衝液で酸性
化し、ボルネオール(bar%aol )のDMF溶液
を添加した(50μを中で10〜;すなわち、2〇−試
料中のクリサンセモールークリサンセミツク酸の合計混
合物の理論量)。試料をホモゲナイザーにかけ、エーテ
ルで抽出した。
各エーテル抽出物を無水MgSO3上で乾燥し、濾過し
、溶剤を水アスピレータ−によってつくられる減圧下で
低温で注意深く蒸発乾個した。上記のセクション4に記
載のとおり、ジアゾエタンで各試料の誘導体合成ヲ行な
ったのち、試料を上記セクション5に記載のとおりにG
Cによって分析した。
、溶剤を水アスピレータ−によってつくられる減圧下で
低温で注意深く蒸発乾個した。上記のセクション4に記
載のとおり、ジアゾエタンで各試料の誘導体合成ヲ行な
ったのち、試料を上記セクション5に記載のとおりにG
Cによって分析した。
アスペルギルス・オクラセウスATCC1ssooによ
るクリサンセモールの個々のジアステレオマーの微生物
的変換は第3図に示され、セしてA、フラビペスATC
C1030によるものは第4図に示される。
るクリサンセモールの個々のジアステレオマーの微生物
的変換は第3図に示され、セしてA、フラビペスATC
C1030によるものは第4図に示される。
この研究によると、トランス−アルコールの酸化がまず
はじまシ、シス−アルコールの著しい酸化がはじまる前
に事実上完了することが示された。
はじまシ、シス−アルコールの著しい酸化がはじまる前
に事実上完了することが示された。
トランス−アルコールの酸化はA、オクラセウスおよび
A、フラビペスについて、それぞれ約35時間および5
0時間で完了する。シス−アルコールの酸化はA、オク
ラセウスおよびA、フラビペスについてそれぞれ約30
時間および50時間まではじまらない。トランス−アル
コールはシス−アルコールの前に酸化されるので、培養
を中断して、トランス−酸を上記セクション1に記載の
とおシ培養混合物から抽出することができろ。培養を次
に継続してシス−酸を生成させることができる。
A、フラビペスについて、それぞれ約35時間および5
0時間で完了する。シス−アルコールの酸化はA、オク
ラセウスおよびA、フラビペスについてそれぞれ約30
時間および50時間まではじまらない。トランス−アル
コールはシス−アルコールの前に酸化されるので、培養
を中断して、トランス−酸を上記セクション1に記載の
とおシ培養混合物から抽出することができろ。培養を次
に継続してシス−酸を生成させることができる。
結果として、本発明の方法は事実上立体化学的に均質な
Z?−酸またはトランス−酸をアルコール基質のラセミ
体混合物から生成させるために使用できる。
Z?−酸またはトランス−酸をアルコール基質のラセミ
体混合物から生成させるために使用できる。
研究2
(+/−)−と2.hランスークリサンセモールを上記
セクション1に記載のとおり基質として用い、試料を1
20時間にわたって24時間間隔で収獲した。試料は上
記セクション4に従って誘導体合成を行ない、上記セク
ション5に記載のとおりGCによって分析した。残留ク
リサンセモールと生成物(エチルエステルとしてのクリ
サンセミツク酸)の分析は、トランス−立体異性体がヱ
?−立体異性体忙先立って代謝されることを明らかに示
している。特に、24時間および48時間におけるA、
フラビペスATCC1030の検討は、トランスークリ
サンセモール酸化のみがおこり、それは72時間で完了
した(すなわち、この培養体は両方のトランスークリサ
ンセモール立体異性体を代謝するので、残留するトラン
ス−アルコールが残留しない)。Zヱークリサンセモー
ル酸化は72時間においてはじめて明らかであり、96
時間で事実上完了した(この微生物は(+)−7,(−
クリサンセモールのみを酸化するので期待される50%
まで反応した)。
セクション1に記載のとおり基質として用い、試料を1
20時間にわたって24時間間隔で収獲した。試料は上
記セクション4に従って誘導体合成を行ない、上記セク
ション5に記載のとおりGCによって分析した。残留ク
リサンセモールと生成物(エチルエステルとしてのクリ
サンセミツク酸)の分析は、トランス−立体異性体がヱ
?−立体異性体忙先立って代謝されることを明らかに示
している。特に、24時間および48時間におけるA、
フラビペスATCC1030の検討は、トランスークリ
サンセモール酸化のみがおこり、それは72時間で完了
した(すなわち、この培養体は両方のトランスークリサ
ンセモール立体異性体を代謝するので、残留するトラン
ス−アルコールが残留しない)。Zヱークリサンセモー
ル酸化は72時間においてはじめて明らかであり、96
時間で事実上完了した(この微生物は(+)−7,(−
クリサンセモールのみを酸化するので期待される50%
まで反応した)。
A、オクラセウスATCC18500に関しては、24
時間分析はトランスークリサンセモールの酸化が完了し
くすなわち、(+)−)ランスークリサンセモールのみ
が酸化されるので50%の程度まで)、名♂−立体異性
体の酸化がないことを示した。48時間においては、シ
スークリサンセモールの酸化が完了する(すなわち、(
+)−シスークリサンセモールのみが酸化されるので、
50%の程度まで)。
時間分析はトランスークリサンセモールの酸化が完了し
くすなわち、(+)−)ランスークリサンセモールのみ
が酸化されるので50%の程度まで)、名♂−立体異性
体の酸化がないことを示した。48時間においては、シ
スークリサンセモールの酸化が完了する(すなわち、(
+)−シスークリサンセモールのみが酸化されるので、
50%の程度まで)。
これらのデーターは上記の研究1におしする発児を確証
するものであり、アルコール基質のラセミ体混合物が本
発明の方法によって立体化学的に純粋tg y x−ま
たはトランス−酸に分割され得ることを示している。
するものであり、アルコール基質のラセミ体混合物が本
発明の方法によって立体化学的に純粋tg y x−ま
たはトランス−酸に分割され得ることを示している。
別の具体化
アルコール基質(ジプロモクリサンセモールとジクロロ
クリサンセモール)がデカメトリンおよびパーメ) I
Jンから次の手続によって得られた。
クリサンセモール)がデカメトリンおよびパーメ) I
Jンから次の手続によって得られた。
5?のデカメトリン(またはパーメトリン)を5%エタ
ノール性NaOH(100d )中で溶かし、室温で一
晩窒素雰囲気下で撹拌した。この溶液を500艷の氷水
混合物中へ注入し、200−のヘキサン(×3)で分液
漏斗中で抽出した(この溶剤は加水分解物の非酸性部分
を抽出する)。この水性層を6NHC1で注意深く酸性
化し、エーテル(3x200m)で抽出し、エーテル相
を次に無水MgSO4上で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸
発乾個した。収率は次のとおりであった二デカメトリッ
ク酸(2,4F)、およびパーメトリック酸(2,3r
)。これらの酸を上述のとおり乾燥エーテル中のLAH
で還元して、ジブロモクリサンセモール(2)?)およ
びパーメトロール(ジクロロクリサンセモール)(2−
IP)が得られた。
ノール性NaOH(100d )中で溶かし、室温で一
晩窒素雰囲気下で撹拌した。この溶液を500艷の氷水
混合物中へ注入し、200−のヘキサン(×3)で分液
漏斗中で抽出した(この溶剤は加水分解物の非酸性部分
を抽出する)。この水性層を6NHC1で注意深く酸性
化し、エーテル(3x200m)で抽出し、エーテル相
を次に無水MgSO4上で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸
発乾個した。収率は次のとおりであった二デカメトリッ
ク酸(2,4F)、およびパーメトリック酸(2,3r
)。これらの酸を上述のとおり乾燥エーテル中のLAH
で還元して、ジブロモクリサンセモール(2)?)およ
びパーメトロール(ジクロロクリサンセモール)(2−
IP)が得られた。
シフロモーアルコールおよびジクロロ−アルコールの微
生物的変換をA、オクラセウス(ATCC18500)
およびA、フラビペス(ATCC1030)を用い、各
培養体についての2個の125ゴ第二段階フラスコを使
用する培養体スクリーニングによって、上述のとおり実
施した。試料は上述のそれらのエチルエステルとしてガ
スクロマトグラフィによって分析した。ジブロモ−およ
びジクロロアルコールは第5図〜第8図において示され
るとおり、それらの相当する酸へ変換された。
生物的変換をA、オクラセウス(ATCC18500)
およびA、フラビペス(ATCC1030)を用い、各
培養体についての2個の125ゴ第二段階フラスコを使
用する培養体スクリーニングによって、上述のとおり実
施した。試料は上述のそれらのエチルエステルとしてガ
スクロマトグラフィによって分析した。ジブロモ−およ
びジクロロアルコールは第5図〜第8図において示され
るとおり、それらの相当する酸へ変換された。
ラバンデュロールのラセミ体混合物の微生物的変換を次
のとおシ実施した。アスペルギルス・オクラセウス(A
TCC18500)6個の1を第二段階増殖培養体が上
記セクション9の研究1に記載のとおり生成された。3
6時間培養後、基質、RE−ラバンデュロールをフラス
コ6た。b80!vの水準へ添加した(40μtDMF
中で)。クロマトグラフ分析が約50%の転化を示すと
きに培養を止めた。培養体を酸性化し、エーテルで徹底
的に抽出し、粗精製抽出物を、シクロヘキサン:ジクロ
ロメタン:エタノール(7:4:1)で溶離するセファ
デックスLH−20の上でカラムクロマトグラフィにか
けた。はとんど純粋な生成物、ラバンデュリツク酸、を
表わす画分な合わせ、重炭酸ナトリウム5%水溶液とペ
ンタンとの間に分配させて未変形基質、ラバンデュロー
ル、の痕跡を除いた。単離された酸(37INi)は薄
層クロマトグラフィーによシ均質であシ、ラバンデュリ
ック酸の(−)−光学対掌体、〔α) 22D=−22
,8(c=3.7.クロロホルム)の実質的富化を示す
旋光性が生じた。
のとおシ実施した。アスペルギルス・オクラセウス(A
TCC18500)6個の1を第二段階増殖培養体が上
記セクション9の研究1に記載のとおり生成された。3
6時間培養後、基質、RE−ラバンデュロールをフラス
コ6た。b80!vの水準へ添加した(40μtDMF
中で)。クロマトグラフ分析が約50%の転化を示すと
きに培養を止めた。培養体を酸性化し、エーテルで徹底
的に抽出し、粗精製抽出物を、シクロヘキサン:ジクロ
ロメタン:エタノール(7:4:1)で溶離するセファ
デックスLH−20の上でカラムクロマトグラフィにか
けた。はとんど純粋な生成物、ラバンデュリツク酸、を
表わす画分な合わせ、重炭酸ナトリウム5%水溶液とペ
ンタンとの間に分配させて未変形基質、ラバンデュロー
ル、の痕跡を除いた。単離された酸(37INi)は薄
層クロマトグラフィーによシ均質であシ、ラバンデュリ
ック酸の(−)−光学対掌体、〔α) 22D=−22
,8(c=3.7.クロロホルム)の実質的富化を示す
旋光性が生じた。
第1図はAl−り)yセウ、< (ATCC18500
)によるクリサンセモールの立体異性体の生物学的変換
のガスクロマトグラム図を示している。 第2図は1.7ラビペス(ATCC103o)によるク
リサンセモールの立体異性体の生物学的変換のガスクロ
マトグラム図を示している。 第3図はA、オクラセウ7.(ATCC18500)に
よるクリサンセモールの立体異性体の時間依存的な生物
学的変換を説明するグラフである。 第4図はA、7;7ビペス(ATCC1030)による
クリサンセモールの立体異性体の時間依存的な生物学的
変換を説明するグラフである。 第5図はA、オクラセウス(ATCC18500)によ
るジブロモクリサンセモールの立体異性体の生物学的変
換のガスクロマトグラム図を示す。 第6図はA、フラビペス(ATCC1030)によるジ
ブ、ロモクリサンセモールの立体異性体の生物学的変換
のガスクロマトグラム図を示す。 第7図はA、オクラセウス(ATCC18500)によ
るジクロロクリサンセモールの立体異性体の生物学的変
換のガスクロマトグラム図を示す。 第8図はA、フラビペス(ATCC1030)によるジ
クロロクリサンセモールの立体異性体の生物学的変換の
ガスクロマトグラム図を示している。 (外4名) 図面の;簑書(内容に変更なし) 葬4図 12図 時 藺 (時) 時FJ I時) 集う凹 爲ろ凹 氷7盟 Aλクラπつ7!、 /13500ぺ!リノぐ一ノ■ロ
ールC卦り彎的者1空生氏%recクロマ1ゲウムネ8
7 千 ユ
)によるクリサンセモールの立体異性体の生物学的変換
のガスクロマトグラム図を示している。 第2図は1.7ラビペス(ATCC103o)によるク
リサンセモールの立体異性体の生物学的変換のガスクロ
マトグラム図を示している。 第3図はA、オクラセウ7.(ATCC18500)に
よるクリサンセモールの立体異性体の時間依存的な生物
学的変換を説明するグラフである。 第4図はA、7;7ビペス(ATCC1030)による
クリサンセモールの立体異性体の時間依存的な生物学的
変換を説明するグラフである。 第5図はA、オクラセウス(ATCC18500)によ
るジブロモクリサンセモールの立体異性体の生物学的変
換のガスクロマトグラム図を示す。 第6図はA、フラビペス(ATCC1030)によるジ
ブ、ロモクリサンセモールの立体異性体の生物学的変換
のガスクロマトグラム図を示す。 第7図はA、オクラセウス(ATCC18500)によ
るジクロロクリサンセモールの立体異性体の生物学的変
換のガスクロマトグラム図を示す。 第8図はA、フラビペス(ATCC1030)によるジ
クロロクリサンセモールの立体異性体の生物学的変換の
ガスクロマトグラム図を示している。 (外4名) 図面の;簑書(内容に変更なし) 葬4図 12図 時 藺 (時) 時FJ I時) 集う凹 爲ろ凹 氷7盟 Aλクラπつ7!、 /13500ぺ!リノぐ一ノ■ロ
ールC卦り彎的者1空生氏%recクロマ1ゲウムネ8
7 千 ユ
Claims (31)
- (1)式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の酸の製造方法であって、 1)式 ▲数式、化学式、表等があります▼ のアルコール基質と、 2)微生物起源の一つまたは一つより多くの酸化性酵素
と を一緒に添加し、かつ酸化条件下で温置(インキュベー
ト)することから成り、 R_1が水素原子、−CH_3、−CH_2CH_3、
−CH_2CH_2CH_3、およびハロゲン原子から
成る群から選ばれ; R_2が水素原子、−CH_3、−CH_2CH_3、
−CH_2CH_2CH_3およびハロゲン原子から成
る群から選ばれ; R_3が−CH_3、−CH_2CH_3、−CH_2
CH_2CH_3、−CH_2CH_2CH_2CH_
3、−CH_2CH_2CH_2CH_2CH_3、お
よびハロゲン原子から成る群から選ばれ;そして R_4が−CH_3、−CH_2CH_3、−CH_2
CH_2CH_3、−CH_2CH_2CH_2CH_
3、−CH_2CH_2CH_2CH_2CH_3およ
びハロゲン原子、およびCOOCH_3から成る群から
選ばれる; 製造方法。 - (2)アルコール基質が(1R,3R)(+)−¥トラ
ンス¥立体異性体、(1S,3S)(−)−¥トランス
¥立体異性体、(1S,3R)(+)−¥シス¥立体異
性体、および(1R,3S)(−)−¥シス¥立体異性
体から選ばれる一つまたは一つより多くの立体異性体か
ら成り; 酸が、一つまたは一つより多くのアルコール基質立体異
性体の少くとも一つがその酸の立体化学的類似の立体異
性体へ変換されるよう、一つまたは一つより多くのアル
コール基質立体異性体の一つと立体化学的に類似である
立体異性体から成る、特許請求の範囲第1項に記載の方
法。 - (3)R_1とR_2が−CH_3であり; R_3が−CH_3、塩素原子および臭素原子から成る
群から選ばれ; R_4がR_3と同一である; 特許請求の範囲第2項に記載の方法。 - (4)アルコール基質が上記アルコール基質立体異性体
の少くとも二つから成り;そして酸がアルコール立体異
性体の少くとも二つの一つまたは一つより多くとそれぞ
れ立体化学的に類似である一つまたは一つより多くの立
体異性体から成ることにより、そのアルコール基質立体
異性体の少くとも二つの一つまたは一つより多くがその
酸の立体化学的類似の立体異性体へ変換される特許請求
の範囲第2項に記載の方法。 - (5)酸が、アルコール基質の立体異性体のいくらかだ
けがその酸の立体化学的類似の立体異性体へ痕跡量を超
える量で変換されるよう、アルコール基質のすべてでは
ないがいくらかと立体化学的に類似である立体異性体か
ら成る、特許請求の範囲第4項に記載の方法。 - (6)R_1、R_2、R_3およびR_4が−CH_
3であり、 アルコール基質が(1R,3R)(+)−¥トランス¥
立体異性体、(1S,3S)(−)−¥トランス¥立体
異性体、(1S,3R)(−)−¥シス¥立体異性体お
よび(1R,3S)(+)−¥シス¥立体異性体から成
り、 酸が(1R,3R)(+)−¥トランス¥立体異性体お
よび(1R,3S)(+)−¥シス¥立体異性体と、多
くて痕跡量の(1S,3S)(−)−¥トランス¥立体
異性体および(1S,3R)(−)−¥シス¥立体異性
体とから成る、 特許請求の範囲第5項に記載の方法。 - (7)一つまたは一つより多くの酵素が、アルコール基
質中に含まれる(1R,3R)(+)−¥トランス¥立
体異性体(もし存在するならば)および(1R,3S)
(+)−¥シス¥立体異性体(もし存在するならば)の
実質的部分を相当する酸へ変換するが、しかし、アルコ
ール基質中に含まれる(1S,3S)(−)−¥トラン
ス¥立体異性体(もし存在するならば)あるいは(1S
,3R)(−)−¥シス¥立体異性体(もし存在するな
らば)を多くても痕跡量をこえては相当する酸へ変換す
ることがない、特許請求の範囲第5項に記載の方法。 - (8)R_1、R_2、R_3、およびR_4が−CH
_3であり、 アルコール基質が(1R,3R)(+)−¥トランス¥
立体異性体、(1S,3S)(−)−¥トランス¥立体
異性体、(1S,3R)(−)−¥シス¥立体異性体、
および(1R,3S)(+)−¥シス¥立体異性体から
成り、 酸が(1R,3R)(+)−¥トランス¥立体異性体お
よび(1S,3S)(−)−¥トランス¥立体異性体と
、多くて痕跡量の(1S,3R)(−)−¥シス¥立体
異性体および(1R,3S)(+)−¥シス¥立体異性
体とから成る、特許請求の範囲第5項に記載の方法。 - (9)一つまたは一つより多くの酵素が、アルコール基
質中に含まれる(1R,3R)(+)−¥トランス¥立
体異性体(もし存在するならば)および(1S,3S)
(−)−¥トランス¥立体異性体(もし存在するならば
)の実質的部分を相当する酸へ変換するが、しかし、ア
ルコール基質中に含まれる(1S,3S)(−)−¥シ
ス¥立体異性体(もし存在するならば)または(1R,
3S)(+)−¥シス¥立体異性体(もし存在するなら
ば)を多くても痕跡量をこえては相当する酸へ変換する
ことがない、特許請求の範囲第5項に記載の方法。 - (10)R_1、R_2、R_3、およびR_4が−C
H_3であり、微生物が¥アスペルギルス・フラビペス
¥(¥Aspergillusflavipes¥)(
ATCC1030)である、特許請求の範囲第9項に記
載の方法。 - (11)上記の温置を約45時間から約55時間後に中
断する、特許請求の範囲第10項に記載の方法。 - (12)上記の温置を約65時間から約75時間後に中
断する、特許請求の範囲第11項に記載の方法。 - (13)上記酸の上記(1R,3R)(+)−¥トラン
ス¥立体異性体(もし存在するならば)および上記(1
S,3S)(−)−¥トランス¥立体異性体(もし存在
するならば)を抽出し; その抽出後において上記(1S,3R)(−)−¥シス
¥立体異性体(もし存在するならば)および上記(1R
,3S)(+)−¥シス¥立体異性体(もし存在するな
らば)から成る酸を生成するよう、上記温置を継続する
; ことからさらに成る、特許請求の範囲第10項または第
11項に記載の方法。 - (14)R_1、R_2、R_3、およびR_4が−C
H_3であり、 アルコール基質が(1R,3R)(+)−¥トランス¥
立体異性体であり、 酸が(1R,3R)(+)−¥トランス¥立体異性体と
、多くて痕跡量の(1R,3S)(+)−¥シス¥立体
異性体とから成る、 特許請求の範囲第9項に記載の方法。 - (15)微生物が¥アスペルギルス・オクラセウス¥(
¥Aspergillus ochraceus¥)(
ATCC18500)である、特許請求の範囲第14項
に記載の方法。 - (16)上記温置を約20時間から約30時間後に中断
する、特許請求の範囲第15項に記載の方法。 - (17)上記温置を約30時間から約40時間後に中断
する、特許請求の範囲第16項に記載の方法。 - (18)上記酸の上記(1R,3R)(+)−¥トラン
ス¥立体異性体を抽出し、そして、その抽出後において
、上記(1R,3S)(+)−¥シス¥立体異性体の実
質的部分から成る酸を生成させるよう、上記温置を継続
することからさらに成る、特許請求の範囲第16項また
は第17項に記載の方法。 - (19)R_1、R_2、R_3、およびR_4が−C
H_3であり、 アルコール基質が(1S,3R)(−)−¥シス¥立体
異性体と(1R,3S)(+)−¥シス¥立体異性体と
から成り、 酸が(1R,3S)(+)−¥シス¥立体異性体と、多
くて痕跡量の(1S,3R)(−)−¥シス¥立体異性
体とから成る、 特許請求の範囲第5項に記載の方法。 - (20)アルコール基質中に含まれる(1R,3R)(
+)−¥トランス¥立体異性体(もし存在するならば)
と(1S,3S)(−)−¥トランス¥立体異性体(も
し存在するならば)との実質上すべてが一つまたは一つ
より多くの酵素によって変換されてしまうまで、酸の(
1R,3S)(+)−¥シス¥立体異性体が痕跡量より
大きい量では生成されない、特許請求の範囲第19項に
記載の方法。 - (21)微生物が¥アスペルギルス・オクラセウス¥(
ATCC18500)である、特許請求の範囲第2項に
記載の方法。 - (22)微生物が¥アスペルギルス・フラビペス¥(A
TCC1030)である、特許請求の範囲第2項に記載
の方法。 - (23)微生物が¥アスペルギルス・フラビペス¥(A
TCC11013)である、特許請求の範囲第2項に記
載の方法。 - (24)微生物が上記の一つまたは一つより多くの酵素
を含むように形質転換される、特許請求の範囲第2項に
記載の方法。 - (25)一つまたは一つより多くの酵素が上記温置中に
固定化されている、特許請求の範囲第2項に記載の方法
。 - (26)1)式 ▲数式、化学式、表等があります▼ のアルコール基質と、2)微生物起源の一つまたは一つ
より多くの酸化性酵素とを一緒に添加し、かつ酸化性条
件下で温置することから成る、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の酸の製造方法であって、 ここに、R_1が水素原子、−CH_3、−CH_2C
H_3、−CH_2CH_2CH_3、およびハロゲン
原子から成る群から選ばれ、 R_2が水素原子、−CH_3、−CH_2CH_3、
−CH_2CH_2CH_3およびハロゲン原子から成
る群から選ばれる、 製造方法。 - (27)アルコール基質が(1R,3R)(+)−¥ト
ランス¥立体異性体、(1S,3S)(−)−¥トラン
ス¥立体異性体、(1R,3S)(+)−¥シス¥立体
異性体、および、(1S,3R)(−)−¥シス¥立体
異性体から成る群から選ばれる一つまたは一つより多く
の立体異性体から成り、 酸が、一つまたは一つより多くのアルコール基質立体異
性体の少くとも一つが酸と立体化学的に類似の立体異性
体へ変換されるよう、一つまたは一つより多くのアルコ
ール基質立体異性体の一つと立体化学的に類似である立
体異性体から成る、特許請求の範囲第26項に記載の方
法。 - (28)R_1とR_2が−CH_3である、特許請求
の範囲第27項に記載の方法。 - (29)1)式 ▲数式、化学式、表等があります▼ のアルコール基質と、2)微生物起源の一つまたは一つ
より多くの酸化性酵素とを一緒に添加し、かつ酸化性条
件下で温置することから成る、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の酸の製造方法であって、 ここに、R_5が−CH_3、水素原子およびハロゲン
原子から成る群から選ばれ、 R_6が−CH_3、水素原子およびハロゲン原子から
成る群から選ばれ、 R_7が水素原子、ハロゲン原子および−CH_3から
成る群から選ばれ、 R_8が水素原子、−CH_3および−CH_2CH_
3から成る群から選ばれ、 R_9が水素原子および−CH_3から成る群から選ば
れ、 R_1_0が−CH_3、−CH_2CH_3、イソプ
ロピレン基、イソプロピル基、二級ブチル基、イソブチ
ル基、三級ブチル基、シクロペンチル基、シクロプロピ
ル基から成る群から選ばれる、 製造方法。 - (30)アルコール基質がR−(−)立体異性体とS−
(+)立体異性体とから成る群から選ばれる一つまたは
一つより多くの立体異性体から成り、 酸が、一つまたは一つより多くのアルコール基質立体異
性体の少くとも一つが酸の立体化学的類似の立体異性体
へ変換されるよう、一つまたは一つより多くのアルコー
ル基質立体異性体の一つと立体化学的に類似である立体
異性体から成る、 特許請求の範囲第29項に記載の方法。 - (31)R_5とR_6が−CH_3であり、 R_7、R_8およびR_9が水素原子であり、 R_1_0がイソプロピレン基である、 特許請求の範囲第30項に記載の方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2015110554A (ja) * | 2013-10-30 | 2015-06-18 | 信越化学工業株式会社 | 酢酸(e)−2−イソプロピル−5−メチル−2,4−ヘキサジエニルの製造方法 |
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US5972691A (en) * | 1995-06-07 | 1999-10-26 | Hercules Incorporated | Dehalogenation of polyamine, neutral curing wet strength resins |
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1987
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- 1987-08-11 AU AU76767/87A patent/AU7676787A/en not_active Abandoned
- 1987-08-11 JP JP62200739A patent/JPS63119686A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2015110554A (ja) * | 2013-10-30 | 2015-06-18 | 信越化学工業株式会社 | 酢酸(e)−2−イソプロピル−5−メチル−2,4−ヘキサジエニルの製造方法 |
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NZ221213A (en) | 1990-10-26 |
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AU7676787A (en) | 1988-02-18 |
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