JPS6281565A - 核酸を変性ナイロン支持体に固定化する方法、これにより固定化された核酸及び試料中のポリヌクレオチド配列を測定する方法 - Google Patents

核酸を変性ナイロン支持体に固定化する方法、これにより固定化された核酸及び試料中のポリヌクレオチド配列を測定する方法

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JPS6281565A
JPS6281565A JP61225059A JP22505986A JPS6281565A JP S6281565 A JPS6281565 A JP S6281565A JP 61225059 A JP61225059 A JP 61225059A JP 22505986 A JP22505986 A JP 22505986A JP S6281565 A JPS6281565 A JP S6281565A
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    • Y10S435/803—Physical recovery methods, e.g. chromatography, grinding

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ 本発明はＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸を固体支持体上
に固定化する方法に関する。固定化された核酸は相補性
の一重鎖ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成により
、特定のポリヌクレオチド配列の存在を測定するための
プローブ（ｐｒｏｂｅ）として特に使用される。核酸の
ハイブリッド形成は、中でも人間及び動物薬、１業及び
食品科学の分野における分析方法として有用である。特
に、該方法はバクテリア及びビールスのような病原因子
の検知及び同定を行い、抗生物質耐性について微生物を
選別（スクリーニング）し、また悪性細胞を検出するの
に用いられる。
ハイブリッド形成試験では、通常、試料中に存在する核
酸又はプローブ核酸のどちらか一方を固定化する。かか
る固相技術においては、最終的には、固定相上に形成さ
れた、プローブと相補性の試料ポリヌクレオチド間のハ
イブリッドの検出が行なわれる。これらの方法において
、核酸の固定化のために従来最も一般的に用いられてき
たマトリックスは微細孔性のニトロセルロース膜である
。より近年になって、微細孔性、ナイロン膜は、ニトロ
セルロースよりも良好な機械的強度を有するため、普及
するようになった。第４級アンモニウムイオンのような
陽イオン性基をナイロン膜に導入してその湿潤性の改良
を行った製造業者もいる。核酸の固定化に用いられる全
ての公知のニトロセルロース膜及びナイロン膜は、それ
らの表面上にポリヌクレオチドを吸着せしめるために高
濃度の塩（ｈｉｇｈ　５ａｌｔ）を必要とし、また吸着
したＤＮＡ又はＲＮＡを永久的に固定するために約８０
°Ｃのベーキングを必要とする。
固体マトリックス上に形成された固定化ハリブリッドの
検出は、通常、該ハイブリッドと特異的に結合する検知
可能な蛋白質試薬を加えることにより行われる０通常、
かかる蛋白質試薬は、プローブ核酸上のりガント部分又
はハイブリッド自体の独特な構造と結合するという点で
特異的な抗体又は他の結合性蛋白質から成る。前者の例
としては、ビオチン基又はハプテン基を有するプローブ
核酸のアビジン又は抗ハプテン抗体との結合による検出
がある。後者の例としてはＤＮＡ・ＲＮＡ若しくはＲＮ
Ａ　−ＲＮＡ二重鎖体（ｄｕｐｌｅｘｅｓ）又は挿入若
しくは抗原的に変性された二重鎖体に対して選択性を有
する抗体の使用がある。特異的結合性蛋白質試薬は検知
可能な成分、通常は酵素で標識化される。
酵素標識された又は検知可能な蛋白質試薬を用いて、従
来公知の固体マトリックス上のハイブリッド形成を測定
する際の問題はかかる試薬の非特異的吸着である。この
非特異的結合により、全試験操作の感度が制限される。
したがって、効果的かつ安定な固定化を得るために高濃
度の塩やベーキングを必要としないより良好な、核酸を
固定化するための固体マトリックスが必要とされている
。さらに、かかる新規なマトリックスは、特にハイブリ
ッド形成試験において、また特に得られたハイブリッド
を標識蛋白質試薬を用いて検出する場合に必要とされる
。また、ハイブリッド形成操作には、通常、数段階のイ
ンキュベーション及び洗浄工程が要求されるため、公知
の微細孔性膜は、脆弱で取扱いが困難であるために迅速
処理には向かない、固体状のより剛性の支持体材料によ
ってこれらの問題は解決される。
［発明の概要］ 核酸が、アミジン残基に変換（誘導）されたアミド基を
有するナイロンから成る固体支持体又はマトリックス上
に効果的かつ安定に固定化され得ることが今や見出され
た。かかる変換反応は、通常、ナイロンのアミド基を、
トリアルキルオキソニウム塩のようなアルキル化剤を用
いて処理することにより無水条件下で活性化し、次いで
アルキル化アミド基を適切なアミンと無水条件下で反応
せしめることによって達成される。核酸とアミジン変換
ナイロン支持体との間の相互作用の性質は正確には良く
知られていないが、静電気力及び恐らくは他の非共有的
結合力が主に係るものと考えられる。
本発明の核酸固定化方法は幾つかの利点によって特徴づ
けられる。核酸の、変性されたナイロン表面への吸着を
達成するために高濃度の塩”を存在せしめる必要がない
。さらに、吸着された核酸のベーキングを行って固体支
持体に安定に固定化せしめる必要もない、酵素標識複合
体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）のような蛋白質系試薬を用
いて支持体上に形成されたハイブリッドの検出を行う際
の特別な利点は、この変性ナイロン表面がかかる試薬に
対して極めて低い非特異的結合性を示すことによってよ
り高感度の検出限界が達成されることである。
［好ましい実施態様の説明］ 特定の核酸のハイブリッド形成に必要であるか、又・は
好ましいナイロン支持体中のアミド基の変換の程度は、
通常、日常的な試験によって測定される。したがって、
反応条件は、固定化される核酸にとっての特定の必要性
によって広範に変化させてもよい。例えば、ナイロン支
持体をビーズの形で用いた場合、通常は、直径４．８ｍ
ｍのビーズ表面上に露出される、利用可能なアミド基の
１００〜４００ナノモルが変換されることが予測される
０表面が平滑であると仮定すると、これにより１平方ｃ
ｍ当り１４０〜５６０ナノモルのアミジン基が得られる
。かかる直径が４．８＋＊ｍのビーズ上に露出されたア
ミド基の約２００〜２５０ナノモルの変性が、核酸を固
定化するのに特に有用であることが判明している。
誘導反応の第一段階には、無水条件下における、適切な
アルキル化剤によるアミド基の活性化が含まれる。活性
化剤はアミドを０−アルキル化してイミデートを形成す
る働きをする０次の、アミンとの反応によりアミジン残
基が形成される。
有用なアルキル化剤には硫酸ジアルキル、アルキルトリ
フレート、アルキルジフェニルスルホニウム塩、過塩素
酸アルキル及び特に、低級アルキル塩のようなトリアル
キルオキソニウム塩、好ましくはトリメチルオキソニウ
ム塩及びトリエチルオキソニウム塩が挙げられる。塩の
対アニオンは、通常、ヘキサクロロアンチモン酸塩、ヘ
キサフルオロリン酸塩及びテトラフルオロ硼酸塩から選
ばれるが、最後に挙げたテトラフルオロ硼酸塩が好まし
い。
使用するアミンは第１及び第２脂肪族アミン並びに第１
及び第２芳香族アミンから選ばれる。アミンは１又は複
数の第１及び／又は第２アミノ基を有することができる
０例えば、ジアミノエタン、ジアミノヘキサン、スペル
ミジン、スペルミン及びポリエチレンイミンが有用であ
る。アミンは、活性化アミドと反応する第１又は第２ア
ミン基を必ず少くとも１個有していなければ゛ならず、
更に、第３及び第４アミン類及びグアニド残基のような
カチオン性基又はカチオンとなり得る基を含んでいても
よい、特に有用なアミンはジアミン類及びポリアミン類
である。ジアミン類を使用すれば良好な結果が得られ、
ナイロン支持体上にアミノアミジン基が形成さえる。か
かるジアミン類としてはアルカンジアミン類、特に炭素
原子数２〜１２のα、ω−アルカンジアミン類、例えば
１．６−ヘキサンジアミン、エチレンジアミン、プトレ
ッシン及びカダベリン（ｃａｄｏマｅｒｉｎｅ）が挙げ
られる。得られたアミジン残基は次式＝−ＮＨ−Ｑ ＮＨｅ　　Ｘｅ （式中、Ｑはアルキル化ナイロンとの反応に用いたアミ
ンの残基を表わし；Ｘは、対アニオンを表わす）を有す
る。ジアミンを用いた場合には、上記式中のＱは−Ｒ−
ＮＨ２基（式中、Ｒは好ましくはアルキレン基、フェニ
レン基、アルキフェニレン基又はフェナルキレン基を表
わす）を表わす。
本発明によるナイロン支持体を変性するための特に有用
な一般的方法は、まず、支持体をトリアル＊　ＪＬ／　
：ｔ　＊ソニウム塩１例えばテトラフルオロ硼酸トリメ
チルオキソニウムの非水溶媒、例えば塩化メチレン、四
塩化炭素又はジエチルエーテル溶液で処理する。インキ
ュベーションを、好ましくは撹拌しながら約１繕〜約５
時間行うが、約３時間位が最適である０反応温度は広範
に変化させることができ、主に任意に決定される。室温
における処理が通常用いられる。活性化せしめた支持体
を非水溶液から除去し、次いで場合により一連の非水溶
媒による洗浄を行う０次に、活性化ナイロンを選ばれた
アミン、例えば１．６−ヘキサンジアミンのようなアル
カンジアミンと上記のような非水溶媒溶液中で反応させ
る。この反応は周囲条件下にて約１〜約５時間行うが、
反応時間は少くとも約３時間位が好適である０次いで、
好ましくは、変性された支持体を、まず非水溶媒を用い
て、そして最後に水又は緩衝液を用いて一晩又は所望に
よりそれ以上の、長時間にわたって洗浄する。最終生成
物は水若しくは緩衝液の存在下に又は乾燥状態で保存す
ることができる。
ナイロン支持体は、通常、α、ω−アミノカルボン酸モ
ノマーから成るものばかりでなく、ジアミンとジカルボ
ン酸モノマーとの縮合物をはじめとするポリアミドから
成るものとする。活性化操作は、モノマ一単位の長さに
かかわらず、どのようなポリアミドにも適用することが
できる。芳香族、アルキル又はアルヶニ°ル骨格はすべ
てアミノカルボアルコキシ（ａ＋＊１ｎｏｃａｒｂａｌ
ｋｏｘｙ）　−ｆｌｌナナイロン与える。同様に、骨格
及びアミド基は広範に置換され得るが、もしある種の官
能基、例えばカルボキシル基、ヒドロキシル基、フェノ
ール基及びアミンが存在する場合には、これらはアルキ
ル化反応中に修飾される。これは、最終的に変性された
ナイロンが、実質的に核酸を吸着する働きをする限り許
容される。
支持体の配座及び一般的組成は、その表面上に変換され
て及び核酸と相互作用する、露出されたナイロンアミド
基を有する限り、核酸の固定化への適用に際しては所望
により変化させることができる。支持体はビーズ、細片
、マイクロタイターウェル（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｗ
ｅｌｌｇ）　、試験管、微細孔性膜等の形態であってよ
い、ビーズは、その操作性の良さ及び高い表面積率から
特に有利であることが判明している。直径１ｇＭ〜約１
ｃｍの範囲のナイロンビーズが特に用いられる。均質又
は不均質なナイロンで形成された支持体を用いることが
でき、また非ナイロン芯又は基材上にナイロンを被覆し
て用いてもよい。
本発明の変性されたナイロン支持体は、一般に、所望の
数の塩基を含むＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの誘導体又は
変性体をはじめとする核酸の固定化に用いることができ
る。ゲノム及びプラスミド核酸並びにそれらの制限フラ
グメント及び合成オリゴヌクレオチドは本発明により固
定化することができる。
通常、所望の核酸又は核酸の母集団は、支持体を該核酸
の緩衝液又は分散液中でインキュベートすることにより
変性ナイロン支持体上に固定化される。緩衝液はイオン
強度が低く、通常、ｆＭ濃度約０．５Ｍ以下及びｐ）Ｉ
約４〜約１０、好ましくは約７を有するものが好ましい
、有用な緩衝液は、リン酸塩、炭酸塩、トリス等を含み
、ヌクレアーゼ阻害剤１例えばエチレンジ７ミン四酢融
（ＥＤＴＡ）、ドデシル硫酸ナトリウム又はアウリント
リカルポン醜（ａｕｒｉｎ　ｔｒｉｃａｒｂｏｘ！ｈｉ
　ａｃｉｄ）を含有する。インキュベーションを約１〜
４時間行って結合部位を飽和せしめる。より短いインキ
ュベーション時間を用いて飽和状態に満たない量の核酸
を吸着せしめてもよい、インキュベーション温度は、好
ましくは、２０〜６０℃であるが１例えば５０℃といっ
たや一高温を用いるのが好ましい。固定化が完了したら
、次に支持体をこの目的のため周知のサケ精子ＤＮＡの
ような非特異的な核酸溶液中でインキュベートして、満
たされていない核酸結合部位を飽和せしめるのが好まし
い。
固定化核酸は、アフィニティーリガンドとして一重鎖又
は二重鎖核酸を用いたアフィニティークロマトグラフィ
ー及び精製方法において使用することができ、特に、生
体液のような試料中の特定のポリヌクレオチド配列を検
知するハイブリッド形成試験に適用される。一般に１本
発明の核酸固定化手段は、固相ポリヌクレオチドの使用
又は形成を伴ういかなるハイブリッド形成方法において
も用いることができる。
通常のハイブリッド形成試験においては、試料の核酸又
はプローブとしての核酸のどちらかが、相補性を測定す
る目的で他の一方と接触せしめられる場合に固定化され
る。プローブは、対象とされる配列に対して実質的に相
補性の少くとも１の一重鎖の塩基配列を有する０本発明
の固定化方法は、通常、より長いインキュベーション時
間ｔ−用いてこの素子を製造又は調製することができ、
しかも、実際の試験に必要な時間が増えることがないの
で、該試験を行うための固定化プローブを提供するのに
より有用である。
試料中の対象となる配列の存在を示す、ハイブリッドの
形成は種々の方法で検知される。当業界公知のように試
料の核酸及び固定化されていないプローブのうちの一方
を放射性同位元素、蛍光体、化゛学発光体、酵素又は特
異的に結合可能なリガンドのような検知可能なマーカー
で標識することができる。したがって、ナイロン支持体
と結び付くようになる、かかる標識の量はハイブリッド
形成の程度と直接関係する。また、対象とされる配列の
第１の部分が、固定化された第１のプローブとハリブリ
ッドを形成し、対象とされる配列の、相互に排他的な第
２の部分と標識化された又は他の方法により検知可能な
第２のプローブとのハイブリッド形成により検知が行な
われる２重ハイブリッド形成方法も公知である。
プローブを標識化する特に際立った方法は、特定のヌク
レオチド配列を選ぶか又はプローブの化学的変性により
、プローブの分子中に、特定の結合性物質のための結合
部位を包含せしめることである。ヌクレオチド配列中に
存在する結合部位の例は、プローブがプロモーター蛋白
質（例えばバクテリオファージプロモーター及びＲＮＡ
ポリメラーゼ）と結合可能なプロモーター配列［例えば
ラクトースプロモーター及びトリプトファンプロモータ
ー（ｔｒｐ−ｐｒａ＋ｗｏｔｅｒ）　］から成るか、又
はリプレッサー蛋白質（例えばラクトースリプレッサー
）と結合可能なオペレーター配列（例えばラクトースオ
ペレーター）から成るか、あるいはまた特定の抗体と結
合可能な抗原性ヌクレオチド若しくは配列（例えば５−
ブロモ若しくは５−ヨードデオキシウリジン及びＺ−Ｄ
ＮＡ）から成るような部位である（英国特許明細舎弟２
．１２５，９８４号参照）、プローブの化学的変性によ
り導入された結合部位は特に有用であり、通常、特定の
結合対の片方をプローブ核酸と結合せしめることが伴う
、結合対は、ビオチン／アビジン、ハプテン及び抗原／
抗体、炭水化物／レクチン、酵素／阻害剤等の有用な結
合対から選ばれる。結合対が蛋白質性要素と非蛋白質性
要素とから成る場合、蛋白質性要素はプローブのハイブ
リッド形成の変性条件下では不安定になるため、非蛋白
質性要素をプローブと結合せしめるのが好ましい、好ま
しいシステムにはプローブと、ビオチン又はハプテンの
ようなりガントとを結合させ、これらに対してそれぞれ
標識アビジン又は抗ハプテン抗体を用いることが含まれ
る。
有用なリガンド標識プローブの製造は公知である（例え
ば欧州特許公告公報第６３．８７９号及び第９７．３７
３号、ＰＣＴ公報第８３−００２．２８６号参照。
本発明に特に有用なハイブリッド形成の形式は、固定化
ポリヌクレオチドプローブの使用及び得られたハイブリ
ッドを標識化された若しくはその他の方々によって検知
可能なハイブリッド結合性試薬、通常は該ハイブリッド
に対する選択性を有する抗体のような特異的結合性蛋白
質との結合によって測定することが伴うものである。一
重鎖核酸類及び他の種類の二重鎖体と比較して特定の二
重鎖体に対して選択性を有する抗体には、ＤＮＡ−ＲＮ
Ａ、ＲＮＡ−ＲＮＡに対する抗体及び限られた範囲内の
ＤＮＡ−ＤＮＡに対する抗体並びに挿入二重鎖体（１ｎ
ｔｅｒｃａｌａｔｅｄ　ｄｕｐｌｅｘｅｓ）に対する抗
体がある。
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに対して特異性を有する抗
体は、単独重合体又はヘテロ重合体ポリヌクレオチド二
重鎖体から成る免疫原（抗原）によって刺激される。有
用な単独重合体二重鎖体のうち、特に好ましいものはポ
リ（ｒＡ）φポリ　（ｄＴ）である［キタガワ（Ｋ　ｉ
　ｔａｇａｗａ）及びストーラー（Ｓｔｏｌｌｅｒ）　
、　Ｍｏ１．　ｌｍ５ｕｎｏｌ　、　１９　。
４１３　（１９８２）］、Ｌかしながら、通常、ヘテロ
重合体二重鎖体が好んで用いられφ×１７４ピリオン（
ｖｉｒｉｏｎ）　Ｄ　ＮＡのＲＮＡポリメラーゼによる
転写をはじめとする種々の方々によって製造される［ナ
カザト（Ｎａｋａｚａｔｏ）　　、　　Ｂｉｏｃｈｅｓ
＋　。
±９，２８３５　（１９８１）］。選ばれたＤＮＡ−Ｒ
ＮＡ二重鎖体はメチル化蛋白質によって吸着されるか又
は他の方法により通常の抗原性担体材料、例えば牛血清
アルブミンと結合せしめて所望の宿主である動物に注射
する［ストーラー（Ｓｔｏｌｌｅｒ）　、　Ｍｅｔｈ、
　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　、　７０　、７０（１９８０）参
照］。
ＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖体に対する抗体は中でもレオウィ
ルス又は砂糖きびが感染するフィージー病ウィルスのよ
うなウィルス類からの二重鎖ＲＮＡに対して惹起される
。またホモポリマーの二重鎖体、例えば、中でもポリ（
ｒ　Ｉ）・ポリ（ｒＣ）又はポリ（ｒＡ）・ポリ（ｒＵ
）が上記のような免疫感作に用いられる。
ＤＮＡ・ＤＮＡ二重鎖体に対して選択性を有するモノク
ローナル抗体が欧州特許公開第１３５．１３９号に報告
されている。
挿入二重鎖体に対する抗体は１通常、カチオン性蛋白質
又は蛋白質誘導体（例えばメチル化牛血清アルブミン）
とアニオン性の挿入核酸複合体とのイオン複合体から成
る免疫原に対して惹起される。あるいは、挿入複合体は
担体プロティンと共有結合せしめてもよい。
上記の抗ハイブリッド抗体は、通常、上記のような検知
可能な基で標識され、本発明の支持体上に形成されたハ
イブリッドを容易に測定することが可能となる。また、
抗体試薬は、それ自体の抗原性のような本来の性質に基
いて検出される。標識化抗（抗体試薬）又は蛋白質Ａは
、−次抗体試薬と結合してその検知が可能となる。
本発明を下記の実施例により説明するが、これによって
本発明は、何ら制限されるものではない。
［実施例１］ 大腸菌（Ｅ、　ｃｏ！ｉ）２３　ｓリポーソームＲＮＡ
に対して相補性の配列を有する一重鎖ＤＮＡプローブを
アミノアミジン変性ナイロンビーズ上に吸着せしめた。
該プローブと大腸菌２３ｓＲＮＡとのハイブリッドを形
成し、このハイブリッドを、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッ
ドに対する抗体を用いて検出した。
アミノアミジンナイ、ロンビーズ　− 直径４．８ｆｆ１厘の磨き仕上されたナイロンど−ズ［
米国、イリノイ州、シカゴのプレシジョン・プラスチッ
ク・ポール・カンパニー（ＰｒｅｃｉＳｉｏｎＰｌａｓ
ｔｉｃ　Ｂａ１ｌ　Ｇｏ、）社から入手可能］を、ビー
ズ１００個につき約２０−の割合の塩化メチレン中に入
れた。ビーズ１００個につき０．３ｇのテトラフルオロ
硼酸トリメチルオキソニウムを加え、この溶′液を３０
分間激しく撹拌した。ビーズを取り出し、塩化メチレン
で速やかに洗浄し、新たに調製した１、６−ヘキサンジ
アミンの塩化メチレン１６＋ｓｇ／ａ／溶液、ビーズ１
００個につき２０．Ｊ中で４時間振とうした。ビーズを
塩化メチレン。
次いで十分量の脱イオン水で一晩洗浄した。これを減圧
下、４０〜５０℃にて乾燥した。
ＴＮＢＳ試験によりこのビーズのアミノ基を調べた。ビ
ーズ１個を、その表面上のアミンと反応してビーズを黄
橙色に着色するスルホン酸トリニトロベンゼン（ＴＮＢ
Ｓ）１．１７ミリモルを含むｐＨ９、３１７）Ｏ、ＬＭ
　　Ｎ　＆２Ｂ４０７緩衝液０．８５−と共に室温にて
３時間振とうした。次に３０ｍＭグリシン１５０ｇＭを
加えて過剰のＴＮＢＳと３０分間反応させた。反応混合
物のアリコート４０ｐ４を亜硫酸ナトリウム１．５ｍＭ
を含むｐ）！７．０のＯ，１Ｍ硫酸ナトリウム緩衝液０
．９６ｄ中に加えて希釈すると、４１４ｎｍにおける吸
収が記録された。この反応に用いた全ＴＮＢＳを、ビー
ズを用いない以外は上記のように製造した対照を用いて
測定した。
種々の量のグリシン（ＯＮｏ、８ミリモル）ヲと記Ｎａ
２　Ｂ４０７緩衝液中でＴＮＢｓ　　１．６ミリモルと
３０分間反応させて検量線を作成した。ビーズを用いず
に測定した全ＴＮＢＳとビーズと反応後の過剰のＴＮＢ
Ｓの量との差がビーズ上のアミノ基のモル数である０通
常、各々のビーズはアミノ基２００〜２５０ナノモルを
含んでいた。
Ｄ　ｒＪ　Ａ　　アミノアミジンビーズヒへの　゛ビー
ズ２５個を工＋１７ン・シアタン西齢触（ＥＤＴＡ）１
ミリモルとプローブＤＮＡ　　５０μｇを含むｐＨ７、
４の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液３．０−に加えた
。この混合物を５０°Ｃで８．５時間振とうし、アルカ
リ処理を行ったサケ精子Ｄ　Ｎ　Ａ　（５、２ｍｇ／Ｊ
ｎｌ）　０　、２２．、Ｊを加え、更に４時間振とうを
続けた。ビーズをハイブリッド形成反応溶液５．０４中
に移し、これを５５℃で１１時時間上うした。ビーズを
１ｘＳＳＰＥ（ＳＤＳ　　１％）２〜３−で２度すすい
でハイブリッド形成反応に用いた（ＩＸＳＳＰＥはＮａ
Ｃｌ　　０．１８％ル、ＥＤＴＡ　　１ミリモ／ｌ／を
含むｐ）Ｉ’７．７の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
である）。
対照ビーズを下記のよにして製造した。アミノアミジン
ナイロンビーズ５２個を、アルカリ処理したサケ精子Ｄ
ＮＡ　（５、２ｍｇ／ｍｌ）　０　、５２を含むＰＨ７
，４のリン酸ナトリウム緩衝液６．０−に加えた。混合
物を５０°Ｃで１７時間振とうし、ビーズを／・イブリ
ッド形成溶液６−中にＸｔＪ＋−τカ）ち５５°０で６
簡１１１１編ンう１．た−ビープをｌＸ５ＳＰＥ　（Ｓ
ＤＳ　　１％）で２度すすいだ。
ＤＮＡ−ＲＮＡに、するモノクローナル−造 ′ＤＮＡ＠ＲＮＡハイブリッドの製造 このハイブリッドは、φ×１７４ピリオンＤＮＡの大腸
菌からのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる転写に
よって製造される。この操作法はナカザｈ　（Ｎａｋａ
ｚａｔｏ）によりＢｉａｃｈｅｓ　　、　１９　、２８
３５　（１９８０）に記載されている。
メチル化チログロブリンの製造 キナログロブリン［米国、ミズリー州、セントルイスの
シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ（：ｈｅｍｉｃａｌ　
Ｃａ、）製］１００ｍｇを無水メタノールｌ〇−及び２
．５Ｍ　　ＨＣ見のメタノール溶液４００ＩＬＪ１と合
わせた。混合物をロータリーミキサーで室温にて５日間
反応させた。沈澱物を遠心分離により採取してメタノー
ルで２度、更にエタノールで２度洗浄した。次いで該沈
澱物を減圧下で一晩乾帰した。
マウスの免疫感作 ＥＤＴＡ　　ｌミリモルを含むｐＨ７、４の２０ｍＭト
リス−塩化水素緩衝液２５０ｇ１中のＤＮＡ・ＲＮＡハ
イプリント１５０．ｇをメチル化チログロブリン１５０
ｇｇの水２５０＃ｉ溶液と合わせた。沈澱物が形成され
、これにトリス緩衝液２．５−を加えた。混合物全体を
等量のフロインドアジュバントで乳化した。各々のＢＡ
ＬＢ／Ｃマウスに上記懸濁液０．５４を免疫注射した。
３週間後及びそれ以後は１週間ごとに追加免疫注射を行
った。第１回目の追加免疫注射を行ってからＩＢ間目か
ら開始して以後２週間ごとに血液を採取した。
血清中の抗体価を酵素標識免疫吸着試験法によって測定
した。イムロン（Ｉｍｍｕｌｏｎ）　ＩＩ　［米国、バ
ージニア州、アレクサンドリアのグイナテック社（Ｄｙ
ｎａ　ｔｅｃｋ）製］マイクロタイターウェルのそれぞ
れに５Ｊ１．ｇ／−溶液５０終文を入れることによりＤ
ＮＡ−ＲＮＡを塗布した。このＤＮＡ、ＲＮＡを、Ｎａ
Ｃｕ　　０．１５モルを含むＰＨ−６，８の０．０１５
Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液中に加えた。この溶液を室
温で２時間放置してから、ウェルを生血清アｌレブミン
５ｍｇ／−及びトウイー７　（Ｔｖｅｅｎ）　２０洗浄
剤０．５％（Ｖ／Ｖ）を含むｐＨ７，４の０．０２Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。適当に希釈した抗血
清をウェルに加えて固定化ＤＮＡ−ＲＮＡと該抗体とを
結合せしめた０次に結合した抗体を周知の操作により、
酵素標識抗マウスＩｇＧを用いて検出した。ＤＮＡ−Ｒ
ＮＡに対して高い血清力価を有するが、一重鎖ＤＮＡに
対しては低い力価を有するマウスの牌臓細胞とミエロー
マ細胞とを融合してハイブリドーマを製造した［スチュ
アート　（Ｓｔｕａｒｔ）等のＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。
出、７８．３７５１　（１９８１）；ガルフレ（Ｇａｌ
ｆｒｅ）及びミルスタイｙ　（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　（
１）Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍａ＋、　、ヱ３，１
（１９８１）］。
例えば、この細胞系は、米国、マリーランド州、ロック
ビルのアメリカン・タイプ・カルシチャー拳コレクショ
７　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　
Ｃｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎ）にＡＴＣＣＨＢ　　８７３０
として寄託されている。
クローン化ハイブリドーマはマウスの１ｍ腔内で増殖せ
しめ更なる用途のための適当量の抗体が生成される。抗
体は、アニオン交換高速液体クロマトグラフィーにより
腹水から単離した。
２３ｓＲＮＡのハイブリード／　試験 各々のビーズを表示した量の２３ｓＲＮＡを含むハイブ
リッド形成反応溶液１５０ｇｕ中に入れた。これらをこ
の溶液０．５ｄ中、５５°Ｃで３０分間インキュベート
し、最後にもう一度すすぎを行った。
ビーズ上に形成されたＲＮＡ・ＤＮＡハイブリッドをイ
ムノアッセイ法により測定した。各々のビーズを、Ｎａ
０文　０．１５モル、牛血清アルブミン０．５％（ｗ／
ｖ）、トウィーン２００．５％（ｖ／ｖ）及びＥＤＴＡ
　　１　ミリモルを含むｐＨ７、４の０．０２Ｍリン酸
ナトリウム（ＰＢＳ／ＢＳＡ／トウィーン／ＥＤＴＡ）
５０ル文中、室温で３０分間振とうし、次にＲＮＡ−Ｄ
ＡＮに対する抗体０．１ｐＬｇを含むこの溶液ｔｏｏｇ
文を加えた。振とうを３０分分間性し。
ビーズを、トウィーン０．５％（Ｖ／Ｖ）。
ＢＳＡ　　Ｏ，５％（Ｗ／Ｖ）及びＭ　ｇ　Ｃｊｌ　２
１．０ミリモルを含むｐ）１７　、４の５０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（リン酸塩／Ｂ　Ｓ　Ａ／トウィーン
／ＭｇＣ立２）で２度（各０．５．７）すすいだ。β−
ガラクトシダーゼ抗マウスＩｇＧ［５００倍希釈；米国
、イリノイ州、シカゴのアマージャム社（Ａａ＋ｅｒｓ
ｈａｍ）製］を含むリン酸塩／ＢＳＡ／ｌウィーン／Ｍ
ｇＣｌ２．　１　５　０　　用文を各ビーズに加えて１
時間振とうした。ビーズをリン酸塩／ＢＳＡ／ｌウィー
ン／ＭｇＣ見２０．５−ですすぎ更に５分ずつ２度振と
うしながら洗浄して更にもう一度すすぎを行った。
各々のビーズと結合したβ−ガラクトシダーゼ標識を、
Ｍｇ０文、　５ミリモル及び７−β−ガラクトシル−３
−［３−ジメチルーアミノブロピル力ルポキシアミド］
クマリン０．８ミリモルを含むｐＨ７、４の５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液［ウォーラ（Ｗｏｒａｈ）等のＣ
ｌ１ｎ、　Ｃｈｅｌｌ、　。
２７．６７３　（１９８１）］　０．４５−を加え、こ
の混合物を２５℃で３０分間インキュベートしてａｌｌ
定した０次にＭｇＣｌ２１　ミリモルを含むｐ＋（７、
４の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液１．５−を加え、
蛍光を記録した。
支持体と緩衝液のみを含む支持体対照を用いて試験を行
い結果の背景蛍光を修正した。また。
２０、“０００倍に希釈したβ−ガラクトシダーゼ複複
合体２０見見活性を測定して対照ビーズに対する非特異
的結合を計算した。
結果を下記に示す。
検出されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリットの量は、ハイブ
リッド形成反応混合物中に加えた２３ｓＲＮＡの量に比
例して増加している。
対照ビーズに対するβ−ガラクトシダーゼ抗マウスＩｇ
Ｇの非特異的結合は、ビーズと接触した全酵素複合体の
０．０３５％であった。
［実施例２］ ＤＮＡで被覆されたアミノアミジンビーズへのβ−ガラ
クトシダーゼ−ストレプトアビジンの非特異的結合に関
する研究を行った。
β−ガラクトシダーゼ上のスルフヒドリル残基をジチオ
トレイトールを用いた還元により露出せしめた。ＮａＣ
１０，０９モ／ｌｚを含むｐＨ７，０のＯ，１Ｍ　　Ｎ
−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ′−２−二タ
ンスルホネート緩衝液（ＨＥＰＥＳ）２ｍＪ中のβ−ガ
ラクトシダーゼ（３０，０００単位１等級■、シグマ・
ケミカル社製）をジチオトレイトール３．５！Ｍと合わ
硅　安泗り、−４蒔ＦｌｉｔＡｔ署１．たー　・ゾ手ナ
ト１フィトールを、上記緩衝液中のセファロース（５ｅ
ｐｈａ　ｒｏｓｅ）ＣＩ−６Ｂ　［米国、ニュー・シャ
ーシー州、ビスキャタウェイのファルマシア・ファイン
番ケミカルズ社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）　！ｇＩ］の２．５Ｘ８０ｃｍカラム
を用いたクロマトグラフィーにより除去した。蛋白質を
含む画分を合わせてプールした。酵素１モルに対するス
ルフヒドリル基のモル数をエルマン（１：ｌｌｍａｎ）
の方法［Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、　Ｂｉｏｈ
　ｓ、　、　８２　、７０（１９５９）］により測定し
た。
スクシンイミジル−４〜（Ｎ−マレインイミドメチル）
シクロヘキサン−１−力ルポキシレート（ＳＭＣＣ）［
米国、イリノリ州、ロックフォードのピアース・ケミカ
ル社（Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌＧｏ、）製１５
．３ｍｇを無水Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド２５０ｐ
ｉ中に溶解し、そのアリコート４０ｇＭを、Ｎａ０文　
０．１５モルを含むｐＨ７，０のＯ，１Ｍ　　ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液３−と合わせた。この水溶液の７リコート２５
ｋｌをＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　／　Ｎ　ａ　Ｃ９，緩衝液８
２５川文及びｌｍＭグルタチオン（還元されたもの）１
００ｇＭに加えた。この反応混合物を室温に１５分間静
置し、未反応のグルタチオンをエルマン法により測定し
た。得られた結果をＳＭＣ０６度の計算に用いた。
ストレプトアビジン［米国、マリーランド州。
ガイサースバーグのベスセダ参リサーチ・ラボラトリー
ズ（Ｂｅｔｈｓｅｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）から入手］をバイオゲル（Ｂｉｏｇｅ
ｌ）　Ｐ　−６Ｄ　Ｇ　Ｃ米国、カリフォルニア州、リ
ッチモンドのパイオーラッド−ラボラトリーズ（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製］中のゲル排
除（ｇｅｌ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー
により、ＮａＣ１Ｏ，１５モルを含むｐＨ７，０の０．
．１Ｍ　　ＨＥＰＥＳＩ衝液に交換した。次いで３．７
ｍｇ／−ストレプトアビジン１．７５−を６１ｍＭ　　
ＳＭＣＣ１７，６ｐ−１と合わせ３０℃で１時間反応せ
しめた０反応混合物を、ＨＥＰＥＳＩ衝液中のバイオゲ
ルＰ−６ＤＧのｌＸ２５ｃｍカラム上でクロマトグラフ
ィーを行った。２８０ｎｍにおける吸収帯を有する最初
の流出液のピークに対応する両分をプールし、上記のよ
うにグルタチオンの逆滴定によりマレインイミド含有量
を測定した。
マレインイミドが加水分解されたので、速やかにβ−ガ
ラクトシダーゼとの結合を開始した。
ＨＥＰＥＳ緩衝液３．３ｄ中の活性化ストレプトアビジ
ン３．９ｍｇ１還元されたβ−ガラクトシダーゼ３２ｍ
ｇに加えると反応混合物９．３−が得られた。２５℃に
て４時間反応を行った後に１ｍＭグ′ルタチオン８００
ｇＭを加えて反応をクエンチし、更に２５℃で３０分間
インキュベーションを行った０次に反応混合物をバイオ
ゲルＡ−１、５ｍ　（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ
酸）の１．５Ｘ１１０ｃｓカラム上でクロマトグラフィ
ーを行い、Ｎａ０文　０．１５モルを含むＰＨ７，０ｃ
７）０．１Ｍ　　ＨＥＰ’ＥＳ緩衝液で展開せしめた０
画分２ｍ厘が採取され、２８０ｎｍにおける吸収が記録
された。最初のピークは更なる研究のためにプールした
。
・　　の。
上記実施例１の対照ビーズに関して記載した方法に実質
的に従って製造したビーズをＢＳＡ　　Ｏ，５％、トウ
ィーン２００．５　％及びＭｇＣｌ２１ミリモルを含む
ｐ）１８　、０の０．１Ｍトリス塩化水素緩衝液２２５
ＩＬ文中で３０分分冊上うした。次いで１００倍、５０
０倍又は５０００倍に希釈したβ−ガラクトシダーゼ−
ストレプトアビジン複合体２５展交を適量のビーズに加
え、室温で１時間振とうした。
ＮａＣ１０，５モルを含むトリス緩衝液０．５−を用い
た５分間の振とうによるビーズの洗浄を２度行った。
ビーズに非特異的に吸着された酵素を実施例１に記載の
蛍光試験により測定した。また、希釈されたβ−ガラク
トシダーゼ−ストレプトアビジン複合体の酵素活性を測
定して、ビーズと接触した全酵素に対する非特異的に結
合した酵素の割合を算出した。結果を下記に示す。
１：５０００　　　　　　　　　　　　　　　　　　０
．００！３２非特異的結合は、ビーズと接触したβ−ガ
ラクトシダーゼ−ストレプトアビジンの量に実質的に比
例している。　　　　゛ 実施例３ 比較を目的として、β−ガラクトシダーゼ複合体の、従
来技術による微細孔性ナイロン膜に対する非特異的結合
について調べた。
良立１１ ボール・バイオダイン（Ｐｏｌｌ　Ｂｉｏｄｙｎｅ）　
Ａ　［米国、ニューヨーク州、グレン・コープのボール
・コーボレーシ、　７　（ＰＯＩＩ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ）から入手される］は孔径１．２μｍ及び付加さ
れた陽イオン基及び陰イオン基を有するナイロン膜であ
る。１５ａ＋ｌの大きさの上記膜の小片を室温にて１時
間、アルカリ処理されたサケ精子ＤＮＡ　　５０弘交／
−を含む１４ＸＳＳＰＥ　　２−と接触させた。次いで
この膜を風乾し、減圧下８０℃にて５時間ベークした。
膜をハイブリッド形成反応溶液３ｍｌ中５５℃で１７昨
間インキュベートした。次にこれをＳＤＳ　　０．１％
を含む１×５ＳＰＥ　　５４中で３０分間インキュベー
トした。
ニドラン（Ｎｙｔｒａｎ）　　［米国、ニューハンプシ
ャー州、キーンのシュレイチャー・アンド−シュニル社
（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）製
］は。
ＤＮＡ及び蛋白質の両者にとってのトランスファー媒体
として用いられる変性ナイロン−６６製の膜である。こ
の膜は付加されたカチオン性基を有する。蒸留水中で湿
潤せしめ１次いで６×５ＳＰＥ中に３０分間浸漬するこ
とにより模擬（ｍｏｃｋ）ハイブリッド形成のための試
料を作成した。この膜を減圧下６５°Ｃにて２時間ベー
クし、ハイブリッド形成反応溶液中に５５°Ｃにて１７
時間インキュベートした。
上記膜を０．５ｃｍ角に切断し、それぞれをＰＢＳ／Ｂ
ＳＡ／ｌウィーン／ＥＤＴＡ　　１５０ｐ−１と共に室
温にて６０分分間上うした。次いで、膜をリン酸塩／Ｂ
　Ｓ　Ａ／　）ウィーン／Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２で２度（各
０．５ｍ１）すすいだ。これらを表示した希釈のβ−ガ
ラクトシダーゼ−抗マウスＩｇＧ又はβ−ガラクトシダ
ーゼ−ストレプトアビジン複合体を含むリン酸塩／Ｂ　
Ｓ　Ａ／　トウィーン１ＭｇＣ文２１５０ｐ文と共に１
時間振とうした。股を、ＮａＣｕＯ，５モルを含むリン
酸塩／Ｂ　Ｓ　Ａ／　）ライ−フッＭｇＣ文２０．５−
で１度次いで５分間づつ振とうしながら２度洗浄した。
膜と結合した酵素を、ＭｇＣ文２　１ミリモル及び７−
β−ガラクトシル−３−［３−ジメチルーアミノプロピ
ルカルポキシアミド］クマリン０．８ミリモルを含むｐ
Ｈ７，４の５０ｍＭリン酸ナトリウム２５０ｐｆＬ中、
２５℃で３０分間インキニーベートして測定した。イン
キュベーションの最後にＭｇＣ！；Ｌ２　１ミリモ２ル
を含むＰＨ７、４の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液１
．５Ｊを加えて蛍光を記録した。また、希釈されたβ−
ガラクトシダーゼ複合体の酵素活性を測定し、膜と接触
した酵素の量に対する膜と非特異的に結合した酵素の割
合を算出した。結果を下記に示す。
β−ガラクトシダーゼ−抗マウスＩｇＧの結合ニドラン
　　　　　１：５００　　　　　０．８＋１／／　　　
　　　　　　ｌ：２０００　　　　　０．８１／／　　
　　　　　　　ｌ：５０００　　　　　１．０β−ガラ
クトシダーゼ−ストレプトアビジンの結合 ／’　　　　　　　　１：２０００　　　　　０．ｅ９
／ｌ　　　　　　　　１：５０００　　　　　０．７Ｂ
非非特異的台率は、β−ガラクトシダーゼ複合体の濃度
に殆んど比例して増加している。
以上が本発明の詳細な説明及び実施例である。明らかに
、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限り　多くのそ
の他の変種及び変形を作成することが可能である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、核酸を、アミジン残基に誘導されたアミド基を有す
    るナイロンから成る固体支持体と接触せしめる工程を含
    むことを特徴とする核酸を固定化するための方法。 ２、ナイロンを、そのアミド基が活性化するように処理
    し、かつアミンと反応せしめて該アミジン残基を導入す
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、活性化工程及びアミン反応工程を無水条件下に行な
    う特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、アミンがジアミンであり、したがってアミジン残基
    がアミノ側鎖を有する特許請求の範囲第２項記載の方法
    。 ５、ジアミンが炭素原子数２〜１２のα，ω−アルカン
    ジアミンである特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、固定化すべき核酸が所定の塩基配列を有し、該核酸
    をナイロン支持体と結合せしめた後に、該支持体に非特
    異的核酸を接触せしめて該支持体上の、残余の核酸と結
    合するための部位を飽和せしめる特許請求の範囲第１項
    記載の方法。 ７、固体支持体がビーズの形状である特許請求の範囲第
    １項記載の方法。 ８、核酸がＤＮＡである特許請求の範囲第１項記載の方
    法。 ９、核酸がＲＮＡである特許請求の範囲第１項記載の方
    法。 １０、アミジン残基に誘導されたアミド基を有するナイ
    ロンから成る固体支持体と結合した核酸から成ることを
    特徴とする固定化核酸。 １１、核酸が非共有結合により、固体支持体と結合せし
    められた特許請求の範囲第１０項記載の固定化核酸。 １２、ナイロン中の複数のアミド基が、次式：▲数式、
    化学式、表等があります▼ （式中、Ｒはアルキレン基、フェニレン基、アルキフェ
    ニレン基又はフェナルキレン基を表わし；Ｘは対イオン
    を表わす）で示されるアミノアミジン残基に誘導されて
    いる特許請求の範囲第１０項記載の固定化核酸。 １３、Ｒが炭素原子数２〜１２の線状アルキレン基であ
    る特許請求の範囲第１２項記載の固定化核散。 １４、Ｒが線状ヘキシレン基である特許請求の範囲第１
    ２項記載の固定化核散。 １５、固体支持体がビーズの形状である特許請求の範囲
    第１０項記載の固定化核酸。 １６、核酸がＤＮＡである特許請求の範囲第１０項記載
    の固定化核酸。 １７、核酸がＲＮＡである特許請求の範囲第１０項記載
    の固定化核酸。 １８、（ａ）試料を、測定すベき配列に対して実質的に
    相補性の、少くとも１の一重鎖塩基配列を有する固定化
    ポリヌクレオチドプローブと接触せしめる工程；及び （ｂ）得られたハイブリッドを、ハイブリッドと結合す
    る標識化結合性試薬と接触せしめることにより測定する
    工程から成り、固定化プローブを、アミジン残基に誘導
    されたアミド基を有するナイロンから成る固体支持体と
    結合せしめてあることを特徴とする、試料中の特定のポ
    リヌクレオチド配列を測定する方法。 １９、プローブが非共有結合により固体支持体と結合せ
    られている特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０、固体支持体がビーズの形状である特許請求の範囲
    第１８項記載の方法。 ２１、プローブがＤＮＡから成る特許請求の範囲第１８
    項記載の方法。 ２２、プローブがＲＮＡから成る特許請求の範囲第１８
    項記載の方法。 ２３、得られたハイブリッドがポリヌクレオチドプロー
    ブとは抗原的に異り、標識試薬が、一重鎖核酸に対する
    よりもハイブリッド二重鎖体に対して選択性を有する抗
    体試薬から成る特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２４、抗体試薬が抗ＤＮＡ・ＲＮＡ性又は抗ＲＮＡ・Ｒ
    ＮＡ性である特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２５、プローブが、標識化結合性試薬と選択的に結合せ
    しめられている、特定の結合性リガンドで標識されてい
    る特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２６、リガンドがビオチン又はハプテンであり、結合試
    薬がそれぞれアビジン又は抗ハプテン抗体である特許請
    求の範囲第２５項記載の方法。 ２７、結合試薬が酵素で標識されている特許請求の範囲
    第１８項記載の方法。
JP61225059A 1985-09-30 1986-09-25 核酸を変性ナイロン支持体に固定化する方法、これにより固定化された核酸及び試料中のポリヌクレオチド配列を測定する方法 Granted JPS6281565A (ja)

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