JPS6279783A - β−アミラ−ゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、微生物を利用したβ−アミラーゼの新たな製
造方法に関する。

（従来の技術） 従来β−アミラーゼは麦芽、大麦、小麦、せ諸、大豆、
馬鈴薯等の植物起源のものが知られていた。その後、微
生物からβ−アミラーゼを製造する方法が報告され、特
公昭５３−４５３９３号には、バチルス・サーキュラン
ス（Ｂａｅｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｅｕｌａｎｓ）、バチル
ス・メガテリウム（ＢａｅｉｌＩｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒ
ｕｍ）等をでん粉を含む培地に培養し、培地中にβ−ア
ミラーゼを蓄積させ、これを採取するβ−アミラーゼの
製造方法が開示されていた。また、特開昭４８−６７４
３７号にはバチルス・メガテリウムを栄養培地に培養し
、生成蓄積したβ−アミラーゼを採取するβ−アミラー
ゼの製造方法が開示されていた。また、バチルス−セリ
ウニｘ、　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｅｅｒｅｕｓ）、シュ
ードモナス属菌株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、）
、ストレプトマイセス属菌株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｅｅ
ｓ　ｓｐ、）がβ−アミラーゼを産生ずることが報告さ
れていた。

バチルス・ステアロサーモフイラスについては、β−ア
ミラーゼを分泌する菌株の報告はあるが、これはａ−ア
ミラーゼおよびグルコアミラーゼを共に産生ずるもので
あって、α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼを産生
ぜず、β−アミラーゼのみを産生ずるバチルス・ステア
ロサーモフイラスは全く報告されていない。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明はバチルス・ステアロサーモフイラスに属し、ａ
−アミラーゼおよびグルコアミラーゼを実質上副産しな
いβ−アミラーゼ生産菌を培養し、その培養物からβ−
アミラーゼを製造する方法を提供する。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは本発明で使用するβ−アミラーゼ生産菌に
属するバチルス・ステアロサーモフイラス、Ｍｌ　２７
１８　（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ　Ｎａ　２７１８　）　（以下「本菌株」と
いう）を兵庫県有馬温泉付近の土壌より分離した。本発
明者らは、上記土壌を無菌水に１白金耳けん濁し、１％
溶性でん粉、０．１％肉エキス、０．１％ポリペプトン
、Ｑ、０５％食塩、１．５％寒天、ｐＨ７の平板培地に
接種し、５５℃で培養しコロニーを得た。

このコロニーにＭ／１０００１．Ｋｌ？１Ｆ液を噴霧し
てコロニー周囲に透明のハローを呈するものを除き、コ
ロニー周囲が青色を維持するものを分離した。この分離
菌を１％溶性でん粉、１％肉エキス、１％ポリペプトン
、０．５％食塩、０．５％ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７の液体
培地に植菌し、４５℃、２日間振どう培養を行い、遠心
除菌した上澄液ｌ１１１を２％溶性でん粉液１ｍｌに加
え、４０℃、２０時間反応させた後１、反応液１０μｌ
をペーパークワ、トグラ、イーに展開し、反応生成オリ
ゴ糖がマルトースであるものを選択して、本菌株を分離
した。本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に受託
番号８４３８　　（ＦＥＲＭ　　Ｐ８４３８）号として
寄託された。

本菌株の菌学的特徴は次のとおりである。

栄養細胞の形態　　　　　桿菌 栄養細胞の大きさ　　　　幅　０．８−１．３μｍ長さ
２．０−４．０μｍ 運動性　　　　　　　　　有 胞子　　　　　　　　　　有 胞子の形　　　　　　　　楕円形 胞子の位置　　　　　　　ｓｕｂｔｅｒｗｉｉｎａｌダ
ラム染色　　　　　　　不定 カタラーゼ　　　　　　　陽性（ｗｅａｋ）生育温度　
最高　　　　　６５℃ 最低　　　　　２５℃ 酸の生成　ブドウ糖　　　十 アラビノース　ｗｅａｋ キシロース　　ｗｅａｋ マンニド“ル　ｗｅａｋ ７％ＮａＣｌにおける発育　　− ｖｐ反応　　　　　　　　− 硝酸塩還元　　　　　　　− インドール生成　　　　　− ゼラチン加水分解　　　　ｗｅａｋ クエン酸塩利用　　　　　− ブドウ糖ブイヨンにおける嫌気的発育　−アミラーゼ生
産性　　　　β−アミラーゼ上記菌学的性質をＢｅｒｇ
ｅｙ′ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第８版（１９７４
）およびＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ、第１６巻と対比して、本菌株はバチルス・ステア
ロサーモフイラス（Ｂａｅｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）であると認められた。しかし
、公知のバチルス・ステアロサーモフイラスはアミラー
ゼ産生性がα−アミラーゼであるのに対し、本菌株はα
−アミラーゼを実質上産生せず、またグルコアミラーゼ
を実質上産生ぜず、β−アミラーゼのみを産生ずること
によって、公知菌と顕著な差異を有するものである。

したがって、本発明は、本菌株のみならず、特許請求の
範囲の要件を充足するβ−アミラーゼ生産菌を用いる限
り、これを培養し、その培養物からβ−アミラーゼを採
取するβ−アミラーゼの製造方法を全て含み、これら全
てに本発明が適用されるのはもとよりである。

また、本発明で用いられる培養方法、採取方法に関して
は、いかなる方法も採用することができ、この点に特段
の限定はない。

本菌株が生産するβ−アミラーゼは、以下に、述べる酵
素化学的性質を有する。

（１）　　作用 でん粉中のα−１，４グルコシド結合を非還元来端側か
らマルト−ス単位に分解する。

生成するマルトースの変施光はβ型である。

終濃度０．１％のアミロース、アミロペクチン、グリコ
ーゲンにＩＯＵの酵素を２４時間作用させ、分解生成オ
リゴ糖ペーパークロマトグラフィーにより求めたところ
、生成オリゴ糖はマルトースのみであった。

また分解率を生成マルトース量から求めたところ、アミ
ロース１００％、アミロペクチン５０％、グリコーゲン
４０％°であった。

（２）基質特異性 でん粉のα−１，４グルコシド結合を非還元末端側から
マルトース単位に分解するが、α−１，６グルコシド結
合とその付近のα−１，４グルコシド結合を分解できな
い。

すなわち、０．１％アミロース溶液に作用させ、経時的
に分解率と６６０ｎｍにおけるＢｌｕｅｖｏＬｕｅの変
化を求めると直線的な関係を得られ、非還元末端よりマ
ルトースを遊離することが示された。

（３）酵素活性測定法 １％溶性でんぷんを含む２０　ｗａＭ　ａｃｅｔａｔｅ
　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６）５ｍｊに酵素液ｌ１１１を加
え４０℃で反応させ、Ｆｅｈｌｉｎｇ−Ｌｅｈｍａｎｎ
−Ｓｅｈｏｏｒｌ変法で生成還元糖を測定し、１分間に
ｓ＋ａｌｔｏｓｅとして１μｍｏｌｅの還元糖を生成す
る酵素力を１単位とした。

（４）熱安定性 酵素液を５０Ｍ　ａｃｅｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　（ｐ
　Ｈ６）　　５ｍＭシスティン塩酸塩存在下、４０℃〜
７０℃の各温度で１５分間処理し、冷却後、残存活性を
測定し相対値で示した（第１図）。

これによれば、従来知られている微生物β−アミラーゼ
中最も熱安定性の高いグループに属する。

（５）至適温度 ４０℃〜７０℃の各温度で活性測定と同組成の酵素反応
を１５分間行い、その結果を相対値で示す（第２図）。

これによれば至適温度は５５〜６０℃であり、公知の微
生物β−アミラーゼ（表１）の至適温度と比較すると、
Ｂ、ＩＩＩｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来β−アミラーゼとほ
由来等の最も高い至適温度を有する。

（６１ｐＨ安定性 ｂｕｆｆｅｒ　０　、５＋＋＋ｊに水ｌ１１１、酵素液
０．５ａ＋Ｉを加え、２７℃で２４時間放置後、０．１
ｍｊを取り１．９ｍｊの０　、７５　Ｍ　ａｃｅｔａｔ
ｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６）に入れｐＨを所定の値に戻
し、４０℃で反応し酵素活性を測定した（第３図）。

使用したｂｕｆｆｅｒはｐＨ３，０〜８．５の範囲はＭ
ｅ　ｌ１ｖａｉｎｅ　ｂｕｆｆｅｒ、　ｐ　Ｈ７，５〜
９　、５の範囲はＴｒｉｓ−ｍａｌａｔｅ　ｂｕｆｆｅ
ｒである。

本菌株のｐＨ安定性は、従来公知の微生物β−アミラー
ゼ中最もｐＩ（安定性の広い、開田ら（大阪重文工業研
究所）のＢｌｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＮｏ、　３２株に匹
敵する広いｐＨ安定性を有する。

（７）至適ｐＨ ２％溶性でんぷん２．５ｍｌにＭｅ　ｌ１ｖａｉｎｅ　
ｂｕｆｆｅｒ２．５ｍｌを加え４０℃に保ち酵素液１ｍ
Ａ’を加え１０分間反応し酵素活性を測定した。その結
果は、第４図に示すところでｐＨ６〜７が至適である。

（８）等電点 ＬＫＢ社ｅｌｅｅｔｒｏｆｏｅｕｓｉｎｇのカラム８１
０１（１１０＋ｉｊ容）を用い、ｄｅｎｓｉｔｙ　ｇｒ
ｏｄｉｅｎｔｓはｇｌｙｅｅｒｉｎｅによって行った０
ｃａｒｒｉｅｒ　ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓはｐＨ３〜１０
を使用して４℃において３００Ｖ４２時間泳動を行い１
フラクション２．Ｏｍｊずつ分取しｐＨ及び酵素活性を
測定した（第５図）。等電点は９．０であった。

（９）分子量 １００　ｍＭＫｃｌ、５０　＋ｍＭ　ａｅｅｔａｔｅ　
ｂｕｆｆｅｒ　ｐ　Ｈ６１、３＋ｍＭ２−Ｍｅｒｅａｐ
ｔｏｅｔｈａｌ溶液で平衡化したＢｉｏｇｅｌＰ　−１
００に酵素液及び分子量既知のタンパク質を負荷し、同
組成の液で展開、溶出し溶出量と分子量の対数に直線関
係があることを利用して測定した。来演で測定した分子
量は約４２．０００であった。

（Ｉｎ　　阻害剤 各種阻害剤を終濃度１＋ａＭになるよう酵素液に角丸３
０℃６０分後活性を測定した。

ＰＣＭＢに代表゛されるＳＨ阻害剤によって阻害され、
システィン等の還元剤により活性は回復した。

また水銀イオン、銀イオン等の重金属イオンによっても
阻害された。

（実施例） 実施例１ 兵庫県有馬温泉付近の土壌を１白金耳、無菌水にけん濁
し、１％溶性でんぷん、０．１％肉エキス、０．１％ポ
リペプトン、０．０５％食塩、１．５％寒天、ｐＨ７の
平板培地に接種し、５５℃で培養しコロニーを得た。　
このコロニーにＭ／１０００１．Ｋｌ溶液を噴霧してコ
ロニー周囲に透明のハローを呈するものを除き、コロニ
ー周囲が青色を維持するものを分離した。

この分離菌を１％溶性でん粉、１％肉エキス、１％ポリ
ペプトン、０．５％食塩、０．５％ＫＨ，Ｐ　Ｏ４、ｐ
Ｈ７の液体培地に植菌し、４５℃、２日間振どう培養を
行い、遠心除菌した上澄液ｌ１１１を２％溶性でん粉液
１１Ｉｌに加え、４０℃、２０時間反応させた後１、反
応液１０μｌをペーパークロマトグラフィーに展開し、
反応生成オリゴ糖がマルトースであるものを選択して、
本菌株を分離した。

実施例２ 本菌株をジャーファンメンタ−を使用し、次の培地組成
、条件下で１０１通気曳拌し培養したところ３　Ｕ　／
　ｒａ　ｊのβ−アミラーゼを生産した。

培地組成　　溶性でんぷん　　　　　１％肉エキス（カ
ツオ製）　　１ ポリペプトン　　　　　ｌ ＮａＣｌ　　　　　　　　０．５ ＫＨＰＯＱ、５ ｐＨ７ 培養温度　　３５℃ 培養期間　　２日間 次の方法によって、β−アミラーゼを精製しな。

培養液 ↓　遠心分離（菌体除去） 上澄液 でんぷん吸着（上澄液１０ＩにコーンスターチＬ４ＱＯ
ｇ添加し、４℃で１時間攪拌）遠心分離（でんぷんを沈
でん） 沈でんを１５％マルトース液で溶出 ↓　　　　　　（でんぷんの５倍量の２０％マルトース
液を加え、４０℃で３ ０分攪拌し酵素を溶出させる。） 硫酸アンモニウムを６５％飽和になるよう加える。

↓ 沈でんをフィルターセルによって濾過して集めろ。

↓ １　、３　ｍＭ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを
含む４０　ｍＭａｅｅｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　ｐ　Ｈ
６（Ａ　　ｂｕｆｆｅｒ）を少量とり、沈でんを溶解す
る。

ヴイスキングチューブに入れＡｂｕｆｆｅｒで透析し、
混在するマルトース及び硫安を除去する。

↓ １０　ｍＭ　ａｃｅｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　ｐ　Ｈ５
、５で平衡化した５Ｐ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−５０に
遠心分離して沈でんを除いた透析内液を負荷し、 人ｂｕｆｆｅｒで十分洗浄した後、人ｂｕｆ　ｆｅｒと
０゜５Ｍ　ａｃｅｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　ｐ　Ｈ６（
１、３ｍ）４２ｍｅｒｃａｐｔｏ　ｅｔｈａｎｏｌを含
む）の直線的濃度勾配により溶出し、５ｍｌずつのフラ
クションに分け、活性画分を集め、ヴイスキングチュー
ブに入れＡ−ｂｕｆｆ’ｅ「で透析後、限外濾過により
濃縮する。

↓ １００　ＭＫＣＩを含むＡ　ｂｕｆｆｅｒで十分平衡化
した旧Ｏｇｅｌ　Ｐ−１００にこの濃縮酵素を負荷し平
衡化に使用した同組成液で展開、溶出を行ったところ、
１０００Ｕの蛋白化学的に均一な精製酵素を得た。

（作用効果） 本発明は、β−アミラーゼを産生じ、α−アミラーゼお
よびグルコアミラーゼを実質上産生しない微生物バチル
ス・ステアロサーモフイラスに属するβ−アミラーゼ生
産菌を培養し、その培養物からβ−アミラーゼを採取す
るβ−アミラーゼの製造方法である。

したがって、公知のβ−アミラーゼ製造方法とは顕著な
差異を有する新規なβ−アミラーゼの製造方法である。

上記の点、ならびに産生ずるβ−アミラーゼが公知の微
生物中最高の至適作用温度に匹敵する５５〜６０℃の至
適作用温度を有するので、工業的用途も極めて広大で、
有用な作用効果を有する。

【図面の簡単な説明】

各図は、本菌株が産生ずるβ−アミラーゼの酵素化学的
性質を示す。 第１図は熱安定性、第２図は至適温度、第３図はｐＨ安
定性、第４図は至適ＰＨ％第５図は等電点。 特許出願人　　昭和産業株式会社 図面の、ルー（ｌ′１割ツ夏になし） 第１図 、Ｂ度（℃） 第２図 Ｈ 第３図 Ｈ 第４図 フラクシミン番号（２ｍＪ　　） 第５図 ５　補正の対象 手続補正書（自発）（２） 昭和６０年１２月０２日 特許庁長官　　宇　賀　　道　部　　殿１　事件の表示 昭和６０年特許願第２１６０９４号 ２　発明の名称 β−アミラーゼの製造方法 ３　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 東京都千代田区内神田２丁目２番１号 パレロヮイヤル赤坂１号館９１９号室 中島敏法律特許事務所 ｒｖｐｌｕｅＪを （１）明細書の「発明の詳細な説明」欄（２）代理人の
代理権を証する書面 ６　補正の内容 ■　明細書第２頁第２行 ｒ　ｍｅｇａｔｅｒｕｍＪを ｒ　ｍｅｇａｔｅｒｊｕｍＪと補正する。 ■　同第４頁第６−第７行 「ペーパークロマトクラフィー＋Ｃ展開Ｊ’、＝「ペー
パークロマトグラフィーＦＪｉ開」と補正する。 ■　同第７頁第２行 「変流光」を 「変流光」と補正する。 ■　同第７頁第５行 「分解生成オリゴ糖ペーパー」を 「分解生成オリゴ糖至ペーパー」と補正する。 ■　同第７頁第１８行 ｒ　ｖａｌｕｅＪと補正する。 ■　同第１０頁第４行 ｒ　ｄｅｎｓｉｔｙ　　ｇｒｏｄｉｅｎｔｓＪ　　をｒ
ｄｅｎｓｉｔｙ　ｇｒａｄｉｅｎｔｓＪと補正する。 ■　同第１０頁第１２行 ｒ　Ｍｅｒｅａｐｔｏｅｔｈａｌ　Ｊをｒ　Ｍｅｒｃａ
ｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ　Ｊと補正する。 ■　同第１１頁第１９行 「上澄液」を 「上澄液」と補正する。 ■　同第１２２頁第−２行 ［ペーパークロマトグラフィー１ｚ　Ｒ１ｍ　Ｊを［ペ
ーパークロマトグラフィー−ｒ−ｕ　ｔ５ｆｌ　ｊに？
１０正する。 ■　同第１４頁第８行 ｒ　Ａ　二ｂｕｆｆｅｒＪ ｒＡ　　ｂｕｆｆｅｒＪに補正する。 ■　同第１４頁第１１行 ｒｌｏＯＭＫｃｌＪを １”１００ｍＭＫＣＩＪと補正スル。 ０　同第１５頁の表題 ｒ　Ｃｏｍｐａｒｉｔｏｎｊを ｒ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｊと補正する。 （２）別紙添付のとおり委任状１通を提出する。 ７１ヘイ寸書類の目録 委任状　　　　　　　　　　　　　１通以　　　　　　
上 手続補正書（方式・指令） 昭和６１年０２月２７日 １　事件の表示 昭和６０年特許願第２１６０９４号 ２　発明の名称 β−アミラーゼの製造方法 ３？１１１正をする者 事件との関係　　特許出願人 東京都港区赤坂２丁目１７番５４号 パレロヮイヤル赤坂１号館９１９号室 ５　補正指令書の日付 昭和６１年０１月０８日 （発送日　昭和６１年０１月２８日） ６　補正の対象 願書添付の図面 ７　補正の内容 別紙添付図面のとおり 以

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. バチルス・ステアロサーモフイラスに属し、α−アミラ
   ーゼおよびグルコアミラーゼを実質上副産しないβ−ア
   ミラーゼ生産菌を培養し、その培養物からβ−アミラー
   ゼを採取することを特徴とするβ−アミラーゼの製造方
   法。