JPS6258469B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、エンドトキシンの検出法に関し、さ
らに詳しくは、活性炭の吸着効果を利用したエン
ドトキシンの検出法に関する。 一般に、感染症の起因菌が生体に与える障害
は、細菌が排出する毒性物質による中毒という現
象のみではない。エキソトキシンにしてもエンド
トキシンにしても、毒素による中毒症状が病変の
主な部分であるという例はむしろ特異な場合であ
つて、そのような実例は破傷風、ボツリヌス中
毒、ジフテリア、赤痢、腸チフスその他の伝染病
などに典型的にみられる。しかしながら、多くの
細菌、とくに日常最もよくみられる感染症の起因
菌による主病変は、局所に感染巣を作るための組
織の破壊とその組織の生理的機能の障害、並びに
生体全体の生命現象に及ぼす影響である。このよ
うな背景から、グラム陰性菌感染症の病態におけ
るエンドトキシンの作用を分析するためには、生
体試料に含まれるエンドトキシンの検出が必要と
なつてくる。 感染症という形はとらないがエンドトキシンが
関与すると考えられる病態も指摘されている。例
えば、腸内の常在菌の大半はグラム陰性菌であ
り、これをエンドトキシンに換算すると生体の致
死量を遥かに超える量である。したがつて、何ら
かの腸病変またはその他の機転で、エンドトキシ
ンが流血中に浸入することは充分あり得ることで
ある。とくに肺や肝の破壊的病変、腸の阻血など
の場合が指摘されている。 このような様々なエンドトキシン血症、エンド
トキシンが関与していると考えられる病態を明ら
かにし、致死率の高いこれらの病変の診断と治療
方針を確立するためには、血中エンドトキシンの
検出は欠くべからざる検査法であるといえよう。 エンドトキシンの検出法としては、代表的な例
としてリムルス法が挙げられる。このリムルス法
は、カブトガニの血球（amebocyte）を集めて等
量の蒸留水で溶血させて得られる、いわゆるリム
ルス・ライセートLimuls Lysate（pre―gel）を
エンドトキシンと混合するとゾルからゲルに変化
するということが基本になつている。上記ライセ
ートは、生理食塩水や蒸留水中のエンドトキシン
とは簡単に反応してゲルを形成するが、自然界に
存在するエンドトキシンを検出しようとする場合
には、検体には蛋白その他種々の物質が混在して
複雑な溶液となつている場合があり、ゲル化反応
が起こらないという問題がある。さらに、ヒトの
血液中にエンドトキシンが含まれる場合、エンド
トキシン血症を証明するには種々の問題があつ
て、全血ないし血漿をそのまま等量のライセート
と混じてもゲル化反応が起こらない。その原因と
しては、血漿蛋白のある分画がライセートのゲル
化を妨げる要因であるといわれている。 したがつて、検体、例えば血液中に含まれるエ
ンドトキシンをリムルス法によつて検出する場合
には、予め血液を処理する必要があり、この血液
処理としてはクロロホルムによる処理（クロロホ
ルム処理法）が知られている。このクロロホルム
処理法は、患者から採血した血液をまず低速遠沈
または3000r.p.m.で40秒位の短時間遠沈で血小板
が豊富に含まれる上澄、すなわち多血小板血漿に
するのが合理的である。つぎに、多血小板血漿４
部に対しクロロホルム１部の割合で混じ、60分以
上激しく振盪した後、2500r.p.m.位（1100G）で
10分以上遠沈して３層に分離し、その中間層を
0.1ml採取してライセート0.1mlと混じる方法であ
る。この処理法は蛋白質の変性をねらつた考え方
であるが、含まれるエンドトキシンの回収率は
100％ではなく、また操作が複雑であるために操
作ミスの危険性が高いといわれている。またリム
ルス・ライセートに検体を混じるまでに２時間程
度と長時間を要し、操作器具の種類も多く、器具
自体からエンドトキシンが遊離することもあり、
検出率の低下を招く原因ともなつており、あるい
は逆に処理工程においてエンドトキシンが混入す
る可能性があり、判定に信頼性が伴わないのが現
実である。さらに、血液を検体として使用する場
合、採血量が10mlと量的に多量の血液を要するの
も欠点の一つである。 エンドトキシンの有無に対しては、迅速適確な
判定を行なうことが、シヨツクを起している患者
の救命にもつながる非常に重要な要素であり、さ
らに定量がその後の治療に大きな影響を与える結
果にもつながることから、エンドトキシンシヨツ
クが想定される患者に対しての検出法は100％信
頼のおけるものでなくてはならない。 本発明は、上記のような事情に鑑みなされたも
ので、その目的は、リムルステスト法における検
体処理法、殊に血液処理法をさらに簡易化するこ
とにより、熟練を要さなくても簡単かつ迅速適確
に行なうことができるエンドトキシンの検出法を
提供することにある。 本発明者は、リムルステスト法における検体処
理が、活性炭の吸着作用をエンドトキシンの吸着
に利用することによつて迅速かつ適確に行なえる
ことを見出し、本発明を完成したものである。 すなわち、本発明に係るエンドトキシンの検出
法は、活性炭を予め酸処理してパイロジエンフリ
ーとし、該前処理された活性炭を検体と接触せし
め、ついで該活性炭をリムルス・ライセートと反
応せしめることを特徴とするものである。 以下、本発明に係るエンドトキシンの検出法
を、種々の活性炭のうち一例としてやしがら粒状
活性炭を用いて詳しく説明する。 まず、活性炭自体にエンドトキシンが附着して
いる可能性があるので、このエンドトキシンを除
去するために酸による処理をする必要がある。も
ちろん、パイロジエンフリーであることが確認さ
れている活性炭を使用する場合には、この前処理
が必要でないことは当然のことであるが、通常活
性炭はエンドトキシンを含有しているのでこの酸
による前処理が必要となる。この酸による前処理
の一例を説明すると、まず1Nの塩酸に上記粒状
活性炭を入れ、30〜60分間煮沸する。煮沸後、活
性炭をパイロジエンフリーの蒸留水で何度も洗浄
し、約120℃で乾燥させる。ついで、エンドトキ
シンによる汚染を防ぐために、乾燥済の活性炭を
パイロジエンフリーの容器中に保存する。この処
理の重要性は、活性炭から完全にエンドトキシン
を除去することにあり、その一例として塩酸によ
る処理を説明したが、他の酸によつてもエンドト
キシンを除去できることが確認されており、また
酸の濃度や煮沸時間、乾燥温度等も適宜選定され
る。 ここで、酸によつて前処理された活性炭と未処
理の活性炭について、エンドトキシン有無の試験
例を示す。 試験例 １ エンドトキシン有無の判定試薬としては、米国
マリンクロツト社製“パイロジエント シングル
テスト キツト”を使用した。このパイロジエン
ト シングルテスト キツトは、反応試薬（リム
ルス・ライセート）が１テスト分ごとバイアル
（薬液を入れる小さな容器）に分注、凍結乾燥さ
れており、反応試薬バイアルはそのままテストチ
ユーブとして使用できるものである。 試験方法は、反応試薬バイアルにエンドトキシ
ンフリーの注射用蒸留水を加えた0.25mlのライセ

【表】 なお、陽性（＋）は反応試薬バイアルを180゜
倒立しても崩れない固いゲルを形成した場合で、
エンドトキシンを含有していることを示し、陰性
（−）は全くゲル化していないかあるいは転倒し
てもゲルが流れるような場合で、発熱原性に関し
て陰性であることを示し、この判定基準は後述す
る試験においても同様である。ただし、本試験の
場合にはゲル化しなかつた。 第１表から明らかなように、通常活性炭にはエ
ンドトキシンが含有されていて、未処理状態では
使用することができない。 このように予め酸処理されエンドトキシンが除
去された活性炭は、つぎに検体中に浸漬して所定
時間（通常10分程度）静置したのち、活性炭を取
り出してパイロジエンフリーの生理食塩水で軽く
すすぎ、ついでリムルス・ライセート液に入れ所
定時間静置後判定する。 つぎに、in vitroテストによる兎および人の血
液に対するエンドトキシンの検出試験、陽性検体
および陰性検体に対する検出効率を、クロロホル
ム法と本発明に係る活性炭法のそれぞれについて
示し、本発明の効果をさらに詳細に説明する。 試験例 ２ 本試験例は、兎および人の血液に対するエンド
トキシンの検出試験を示すものである。使用され
た活性炭は、長さ５mm、巾３mmのやしがら粒状活
性炭を1N塩酸に入れ30分間煮沸後、パイロジエ
ンフリーの蒸留水で何度も洗浄し、約120℃で乾
燥させパイロジエンフリーの容器中に保存してお
いたものである。クロロホルム処理法および活性
炭法によるそれぞれのエンドトキシン検出は、以
下の手順で行なつた。 (A) クロロホルム処理法 (1) 兎と人の血液にE.coli 0111 Ｂ ４のエン
ドトキシンを溶解し、１μｇ/ml、10^-1μｇ/
ml、10^-2μｇ/ml、10^-3μｇ/mlおよび10^-4μ
ｇ／mlの濃度の血液を調製する。 (2) 各種濃度の血液を190Gで10分間遠心し、
多血小板血漿を得る。 (3) 採取した血漿の1/4量のクロロホルムを添
加する。 (4) ミキサーで60分以上激しく撹拌してエマル
ジヨンを作る。 (5) エマルジヨンを1100Gで12分間遠心する。
遠心後に３つの層が現われるので、ピペツト
で中層を試験管に採取し、軽く栓をして37℃
の水浴中で１分間静かに振盪し、クロロホル
ムの痕跡を蒸散させる。 (6) 中層0.1mlと0.1mlのリムルス・ライセート
液を混じ、37℃で４時間静置して判定する。 (B) 活性炭法 (1) 各種濃度の血液の調製は、クロロホルム処
理法と同じように行なう。 (2) 各種濃度の血液に前記酸処理された活性炭
を１ケづつ入れて浸漬する。 (3) 10分後活性炭を取り出して、パイロジエン
フリーの生理食塩水で軽くすすぎ、付着して
いる血液を洗い流す。 (4) 0.25mlのリムルス・ライセート液に洗浄後
の活性炭を入れ、37℃で４時間静置して判定
する。 なお、各法において使用された試薬（リムル
ス・ライセート液）は、いずれも米国マリンクロ
ツト社製の“パイロジエント シングルテスト
キツト”である。 判定結果を第２表に示す。

【表】 第２表から明らかなように、クロロホルム処理
法および活性炭法のいずれの検体処理法によつて
も判定結果は同一であり、本発明に係る活性炭法
による検体処理によつて、十二分にエンドトキシ
ンの検出試験を行なうことができる。 試験例 ３ 本試験例は陽性検体および陰性検体の検出効率
を示すものであり、陽性検体としては前記試験例
２で陽性と判定された兎および人の血液、すなわ
ちエンドトキシン濃度10^-3μｇ/ml以上の兎と人
の血液を用い、陰性検体としては同様に前記試験
例２で陰性と判定された、すなわち10^-4μｇ/ml
以下のエンドトキシン濃度の兎と人の血液を用
い、前記試験例２と同様の試験手順で行なつた。
したがつて、陽性検体の検出効率とは、陽性検体
が陽性と判定される可能性、換言すれば陰性と判
定されない可能性を示し、同様に陰性検体の検出
効率は陰性検体が陽性と判定されない可能性を示
す。 結果を下記第３表および第４表に示す。

【表】

【表】 上記第３表および第４表から明らかなように、
陽性検体での検出効率はクロロホルム法および活
性炭法共に100％であり問題はないが、陰性検体
での検出効率は、クロロホルム処理法の場合約80
％であり、このことは検体が陰性の場合でも20％
の確率で陽性と判定する危険性があり、判定に信
頼性が失われ、臨床的に受け入れ難い面が出てい
る。これに比較して、活性炭処理法による判定
は、陰性検体の検出効率が100％であり、判定の
信頼性が100％であると断定できる。したがつ
て、臨床面に導入しても治療に対して診断と治療
方針の確立に速応でき、現在まで確立されていな
かつたエンドトキシンの検査法が実際上臨床に導
入できる点が高く評価される。 以上の説明から明らかなように、本発明に係る
エンドトキシンの検出法は、リムルステスト法の
検体処理としてクロロホルム処理を適用すること
なく、酸による処理を施したパイロジエンフリー
の活性炭にエンドトキシンを吸着させてリムル
ス・ライセートと反応させることを本質とするも
のである。これにより、従来のクロロホルムによ
る検体処理を採用する場合に比べて、操作が極め
て簡便であり、また迅速に行なうことができ、判
定の信頼性も極めて高いという利点が得られる。
したがつて、従来から必要とされつづけてきたエ
ンドトキシンの確実な検出法が確立されたことに
より、今後臨床面に大きな変革がもたらされるも
のと考えられる。 なお、以上やしがら粒状活性炭を一例として説
明したが、活性炭にも多くの種類があり、他の種
類の活性炭にも同様に本発明を適用できることは
説明するまでもなく明らかである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 活性炭を予め酸処理してパイロジエンフリー
   とし、該前処理された活性炭を検体と接触せし
   め、ついで該活性炭をリムルス・ライセートと反
   応せしめることを特徴とするエンドトキシンの検
   出法。