JPS6255086A - 形質転換酵母菌によるｂ型肝炎ウイルス表面抗原及びプレ表面抗原付き表面抗原の製造 - Google Patents
形質転換酵母菌によるｂ型肝炎ウイルス表面抗原及びプレ表面抗原付き表面抗原の製造Info
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- JPS6255086A JPS6255086A JP19391685A JP19391685A JPS6255086A JP S6255086 A JPS6255086 A JP S6255086A JP 19391685 A JP19391685 A JP 19391685A JP 19391685 A JP19391685 A JP 19391685A JP S6255086 A JPS6255086 A JP S6255086A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はＢ型肝炎ウィルスの表面抗原遺伝子又はプレ表
面抗原付き表面抗原の遺伝子を組込んだ新規な組換えプ
ラスミドに関し、！た該プラスミドにより形質転換され
た酵母直に関し、さらにこの酵母菌によるＢ型肝炎ウィ
ルス表面抗原又はプレ表面抗原付き表面抗原の製造法に
関する。
面抗原付き表面抗原の遺伝子を組込んだ新規な組換えプ
ラスミドに関し、！た該プラスミドにより形質転換され
た酵母直に関し、さらにこの酵母菌によるＢ型肝炎ウィ
ルス表面抗原又はプレ表面抗原付き表面抗原の製造法に
関する。
さらに詳しくは１本発明は大腸菌及び酵母菌の両方で増
殖しうる、いわゆるシャトルベクターを用い、その４ク
ターに担われたガラクトキナ−ぜ形質発現調節領域（以
下、ガラクトキナーゼプロモーターまたはＧＡＬ／プロ
モーターという］の下流にＢ型肝炎ウィルス（以下、Ｈ
ＢＶ と略丁）の表面抗原（以下ｈ ＨＲｓ Ｆｒ、
原またはＨＢｍＡｇという。
殖しうる、いわゆるシャトルベクターを用い、その４ク
ターに担われたガラクトキナ−ぜ形質発現調節領域（以
下、ガラクトキナーゼプロモーターまたはＧＡＬ／プロ
モーターという］の下流にＢ型肝炎ウィルス（以下、Ｈ
ＢＶ と略丁）の表面抗原（以下ｈ ＨＲｓ Ｆｒ、
原またはＨＢｍＡｇという。
単にＳ抗原と略すこともある）、又はプレ表面抗原付き
表面抗原（以下、プレ９ ＋ ＨＢｓＡｇまたはプレ８
＋８抗原と略すこともある）の遺伝子を組込んだ組換え
プラスミドを得、これを酵母菌に導入して形質転換させ
て形質転換酵母菌とし、この酵母菌’１ＧＡＬ／プロモ
ーターが抑制されない条件下に培養させて産生される免
疫学的にヒト由来のＨＢｍＡｇと同等に活性な８８ｇ抗
原又はプレ８＋８抗原を得る技術に関する。
表面抗原（以下、プレ９ ＋ ＨＢｓＡｇまたはプレ８
＋８抗原と略すこともある）の遺伝子を組込んだ組換え
プラスミドを得、これを酵母菌に導入して形質転換させ
て形質転換酵母菌とし、この酵母菌’１ＧＡＬ／プロモ
ーターが抑制されない条件下に培養させて産生される免
疫学的にヒト由来のＨＢｍＡｇと同等に活性な８８ｇ抗
原又はプレ８＋８抗原を得る技術に関する。
（従来の技術）
Ｂ型ウィルス肝炎（血清肝炎）は１手として血液を介し
て感染する疾患であって一過性感染のほかに持続性感染
のあることが特徴である。持続性感染の場合には、徐々
に重症の肝臓障害、初期癌から死亡へとＷｆｒ時進行す
る。特にアジア及びアフ。
て感染する疾患であって一過性感染のほかに持続性感染
のあることが特徴である。持続性感染の場合には、徐々
に重症の肝臓障害、初期癌から死亡へとＷｆｒ時進行す
る。特にアジア及びアフ。
リカ諸国における人口の多数は持続性感染者であって、
この病気を広い範囲に伝染させるという危険な潜在性を
有している。Ｂ型肝炎感染からの完全な回復を期待でき
ることもあるが治療薬が無く。
この病気を広い範囲に伝染させるという危険な潜在性を
有している。Ｂ型肝炎感染からの完全な回復を期待でき
ることもあるが治療薬が無く。
大抵の場合、完全治庶が困難である。そこでこの疾患に
は予防策を講じることが重要であり、そのためにはＨ８
Ｖ表面抗原から成るワクチンが最も有効であると考えら
れている。しかしながらＨＢＶはヒトとチンパンジーの
みにしか感染せず、しかも培養細胞への感染の試みも成
功していない。
は予防策を講じることが重要であり、そのためにはＨ８
Ｖ表面抗原から成るワクチンが最も有効であると考えら
れている。しかしながらＨＢＶはヒトとチンパンジーの
みにしか感染せず、しかも培養細胞への感染の試みも成
功していない。
このような事情から、 ＨＢｓＡＨの供給源としてはキ
ャリアーの血清に頼るしか無く、肝炎ワクチンの量産に
限界がある。近年、この対策としてＨＢｓＡｇをヒト血
清によらず１組換えＤＮＡ 技術を用いて細菌（特開昭
６７−２０９２りを号：特開昭！ｒ−タＯ！／７号公報
）や、真菌の一種である酵母菌（例えばＮａｔｕｒｅ
、−タｊ巻、３≠７〜ＪｊＯ頁（１５’♂コ年７月２２
日〕及び特開昭！ター３１７タタ号フ、また同様に組換
えＤＮＡ技術を用いて動物細胞を形質転換させ、かかる
形質転換動物細胞によるＨＢｓＡｇの産生を行なう試み
も提案されている（例えば特開昭！７−３？７ｒ４を号
；特開昭ｓｒ−タｙ夕号；特開昭！ｌ’−１６６ｒｒ号
；特開昭ｊｌ−／り弘ｒり７号；特開昭！ターｊＡＩＰ
ｆ号公報）。
ャリアーの血清に頼るしか無く、肝炎ワクチンの量産に
限界がある。近年、この対策としてＨＢｓＡｇをヒト血
清によらず１組換えＤＮＡ 技術を用いて細菌（特開昭
６７−２０９２りを号：特開昭！ｒ−タＯ！／７号公報
）や、真菌の一種である酵母菌（例えばＮａｔｕｒｅ
、−タｊ巻、３≠７〜ＪｊＯ頁（１５’♂コ年７月２２
日〕及び特開昭！ター３１７タタ号フ、また同様に組換
えＤＮＡ技術を用いて動物細胞を形質転換させ、かかる
形質転換動物細胞によるＨＢｓＡｇの産生を行なう試み
も提案されている（例えば特開昭！７−３？７ｒ４を号
；特開昭ｓｒ−タｙ夕号；特開昭！ｌ’−１６６ｒｒ号
；特開昭ｊｌ−／り弘ｒり７号；特開昭！ターｊＡＩＰ
ｆ号公報）。
（発明が解決しようとする問題点）
これらの従来の方法のうちで大腸菌や動物細胞による方
法では、その生産量が低く、所望の１１ＢｓＡＨの大量
生産にはかならずしも適当でない。
法では、その生産量が低く、所望の１１ＢｓＡＨの大量
生産にはかならずしも適当でない。
また、酵母菌による方法のうち曲者のＮａｔｕｒｅ誌の
報告では、アルコールデヒドロゲデーぜ（ＡＤＨυのプ
ロモーターを利用してＨＢｓＡｇ金生産させているが、
この方法で産生されるＨＢｓＡｇｉは低いので量産には
必らずしも充分ではないと考えられる。一方、後者の特
開昭３タ−Ｊ／７５’５’号による方法では、抑制性酸
性ホスファターゼ（ｐＨｏｊ）、のプロモーターが利用
さｎ、それによる生産量は−高く量産も充分可能と考え
られるが、ｐＨＯｓプロモーターが作動するようにする
ためには一旦培養して菌体量を増大させた後、培地交換
によって誘導丁・る必要があるので方法的に繁雑である
と考えられる。
報告では、アルコールデヒドロゲデーぜ（ＡＤＨυのプ
ロモーターを利用してＨＢｓＡｇ金生産させているが、
この方法で産生されるＨＢｓＡｇｉは低いので量産には
必らずしも充分ではないと考えられる。一方、後者の特
開昭３タ−Ｊ／７５’５’号による方法では、抑制性酸
性ホスファターゼ（ｐＨｏｊ）、のプロモーターが利用
さｎ、それによる生産量は−高く量産も充分可能と考え
られるが、ｐＨＯｓプロモーターが作動するようにする
ためには一旦培養して菌体量を増大させた後、培地交換
によって誘導丁・る必要があるので方法的に繁雑である
と考えられる。
往々研究の結果１本発明者は、大腸直中及び酵母菌中で
増殖できるシャトルベクター中にＨＢｓ Ａｇ又はプレ
Ｓ ＋ ＨＢｓＡｇをコードするＤＮ入配列とＧＡＬ
／プロモーターを組込み、その組換えプラスミドを酵母
菌に導入した後、 ＧＡＬ／プロモーターをＨＢｌｌＡ
ｇの産生に利用丁ｎば、培地交換をする必要がなく、ま
ｔｃ適当な時期に、誘導物質としてガラクトースを添加
することによってＧＡＬ／プロモーターを作動させると
、 ＨＢｓんｇの生産の遺伝子を発現することができる
ためＨＢｓＡｇの生産法は比較的容易とすることができ
ると着想した。
増殖できるシャトルベクター中にＨＢｓ Ａｇ又はプレ
Ｓ ＋ ＨＢｓＡｇをコードするＤＮ入配列とＧＡＬ
／プロモーターを組込み、その組換えプラスミドを酵母
菌に導入した後、 ＧＡＬ／プロモーターをＨＢｌｌＡ
ｇの産生に利用丁ｎば、培地交換をする必要がなく、ま
ｔｃ適当な時期に、誘導物質としてガラクトースを添加
することによってＧＡＬ／プロモーターを作動させると
、 ＨＢｓんｇの生産の遺伝子を発現することができる
ためＨＢｓＡｇの生産法は比較的容易とすることができ
ると着想した。
更に本発明者は、 ＨＢＶ（ＤＨＲｓｋｇ遺伝子の上流
に存在するプ５しＳ抗原遺伝子をもプラスミドに組込む
ことによって、プレＳ抗原を伴なったＨＢｓＡｇも産生
させること全意図した。このプレＳ抗原遺伝子のコード
する蛋白は、Ｔ（ＢＹが肝臓を攻撃する際、肝臓表面上
にあるポリアルブミンに結仕するｔめのレセプターと言
われている。このことから１プレＳ遺伝子を含む組換え
ＤＮＡ’ｉ用いると、プレＳ蛋白質を含むワクチンを生
産することが可能であり、このプレＳ抗原含有のワクチ
ンがあればＨＩ３Ｖ感染の第一段階を特異的に阻止でき
ると考えられる。
に存在するプ５しＳ抗原遺伝子をもプラスミドに組込む
ことによって、プレＳ抗原を伴なったＨＢｓＡｇも産生
させること全意図した。このプレＳ抗原遺伝子のコード
する蛋白は、Ｔ（ＢＹが肝臓を攻撃する際、肝臓表面上
にあるポリアルブミンに結仕するｔめのレセプターと言
われている。このことから１プレＳ遺伝子を含む組換え
ＤＮＡ’ｉ用いると、プレＳ蛋白質を含むワクチンを生
産することが可能であり、このプレＳ抗原含有のワクチ
ンがあればＨＩ３Ｖ感染の第一段階を特異的に阻止でき
ると考えられる。
このような背景のもとに１本発明者は酵母菌によるＨＢ
ｓＡｇ及びプレＳ付Ｈ８ａんｇの生産について検討を重
ねた結果、大腸菌中でも酵母菌中でも両方で組換えプラ
スミドが増殖することを可能にさせるような酵母菌の遺
伝子と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母菌のガラクトキ
ナ−ぜ遺伝子を担った特定のプラスミドベクター中に、
該ガラクトキナーゼプロモーターの制御下にＨＢｓＪｋ
ｇ遺伝子又に遺伝子骨ＨＢｓＡｇ遺伝子を組込んだ新規
な組換えＤＮＡを創製し、それによって酵母菌を形質転
換させ。
ｓＡｇ及びプレＳ付Ｈ８ａんｇの生産について検討を重
ねた結果、大腸菌中でも酵母菌中でも両方で組換えプラ
スミドが増殖することを可能にさせるような酵母菌の遺
伝子と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母菌のガラクトキ
ナ−ぜ遺伝子を担った特定のプラスミドベクター中に、
該ガラクトキナーゼプロモーターの制御下にＨＢｓＪｋ
ｇ遺伝子又に遺伝子骨ＨＢｓＡｇ遺伝子を組込んだ新規
な組換えＤＮＡを創製し、それによって酵母菌を形質転
換させ。
かかる形質転換酵母菌株を用いてヒト由来のＨＢｓＡｇ
と同じ免疫学的活性を有するＨ Ｒｓんｇｔ−生産する
ことに成功し１本発明を完成するに至った。
と同じ免疫学的活性を有するＨ Ｒｓんｇｔ−生産する
ことに成功し１本発明を完成するに至った。
（問題点を解決するための手段］
すなわち、第〆の本発明によると、酵母画内での組換え
プラスミＰの増殖を可能にする遺伝子と。
プラスミＰの増殖を可能にする遺伝子と。
大腸菌内での組換えプラスミドの増殖を可能にする遺伝
子と、該組換えプラスミドの導入による酵母菌形質転換
株を検出するための選択マーカーとして作用する遺伝子
と、該組換えプラスミドの導入による大腸菌形質転換株
を検出するための選択マーカーとして作用する遺伝子と
全含み且つ酵母菌のガラクトキナーゼ形質発現調節領域
の遺伝子を担い、しかも酵母菌及び大腸菌の両方で増殖
し得るプラスミドベクターに、このベクター中で該ガラ
クトキナーゼプロモーターの制御を受ける位置に、Ｂ型
肝炎ウィルスの表面抗原遺伝子、又はプレ表面抗原遺伝
子及び表面抗原遺伝子を組込んで構築されたことを特徴
とする新規な組換えブラスミｒが提供さｎる。
子と、該組換えプラスミドの導入による酵母菌形質転換
株を検出するための選択マーカーとして作用する遺伝子
と、該組換えプラスミドの導入による大腸菌形質転換株
を検出するための選択マーカーとして作用する遺伝子と
全含み且つ酵母菌のガラクトキナーゼ形質発現調節領域
の遺伝子を担い、しかも酵母菌及び大腸菌の両方で増殖
し得るプラスミドベクターに、このベクター中で該ガラ
クトキナーゼプロモーターの制御を受ける位置に、Ｂ型
肝炎ウィルスの表面抗原遺伝子、又はプレ表面抗原遺伝
子及び表面抗原遺伝子を組込んで構築されたことを特徴
とする新規な組換えブラスミｒが提供さｎる。
この組換えプラスミｒにおいては、Ｂ型肝炎ウィルス表
面抗原遺伝子と、その上流に連結されたプレ表面抗原遺
伝子とが一緒にプラスミドベクタ−中でガラクトキナー
ゼプロモーター形質発現調節領域の下流に組込まれるこ
とができる。
面抗原遺伝子と、その上流に連結されたプレ表面抗原遺
伝子とが一緒にプラスミドベクタ−中でガラクトキナー
ゼプロモーター形質発現調節領域の下流に組込まれるこ
とができる。
本発明の組換えプラスミドは、簡略に言えば。
大腸菌および酵母菌の両方の遺伝子を備え、大腸菌、酵
母菌のいずれでも増殖しうるシャトルベクターを用い、
そのベクターに担われたガラクトキナーゼプロモーター
の下流において８８ｇ抗原遺伝子またはプレ８付Ｈａｓ
抗原遺伝子を組込んで得らｆしたものである。このよう
にして得らｎたＨＢｓ遺伝子発現プラスミド全常法によ
り酵母菌に作用、導入させて形質転換することにより所
望の形質転換酵母菌が得られる。この形質転換酵母菌を
、好ましくはガラクトキナーゼプロモーターが抑制さｎ
ない条件下にガラクトースの存在下に培養することによ
り、所望のＨＲｓＡｇ及びプレＳ付ＨＦ１ｓ＆ｇが高収
量で生産さｎる。
母菌のいずれでも増殖しうるシャトルベクターを用い、
そのベクターに担われたガラクトキナーゼプロモーター
の下流において８８ｇ抗原遺伝子またはプレ８付Ｈａｓ
抗原遺伝子を組込んで得らｆしたものである。このよう
にして得らｎたＨＢｓ遺伝子発現プラスミド全常法によ
り酵母菌に作用、導入させて形質転換することにより所
望の形質転換酵母菌が得られる。この形質転換酵母菌を
、好ましくはガラクトキナーゼプロモーターが抑制さｎ
ない条件下にガラクトースの存在下に培養することによ
り、所望のＨＲｓＡｇ及びプレＳ付ＨＦ１ｓ＆ｇが高収
量で生産さｎる。
従って、第コの本発明によると、酵母菌内での組換えプ
ラスミドの増殖を可能にする遺伝子と。
ラスミドの増殖を可能にする遺伝子と。
大腸菌内での組換えプラスミドの増殖を可能にする遺伝
子と、紋紙換えプラスはドの導入による酵母菌形質転換
株を検出するための選択マーカーとして作用する遺伝子
と、紋紙換えプラスミドの導入による大腸菌形質転換株
を検出するための選択マーカーとして作用する遺伝子と
を含み且つ酵母菌のガラクトキナーゼ形質発現調節領域
の遺伝子を担い、しかも酵母菌及び大腸菌の両方で増殖
し得るプラスミドベクターに、このベクター中で該ガラ
クトキナーゼプロモーターｑ】制御を受ける位１ξＢ型
肝炎ウィルスの表面抗原遺伝子、又はプレ表面抗原遺伝
子及び表面抗原遺伝子全組込んで構築された組換えプラ
スミドを導入されて形質転換さｆ’したことを特徴とす
る形質転換酵母菌が提供される。
子と、紋紙換えプラスはドの導入による酵母菌形質転換
株を検出するための選択マーカーとして作用する遺伝子
と、紋紙換えプラスミドの導入による大腸菌形質転換株
を検出するための選択マーカーとして作用する遺伝子と
を含み且つ酵母菌のガラクトキナーゼ形質発現調節領域
の遺伝子を担い、しかも酵母菌及び大腸菌の両方で増殖
し得るプラスミドベクターに、このベクター中で該ガラ
クトキナーゼプロモーターｑ】制御を受ける位１ξＢ型
肝炎ウィルスの表面抗原遺伝子、又はプレ表面抗原遺伝
子及び表面抗原遺伝子全組込んで構築された組換えプラ
スミドを導入されて形質転換さｆ’したことを特徴とす
る形質転換酵母菌が提供される。
この組換えプラスミドの導入による形質転換を受ける酵
母菌はトリシト７アン要求性変異株のサツカロミセス・
セレビシェであるのが好ましい。
母菌はトリシト７アン要求性変異株のサツカロミセス・
セレビシェであるのが好ましい。
更に、第Ｊｔｉｙ本発明によると、酵母菌内での組換え
プラスミドの増殖を可能にする遺伝子と、大腸菌内での
組換えプラスミドの増殖を可能にする遺伝子と、＃組換
えプラスミドの導入による酵母菌形質転換株を検出する
ための選択マーカーとして作用する遺伝子と、紋紙換え
プラスミドの導入による大腸菌形質転換株を検出するた
めの選択マーカーとして作用する遺伝子とを含み且つ酵
母菌のガラクトキナ−ぜ形質発現調節領域の遺伝子を担
い、しかも酵母菌及び大腸菌の両方で増殖し得るプラス
ミドベクターに、このベクター中で該ガラクトキナーゼ
プロモーターの制御を受ける位置に、Ｂ型肝炎ウィルス
の表面抗原遺伝子、又はプレ表面抗原遺伝子及び表面抗
原遺伝子を組込んで構築された組換えプラスミドを導入
されて形質転換された形質転換酵母菌を培養することを
特徴とする。Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原又はプレ表面
抗原付き表面抗原の製造方法が提供される。
プラスミドの増殖を可能にする遺伝子と、大腸菌内での
組換えプラスミドの増殖を可能にする遺伝子と、＃組換
えプラスミドの導入による酵母菌形質転換株を検出する
ための選択マーカーとして作用する遺伝子と、紋紙換え
プラスミドの導入による大腸菌形質転換株を検出するた
めの選択マーカーとして作用する遺伝子とを含み且つ酵
母菌のガラクトキナ−ぜ形質発現調節領域の遺伝子を担
い、しかも酵母菌及び大腸菌の両方で増殖し得るプラス
ミドベクターに、このベクター中で該ガラクトキナーゼ
プロモーターの制御を受ける位置に、Ｂ型肝炎ウィルス
の表面抗原遺伝子、又はプレ表面抗原遺伝子及び表面抗
原遺伝子を組込んで構築された組換えプラスミドを導入
されて形質転換された形質転換酵母菌を培養することを
特徴とする。Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原又はプレ表面
抗原付き表面抗原の製造方法が提供される。
仁の本発明の方法は、形質転換酵母菌の培養物ｔ−５ａ
ｉ処理し、その溶菌液からＢ型肝炎ウィルスの表面抗原
、プレ表面抗原付き表面抗原及び／又はプレ表面抗原の
蛋白質を採取する工程室含むことができる。
ｉ処理し、その溶菌液からＢ型肝炎ウィルスの表面抗原
、プレ表面抗原付き表面抗原及び／又はプレ表面抗原の
蛋白質を採取する工程室含むことができる。
また１本発明の方法においては、該形質転換酵母菌の培
養をガラクトキナーゼプロモーターが抑制されない条件
下にガラクトースの存在下に行う・ことが好ましい。
養をガラクトキナーゼプロモーターが抑制されない条件
下にガラクトースの存在下に行う・ことが好ましい。
以下に本発明の組換えプラスミド、酵母菌の形質転換及
びそれによる）ＩＢＳＡｇ、プレＳ付Ｈ８ａ Ａ ｇの
生産についてさらに詳細に具体的に説明する。
びそれによる）ＩＢＳＡｇ、プレＳ付Ｈ８ａ Ａ ｇの
生産についてさらに詳細に具体的に説明する。
（１） ＨＯＷ遺伝子
本発明における組換えＤＮＡの作製に用いらｎるＨＦＩ
Ｖ遺伝子は日本や東南アジアなどで多く見らｎるサブタ
イプａｄｒのもの七人ｉ菌によりクローニングして得ら
れたＨＢＶＤＮＡである。このＨＢＶＤＮＡは次のよう
にして調製される。まずＨＢｅＡｇを産生じているヒト
血液中に含まれるディン（Ｄ鳳ｎｅ）粒子と呼ばれるウ
ィルス粒子を後記するように調製する。 コ０ＨＢＶＤ
ＮＡは３２００塩基対（以下、 ｂｐと略す）を有する
環状２本鎖構造をとっているが。
Ｖ遺伝子は日本や東南アジアなどで多く見らｎるサブタ
イプａｄｒのもの七人ｉ菌によりクローニングして得ら
れたＨＢＶＤＮＡである。このＨＢＶＤＮＡは次のよう
にして調製される。まずＨＢｅＡｇを産生じているヒト
血液中に含まれるディン（Ｄ鳳ｎｅ）粒子と呼ばれるウ
ィルス粒子を後記するように調製する。 コ０ＨＢＶＤ
ＮＡは３２００塩基対（以下、 ｂｐと略す）を有する
環状２本鎖構造をとっているが。
通常ＤＮＡ全体のｌＪ係〜ｊＯ係の領域は１本鎖である
。そのため遺伝子のクローニングを行なうに先立って１
本鎖部分ｔ−ＨＢＶに含まｎるエンドジナスＤＮムポリ
メラーゼを利用して２本鎖に修復する。
。そのため遺伝子のクローニングを行なうに先立って１
本鎖部分ｔ−ＨＢＶに含まｎるエンドジナスＤＮムポリ
メラーゼを利用して２本鎖に修復する。
このあとＤＮＡを抽出し、とｔ″Ｌｔ−適当な制限酵素
によって開裂してから、大腸菌のプラスミドに組込みク
ローニングを行なう。このａｄｒタイプのＨＢＶＤＮＡ
は制限酵素Ｘ ｈ ｏ ＩおよびＢｍｍＨＩ 認識部位
を各々１個所ずつ有しており、大腸菌でのＩ（ＲＶゲノ
ムのクローニングのためには通常とｎら認識部位のいず
ｎかが利用されて大腸菌プラスミドに組込まｎる。
によって開裂してから、大腸菌のプラスミドに組込みク
ローニングを行なう。このａｄｒタイプのＨＢＶＤＮＡ
は制限酵素Ｘ ｈ ｏ ＩおよびＢｍｍＨＩ 認識部位
を各々１個所ずつ有しており、大腸菌でのＩ（ＲＶゲノ
ムのクローニングのためには通常とｎら認識部位のいず
ｎかが利用されて大腸菌プラスミドに組込まｎる。
クローニングし＊ ＨＢＶＤＮ＆？大腸菌内で増幅した
のち１通常はさらに適当な制限＃素で処理して所定の断
片として後述のプラスミドの構築に供するが、このよう
なＨＢＶＤＮＡの大腸菌内クローニングは例えば特開昭
！ターＪ／７タタ公報に記載される公知の手法で実施で
きる。
のち１通常はさらに適当な制限＃素で処理して所定の断
片として後述のプラスミドの構築に供するが、このよう
なＨＢＶＤＮＡの大腸菌内クローニングは例えば特開昭
！ターＪ／７タタ公報に記載される公知の手法で実施で
きる。
０） シャトルベクタ一
本発明で用いらｎるシャトルベクターは、酵母菌内での
プラスミド増殖を可能にする遺伝子（好ましくは酵母菌
プラスミド由来のもの２と大腸菌の内での増殖を可能に
する遺伝子（好ましくは大腸菌プラスミド由来のもの〕
とを含みかつ酵母菌のガラクトキナーゼ遺伝子全損った
プラスミドベクターである。
プラスミド増殖を可能にする遺伝子（好ましくは酵母菌
プラスミド由来のもの２と大腸菌の内での増殖を可能に
する遺伝子（好ましくは大腸菌プラスミド由来のもの〕
とを含みかつ酵母菌のガラクトキナーゼ遺伝子全損った
プラスミドベクターである。
このベクター中の酵母菌の遺伝子としては、一般に、プ
ラスミドが酵母菌中で染色体と独立して増殖するのに必
要なりＮＡ配列１例えば酵母菌の自律増殖に必要なりＮ
Ａ配列（ａｒｓＡ）とコμｍ Ｄ Ｎ Ａの複製に必要
なりＮＡ配列（２μｏｒｂ）がある。このプラスミドベ
クターは所望により、さらに形質転換酵母菌株の選択マ
ーカーとなる遺伝子を含む。この選択マーカーとしては
、ロイシン−８−成遺伝子、ヒスチジンせ成遺伝子、ト
リプトファン付成遺伝子。
ラスミドが酵母菌中で染色体と独立して増殖するのに必
要なりＮＡ配列１例えば酵母菌の自律増殖に必要なりＮ
Ａ配列（ａｒｓＡ）とコμｍ Ｄ Ｎ Ａの複製に必要
なりＮＡ配列（２μｏｒｂ）がある。このプラスミドベ
クターは所望により、さらに形質転換酵母菌株の選択マ
ーカーとなる遺伝子を含む。この選択マーカーとしては
、ロイシン−８−成遺伝子、ヒスチジンせ成遺伝子、ト
リプトファン付成遺伝子。
ウラシル合成遺伝子、アデニン甘酸遺伝子などが含まｎ
、こｎらの１種まπは４種以上が用いらｎる。
、こｎらの１種まπは４種以上が用いらｎる。
前記シャトルベクター中の大′ＩｋｖＭ側の遺伝子とし
ては、大腸菌体内においてプラスばドが増殖するために
必要なりＮＡ配列１例えばＣｏ ７１ Ｉ系のプラスミ
ドの複製起点の［）Ｎ入配列がある。該プラスミドベク
ターは好ましくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカー
となる遺伝子を含む。この選択マーカーの遺伝子として
はアンピシリン耐性遺伝子。
ては、大腸菌体内においてプラスばドが増殖するために
必要なりＮＡ配列１例えばＣｏ ７１ Ｉ系のプラスミ
ドの複製起点の［）Ｎ入配列がある。該プラスミドベク
ターは好ましくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカー
となる遺伝子を含む。この選択マーカーの遺伝子として
はアンピシリン耐性遺伝子。
テトラサイクリン耐性遺伝子などが挙げらｎ、これらの
遺伝子の１種または４種以上が用いらｎる。
遺伝子の１種または４種以上が用いらｎる。
このような大腸ｌ ＤＮＡとして、アンピシリン耐性遺
伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を有するｐＢＲＪ２
コが一般に通常使用さｎる。
伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を有するｐＢＲＪ２
コが一般に通常使用さｎる。
本発明で用いるシャトルベクターは酵母菌のガラクトキ
ナーゼプロモーターを担っていることが特色であり、こ
ｎはつぎのようにして構築さｎる。
ナーゼプロモーターを担っていることが特色であり、こ
ｎはつぎのようにして構築さｎる。
゛公知のプラスミドｐＢＭ／ Ｊ ｊより得らＴＬタガ
ラクトヤナデープロモーター領域ヲＪｓ成する遺伝子を
含ｔｒ約□Ｊコキロベースペアの制限酵素ＥｃｏＲＩ−
ＲａｍＨＩ 断片（Ｍｏｌｅｃｕｌｉｒ ａｎｄ
ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ 、 ４！巻、１ｔ
ｉ−４Ａｏ−ｔｔｔｕｔ頁、／Ｐｌ弘）を公知の大腸菌
・酵母菌シャトルベクターＹＲｐ７ （Ｇｅｎｅ 、
／ ０巻、１ｚｙ−ｔｉｎｔ頁。
ラクトヤナデープロモーター領域ヲＪｓ成する遺伝子を
含ｔｒ約□Ｊコキロベースペアの制限酵素ＥｃｏＲＩ−
ＲａｍＨＩ 断片（Ｍｏｌｅｃｕｌｉｒ ａｎｄ
ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ 、 ４！巻、１ｔ
ｉ−４Ａｏ−ｔｔｔｕｔ頁、／Ｐｌ弘）を公知の大腸菌
・酵母菌シャトルベクターＹＲｐ７ （Ｇｅｎｅ 、
／ ０巻、１ｚｙ−ｔｉｎｔ頁。
１ｙｒｏ）のＢｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩｉＢ位に挿入する
。このグラスミド’ｌ：ｐＹＧ１０／と命名する。
。
。このグラスミド’ｌ：ｐＹＧ１０／と命名する。
。
このプラスミドＩ） ＹＧ ／ ０ ／のＥｃ ＯＲＩ
部位に酵母菌の一μｍＤＮＡの複製に必要なりＮＡ配
列（２μｏｒｉＪを含むＨｉｎｄｌｌ−ＥｃｏＲＩ断片
（Ｎａｔｕｒｅ、 ２ ｒ ６巻。
部位に酵母菌の一μｍＤＮＡの複製に必要なりＮＡ配
列（２μｏｒｉＪを含むＨｉｎｄｌｌ−ＥｃｏＲＩ断片
（Ｎａｔｕｒｅ、 ２ ｒ ６巻。
１ｒｔｏ−ｒｔｚ頁、／９１０）ｆ：挿入する。このよ
うにして得らｎるプラスミドがシャトルベクター ｐＹ
Ｇ／ ／ ０である。
うにして得らｎるプラスミドがシャトルベクター ｐＹ
Ｇ／ ／ ０である。
このプラスミドベクターｐＹＧ／／Ｑは、大腸菌の遺伝
子として、 ｐｓａ３２コのアンピシリン耐性遺伝子（
Ａｐ’）を含むＦｉｃｏＲＩ部位から８ａｔＩ部位まで
を有し、一方、酵母菌の遺伝子として、 ｐＨＦＬＪ２
２と結付し７ＣＥｃｏｌ（Ｉｆｍ位よりλＩｔｏｒｉ、
ｔｒｐ／、ａｒＳ／遺伝子の順に位置し、さらにそのつ
ぎにＧＡＬ ／遺伝子のプロモーター領域のＢａｍＨＩ
部位までを有する。そしてそのＢｃｏＲＩおよびＢａｍ
ＨＩ部位でこれら大腸菌遺伝子と酵母菌遺伝子が結付し
た構造となっている。、？：、のプラスミドベクターｐ
ＹＧ／１０Ｆｉ大腸菌内においてはｐＢＢ、ｒ２２によ
り増殖し、また酵母菌内においてはａｒｍｉおよびλμ
ｏｒｉによジ増殖可能となる。さ゛らにこのプラスミド
による形質転換体の選択マーカーとして大腸菌側にアン
ピシリン耐性遺伝子（Ａｐ’Ｊを、算母菌側にはトリプ
トファン合成遺伝子（ｔｒｐ／）ｋ有しており、シャト
ルベクターとしての条件全充分に満たしている。
子として、 ｐｓａ３２コのアンピシリン耐性遺伝子（
Ａｐ’）を含むＦｉｃｏＲＩ部位から８ａｔＩ部位まで
を有し、一方、酵母菌の遺伝子として、 ｐＨＦＬＪ２
２と結付し７ＣＥｃｏｌ（Ｉｆｍ位よりλＩｔｏｒｉ、
ｔｒｐ／、ａｒＳ／遺伝子の順に位置し、さらにそのつ
ぎにＧＡＬ ／遺伝子のプロモーター領域のＢａｍＨＩ
部位までを有する。そしてそのＢｃｏＲＩおよびＢａｍ
ＨＩ部位でこれら大腸菌遺伝子と酵母菌遺伝子が結付し
た構造となっている。、？：、のプラスミドベクターｐ
ＹＧ／１０Ｆｉ大腸菌内においてはｐＢＢ、ｒ２２によ
り増殖し、また酵母菌内においてはａｒｍｉおよびλμ
ｏｒｉによジ増殖可能となる。さ゛らにこのプラスミド
による形質転換体の選択マーカーとして大腸菌側にアン
ピシリン耐性遺伝子（Ａｐ’Ｊを、算母菌側にはトリプ
トファン合成遺伝子（ｔｒｐ／）ｋ有しており、シャト
ルベクターとしての条件全充分に満たしている。
なお、このようなシャトルベクターを用いるのは後記組
換えシラスミ）１′全大腸菌を用いて複製するためであ
り、紋紙換えプラスミドで酵母菌を形質転換する段階に
至っては、大腸菌の遺伝子は除去されても差支えがない
。
換えシラスミ）１′全大腸菌を用いて複製するためであ
り、紋紙換えプラスミドで酵母菌を形質転換する段階に
至っては、大腸菌の遺伝子は除去されても差支えがない
。
このシャトルベクター ｐＹＧ／１０Ｋは、 ＧＡＬ／
プロモーター領域の下流にＢａｍＨＩ部位がｌケ所あり
。
プロモーター領域の下流にＢａｍＨＩ部位がｌケ所あり
。
この位置に外来性遺伝子としてＨａｓ遺伝子全組込むこ
とができる。
とができる。
（３） Ｈａｓ遺伝子発現プラスミドの構築本発明の
組換えプラスミド、すなわちＨａｓ遺伝子又はプレ８付
Ｈｅｒ遺伝子を組込んだプラスミドの調製は、まず前記
シャトルベクターをＢａｍＨＩにて処理して開裂させ、
これに上記ＨＢＶＤＮ入全作用させて連結させる。こｎ
ｆ先づ大腸菌にて増幅し。
組換えプラスミド、すなわちＨａｓ遺伝子又はプレ８付
Ｈｅｒ遺伝子を組込んだプラスミドの調製は、まず前記
シャトルベクターをＢａｍＨＩにて処理して開裂させ、
これに上記ＨＢＶＤＮ入全作用させて連結させる。こｎ
ｆ先づ大腸菌にて増幅し。
各種制限酵素分析によって、正しい配位に組込まｔｌ、
りもののみ全選択し、目的とする組換えシラスミ ドを
得る。
りもののみ全選択し、目的とする組換えシラスミ ドを
得る。
Ｃ）酵母の形質転換
形質転換されるべき酵母菌としては、プラスミドで担わ
ｎ’ｒｃ形質転換酵母菌の選択マーカー遺伝子によって
相補される変異をもった変異株１例えばトリプトファン
要求性変異株であるサツカロミセス・セレビシェ（８ａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅハ特に
好ましくはセレビシェ菌株ＸコタコＪ’−ＪＤ−／Ａ（
ａ ｓｄｅ／ ｇａｔ／ ｔｅｕ／ ｈｉｓＪ ｕｒａ
３ ｔｒｐ／ｍｅｔ１４ｔＪ’ｉ用いる。上記組換えプ
ラスミドを大腸菌にて増殖させたのち、該酵母菌変異株
に常法により導入する。この導入には１例えば酵母菌を
ス７エロゾラスト化したのちカルシウム処理した菌体と
所要プラスミドＤＮＡとを混会して形質転換奮起させる
。このように処理さｎ７１ｍ酵母菌から、ベクター上に
担われている宿主酵母菌の変異を相補する遺伝子１例え
ばトリシトファン付成遺伝子の発現を指標として形質転
換酵母菌株全選択し１分離する。
ｎ’ｒｃ形質転換酵母菌の選択マーカー遺伝子によって
相補される変異をもった変異株１例えばトリプトファン
要求性変異株であるサツカロミセス・セレビシェ（８ａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅハ特に
好ましくはセレビシェ菌株ＸコタコＪ’−ＪＤ−／Ａ（
ａ ｓｄｅ／ ｇａｔ／ ｔｅｕ／ ｈｉｓＪ ｕｒａ
３ ｔｒｐ／ｍｅｔ１４ｔＪ’ｉ用いる。上記組換えプ
ラスミドを大腸菌にて増殖させたのち、該酵母菌変異株
に常法により導入する。この導入には１例えば酵母菌を
ス７エロゾラスト化したのちカルシウム処理した菌体と
所要プラスミドＤＮＡとを混会して形質転換奮起させる
。このように処理さｎ７１ｍ酵母菌から、ベクター上に
担われている宿主酵母菌の変異を相補する遺伝子１例え
ばトリシトファン付成遺伝子の発現を指標として形質転
換酵母菌株全選択し１分離する。
なお、形質転換に用いられる酵母菌としてはトリットフ
ァン要求性変異株のほかに、ヒスチジン要求性変異株、
ロイシン要求性変異株、ウラシル要求性変異株、アデニ
ン要求性変異株などが挙げられる。
ァン要求性変異株のほかに、ヒスチジン要求性変異株、
ロイシン要求性変異株、ウラシル要求性変異株、アデニ
ン要求性変異株などが挙げられる。
（ｊ） 形質転換酵母菌の培養およびＨＢｓＡＨの生
産上記の方法で得らｎ７ｃ形質転換酵母菌をグルコース
、ガラクトースを含まない培地にて通常の培養条件下に
前培養し、対数増殖期に培養液にガラクトースを加えて
ガラクトキナーゼプロモーターが作動する条件下に培養
する。培養後、常法により集隋し、溶菌処理し、所望の
ＨＲｓＡｇを多量に含むｎ菌液を得る。
産上記の方法で得らｎ７ｃ形質転換酵母菌をグルコース
、ガラクトースを含まない培地にて通常の培養条件下に
前培養し、対数増殖期に培養液にガラクトースを加えて
ガラクトキナーゼプロモーターが作動する条件下に培養
する。培養後、常法により集隋し、溶菌処理し、所望の
ＨＲｓＡｇを多量に含むｎ菌液を得る。
この溶菌液を例えば／ ｊ、０００ ｒ、ｐ、ｍ、、
／ ０分遠心して得らｎ７’ｃ上清について、更に超遠
心による分画や、抗体を用いたアフイニテイクロマトグ
本発明の方法で得らｎるＨＢａＡｇは免疫学的にヒト血
清から得らｎるものと全く同一であり、ヒト血清による
ものと同様にしてＨＢＶ用ワクチンとして有用である。
／ ０分遠心して得らｎ７’ｃ上清について、更に超遠
心による分画や、抗体を用いたアフイニテイクロマトグ
本発明の方法で得らｎるＨＢａＡｇは免疫学的にヒト血
清から得らｎるものと全く同一であり、ヒト血清による
ものと同様にしてＨＢＶ用ワクチンとして有用である。
つぎに実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
実施例１
（１）１団ＶＤＮＡの調製
（１） ウィルスＤＮＡの調製
ＨＢｓ抗原、 ＨＲｅ抗原共に陽性の供血者（血清型ａ
ｄｒ）からのヒト血Ｍｉｔｔ人分のプール、ｉｏｏ。
ｄｒ）からのヒト血Ｍｉｔｔ人分のプール、ｉｏｏ。
ｍ’に４℃で１０１００００ｒｐ久保田Ｒ１）、７！Ｏ
分間遠心し、不溶物を除去した。上ｍｋベックマン！
０．／ ａ−ターで弘℃にて２よ０００ｒｐｍ、２０時
間遠心して沈渣ｆ３０−の緩衝液Ａ（１０ｍＭ ？リス
塩酸、 ｐＨ７４、０，／ ＭＮａＯｌ、 ／ｍＭＥＤ
ＴＡＪに溶解させた。ｊＯｍｌ容の遠心管に底部から５
０％。
分間遠心し、不溶物を除去した。上ｍｋベックマン！
０．／ ａ−ターで弘℃にて２よ０００ｒｐｍ、２０時
間遠心して沈渣ｆ３０−の緩衝液Ａ（１０ｍＭ ？リス
塩酸、 ｐＨ７４、０，／ ＭＮａＯｌ、 ／ｍＭＥＤ
ＴＡＪに溶解させた。ｊＯｍｌ容の遠心管に底部から５
０％。
ｕＯｔ４．３０％及び２０ ％ （ｗ／ｖ〕のｌ１ｆｉ
に緩衝液Ａに溶解した蔗糖液を各ｉｏｄずつ！ＲｆＩＬ
だ頂部に先の試料１０ｍｔｆ重層し、ベックマンＳＷ
Ｊ ｊローターにて４℃で２仏０００ｒｐｍ、７１時間
遠心した。３−ずつに分画し、後述する方法でウィルス
粒子を含む両分を集めた。このプール全緩衝液Ｎにて約
ｒ倍に希釈した後、ペックマンｊ Ｏ，７０−ターで弘
℃にてλ！０００ｒｐｍ、コＯ時間遠心して沈渣ｆｃｊ
ｄの緩衝液Ｎｋ溶解した。この溶液にメトリズアミＦ”
（ｍｅｔｒｉｚａｍｉｄｅ）ｆ加えて屈折率を／、４
Ｌ、２ ／ ０に調整した。底部から屈折率１．弘１３
コ。
に緩衝液Ａに溶解した蔗糖液を各ｉｏｄずつ！ＲｆＩＬ
だ頂部に先の試料１０ｍｔｆ重層し、ベックマンＳＷ
Ｊ ｊローターにて４℃で２仏０００ｒｐｍ、７１時間
遠心した。３−ずつに分画し、後述する方法でウィルス
粒子を含む両分を集めた。このプール全緩衝液Ｎにて約
ｒ倍に希釈した後、ペックマンｊ Ｏ，７０−ターで弘
℃にてλ！０００ｒｐｍ、コＯ時間遠心して沈渣ｆｃｊ
ｄの緩衝液Ｎｋ溶解した。この溶液にメトリズアミＦ”
（ｍｅｔｒｉｚａｍｉｄｅ）ｆ加えて屈折率を／、４
Ｌ、２ ／ ０に調整した。底部から屈折率１．弘１３
コ。
／、３ｒｔＯ，及び／、３４ Ｊ Ｏに調整し７（メト
リスアミド溶液（緩衝液ＡＫ酸溶解全容ｌｄずつ重層し
’ｆｃ！ａｔ容の遠心管の最下層に先の溶液をシリンジ
Ｃ注ｔｌ込みペックマン６３０−ターテμ℃。
リスアミド溶液（緩衝液ＡＫ酸溶解全容ｌｄずつ重層し
’ｆｃ！ａｔ容の遠心管の最下層に先の溶液をシリンジ
Ｃ注ｔｌ込みペックマン６３０−ターテμ℃。
≠１１００Ｏｒｐ、／７．ｊ時間遠心分離を行なった。
０、−２７ずつ分画して、前記と同様の方法によりウィ
ルス粒子金倉む画分金集めた。のちの操作を容易にする
ために、この）１８Ｖ粒子について、 Ｉ（ＢＶのもつ
ＤＮＡポリメラーゼによる反応を以下のように行なった
。即ち、 ｊ ＯｍＭト１３ス塩酸（ｐＨ７，ψン。
ルス粒子金倉む画分金集めた。のちの操作を容易にする
ために、この）１８Ｖ粒子について、 Ｉ（ＢＶのもつ
ＤＮＡポリメラーゼによる反応を以下のように行なった
。即ち、 ｊ ＯｍＭト１３ス塩酸（ｐＨ７，ψン。
２０ ｍＭＭｇＯ４２，３ｍＭジチオスレイトール、７
％／ニデットｐ ４ｔＯ（ＮＰ４１０ 、８ ｈ ｅ
Ｊ Ｉ社製］、それぞれｉｏｏｐＭのｄＯＴＰ（デオキ
シシチジントリホスフエートＪ、ｄＧＴＰ（デオギシグ
アノシントリホスフエー） ）、 ｄＴＴＰ （デオ牛
シチミジントリホスフエートフ及びコ０７７Ｍ ［：
Ｈ］ｄＡＴＰ （デオキシアデノシントリホスフェ−ト
ノの混せ液にウィルス粒子Ｍ濁液を加え全量ｋｃａｌと
して３７℃にて４Ｌ時間反応を行なった。これにキャリ
アーとして。
％／ニデットｐ ４ｔＯ（ＮＰ４１０ 、８ ｈ ｅ
Ｊ Ｉ社製］、それぞれｉｏｏｐＭのｄＯＴＰ（デオキ
シシチジントリホスフエートＪ、ｄＧＴＰ（デオギシグ
アノシントリホスフエー） ）、 ｄＴＴＰ （デオ牛
シチミジントリホスフエートフ及びコ０７７Ｍ ［：
Ｈ］ｄＡＴＰ （デオキシアデノシントリホスフェ−ト
ノの混せ液にウィルス粒子Ｍ濁液を加え全量ｋｃａｌと
して３７℃にて４Ｌ時間反応を行なった。これにキャリ
アーとして。
酵母トランスファーＲＮＡを１００μ？加え１次いでＤ
ＮＡに強く結付している蛋白質を消化するために＋１Ｈ
１１１１／岬／ｍｔになるようにゾロティデーゼＫ（Ｓ
Ｊｇｍｓ社製）を加えて３７℃３０分間インキュベート
した。終了後、終濃度がそれぞれ／４，１０ｍＭになる
ように８Ｄ８及び２−メルカプトエタノールｌｎえ３７
℃で１時間インキュベートシタ。
ＮＡに強く結付している蛋白質を消化するために＋１Ｈ
１１１１／岬／ｍｔになるようにゾロティデーゼＫ（Ｓ
Ｊｇｍｓ社製）を加えて３７℃３０分間インキュベート
した。終了後、終濃度がそれぞれ／４，１０ｍＭになる
ように８Ｄ８及び２−メルカプトエタノールｌｎえ３７
℃で１時間インキュベートシタ。
次いで終＠ｆＯ０／％のザルコシルを加えた後。
ＴＥ（１０ｍＭ トリス塩酸、 ｐ）（７，’Ａ 、
／ｍＭＥＤＴＡ）−飽和フェノールで常法に従って除蛋
白質金行ない。
／ｍＭＥＤＴＡ）−飽和フェノールで常法に従って除蛋
白質金行ない。
エタノール沈殿させた。得られた沈渣を１００７７ｔの
ＴＥ Ｐ！″溶解後、ＴＲで充填したセファデックスａ
−ｔｏｏによるゲル濾過を行なって素通りする画分を集
め、これに３０７１９の酵母トランスファーＲＮＡを加
えて、再度エタノール沈殿した。得ら九た沈渣が）（Ｒ
Ｖｒ）ＮＡであジ、こｎ全量に溶かして保存した。
ＴＥ Ｐ！″溶解後、ＴＲで充填したセファデックスａ
−ｔｏｏによるゲル濾過を行なって素通りする画分を集
め、これに３０７１９の酵母トランスファーＲＮＡを加
えて、再度エタノール沈殿した。得ら九た沈渣が）（Ｒ
Ｖｒ）ＮＡであジ、こｎ全量に溶かして保存した。
（ｌｉ） ＨＢＶＤＮＡのクローンｆヒ前記（１）の
方法で調製され次層状二本鎖のＨＲＶＤＮＡ全下記のよ
うに公知のプラスミドル８Ｒ３２２ｆベクターとしてク
ローン化した。
方法で調製され次層状二本鎖のＨＲＶＤＮＡ全下記のよ
うに公知のプラスミドル８Ｒ３２２ｆベクターとしてク
ローン化した。
即ち、＠記（１）で得７ｃ１４［（ＶＤＮＡの／ ００
ｐｆｔ−４ｍＭト リス塩酸（ｐＨ７，タ ］、
ＡｍＭＭｇＯｔ２ 、 ／ ｊ ＯｍＭＮａｉｌの混
液２０μを中にて３Ｑ単位の制限酵素ＢａｍＨＩにより
３７℃、μ時間処理した後、ＴＥ飽和フェノールλＱＯ
μｔに抽出し１次いでエーテル抽出後、その水〜に一〇
μりの酵母トランスファーＲＮＡ、 ２，１倍容量の冷
エタノールヲ加えてＲａｍＨＩ開裂ＤＮＡを沈殿させた
。この混液′ｊｔ−７０℃で２時間保持したのち、／ｊ
０００ｒｐｍにて、１０分間遠心分離して沈殿する）１
８ＶＤＮＡのＢ ａ ｍ ＨＩ開裂ＤＮＡを回収した。
ｐｆｔ−４ｍＭト リス塩酸（ｐＨ７，タ ］、
ＡｍＭＭｇＯｔ２ 、 ／ ｊ ＯｍＭＮａｉｌの混
液２０μを中にて３Ｑ単位の制限酵素ＢａｍＨＩにより
３７℃、μ時間処理した後、ＴＥ飽和フェノールλＱＯ
μｔに抽出し１次いでエーテル抽出後、その水〜に一〇
μりの酵母トランスファーＲＮＡ、 ２，１倍容量の冷
エタノールヲ加えてＲａｍＨＩ開裂ＤＮＡを沈殿させた
。この混液′ｊｔ−７０℃で２時間保持したのち、／ｊ
０００ｒｐｍにて、１０分間遠心分離して沈殿する）１
８ＶＤＮＡのＢ ａ ｍ ＨＩ開裂ＤＮＡを回収した。
分離した沈渣（ＢａｍＨＩ開裂ＤＮｋ）をＴＥｊａ／に
溶解させた。次いでこのＨＲＶＤＮＡと等モル量のプラ
スミドｐｓａ、ｙｘＪを前記とｆｉｆｆ］ｍの手法ｖｃ
テＩＩＩ ［＃素Ｒａｍｊ−１１を作用させることに
より開裂させた。得らｆＬだプラスミドｐＢＲ，ｊ、２
コＤＮＡのＲａｍＨＩ開裂ＤＮＡ鎖と、上記の如くして
得られた１（ＢＶＤＮＡのＲａｍＨＩ開裂ＤＮＡ鎖との
両者１−混せしてｊ ＯｍＭ ）リス塩酸（ｐｌ（’７
．ｇハ ／ Ｏｍ Ｍ Ｍ ｆ Ｏｔ２ 。
溶解させた。次いでこのＨＲＶＤＮＡと等モル量のプラ
スミドｐｓａ、ｙｘＪを前記とｆｉｆｆ］ｍの手法ｖｃ
テＩＩＩ ［＃素Ｒａｍｊ−１１を作用させることに
より開裂させた。得らｆＬだプラスミドｐＢＲ，ｊ、２
コＤＮＡのＲａｍＨＩ開裂ＤＮＡ鎖と、上記の如くして
得られた１（ＢＶＤＮＡのＲａｍＨＩ開裂ＤＮＡ鎖との
両者１−混せしてｊ ＯｍＭ ）リス塩酸（ｐｌ（’７
．ｇハ ／ Ｏｍ Ｍ Ｍ ｆ Ｏｔ２ 。
１０ｍＭジｆ オスＬ／イトール、 ７００８９／ｌ
ｄ＋血清アルブミン、 ＯＪ ｍＭ ＡＴＰ ｔ−含む
１ｏｐｌの反応液中でＴ≠ＤＮ入りガーゼをμ℃、１時
間作用させて結付反応させた。この反応混せ液を前記と
同様にしテ順次フェノール及びエーテル抽出、更にエタ
ノール沈殿に付すると、得らｔＮた沈渣は、プラスミド
ｐＢＲ，Ｊ２２ ＤＮＡのＢａｍＨＩ 開裂ＤＮＡ鎖
とＨＢＶＤＮＡのＢａｍＨＩ開裂ＤＮＡ鎖との結合反応
生成物（混成状態である夕である。こｎ ｉ ＴＥ／
０μを中に溶解させて保存した。
ｄ＋血清アルブミン、 ＯＪ ｍＭ ＡＴＰ ｔ−含む
１ｏｐｌの反応液中でＴ≠ＤＮ入りガーゼをμ℃、１時
間作用させて結付反応させた。この反応混せ液を前記と
同様にしテ順次フェノール及びエーテル抽出、更にエタ
ノール沈殿に付すると、得らｔＮた沈渣は、プラスミド
ｐＢＲ，Ｊ２２ ＤＮＡのＢａｍＨＩ 開裂ＤＮＡ鎖
とＨＢＶＤＮＡのＢａｍＨＩ開裂ＤＮＡ鎖との結合反応
生成物（混成状態である夕である。こｎ ｉ ＴＥ／
０μを中に溶解させて保存した。
大腸菌ＨＢＩＯｌの培養液を［メソッド・イン・エンザ
イモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄａ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ月７ｒ巻３コ１ｘ−３３／頁に記載の方法で処理、
調製された菌液θ、ｌ−に対して、上記アニールさ：ｎ
７ｃＤＮＡ調製物（即ち、前記の結合反応生成物として
得られた組換えＤＮすｔｏｔｔｔを加えてよく混付させ
、０℃でグＯ分間時々混せしながら放置した後。
イモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄａ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ月７ｒ巻３コ１ｘ−３３／頁に記載の方法で処理、
調製された菌液θ、ｌ−に対して、上記アニールさ：ｎ
７ｃＤＮＡ調製物（即ち、前記の結合反応生成物として
得られた組換えＤＮすｔｏｔｔｔを加えてよく混付させ
、０℃でグＯ分間時々混せしながら放置した後。
≠λ℃、２分間加温し罠。次いで≠ｄのＬ培地（トリプ
トン１％、酵母エキス０．３％１食塩／％。
トン１％、酵母エキス０．３％１食塩／％。
ｐＨ７，０） ｆ加えて更に゛１時間、３７℃で加温す
る。
る。
この間に、大腸菌ＨＢ１０／細胞は上記の組換えＤＮＡ
を取り込んで形質転換したものが生成さｆＬ７Ｃ０この
ように処理さｔ″Ｌ７ｃＬ７ｃ菌液シリン−２ｊμ？鷹
を添加したＬ寒天平板上に塗沫して３７℃で一夜培養し
た。出現した７０ニ−ｆ／個ずつツマ楊子で釣り上げ、
テトラサイクリン（１０１ｔｆ□）及ヒアンビシリン（
２３μｆ／ａｔ） ｋ含むＬ寒天平板上にそれぞｎ対応
させて塗沫し、アンピシリン上でのみ増殖したコロニー
を選択する。プラスミドｐ８ＲＪλλはアンピシリン耐
性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を有しているが
テトラサイクリン耐性遺伝子中にあるＲａｍＨＩ部位に
ＨＢＶＤＮＡが挿入さｆ′Ｌ７ｃことにより、テトラサ
イクリン耐性が消失するので、上記の組換えＤＮＡ１取
り込んで形質転換された大腸菌細胞はテトラサイクリン
耐性ｔ−示さないのでテトラサイクリン含有培地では死
滅する。このようにして選択さｎ７（コロニーはｐ Ｂ
ＲＪ ２２ ＤＮＡ −ＨＲＶＤＮＡ トいう組換え
ＤＮＡ１保持している。このように選択されたコロニー
数個を用いて「Ａｎａｌｙ目ｃａｌ Ｒ４ｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙＪ ／ ／ ４１巻。
を取り込んで形質転換したものが生成さｆＬ７Ｃ０この
ように処理さｔ″Ｌ７ｃＬ７ｃ菌液シリン−２ｊμ？鷹
を添加したＬ寒天平板上に塗沫して３７℃で一夜培養し
た。出現した７０ニ−ｆ／個ずつツマ楊子で釣り上げ、
テトラサイクリン（１０１ｔｆ□）及ヒアンビシリン（
２３μｆ／ａｔ） ｋ含むＬ寒天平板上にそれぞｎ対応
させて塗沫し、アンピシリン上でのみ増殖したコロニー
を選択する。プラスミドｐ８ＲＪλλはアンピシリン耐
性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を有しているが
テトラサイクリン耐性遺伝子中にあるＲａｍＨＩ部位に
ＨＢＶＤＮＡが挿入さｆ′Ｌ７ｃことにより、テトラサ
イクリン耐性が消失するので、上記の組換えＤＮＡ１取
り込んで形質転換された大腸菌細胞はテトラサイクリン
耐性ｔ−示さないのでテトラサイクリン含有培地では死
滅する。このようにして選択さｎ７（コロニーはｐ Ｂ
ＲＪ ２２ ＤＮＡ −ＨＲＶＤＮＡ トいう組換え
ＤＮＡ１保持している。このように選択されたコロニー
数個を用いて「Ａｎａｌｙ目ｃａｌ Ｒ４ｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙＪ ／ ／ ４１巻。
ｌり３頁、（／りｒｉ）に記載される方法に従つ。
てプラスミドをｖＩ４製しに０
（コ） 発現用シャトルベクターの調製（１） シャ
トルベクターＹＲｐ７”ＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ開裂断片の調製公知の大腸菌・酵母シャトル・ベクタ
ーのプラスミドＹＲｐ７ （Ｇｅｎｅ 、／ ０巻、
／７７−／ｊ４頁、／ ５’ Ｊ’ ／ ） ７０１１
ｆｆＡ ＯｍＭトリス塩ｎ （ｐＨ７，２） 、／ ｊ
ＯｍＭＮａｏ６、 ６ ｍＭＭｇｏｔ２の混付液１０
０μを中にて制限酵素ＢａｍＨＩコＯ単位を加え。
トルベクターＹＲｐ７”ＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ開裂断片の調製公知の大腸菌・酵母シャトル・ベクタ
ーのプラスミドＹＲｐ７ （Ｇｅｎｅ 、／ ０巻、
／７７−／ｊ４頁、／ ５’ Ｊ’ ／ ） ７０１１
ｆｆＡ ＯｍＭトリス塩ｎ （ｐＨ７，２） 、／ ｊ
ＯｍＭＮａｏ６、 ６ ｍＭＭｇｏｔ２の混付液１０
０μを中にて制限酵素ＢａｍＨＩコＯ単位を加え。
３７℃で４時間反応させた。この反応混せ液を等量のフ
ェノールｔクロロホルム（／：／）にて抽出し、次いで
エーテル処理後、その水層にｌ／り量の２０％酢酸ナト
リウム（ｐＨ１，３） ｋ加え、更にその混せ液の２０
．を倍量の冷エタノール金加えた。
ェノールｔクロロホルム（／：／）にて抽出し、次いで
エーテル処理後、その水層にｌ／り量の２０％酢酸ナト
リウム（ｐＨ１，３） ｋ加え、更にその混せ液の２０
．を倍量の冷エタノール金加えた。
この混曾液″ｆｔ−７０℃で１時間冷却した後／！００
０ｒｐｍにて２．３分間遠心して沈殿するＤＮＡ（プラ
スミドＹＲｐ７”ＤＮＡのＢａｍＨＩ開裂断片）を回収
した。
０ｒｐｍにて２．３分間遠心して沈殿するＤＮＡ（プラ
スミドＹＲｐ７”ＤＮＡのＢａｍＨＩ開裂断片）を回収
した。
このようにして得たＤＮＡｔ−次に制限酵素ＥｃｏＲＩ
で処理することになるが、この断片に＃：ｔＥｃｏＲＩ
切断部位がコケ所存在するために穏やかな条件で処゛理
し、コケ所とも光音に切断されないよう罠注意し友。即
ち、上記で得らｆＬ？ｃ ＹＲｐ７” ＤＮＡ Ｂａｍ
ＨＩ開裂断片ｆ！ＯｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７，ｒ
） 、 １００ｍＭ Ｎａ１ｌ、 ７ ｍＭＮａＯＬ２
、７ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、ｏ、ｏｉ％
ウシ血清アルブミンの混せ液１０μを中にて制限酵素Ｂ
ｃｏＲＩ ／ ｏ単位を加え、３７℃で３０分間反応さ
せた。この反応液ｆＯ，り係アガロースゲル電気泳動に
かけ、エチジウムプロミドで染色後、！、Ｊ Ｊ ｋｂ
ｐのＹＲｐ ７”−Ｂｅ ｏＲＩ ・ＢａｍＨＩ開裂断
片をゲルごと切り出し罠。このゲル断片を透析チューブ
にＴＢと共に入れ、電気泳動檜中でＤＮＡ’１Ｔ１１ｉ
！中に溶出させた後、 ＴＥ浴溶液みを取り出し、水飽
和フェノールで抽出し、アガロースとエチジウムプロミ
ドを除去した。１８層をλ−ブタノールで濃縮した後、
エタノール沈殿させ、ｊ、３コｋｂｐの大きさをもつＹ
ＦＬｐ７”ＤＮＡ のＢａｍＨＩ −ＥｃｏＲＩ開裂断
片を得た。
で処理することになるが、この断片に＃：ｔＥｃｏＲＩ
切断部位がコケ所存在するために穏やかな条件で処゛理
し、コケ所とも光音に切断されないよう罠注意し友。即
ち、上記で得らｆＬ？ｃ ＹＲｐ７” ＤＮＡ Ｂａｍ
ＨＩ開裂断片ｆ！ＯｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７，ｒ
） 、 １００ｍＭ Ｎａ１ｌ、 ７ ｍＭＮａＯＬ２
、７ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、ｏ、ｏｉ％
ウシ血清アルブミンの混せ液１０μを中にて制限酵素Ｂ
ｃｏＲＩ ／ ｏ単位を加え、３７℃で３０分間反応さ
せた。この反応液ｆＯ，り係アガロースゲル電気泳動に
かけ、エチジウムプロミドで染色後、！、Ｊ Ｊ ｋｂ
ｐのＹＲｐ ７”−Ｂｅ ｏＲＩ ・ＢａｍＨＩ開裂断
片をゲルごと切り出し罠。このゲル断片を透析チューブ
にＴＢと共に入れ、電気泳動檜中でＤＮＡ’１Ｔ１１ｉ
！中に溶出させた後、 ＴＥ浴溶液みを取り出し、水飽
和フェノールで抽出し、アガロースとエチジウムプロミ
ドを除去した。１８層をλ−ブタノールで濃縮した後、
エタノール沈殿させ、ｊ、３コｋｂｐの大きさをもつＹ
ＦＬｐ７”ＤＮＡ のＢａｍＨＩ −ＥｃｏＲＩ開裂断
片を得た。
（１］） プラスミドｐＢＭ／２ｊからＧＡＬ／プロ
モーター頒域の調製 公知のプラスミドｐＢＭ／２ｊ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄＯａ目ｕｌａｒ Ｉｌｉｏｌｏｇｙ ４ｌ巻
、ｌ弘ａｏ−〆１す。
モーター頒域の調製 公知のプラスミドｐＢＭ／２ｊ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄＯａ目ｕｌａｒ Ｉｌｉｏｌｏｇｙ ４ｌ巻
、ｌ弘ａｏ−〆１す。
１２♂１４ ） Ｉ） ／ Ｏｏ／ｌｆｆ ／ ＯｍＭ
ｈリス塩酸ＣｐＨ７，３） 、 ／ ０
０ ｍＭＮａＯＬ 、 ／ ＯｍＭＭＰＯｔ２
、 １ｍＭジチオスレイトールの混せ液７００ｐｔ中
にて制限酵素ＥｃｏＲＩ／を単位及び制限酵素８ａｍＨ
Ｉ２０単位を加え、３７℃で６時間反応させた。この反
応液全１．θ憾アガロースゲル電気泳１ｔＪＶｃかけＧ
ＡＬ／プロモーター領域を含むＯＪ ２ ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片を前項Ｇ２）（＋）で述べた方法に従い分離した
。
ｈリス塩酸ＣｐＨ７，３） 、 ／ ０
０ ｍＭＮａＯＬ 、 ／ ＯｍＭＭＰＯｔ２
、 １ｍＭジチオスレイトールの混せ液７００ｐｔ中
にて制限酵素ＥｃｏＲＩ／を単位及び制限酵素８ａｍＨ
Ｉ２０単位を加え、３７℃で６時間反応させた。この反
応液全１．θ憾アガロースゲル電気泳１ｔＪＶｃかけＧ
ＡＬ／プロモーター領域を含むＯＪ ２ ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片を前項Ｇ２）（＋）で述べた方法に従い分離した
。
ＧｉＤ ＧＡＬ／ フロモーターが組込まｉ７（シャ
トルベクターの調製 前項（−２）（＋）で得られ７ＣＹＲｐ７” ブラスミ
ｈ−ＤＮｈノＢｃｏＲＩ−ＲａｍｆｌＩ開裂断片１００
ｎ？トｆｆ１Ｊ項（ｚ） （ｉ）でＧＡＬ／ ニア”ロ
モーター領域金含むＤＮＡ断片として得られ７’ｅｐＢ
Ｍ／λ！プラスミドＤＮ入のｇｃｏＲＩ −１４ａｒｎ
ＨＩ開裂断片コｏｏｎｙとｔ−ｊ ＯｍＭ トリス塩酸
（ｐ）Ｉ ７．ｔ） 。
トルベクターの調製 前項（−２）（＋）で得られ７ＣＹＲｐ７” ブラスミ
ｈ−ＤＮｈノＢｃｏＲＩ−ＲａｍｆｌＩ開裂断片１００
ｎ？トｆｆ１Ｊ項（ｚ） （ｉ）でＧＡＬ／ ニア”ロ
モーター領域金含むＤＮＡ断片として得られ７’ｅｐＢ
Ｍ／λ！プラスミドＤＮ入のｇｃｏＲＩ −１４ａｒｎ
ＨＩ開裂断片コｏｏｎｙとｔ−ｊ ＯｍＭ トリス塩酸
（ｐ）Ｉ ７．ｔ） 。
／ （１７ｍＭＭｔｏ！−２、／ ＯｍＭジチオスレイ
トール、０．！ｍＭＡＴＰの混付液コθｌＩｔ中にて’
ｐｐリガーゼｏ、ｉ単位を加えて７６℃でｉｏ時間反応
させて桔甘させ次。この反応溶液に最終濃度が０．／
ＭになるようにＯｔ＋ Ｏ１２を加え、さらに大腸菌Ｈ
Ｂ ／ ０ ／株のコンピテントセル（「Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ ｇｎｚｙｍｏｌｏｇｙＪ ｔ Ｊ’ ＠。
トール、０．！ｍＭＡＴＰの混付液コθｌＩｔ中にて’
ｐｐリガーゼｏ、ｉ単位を加えて７６℃でｉｏ時間反応
させて桔甘させ次。この反応溶液に最終濃度が０．／
ＭになるようにＯｔ＋ Ｏ１２を加え、さらに大腸菌Ｈ
Ｂ ／ ０ ／株のコンピテントセル（「Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ ｇｎｚｙｍｏｌｏｇｙＪ ｔ Ｊ’ ＠。
３２４−Ｊ２ＩＱ、／９１０）２００Ｂｔｋ加Ｌ＊氷中
で７時間保持したのちグコ℃で２分間反応させた。この
菌液にＬ培地／Ｊｍｌ−を加え３７℃で１時間培養し友
。この菌液をアンピシリン（２！μＰ／ｍＰ ）含有の
Ｌ寒天平板にまき、３７℃でｌ１時間培養し、寒天平板
上に現わｎたコロニーヲ採取し。
で７時間保持したのちグコ℃で２分間反応させた。この
菌液にＬ培地／Ｊｍｌ−を加え３７℃で１時間培養し友
。この菌液をアンピシリン（２！μＰ／ｍＰ ）含有の
Ｌ寒天平板にまき、３７℃でｌ１時間培養し、寒天平板
上に現わｎたコロニーヲ採取し。
た。こレラのコロニー全各々アンピシリン（Ｊｊμｆ／
ｍｅ）ｔ−含むＬ培地で培養後、 Ｐｌａｓｍｉｄ、
／ ２巻、ｌター３４頁、ｔＰｒ＆に記載さｎる方法
に苺°つてプラスミド？抽出し罠。こｎら’１ＥｃｏＲ
ＩやＢａｍＨＩ などの制限酵素で処理しその切断ノ
ミターンを分析することによジ、シャトルベクターＹＲ
ｐ７”にＧＡＬ／プロモーター領域が挿入された組換え
ＤＮＡを選択し罠。こｎをプラスミドｌ） ＹＧ １０
／と命名した。
ｍｅ）ｔ−含むＬ培地で培養後、 Ｐｌａｓｍｉｄ、
／ ２巻、ｌター３４頁、ｔＰｒ＆に記載さｎる方法
に苺°つてプラスミド？抽出し罠。こｎら’１ＥｃｏＲ
ＩやＢａｍＨＩ などの制限酵素で処理しその切断ノ
ミターンを分析することによジ、シャトルベクターＹＲ
ｐ７”にＧＡＬ／プロモーター領域が挿入された組換え
ＤＮＡを選択し罠。こｎをプラスミドｌ） ＹＧ １０
／と命名した。
Ｑ９２μｍＤＮＡ複製開始領域−ｐ ＹＱ ／ ０ ／
組換えＤＮＡの調製 前項０ｉｔｌで得られたプラスミドｐ ＹＧ ／ ０
／はＩＥ：ｃｏＲＪ部位をコケ所持っているため、穏や
かにル１ｊ限溝素。
組換えＤＮＡの調製 前項０ｉｔｌで得られたプラスミドｐ ＹＧ ／ ０
／はＩＥ：ｃｏＲＪ部位をコケ所持っているため、穏や
かにル１ｊ限溝素。
Ｐ： ｃ ｏ ＲＩで処理した。即ち、 ｐＹＧ１０／
のＪＯｌｌｆ’ｆｒｊＯｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７，
ｊ ） 、 ／ ００ｍＭ Ｎａ０ｔ。
のＪＯｌｌｆ’ｆｒｊＯｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７，
ｊ ） 、 ／ ００ｍＭ Ｎａ０ｔ。
７ｍＭＭｔＣ１２，７ｎ＋Ｍｕ−メルヵゾトエタノール
。
。
０、／チラシ血清アルブミンの掛合′ｏ、３０μを中に
て制限酵素ｇｃｏＲＩ／θ単位金加え、３７℃で３００
分間反応せた。この反応液を０．７ ％アガロースゲル
電気泳動にかけ、Ｊ、／ Ｊ ｋｂｐのｒ）Ｎ＾断片（
ｐｙ。
て制限酵素ｇｃｏＲＩ／θ単位金加え、３７℃で３００
分間反応せた。この反応液を０．７ ％アガロースゲル
電気泳動にかけ、Ｊ、／ Ｊ ｋｂｐのｒ）Ｎ＾断片（
ｐｙ。
１０／のＥｅ ｏＲＩ開裂断片）ｋ前項（２）（ｆ）の
方法に従って回収した。このようにして分離し７ＣＤＮ
Ａ’ｉｉ７２００ｍＭヘペス（Ｎ−コーヒドロキシビペ
ラジンーＮ−コーエタンスルホン酸）（ｐＨＪ、ｌｒ）
、／ ＯｍＭＭｇＯ１２、／ ＯｍＭジチオスレイトー
ル、そｎ −ｆ ｇｏ、２ｍＭのｄＡＴＰ−ｄＧＴＰ−
ｄＯＴ’Ｐ−ｄ’ｒＴＰ１７）混當液１００１Ｉｔ中に
てクレノー断片３単位ｔｌ−加え、７３℃で２時間反応
させ、制限酵素Ｅｃ ｏＩＬＩによって開裂されたｐ
ＹＧ ／ ０ ／の末端部位を修復し、平滑末端とした
。この反応溶液全フェノール・クロロホル、Ｉ！、（／
：／Ｊ抽出、エーテル処理及びエタノール沈殿に付し、
平滑末端となつ７ｃ Ｉ）ＹＧ／１１；ｌ／ ＥｃｏＲ
Ｉ開裂断片（Ａ）を分離した。
方法に従って回収した。このようにして分離し７ＣＤＮ
Ａ’ｉｉ７２００ｍＭヘペス（Ｎ−コーヒドロキシビペ
ラジンーＮ−コーエタンスルホン酸）（ｐＨＪ、ｌｒ）
、／ ＯｍＭＭｇＯ１２、／ ＯｍＭジチオスレイトー
ル、そｎ −ｆ ｇｏ、２ｍＭのｄＡＴＰ−ｄＧＴＰ−
ｄＯＴ’Ｐ−ｄ’ｒＴＰ１７）混當液１００１Ｉｔ中に
てクレノー断片３単位ｔｌ−加え、７３℃で２時間反応
させ、制限酵素Ｅｃ ｏＩＬＩによって開裂されたｐ
ＹＧ ／ ０ ／の末端部位を修復し、平滑末端とした
。この反応溶液全フェノール・クロロホル、Ｉ！、（／
：／Ｊ抽出、エーテル処理及びエタノール沈殿に付し、
平滑末端となつ７ｃ Ｉ）ＹＧ／１１；ｌ／ ＥｃｏＲ
Ｉ開裂断片（Ａ）を分離した。
ｍ−万、２μｍＤＮＡ 機製開始領域は、公知のプラス
ミドｐＢＴＩ−／より調製し７’Ｃ（ＤＮＡ、／巻、λ
７−３６頁、ｌりＩＩ）。プラスミドｐＢＴＩ−／ｊＯ
ｐｆｆ ／ ＯｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７，３） 、
／ ＯｍＭ ＭｇＯ２２。
ミドｐＢＴＩ−／より調製し７’Ｃ（ＤＮＡ、／巻、λ
７−３６頁、ｌりＩＩ）。プラスミドｐＢＴＩ−／ｊＯ
ｐｆｆ ／ ＯｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７，３） 、
／ ＯｍＭ ＭｇＯ２２。
ｊ ＯｍＭ ＮａＯ２，／ ｍＭジチオスレイトールの
混せ液／ ００ ｔｔＬ中にて制限酵素Ｈｉｎｄ［ｌ／
θ 単位と制限酵素ＰｓｔＩ ／ ｊ単位を加え、３７
℃で６時間反応させた。この反応液をＯ０ｒ値アガロー
スゲル電気泳切にかけ、／、りｋｂｐ（ＦＪＤＮＡ断片
を前項（，２）（＋）の方法により回収した。このよう
にして得らｆＬ７ＣＤＮＡ断片全３０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨμ、ｊハ／ ｍＭＺｎＯｔ２．ｊ ｊ ＯｍＭ
Ｎａｏｔの混曾液１０ｔｔＬ中にてＳ／ヌクレアーゼ弘
θ単位金加え、３７℃で３００分間反応せ、制限酵素Ｈ
ｉｎｄｌ及び制限酵素ＰｓｔＩによって開裂されｒｃ
ＤＮＡの末端部位を削り平滑末端とした。この反応液を
フェノール・クロロホルム（ｉ：ｉ）抽出、エーテル処
理及びエタノール沈殿に付し、平滑末端となった１、り
ｋｂｐ のｐＲＴＩ−／ Ｈｉｎｄｌｌ−Ｐｓ ｔ Ｉ
開裂断片（８）全分離した。
混せ液／ ００ ｔｔＬ中にて制限酵素Ｈｉｎｄ［ｌ／
θ 単位と制限酵素ＰｓｔＩ ／ ｊ単位を加え、３７
℃で６時間反応させた。この反応液をＯ０ｒ値アガロー
スゲル電気泳切にかけ、／、りｋｂｐ（ＦＪＤＮＡ断片
を前項（，２）（＋）の方法により回収した。このよう
にして得らｆＬ７ＣＤＮＡ断片全３０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨμ、ｊハ／ ｍＭＺｎＯｔ２．ｊ ｊ ＯｍＭ
Ｎａｏｔの混曾液１０ｔｔＬ中にてＳ／ヌクレアーゼ弘
θ単位金加え、３７℃で３００分間反応せ、制限酵素Ｈ
ｉｎｄｌ及び制限酵素ＰｓｔＩによって開裂されｒｃ
ＤＮＡの末端部位を削り平滑末端とした。この反応液を
フェノール・クロロホルム（ｉ：ｉ）抽出、エーテル処
理及びエタノール沈殿に付し、平滑末端となった１、り
ｋｂｐ のｐＲＴＩ−／ Ｈｉｎｄｌｌ−Ｐｓ ｔ Ｉ
開裂断片（８）全分離した。
上記のように傅らｎたＡ及びＢの両ＤＮＡ断片をそｎぞ
れ１００ｎｆ／及び／ｐｆと？前項（，２） （ｉｌｌ
）の反応混液コｏｔｔｔ中にてＴ弘すガーゼλ単位を加
えて連結し、前項（−２） （ｉｌｌで記した方法によ
り大）動画ｒＨ３１０／を形質転換した。イｔｊらｆ’
Ｌ７ｃ）し質転換体が保持するプラスミドを分析するこ
とにより、 ｐＹＧ１０／に１μｍ１）ＮＡ複製開始
領域が挿入さｉ１′ｃ組換えＤＮＡ選択し、こｎをプラ
スミドベクターｐＹＧ／１０と６？ｉ名し７ζ。
れ１００ｎｆ／及び／ｐｆと？前項（，２） （ｉｌｌ
）の反応混液コｏｔｔｔ中にてＴ弘すガーゼλ単位を加
えて連結し、前項（−２） （ｉｌｌで記した方法によ
り大）動画ｒＨ３１０／を形質転換した。イｔｊらｆ’
Ｌ７ｃ）し質転換体が保持するプラスミドを分析するこ
とにより、 ｐＹＧ１０／に１μｍ１）ＮＡ複製開始
領域が挿入さｉ１′ｃ組換えＤＮＡ選択し、こｎをプラ
スミドベクターｐＹＧ／１０と６？ｉ名し７ζ。
（Ｊ） ＨＲｓ Ａ ｇ遺伝子発現プラスミドの調製
（１） ＨＢｓＡｇ遺伝子断片が組込まｎたプラスミ
ドの調製 前述し罠プラスミドｐＨ８ル１０！１００μ？を１０ｍ
Ｍ）リス塩酸（ｐＨ７，ｊ ） 、 ／ ＯｍＭＭｆＯ
６２，ｊ ０ｍＭＮａ０１． ／ ｍＭジチオスレイ
トールの混曾液１００μを中にて制限酵素ＳｍｕｊＡＩ
／ Ｏ単位を加えて３７℃で２時間反応させに０次に
制限酵素Ｔｔｔ＋Ｈ８Ｊ’Ｉ１０単位を加えてＡｊ℃で
２時間反応させ罠。この反応混せ液ｆ／、２％アガロー
スゲル電気泳動によって／、／μｋｂｐのＨＦＩＶＤＮ
Ａ断片を前項−）（１）の方法に従って回収した。この
ようにして分離したＤＮＡ断片ｆ ２００ ｍＭヘベス
（ｐｉ（４Ｊ ） 、 ／ ＯｍＭＭｇＯｔ２ 、 ／
ＯｍＭジチオスレイトール、それぞｎＯ，２ｍＭ（７
） ｄ Ａ’ｌ’Ｐ ・ｄＧＴＰ−ｄ ｅＴＰ−ｄＴＴ
Ｐ（ｌｉ）混合液２０μを中にてクレノー断片ｌ単位を
加え、１６℃で１時間反応させることによって制限酵装
’ｌ’ｔｈＨＢｆＩ及び５ａｕＪＡＩで切断されたＤＮ
Ａ断芹の末端部位を修復し、平滑末端とした。この反応
液をフェノール・クロロホルム（／：／）及びエーテル
で順次抽出後エタノール沈殿に付し、 ＤＮ＾断片を沈
殿させｙｃ （０）。
（１） ＨＢｓＡｇ遺伝子断片が組込まｎたプラスミ
ドの調製 前述し罠プラスミドｐＨ８ル１０！１００μ？を１０ｍ
Ｍ）リス塩酸（ｐＨ７，ｊ ） 、 ／ ＯｍＭＭｆＯ
６２，ｊ ０ｍＭＮａ０１． ／ ｍＭジチオスレイ
トールの混曾液１００μを中にて制限酵素ＳｍｕｊＡＩ
／ Ｏ単位を加えて３７℃で２時間反応させに０次に
制限酵素Ｔｔｔ＋Ｈ８Ｊ’Ｉ１０単位を加えてＡｊ℃で
２時間反応させ罠。この反応混せ液ｆ／、２％アガロー
スゲル電気泳動によって／、／μｋｂｐのＨＦＩＶＤＮ
Ａ断片を前項−）（１）の方法に従って回収した。この
ようにして分離したＤＮＡ断片ｆ ２００ ｍＭヘベス
（ｐｉ（４Ｊ ） 、 ／ ＯｍＭＭｇＯｔ２ 、 ／
ＯｍＭジチオスレイトール、それぞｎＯ，２ｍＭ（７
） ｄ Ａ’ｌ’Ｐ ・ｄＧＴＰ−ｄ ｅＴＰ−ｄＴＴ
Ｐ（ｌｉ）混合液２０μを中にてクレノー断片ｌ単位を
加え、１６℃で１時間反応させることによって制限酵装
’ｌ’ｔｈＨＢｆＩ及び５ａｕＪＡＩで切断されたＤＮ
Ａ断芹の末端部位を修復し、平滑末端とした。この反応
液をフェノール・クロロホルム（／：／）及びエーテル
で順次抽出後エタノール沈殿に付し、 ＤＮ＾断片を沈
殿させｙｃ （０）。
一方前項（λ）（ｌψで得られたベクターｐＹＧ／／＋
７の１０ｔｔｆｆ ６０ ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７，
２〕、／ｊＯｍＭＮａＯ６、 ｔ ｍＭ ＭｔＯＬ２の
混せ液コＯμを中にて制限酵素ｔｌａｍＨＩ を単位を
加え３７℃で１時間反応させた。
７の１０ｔｔｆｆ ６０ ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７，
２〕、／ｊＯｍＭＮａＯ６、 ｔ ｍＭ ＭｔＯＬ２の
混せ液コＯμを中にて制限酵素ｔｌａｍＨＩ を単位を
加え３７℃で１時間反応させた。
この反応溶液を等量のフェノール・クロロホルム（／：
／）及びエーテルで順次抽出した後エタノール沈殿に付
した。次いでこのＢａｍＨＩ部位で開裂したｐ’（ＱＩ
ｌｏ ＤＮＡ断片ｆ ２００ ｍＭヘペス＜ｐＨ６、ｒ
ハ／ ＯｍＭＭｇｏｔ２ 、 ／ ＯｍＭジチオスレ
イトール、そ九ぞれ０．２ ｍＭのｄＡＴＰ−ｄＯＴＰ
−ｄＧＴ’Ｐ−ｄＴ′ｒＰの混。
／）及びエーテルで順次抽出した後エタノール沈殿に付
した。次いでこのＢａｍＨＩ部位で開裂したｐ’（ＱＩ
ｌｏ ＤＮＡ断片ｆ ２００ ｍＭヘペス＜ｐＨ６、ｒ
ハ／ ＯｍＭＭｇｏｔ２ 、 ／ ＯｍＭジチオスレ
イトール、そ九ぞれ０．２ ｍＭのｄＡＴＰ−ｄＯＴＰ
−ｄＧＴ’Ｐ−ｄＴ′ｒＰの混。
せ液２０μを中にてクレノー断片／単位を加え、 ７１
℃で２時間反応させ制限酵素ＲａｍＨＩによって生じた
ＤＮＡの末端部位全修復し、平滑末端とした。この反応
液をフェノール・クロロホルム（ｉ：ｉ）及びエーテル
で順次抽出した後、エタノール沈殿を行ない、平滑末端
になつ７ＣＩ） ＹＧ ／ ／ ０ （７） Ｂ ａｍ
ＨＩ開裂断片を回収した（Ｄ）。
℃で２時間反応させ制限酵素ＲａｍＨＩによって生じた
ＤＮＡの末端部位全修復し、平滑末端とした。この反応
液をフェノール・クロロホルム（ｉ：ｉ）及びエーテル
で順次抽出した後、エタノール沈殿を行ない、平滑末端
になつ７ＣＩ） ＹＧ ／ ／ ０ （７） Ｂ ａｍ
ＨＩ開裂断片を回収した（Ｄ）。
上記のように得られたＣ及びＤのＤＮ＾断片をそれぞｆ
ｉコμ？及びＯ０！μ２とを前項Ｑ）（１ゆの混合液２
０μを中にてＴμＤＮＡリガーゼｌ単位を加え、２０℃
で７ｔ時間反応させた。次いでこの反応混液を用いて前
項−団ｉ；の方法に従って大腸菌ＨＢｔｏｉ を形質
転換し、目的のクローンを選択した。選び出されたプラ
スミドは、 ｐＹＧ／１０のＧＡＬ／プロモーターの
下流にＨＢｓＡｇ遺伝子が正しい向きに挿入された組換
えプラスミドで、これをプラスミドｐＨＢｓ１０ＪＧと
命名した。その制限酵素地図を添付口面の第１図に示す
。
ｉコμ？及びＯ０！μ２とを前項Ｑ）（１ゆの混合液２
０μを中にてＴμＤＮＡリガーゼｌ単位を加え、２０℃
で７ｔ時間反応させた。次いでこの反応混液を用いて前
項−団ｉ；の方法に従って大腸菌ＨＢｔｏｉ を形質
転換し、目的のクローンを選択した。選び出されたプラ
スミドは、 ｐＹＧ／１０のＧＡＬ／プロモーターの
下流にＨＢｓＡｇ遺伝子が正しい向きに挿入された組換
えプラスミドで、これをプラスミドｐＨＢｓ１０ＪＧと
命名した。その制限酵素地図を添付口面の第１図に示す
。
（１１）プレＳ領域全含むＨＢｓＡｇ遺伝子断片刃；組
込ま７１だ発現プラスミドの調製 一前述１．ｙｔプラスミドｐＨＢＲ＃）ｔ １００ｔｉ
ｔ ｆ ｔｒｒＭトリス塩酸（ｐＨ７，タハ／ ！ Ｏ
ｍＭＮａＯ６、 ４ ｍＭＭｒＯｔ２ 。
込ま７１だ発現プラスミドの調製 一前述１．ｙｔプラスミドｐＨＢＲ＃）ｔ １００ｔｉ
ｔ ｆ ｔｒｒＭトリス塩酸（ｐＨ７，タハ／ ！ Ｏ
ｍＭＮａＯ６、 ４ ｍＭＭｒＯｔ２ 。
６ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００ＩＩ９／ｒｄ
ウシ血清アルブミンの混合液１００ｔｔｔ中にて佑１ｊ
限酵素ＲｓｔＢ［／ ０単位を加えて、ｔｏ℃で６時間
反応させた。この反応液をフェノール・クロロホルム（
／：／）抽出、エーテル処理及びエタノール沈殿に付し
た。このようにして回収しπＤＮ入断片を２００ ｍＭ
ヘペス（ｐＨＡ Ｊハ ／ ＯｍＭ Ｍ？ Ｏ４２、／
０ｍＭジチオスレイトール、それぞｔｌ、０．２ｍＭ
のｄＡＴＰ−ｄＧＴＰ−ｄＯＴＰ−ｄＴＴＰの混合液２
００μを中にてクレノー断片３単位を加えて、／、ｔ℃
で１時間反応させ、制限酵素ＢｓｔＥＩＩで開裂させた
ＤＮＡ断片の末端部位を修復し、平滑末端とした。この
反応液ラフエノール・クロロホルム（ｚ：／）抽出。
ウシ血清アルブミンの混合液１００ｔｔｔ中にて佑１ｊ
限酵素ＲｓｔＢ［／ ０単位を加えて、ｔｏ℃で６時間
反応させた。この反応液をフェノール・クロロホルム（
／：／）抽出、エーテル処理及びエタノール沈殿に付し
た。このようにして回収しπＤＮ入断片を２００ ｍＭ
ヘペス（ｐＨＡ Ｊハ ／ ＯｍＭ Ｍ？ Ｏ４２、／
０ｍＭジチオスレイトール、それぞｔｌ、０．２ｍＭ
のｄＡＴＰ−ｄＧＴＰ−ｄＯＴＰ−ｄＴＴＰの混合液２
００μを中にてクレノー断片３単位を加えて、／、ｔ℃
で１時間反応させ、制限酵素ＢｓｔＥＩＩで開裂させた
ＤＮＡ断片の末端部位を修復し、平滑末端とした。この
反応液ラフエノール・クロロホルム（ｚ：／）抽出。
エーテル処理及びエタノール沈殿に付した。回収しｚ
ＤＮ＆断片ｆ ／ ＯｍＭ） ＩＪス塩酸（ｐ）（７，
ｊ）、／ ００ ｍＭＮａＯ６、 ７ ｍＭＭｇＯＬ２
．７ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００μｆ／ｍｅ
ウシ血清アルブミンの混合液ｊＯμを中にて制限酵素Ｘ
ｂａＩ ／ ０単位を加えて、３７℃で２時間反応させ
た。この反応液を７％アガロースゲル電気泳動し、＠項
Ｇ２）（１）の方法に従いｏ、ｔ≠ｋｂｐのＤＮＡ断片
を回収した（Ｅ）、一方前項（３）（１）で得らｎたｐ
ＨＲ８／ ０６Ｇ ／ ００ ｐｆ ｆ Ａ ＯｍＭト
リス塩酸（ｐＨ７，タフ、 ／ ｊ ＯｍＭ Ｎａ０
６、 ＡｍＭＭｇＣ１２の混合液１００ｔｔｌ中にて制
限酵素ＲａｍＨＩコＯ単位を加えて、３７℃で６時間反
応させた。この反応液全フェノール・クロロホルム（／
：／〕油抽出エーテル処理及びエタノール沈殿に付した
。回収し７？、 ＤＮＡ断片１ｆｒ２ＱＯｍＭヘペス（
ｐｒ−ｔｇ、ａ’）、１０ｍＭ Ｍｇ ＯＬ２、／ Ｏ
ｍＭジチオスレイトール、そｎぞれ０．２ ｍＭのｄ
ＴＴＰ −ｄ Ａ’ｒＰ −ｄ ＯＴＰ −ｄＧＴＰの
混合液２００μを中にてクレノー断片３単位を加え、ｉ
ｔ℃でコ時間反応させ、制限酵素ＢａｍＨＩで開裂され
ＦＣＤＮＡ断片の末端部位を修復し平滑末端とした。
ＤＮ＆断片ｆ ／ ＯｍＭ） ＩＪス塩酸（ｐ）（７，
ｊ）、／ ００ ｍＭＮａＯ６、 ７ ｍＭＭｇＯＬ２
．７ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００μｆ／ｍｅ
ウシ血清アルブミンの混合液ｊＯμを中にて制限酵素Ｘ
ｂａＩ ／ ０単位を加えて、３７℃で２時間反応させ
た。この反応液を７％アガロースゲル電気泳動し、＠項
Ｇ２）（１）の方法に従いｏ、ｔ≠ｋｂｐのＤＮＡ断片
を回収した（Ｅ）、一方前項（３）（１）で得らｎたｐ
ＨＲ８／ ０６Ｇ ／ ００ ｐｆ ｆ Ａ ＯｍＭト
リス塩酸（ｐＨ７，タフ、 ／ ｊ ＯｍＭ Ｎａ０
６、 ＡｍＭＭｇＣ１２の混合液１００ｔｔｌ中にて制
限酵素ＲａｍＨＩコＯ単位を加えて、３７℃で６時間反
応させた。この反応液全フェノール・クロロホルム（／
：／〕油抽出エーテル処理及びエタノール沈殿に付した
。回収し７？、 ＤＮＡ断片１ｆｒ２ＱＯｍＭヘペス（
ｐｒ−ｔｇ、ａ’）、１０ｍＭ Ｍｇ ＯＬ２、／ Ｏ
ｍＭジチオスレイトール、そｎぞれ０．２ ｍＭのｄ
ＴＴＰ −ｄ Ａ’ｒＰ −ｄ ＯＴＰ −ｄＧＴＰの
混合液２００μを中にてクレノー断片３単位を加え、ｉ
ｔ℃でコ時間反応させ、制限酵素ＢａｍＨＩで開裂され
ＦＣＤＮＡ断片の末端部位を修復し平滑末端とした。
この反応液をフェノール・クロロホルム抽出、エーテル
処理及びエタノール沈殿に付した。回収しＦＣＤＮＡ断
片′ｆ：／ ＯｍＭ ）リス塩酸（ｐＨ７，ｊハ１００
ｍＭ ＮａＯ４，７ｍＭ ＭｇＯ１２，７ｍＭ２−メル
カプトエタノール、 ／ ００ ｐ？／ｍｌウシ血清
アルブミンのｍ ４ｂ液ｊ ０１ｔｔ中にて制限酵素Ｘ
ｂａＩ１０単位を加えて３７℃で２ｊ分間反応させ、
ｐＨＢｓ１０ｊＧにあるＸｂａｌ ５識部位が部分的に
切断されるようにした。
処理及びエタノール沈殿に付した。回収しＦＣＤＮＡ断
片′ｆ：／ ＯｍＭ ）リス塩酸（ｐＨ７，ｊハ１００
ｍＭ ＮａＯ４，７ｍＭ ＭｇＯ１２，７ｍＭ２−メル
カプトエタノール、 ／ ００ ｐ？／ｍｌウシ血清
アルブミンのｍ ４ｂ液ｊ ０１ｔｔ中にて制限酵素Ｘ
ｂａＩ１０単位を加えて３７℃で２ｊ分間反応させ、
ｐＨＢｓ１０ｊＧにあるＸｂａｌ ５識部位が部分的に
切断されるようにした。
この反応溶液をＯ０♂チアガロースグル電気泳動し。
り、０ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
上記のようにして得られたＥ及びＦのＤＮＡ断片全そｎ
ぞれｌμ？及びＯｊμ２とを前項（Ｊ） （ｉｌｌの混
合′液−０ｔｉＬ中にてＴμＤＮＡリガーぜｌ単位を加
えてコＯ’Ｑ／♂時間尺応させた。この反応液を用いて
前項（コ）（１Ｇの方法に従って大１傷醒ＨＥＩ１０／
ｆ形質転換し、目的のクローンを選択した。選択さｆ
ｌたプラスミドは、ｐＨＢｓ１０ｊＧのＧＡＬ／プロモ
ーターとＨＲｓ Ａｇ遺伝子の間にプレＳ領域の遺伝子
が正しい方向に挿入さｎπ組換えプラスミドでｐＨＲＰ
ｓｌＯｊＧと命名し友、これの制限酵素地図を添付図面
の第２図に示す。
ぞれｌμ？及びＯｊμ２とを前項（Ｊ） （ｉｌｌの混
合′液−０ｔｉＬ中にてＴμＤＮＡリガーぜｌ単位を加
えてコＯ’Ｑ／♂時間尺応させた。この反応液を用いて
前項（コ）（１Ｇの方法に従って大１傷醒ＨＥＩ１０／
ｆ形質転換し、目的のクローンを選択した。選択さｆ
ｌたプラスミドは、ｐＨＢｓ１０ｊＧのＧＡＬ／プロモ
ーターとＨＲｓ Ａｇ遺伝子の間にプレＳ領域の遺伝子
が正しい方向に挿入さｎπ組換えプラスミドでｐＨＲＰ
ｓｌＯｊＧと命名し友、これの制限酵素地図を添付図面
の第２図に示す。
実施例λ
形質転換酵母菌の調型
酵母菌としてサツカロミセス・セレビシェＸＪＰｊｒ−
ＪＤ−／Ａ（ａ ａｄｅ／ ｇａｌ／ Ｌｅｕ／
ｈｉｓｊｕｒａ３ ｔｒｐ／ ｍｅ！／４’）’ｉ用い
、とｆｉ’１ＹＰＤ培地（２％Ｋｆトン、ｔ％酵母エキ
ス、！係グルコースノｔＯ−に接種し、ＪＱ℃で一晩培
養したのち、遠心して集菌した。ｔｏｍＭリン酸Ｍｏｆ
Ｔ液（ｐＨ７Ｊ〕、２０ｄにて菌体を洗浄し、ついで／
、２Ｍソルビトール、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，
ｊハ／弘ｍＭ−！−メルカゾトエタノールおよびｔ ０
０ ａｔ／ｍｅチモリアーゼｔｏｏｏｏ （生化学工秦
社製〕の溶液！−に！＠濁させ、３０℃で約３ｏ分間保
ち、スフェロプラスト化した。ついで、スフェロプラス
［−メ、λＭソルビトール溶液で３回洗浄したのち、／
、２Ｍンルビトーに、ｔＯ％ＹＰＤ１０ｍｌに！ｖ！濁
サセす０℃で１時間穏やかに振とり培養した。生成した
スフェロプラストを集め、／、ＪＭソルビトール、１０
ｍＭ ＬｌａＯ２２および／□ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７
，ｔ）の溶液０．ｊゴに懸濁させ、その１０μｔずつを
小試験管に分注した。こｎに前項の実施例／ 、 （、
？）（ｉ）または（３）（ｔｉ）で調型した組換えプラ
スミにｐＨ８８＃）ｊＧまたはｐＨＢＰｓ１０ｔＧ全加
え、充分混せし、室温に１〜７０分間放置した。ついで
これに、２０％ポＩＪ−ｘ チｖ ７グＩＪ ニア −
ルＩｔ ０００． ／ ＯｍＭ ０ａＯ１２および１
０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，３）溶液／−ずつを加えて
混合し、室温に約２０分間放置し７Ｃ，この混会液Ｏ，
，２，／ずっ？弘３℃に保温された再生培地（／、ｊＭ
ソルビトール、コチグルコース、０．ｔ７係イーストニ
トロゲンペースｗ１０アミノ酸、２気ＹＰＤ、２０ｐり
／ｍｅアデニン、コ０ＩＩ９／−ウラシル。
ＪＤ−／Ａ（ａ ａｄｅ／ ｇａｌ／ Ｌｅｕ／
ｈｉｓｊｕｒａ３ ｔｒｐ／ ｍｅ！／４’）’ｉ用い
、とｆｉ’１ＹＰＤ培地（２％Ｋｆトン、ｔ％酵母エキ
ス、！係グルコースノｔＯ−に接種し、ＪＱ℃で一晩培
養したのち、遠心して集菌した。ｔｏｍＭリン酸Ｍｏｆ
Ｔ液（ｐＨ７Ｊ〕、２０ｄにて菌体を洗浄し、ついで／
、２Ｍソルビトール、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，
ｊハ／弘ｍＭ−！−メルカゾトエタノールおよびｔ ０
０ ａｔ／ｍｅチモリアーゼｔｏｏｏｏ （生化学工秦
社製〕の溶液！−に！＠濁させ、３０℃で約３ｏ分間保
ち、スフェロプラスト化した。ついで、スフェロプラス
［−メ、λＭソルビトール溶液で３回洗浄したのち、／
、２Ｍンルビトーに、ｔＯ％ＹＰＤ１０ｍｌに！ｖ！濁
サセす０℃で１時間穏やかに振とり培養した。生成した
スフェロプラストを集め、／、ＪＭソルビトール、１０
ｍＭ ＬｌａＯ２２および／□ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７
，ｔ）の溶液０．ｊゴに懸濁させ、その１０μｔずつを
小試験管に分注した。こｎに前項の実施例／ 、 （、
？）（ｉ）または（３）（ｔｉ）で調型した組換えプラ
スミにｐＨ８８＃）ｊＧまたはｐＨＢＰｓ１０ｔＧ全加
え、充分混せし、室温に１〜７０分間放置した。ついで
これに、２０％ポＩＪ−ｘ チｖ ７グＩＪ ニア −
ルＩｔ ０００． ／ ＯｍＭ ０ａＯ１２および１
０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，３）溶液／−ずつを加えて
混合し、室温に約２０分間放置し７Ｃ，この混会液Ｏ，
，２，／ずっ？弘３℃に保温された再生培地（／、ｊＭ
ソルビトール、コチグルコース、０．ｔ７係イーストニ
トロゲンペースｗ１０アミノ酸、２気ＹＰＤ、２０ｐり
／ｍｅアデニン、コ０ＩＩ９／−ウラシル。
Ｏ，Ｓ％カザミノ酸、３％寒天）１０ｄに加え、軽く混
合させ、予め準備さｔ”Ｌ７ｒニー／、２Ｍソルビトー
ル含有最小培地（０，６７％イーストニトロゲンベース
Ｗ１０アミノ酸、２餐グルコース、コＯａｔ／ゴアデニ
ン、−２０１ｔり／ｍｅウラシル、 ０．５％カザミノ
酸。
合させ、予め準備さｔ”Ｌ７ｒニー／、２Ｍソルビトー
ル含有最小培地（０，６７％イーストニトロゲンベース
Ｗ１０アミノ酸、２餐グルコース、コＯａｔ／ゴアデニ
ン、−２０１ｔり／ｍｅウラシル、 ０．５％カザミノ
酸。
２％寒天）寒天平板に重層し、固化させたのち。
３０℃で培養してトリプトファン非要求性酵母のコロニ
ー全得た。このコロニーを選択培地（２％グルコース、
０．ｔ７％イーストニトロゲンベースＷ１０アミノ酸、
０．ｊ ％カザミノ９ 、２０１１９／ｍｔアデニン、
２０ｐ？／ｒｄウラシルノにて培養して菌体を集めた。
ー全得た。このコロニーを選択培地（２％グルコース、
０．ｔ７％イーストニトロゲンベースＷ１０アミノ酸、
０．ｊ ％カザミノ９ 、２０１１９／ｍｔアデニン、
２０ｐ？／ｒｄウラシルノにて培養して菌体を集めた。
この菌体から「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｎｚｙｍｏ」
ｏｇｙＪ６！巻、ａｏ４ｔ−ａｉｉ頁、７９７Ｆに記載
されている方法に従いプラスミドを抽出し、そのプラス
ミドを分析することにより、目的のクローンをロミセス
・セレビシェＫＭＦ １２７４株＞よヒＫＭＦ １２７
５株−一一一一はそｒ［ぞｎ微工研菌寄第８４６４号お
よび第８４３５号として寄託さｎである。
ｏｇｙＪ６！巻、ａｏ４ｔ−ａｉｉ頁、７９７Ｆに記載
されている方法に従いプラスミドを抽出し、そのプラス
ミドを分析することにより、目的のクローンをロミセス
・セレビシェＫＭＦ １２７４株＞よヒＫＭＦ １２７
５株−一一一一はそｒ［ぞｎ微工研菌寄第８４６４号お
よび第８４３５号として寄託さｎである。
実施例３
形質転換酵母菌による１月１ｓ Ａｇの製造（イ）ＭＪ
記の実施例コで傅らｒｒた形質転換酵母菌の各コロニー
から菌体を分離し１．２係グリセロール、２％乳酸ナト
リウム、０．ｔ ７％（−ストニトロゲンペースＷ１０
アミノ酸、 ０．、ｔ％カデミノ酸。
記の実施例コで傅らｒｒた形質転換酵母菌の各コロニー
から菌体を分離し１．２係グリセロール、２％乳酸ナト
リウム、０．ｔ ７％（−ストニトロゲンペースＷ１０
アミノ酸、 ０．、ｔ％カデミノ酸。
−２０ｐ？／ｍｌアデニン、２０μ）／ｍｅウランル：
り ｌｉｆ？底さｉる発現用選択培地１０７に接種し
、３０℃にて培養全行なつ７こ、約３６−≠ｒ待時間後
対数増殖期０Ｄｔ００＝０．７〜／、０になったところ
で終Ｊいて、前記ＨＢｓ抗原検出用キット（アゼット社
製）を用いた平行線検定法（厚生省薬務局監修、生物学
的製剤基準解説、１３！頁、ｌり７３）に従い。
り ｌｉｆ？底さｉる発現用選択培地１０７に接種し
、３０℃にて培養全行なつ７こ、約３６−≠ｒ待時間後
対数増殖期０Ｄｔ００＝０．７〜／、０になったところ
で終Ｊいて、前記ＨＢｓ抗原検出用キット（アゼット社
製）を用いた平行線検定法（厚生省薬務局監修、生物学
的製剤基準解説、１３！頁、ｌり７３）に従い。
抗原量および抗原の反応性を推定し罠。なお、対照抗原
としては、ヒト由来の精製Ｈ８ｓ抗原を用いた。その結
果全第３図に示す。第３図に示さｎるように、こｎらの
直線の平行性により、本発明に基づいて産生さｆ′Ｌ７
１：ＨＲｇ抗原及びプレＳ付ＨＢｓ抗ＭＬはいずｎもヒ
ト由来の精製抗原の持つ反応性とほぼ同じ性質金持つこ
とが理解できる。
としては、ヒト由来の精製Ｈ８ｓ抗原を用いた。その結
果全第３図に示す。第３図に示さｎるように、こｎらの
直線の平行性により、本発明に基づいて産生さｆ′Ｌ７
１：ＨＲｇ抗原及びプレＳ付ＨＢｓ抗ＭＬはいずｎもヒ
ト由来の精製抗原の持つ反応性とほぼ同じ性質金持つこ
とが理解できる。
（ハ） ＨＢｓＡｇ蛋白の分離
前項の実施例３（イ）の方法に従って培養した培養液／
ｌよジ得た酵母菌体ｔ−２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，
ｊハ０．／弘Ｍ塩化ナトリウム溶液≠Ｏａｔで２回洗浄
した後、同じ混液ｊ−に懸濁した。この懸濁ｉ ｉ ”
５ＯＮＩＯＡＴＯＲ”％デルＷ−２ＪＪＲ（ウルトラ
ソニック社製）ｋ用いてｉｏｏｗの入力下に１１分間、
氷冷しながら処理し、菌体を、破壊した。この菌体破壊
液ｆ ／ ｊ ０００ ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心し
、残渣を除いた。得らｆした上溝溶液に′ど・Ｘ 塩化セシウムの粉末管加゛ん密Ｗ’ｔ／、／に調整し。
ｌよジ得た酵母菌体ｔ−２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，
ｊハ０．／弘Ｍ塩化ナトリウム溶液≠Ｏａｔで２回洗浄
した後、同じ混液ｊ−に懸濁した。この懸濁ｉ ｉ ”
５ＯＮＩＯＡＴＯＲ”％デルＷ−２ＪＪＲ（ウルトラ
ソニック社製）ｋ用いてｉｏｏｗの入力下に１１分間、
氷冷しながら処理し、菌体を、破壊した。この菌体破壊
液ｆ ／ ｊ ０００ ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心し
、残渣を除いた。得らｆした上溝溶液に′ど・Ｘ 塩化セシウムの粉末管加゛ん密Ｗ’ｔ／、／に調整し。
そのコ、ｊｄｆ、ｊｍｌ容の遠心管に移した。この中に
、上記混液に塩化セシウムを加えて＃！［−／、４Ｌに
調整した別の溶液コ、ｊ−を静かに添加し、 ＲＰＳ−
！！Ｔ−コローター（日立製作所製Ｊｔ用いてμ０００
ｒ、ｐ、ｍ、、 ４！ｒ時間５℃で遠心分離し罠。得ら
れた溶液を遠心管の底部よジＯ，コｄずつ分画した。こ
の分画について、ＡＵＳｌＡｌｌキットを用いてＨＢｓ
抗原活性を測定し、活性部分の蛋白ｔ−集め罠。
、上記混液に塩化セシウムを加えて＃！［−／、４Ｌに
調整した別の溶液コ、ｊ−を静かに添加し、 ＲＰＳ−
！！Ｔ−コローター（日立製作所製Ｊｔ用いてμ０００
ｒ、ｐ、ｍ、、 ４！ｒ時間５℃で遠心分離し罠。得ら
れた溶液を遠心管の底部よジＯ，コｄずつ分画した。こ
の分画について、ＡＵＳｌＡｌｌキットを用いてＨＢｓ
抗原活性を測定し、活性部分の蛋白ｔ−集め罠。
第１図は本発明で用いらｎるＨＢｓ Ａｇ遺伝子発現プ
ラスミドｐＨＢｓ１０ｔＧの構造を示す制限酵素地図、
第２図はプレＳ付ＨＢｓ Ａｇ 遺伝子発現プラスミド
ｐ［ＩＦＩＰｓ ／ ０１Ｇの構造を示す制限酵素地図
、第３図は本発明で得らｎる酵母溶窮液についての平行
線検定法によるＨＦ１ｇ抗原量および抗原の反応性を示
すグラフ図である。 第３図 希 釈 イ１：５ 数
ラスミドｐＨＢｓ１０ｔＧの構造を示す制限酵素地図、
第２図はプレＳ付ＨＢｓ Ａｇ 遺伝子発現プラスミド
ｐ［ＩＦＩＰｓ ／ ０１Ｇの構造を示す制限酵素地図
、第３図は本発明で得らｎる酵母溶窮液についての平行
線検定法によるＨＦ１ｇ抗原量および抗原の反応性を示
すグラフ図である。 第３図 希 釈 イ１：５ 数
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、酵母菌内での組換えプラスミドの増殖を可能にする
遺伝子と、大腸菌内での組換えプラスミドの増殖を可能
にする遺伝子と、該組換えプラスミドの導入による酵母
菌形質転換株を検出するための選択マーカーとして作用
する遺伝子と、該組換えプラスミドの導入による大腸菌
形質転換株を検出するための選択マーカーとして作用す
る遺伝子とを含み且つ酵母菌のガラクトキナーゼ形質発
現調節領域の遺伝子を担い、しかも酵母菌及び大腸菌の
両方で増殖し得るプラスミドベクターに、このベクター
中で該ガラクトキナーゼプロモーターの制御を受ける位
置に、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原遺伝子、又はプレ表
面抗原遺伝子及び表面抗原遺伝子を組込んで構築された
ことを特徴とする組換えプラスミド。 ２、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原遺伝子と、その上流に連
結されたプレ表面抗原遺伝子とが一緒にプラスミドベク
ター中のガラクトキナーゼ形質発現調節領域の下流に組
込まれてある特許請求の範囲第１項に記載の組換えプラ
スミド。 ３、酵母菌内での組換えプラスミドの増殖を可能にする
遺伝子と、大腸菌内での組換えプラスミドの増殖を可能
にする遺伝子と、該組換えプラスミドの導入による酵母
菌形質転換株を検出するための選択マーカーとして作用
する遺伝子と、該組換えプラスミドの導入による大腸菌
形質転換株を検出するための選択マーカーとして作用す
る遺伝子とを含み且つ酵母菌のガラクトキナーゼ形質発
現調節領域の遺伝子を担い、しかも酵母菌及び大腸菌の
両方で増殖し得るプラスミドベクターに、このベクター
中で該ガラクトキナーゼプロモーターの制御を受ける位
置に、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原遺伝子、又はプレ表
面抗原遺伝子及び表面抗原遺伝子を組込んで構築された
組換えプラスミドを導入されて形質転換されたことを特
徴とする形質転換酵母菌。 ４、組換えプラスミドの導入による形質転換を受ける酵
母菌はトリプトファン要求性変異株のサッカロミセス・
セレビシエである特許請求の範囲第３項記載の形質転換
酵母菌。 ５、酵母菌内での組換えプラスミドの増殖を可能にする
遺伝子と、大腸菌内での組換えプラスミドの増殖を可能
にする遺伝子と、該組換えプラスミドの導入による酵母
菌形質転換株を検出するための選択マーカーとして作用
する遺伝子と、該組換えプラスミドの導入による大腸菌
形質転換株を検出するための選択マーカーとして作用す
る遺伝子とを含み且つ酵母菌のガラクトキナーゼ形質発
現調節領域の遺伝子を担い、しかも酵母菌及び大腸菌の
両方で増殖し得るプラスミドベクターに、このベクター
中で該ガラクトキナーゼプロモーターの制御を受ける位
置に、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原遺伝子、又はプレ表
面抗原遺伝子及び表面抗原遺伝子を組込んで構築された
組換えプラスミドを導入されて形質転換された形質転換
酵母菌を培養することを特徴とする、Ｂ型肝炎ウィルス
の表面抗原又はプレ表面抗原付き表面抗原の製造方法。 ６、形質転換酵母菌の培養物を溶菌処理し、その溶菌液
からＢ型肝炎ウィルスの表面抗原、プレ表面抗原付き表
面抗原及び／又はプレ表面抗原の蛋白質を採取する特許
請求の範囲第５項記載の方法。 ７、形質転換酵母菌の培養をガラクトキナーゼプロモー
ターが抑制されない条件下にガラクトースの存在下に行
う特許請求の範囲第５項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19391685A JPS6255086A (ja) | 1985-09-04 | 1985-09-04 | 形質転換酵母菌によるｂ型肝炎ウイルス表面抗原及びプレ表面抗原付き表面抗原の製造 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19391685A JPS6255086A (ja) | 1985-09-04 | 1985-09-04 | 形質転換酵母菌によるｂ型肝炎ウイルス表面抗原及びプレ表面抗原付き表面抗原の製造 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6255086A true JPS6255086A (ja) | 1987-03-10 |
Family
ID=16315872
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19391685A Pending JPS6255086A (ja) | 1985-09-04 | 1985-09-04 | 形質転換酵母菌によるｂ型肝炎ウイルス表面抗原及びプレ表面抗原付き表面抗原の製造 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6255086A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01301626A (ja) * | 1988-05-30 | 1989-12-05 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ＨＢｓ抗原と外来性ペプチドとからなる混成抗原粒子およびその製法 |
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1985
- 1985-09-04 JP JP19391685A patent/JPS6255086A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01301626A (ja) * | 1988-05-30 | 1989-12-05 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ＨＢｓ抗原と外来性ペプチドとからなる混成抗原粒子およびその製法 |
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