JPH01117780A - 組み換えワクチニアウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （従来の技術） 日本脳炎はＲＮＡウィルスであるトガウィルス科に属す
る日本脳炎ウィルスによって引き起こされる急性感染症
であり、アジア地域に分布し、法定伝染病に指定されて
いる重要な疾患である。致命率は平均３５％程度である
が、中枢神経障害などの重篤な後遺症を伴い、完全に治
癒するのは全患者の約３分の１といわれている。

日本脳炎に対する治療は原因療法がなく、−船釣看護と
対処療法が主となっている。また、実用的な予防手段と
しては現在のところワクチンを用いる方法しかない、現
行の日本脳炎ワクチンは、ウィルスに怒染発症させたマ
ウスの脳の食塩水乳剤を原料として、高度に精製し、ホ
ルマリンを加えて不活性化したものである、しかし現在
の製造方法では、完全に両物質が除去されているわけで
なく、常にこの両物質の混入によって中枢神経障害を起
こすのではないかという懸念がつきまとっており、人体
用ワクチンとして、両物質を含まない組織培養等を応用
したワクチンの開発が望まれている。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明の目的は、日本脳炎ウィルスの構造蛋白質をコー
ドする遺伝子のｃＤＮＡを含有するプラスミド、該ｃ　
ＤＮＡを組み込んだ組み換えワクチニアウィルス（ｖａ
ｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓ）並びにそれを含有する日本
脳炎ワクチンを提供することにある。

（問題点を解決するための手段） 日本脳炎ウィルスのＲＮＡ遺伝子は、約１１　、０００
個の塩基より成り、その５°末端の近傍にＣ蛋白質（コ
ア蛋白質）　、ＰｒｅＭ蛋白質（マトリックス蛋白質前
駆体）及びＥ蛋白質（エンベロープ蛋白質）の３種の構
造蛋白質をコードする遺伝子が５°側よりＣ，ＰｒｅＭ
ＳＥの順に配列している。

遺伝子暗号の翻訳は、Ｃ蛋白質遺伝子の始めの部分の開
始コドンより始まり、そして３゛末端の近くまで続けて
行われ、翻訳終了後にプロセッシングをうけて各成熟蛋
白質になることが知られている。

コア（Ｃ）、マトリックス（Ｍ）、エンベロープ（Ｅ）
の各構造蛋白質の中でワクチンとしての抗原性に優れて
いるものは、日本脳炎ウィルスの構造からも明らかなよ
うに、ウィルス表面上に突出しているＥ蛋白質である。

本発明者らは、このＥ蛋白質のワクチンとしての優れた
抗原性に注目し、実質的に該蛋白質をコードする日本脳
炎ウィルス遺伝子のｃＤＮＡをワクチニアウィルスＤＮ
Ａ遺伝子中に組み込み発現させることを目的として、鋭
意研究を重ねた結果、本発明を完成した。

以下に、本発明の詳細な説明する。

（１）外来遺伝子を挿入するためのワクチニアウィルス
遺伝子領域 外来遺伝子を組み込んだ組み換えワクチニアウィルスを
製造する場合、外来遺伝子を組み込むことができる領域
は、ワクチニアウィルスＤＮＡの非必須遺伝子領域であ
る。例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、Ｆフラ
グメント、血球凝集素（ＨＡ）遺伝子などが知られてお
り、いずれをも用いることが可能である。

つまり、上記のワクチニアウィルスＤＮＡの非必須遺伝
子部分を組み込んだプラスミドを製造し、適当な制限酵
素やりガーゼを用いて、目的とする外来遺伝子をワクチ
ニアウィルス非必須遺伝子中に挿入することによって、
組み換えワクチニアウィルスＤＮＡを製造するための挿
入ベクターを得ることができる。

このように製造された外来遺伝子挿入ベクターを常法に
従い、野性株ワクチニアウィルス感染細胞に燐酸カルシ
ウム法でトランスフェクションすると、細胞内でプラス
ミドに含まれているワクチニアＤＮＡ部分とウィルスＤ
ＮＡとの間でホモローガス組み換えが起こり、非必須遺
伝子の中に入っている外来遺伝子がウィルス遺伝子内に
挿入され、組み換えウィルスを得ることができる。

（２）日本脳炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子前述したよ
うに、日本脳炎ウィルスの構造蛋白質としては、コア蛋
白質、マトリックス蛋白質及びエンベロープ蛋白質が挙
げられ、これらをコードする遺伝子が５°末端付近にま
とまって存在しており、５゛側よりＣ，ＰｒｅＭ、Ｅの
遺伝子の順で配列している。

これら構造蛋白質遺伝子は、各々個別に翻訳されるので
はなく、日本脳炎ウィルスＲＮＡのほぼ全体がまとめて
翻訳された後、プロセッシングを受けて個々の成熟蛋白
質となるため、ＰｒｅＭ及びＣ遺伝子それ自体には翻訳
開始コドンが存在しない。

従って、日本脳炎ウィルスＲＮＡ上の翻訳開始コドン（
Ｃ遺伝子の末端に存在）を用いる場合は、基本的にはＣ
ＳＰ　ｒｅＭ　ＸＥの３種の構造遺伝子をまとめて組み
込むこととなる０日本脳炎ワクチンの開発を目的とした
場合、発現を望む構造蛋白質は優れた抗原性を有するＥ
蛋白質であるが、上記のように３種の構造蛋白質をまと
めて組み込むと、Ｃ遺伝子と翻訳開始部位との間には、
Ｃ及びＰｒｅＭ遺伝子の配列が介在する。当該分野にお
ける経験的な面から考慮すると、このような組み換え体
においては、目的とするＥ蛋白質の発現効率が悪い可能
性があると予想される０例えば、目的遺伝子の上流に長
い配列が介在すると、日本脳炎のＲＮＡポリメラーゼに
対しては何も影響を与えないが、ワクチニアのＲＮＡポ
リメラーゼに対しては転写の終結信号となる配列等が存
在する確立が、遺伝子上流の配列が短い場合よりも高く
なるなどの場合が考えられるからである。

本発明者らは、優れた日本脳炎ワクチンの開発を目的と
し、効率良くＥ蛋白質を発現するような組み換えウィル
スを得るために、ワクチニアウィルスにＣ遺伝子を主要
に含む遺伝子部分のｃＤＮＡを組み込んだ。即ち、Ｐｒ
ｅＭ遺伝子後半の短い一部分、Ｅ遺伝子及びＥ遺伝子の
後に続く遺伝子の短い一部分よりなる遺伝子領域のｃＤ
ＮＡを組み込んだ組み換えワクチニアウィルスの製造に
成功した。このｃＤＮＡは、Ｅ遺伝子の前方にＣやＰｒ
ｅＭなどの余分な遺伝子がほとんど存在しないため、目
的とするＥ蛋白質の発現が効率良く行われるものである
。

しかし、上記のｃＤＮＡはＣ遺伝子部分を含まないため
翻訳開始コドンを持たない。従って、後述するように、
例えば他に組み込むプロモーターの翻訳開始コドン等を
利用するなどの方法によりＥ蛋白質の発現を可能にでき
る。

上記のように、Ｃ遺伝子上の日本脳炎ウィルスの翻訳開
始コドンを用いず、他のプロモーター等のものを利用し
た場合、Ｅ遺伝子のリーディングフレームがずれてＥ蛋
白質を発現しないことがある。従って、本来のリーディ
ングフレームに合つたものを得るため、例えば、８ｍａ
ｒ、　１０ｍｅｒ＋　１２ａｅｒと３種類の長さのリン
カ−をＥ遺伝子を含むｃＤＮＡ端に結合させ、リーディ
ングフレームの異なる組み換え体を製造することにより
、そのいずれかの中に正確なＥ遺伝子のリーディングフ
レームを有するものを得ることができる。この長さの異
なるリンカ−を用いる方法は、ｃＤＮＡを結合させるベ
クター側の末端にリンカ−を結合させても同様に実施で
きる。

また、必要な塩基配列が完全に解析されており、且つ制
限酵素によって適切な部位で切断できる場合などは、計
算上でリーディングフレームを合わせることも可能であ
る。

（３）プロモーターの選択 組み換えワクチニアウィルス中の外来遺伝子の発現の強
さは、組み込んだプロモーターの強さに比例するとも言
える。より強力なプロモーターの制御下で外来の抗原遺
伝子を発現させることは、個体へのウィルス接種量を減
らすことにつながり、弱毒化したワクチニアウィルス株
の使用も可能にする。

例えば、ＴＫ遺伝子領域に外来遺伝子を組み込んだ場合
、ＴＫのプロモーターでは弱い発現しか得られないため
、７．５Ｋ蛋白質プロモーターなどの強力なプロモータ
ーを挿入し、より強力な発現力を獲得することができる
。プロモーターの種類は特に限定されず、ワクチニアウ
ィルス遺伝子上のプロモーターならば、いかなるもので
も使用可能である。

次に、本発明組み換えワクチニアウィルスの製造方法の
概略を述べる。

１１）ワクチニアウィルスＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ！
ＩＩで消化し、ＴＫ遺伝子を含むＨ１ｎｄ　ＩＩＩ・Ｊ
断片を得る。

このＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドを制限酵素Ｒｓ
ａｌで消化し、切断部位にＰｓｔｌリンカ−を結合させ
た後、さらにＨｉｎｄｌｌ＋で消化して得られたＤＮＡ
断片をプラスミドに組み込んでｐＺｌを得る（第１図）
。

（２）上記のＨｉｎｄｌｌｒ・Ｊ断片を組み込んだプラ
スミドを制限酵素Ｘｈｏｌで消化し、切断部位をＤＮＡ
ポリメラーゼで平滑末端とした後、ＥｃｏＲＩリンカ−
を結合させ、さらに制限酵素ＥｃｏＲＩで消化する。

ＥｃｏＲＩでｐｚｔを消化し、その切断部位に上記のよ
うに製造したＤＮＡ断片を連結してｐＺ２を得る（第１
図）。

（３）ワクチニアウィルスＤＮＡを制限酵素５ａ１１で
消化して得た７、５Ｋ蛋白質のプロモーターを含む断片
をプラスミドに挿入する。これを制限酵素Ｔａｑｌで消
化し、その切断部位をＤＮＡポリメラーゼで平滑末端と
した後、Ｐｓｔｌリンカ−を結合させる。ｐＺ２を制限
酵素Ｐｓｔｌで消化し、その切断部位に上記の７．５Ｋ
蛋白質プロモーターを含むＤＮＡ断片を連結し、ｐＺ３
を得る（第２図）。

ｆ４１　ｐ　Ｚ　２を制限酵素Ｘｂａｌで部分消化し、
その切断部位をＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした後
、その切断部位に、７．５Ｋ蛋白質プロモーターＤＮＡ
断片を含むプラスミドを制限酵素Ｒｓａｒ及びＨｉｎｃ
■で消化して得られた断片を連結することによって、ｐ
Ｚ４を得る（第３図）。

（５）日本脳炎ウィルスのＥ蛋白質を含むｃＤＮＡを制
限酵素Ｍｌｕｌ及びＢｇｌｌ［で消化し、その切断部位
をＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした後、３種の長さ
のＢａｍＨＩリンカ−を結合させる（第４図）。

＋６１　ｐ　Ｚ　３及びｐＺ４を制限酵素ＢａｍＨＩで
消化し、その切断部位に上記（５）で調製したＥ断片（
３種Ｎ）を連結して、日本脳炎Ｅ構造蛋白質遺伝子がＴ
Ｋ遺伝子部分に組み込まれ、かつ７．５Ｋ蛋白質プロモ
ーターを含む遺伝子配列を有するプラスミドが製造され
る（第５図及び第６図）。

（η得られた挿入プラスミドを、リン酸カルシウム法等
の常法に従って、野性株ワクチニアウィルス感染細胞に
トランスフエフシロンすることにより、細胞内でホモロ
ーガス組み換えがおこり、外来遺伝子がウィルス遺伝子
内に挿入された組み換えウィルスが形成される。

（８）形成された組み換えウィルスを見つける方法とし
ては、プラークハイプリダイゼイション又は薬剤耐性や
プラークの色を利用する方法などが挙げられる。

例えば、外来遺伝子の挿入部分としてＴＫ遺伝子を用い
た場合、組み換えウィルスはブロモデオキシウリジン存
在下でＴＫ−細胞上に形成されるプラークより釣り上げ
選択することができる。

（９）以上のようにして得られた組み換えワクチニアウ
ィルスが、組み込んだ日本脳炎ウィルス構造蛋白質を本
当に発現しているかどうかは、例えば日本脳炎ウィルス
又はその各構造蛋白質に対する抗血清、ポリクローナル
抗体、モノクローナル抗体等を用いた抗原抗体反応を利
用するなどの通常の方法により目的とする蛋白質の発現
を確認することができる。

上記の方法により得られた組み換えワクチニアウィルス
は、日本脳炎に対するワクチン、即ち予防接種剤として
使用することができる。あるいは、培養細胞に感染させ
ることによって、該培養物から公知の方法で感染培養細
胞の産生した抗原蛋白質を得ることもできる。

本発明において、ワクチニアウィルスはいかなる種類の
株をも用いることが可能であり、例えば、池田株、エク
アドル株、リスター株、ＷＲ株、ＣＶ−１株、Ｄｌｓ株
、大連株、ＭＶＡ株、ＬＣ１６ｍＯ株、ＬＣ１６ｄ株な
どの株を挙げることができる。これらの株の中から、非
必須遺伝子領域の調製、プロモーター遺伝子部分の調製
或いは最終的な組み換え体への使用など目的に応じて適
宜選択可能である。

本発明組み換えワクチニアウィルスを用いたワクチンに
関しては、各種投与方法が使用でき、例えば皮肉投与、
経口投与などによってワクチン接種することが可能であ
る。これらワクチンは、単独で或いは適当な薬学的に許
容される担体若しくは希釈剤又はその他の医薬活性成分
と組み合わせて使用してもよい。

さらに、ワクチニアウィルスは大型のウィルスであるた
め、日本脳炎ウィルス遺伝子に加えて、他種複数の病原
体の抗原遺伝子を挿入することにより、多価ワクチンを
製造することも可能である。例えば、単純ヘルペスウィ
ルス、Ｂ型肝炎ウィルス、インフルエンザウィルス、狂
犬病ウィルス、水泡性口内炎ウィルス、ＲＳウィルス、
ＡＩＤＳウィルス、成人Ｔ細胞白血病ウィルス、麻疹ウ
ィルス、風疹ウィルス、ポリオウィルス、水痘−帯状水
泡疹ウイルス等のウィルスやマラリア原虫、チフス菌、
コレラ菌、ペスト菌、百日咳菌等の細菌類などの抗原遺
伝子を日本脳炎ウィルスの構造遺伝子とともに組み込ん
だ多価ワクチンなどが挙げられる。

（実施例） 以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。

１、ワクチニアウィルスＴＫ遺伝子を有するＨ４ｎｄ■
・Ｊ断片の単離 ワクチニアウィルス（ＬＣ１６ｍ８株）のウィルス粒子
より抽出した２Ｊ１ｘのＤＮＡを、１０ｕｎｉｔの制限
酵素Ｈ４ｎｄ　ｍを含む生塩濃度制限酵素バッファー（
１０ｍＭＴｒｉ３−ｔｌＣＩ　（ｐＨ７，４）−５０ｓ
ＭＮａＣＩ−１０ｍＭＭｇＣＩ、−１ｍＭジチオスレイ
トール（＋）ＴＴ））５０Ｊ中で完全に消化した後、等
量のフェノールで抽出し、エタノール沈澱によりＤＮＡ
を回収した。

次に、２躍のｐＢＲ３２２を、５ｕｎｉｔのＨｉｎｄＩ
［［を含む生塩濃度制限酵素バッファー５０ｕ１中で完
全に消化した後、フェノール抽出し、エタノール沈澱に
より回収した＊　１ｕｎｉｔのバクテリオアルカリフォ
スファターゼ（ＢＡＰ）を含む溶液（５０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ（ｐｔ＋９．０）−１ｍＭＭｇｃｌｔ−０，１
＋ａＭＺｎＣｈ）　１００ｍ中で、６５℃。

１時間インキュベートし、５゛末端を脱リン酸化した後
、ＤＮＡを等量のフェノールで抽出し、エタノール沈澱
により回収した。

Ｈ４ｎｄｎｌ消化末端が脱リン酸化された０、１屑のｐ
ＢＲ３２２と、先に′ｆｓ備したＨｉｎｄｎＩによって
消化されたワクチニアウィルスＤＮＡ断片を、０．１ｕ
ｎｉｔのＴ４ＤＮＡリガーゼを含む突出末端連結バッフ
ァー　　（６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐｔ１７．５）
−６，６ａ＋ＭＭｇＣＩｇ−１０＋ｍＭＤＴＴ−０，５
ｍＭＡＴＰ）　２Ｏｐｌ中で混合し、１６℃、１２２時
間インキュベートて連結した。

次に、この連結したＤＮＡを用いて、コンピテントな大
腸菌ＤＨ−１株を形質転換させ、それを５０趨／−のア
ンピシリンと１．５％寒天を含むＬ−ｂｒｏｔｈ壇地（
以下、Ａｍｐ培地と呼ぶ）上で、３７℃、１８時間培養
した。これをベルベットを用いて１５ＩＲ／−のテトラ
サイタリンと１．５％寒天を含むＬ−ｂｒｏｔｈ培地（
以下、Ｔｃ培地と呼ぶ）に転写し、３７℃、１２時間培
養した後、アンピシリン耐性でテトラサイクリン惑受性
の菌を選択した。これらの菌を、Ａｍｐ＠養液２−中で
３７℃、１８時間培養し、低速遠心によりペレット化し
て回収した後、２ｗ／−のりゾチームと１■／−のＲＮ
Ａａｓｅを含む２５ｍＭＴｒｉｓ−ＩＣＩ　（ｐｉｆ８
．０）　−１０ｍＭＥｌ）Ｔ＾−５抛ｈブドウ糖から成
る溶液１００ｄに懸濁し、４℃、３０分間インキュベー
トした。

０．２ＭＮａ０１（−ＩＸＳＤＳ溶液２００４を加え、
室温で１０分間インキュベートした後、１５０ｕＩの３
ｉ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）を加えて４°Ｃ１５０
分間インキュベートした。

これを１２，０００ｘ　ｇ　、　１０分間遠心し、その
上清からエタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。回収
したＤＮＡの一部を５ｕｎｉｔのＨｉｎｄ　ｍを含む中
塩濃度制限酵素バッファー中で完全に消化した後、１％
のアガロースゲル電気泳動（Ａ　Ｇ　Ｅ）で分離し、ｐ
ＢＲ３２２に連結したワクチニアウィルスＤＮＡ断片の
大きさが４．５ｋｂ、　（キロ塩基対）のものを選択し
た。このＤＮＡ断片を含むｐＢＲ３２２を、５ｕｎｉｔ
の制限酵素ＥｃｏＲＩを含むＥｃｏＲＩバッフｙ−（１
００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）−５０ＩＩ
ＭＮａＣ１−７ｓ＋ＭＭｇＣ１ｇ−１＋ｕ＋ＤＴ？）で
完全に消化し、１％ＡＧＥで分離後、そのＤＮＡ断片の
大きさから、先のＤＮＡ断片をワクチェアウイルスＴＫ
遺伝子を含むＨｉｎｄｌ［［・Ｊ断片であると決定した
。

２、ｐＺｌの構築（第１図） ２■のワクチニアウィルスＨｉｎｄ　ｍ・Ｊ断片が連結
したｐＢＲ３２２を、５ｕｎｉｔの制限酵素Ｒｓａｌを
含む中堀濃度制限酵素バッファー５０４中で完全に消化
した後、等量のフェノールで抽出し、エタノール沈澱に
より回収した。このＤＮＡ断片と、末端がリン酸化され
たＰｓｔｌリンカ−を、１ｕｎｉｔのＴ４ＤＮＡリガー
ゼを含む平滑末端連結バッ゛ファー（６６ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ（ＰＨ７，５）−６，６ｓ＋ＭＭｇＣ１ｔ−１
５０ｍＭＮａＣ１−１０ｍＭロＴＴ−６６μＭＡＴＰ−
１５χポリエチレングリコール（ＰＥＧ））６０ｊｌｌ
中で混合し、１６℃、１２時間インキュベートして連結
した。この溶液からＤＮＡをフェノール抽出した後、エ
タノール沈澱により回収し、５ｕｎｉｔの制限酵素Ｐｓ
ｔｌを含むＰｓｔｒバッフｙ−（２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ（ｐＨ７，５）−５０ｍＭ（ＮＨａ）　ｇｓ０４−
１０ｍＭＭｇＣ１ｇ−１ｍＭＤＴＴ）５０ｕ７中で完全
に消化した。末端にＰｓｔｌリンカ−が付加したＤＮＡ
断片と余剰のＰｓｔｌリンカ−を、セファロースＣＬ４
Ｂカラムを用いて分離し、エタノール沈澱によりＤＮＡ
断片を回収した。これらのＤＮＡ断片を、５ｕｎｉｔの
Ｈｉｎｄｎ［を含む中堀濃度制限酵素バッファー５０ｐ
ｌ中で完全に消化した後、フェノール抽出し、エタノー
ル沈澱により回収した。

次に、２■のｐＵｃ１２を、５ｕｎｉｔのＨｉｎｄｌ［
［を含む中堀濃度制限酵素バッファー５０ａ１中で完全
に消化した後、フェノール抽出してエタノール沈澱によ
り回収し、さらにこれを５　ｕｎｉｔのＰｓｔｌを含む
Ｐｓｔ■バッファー５０ｐｌ中で完全に消化した後、同
様に回収した。

これによりｐＵｃ１２は、そのＨｉｎｄＩ［［及びＰｓ
ｔ１部位で開裂し直線状となった。この直線状のＤＮＡ
の５゛末端を、前述の方法を用いて脱リン酸化し、フェ
ノール抽出後、ＤＮＡをエタノール沈澱により回収した
。

Ｈｉｎｄｌｌｌ及びＰｓｔｌ消化末端が脱リン酸化した
０、１ｎのｐＵＣ１２と、先に準備したＲｓａｌ消化末
端にＰｓｔリンカ−が付加し、Ｈｉｎｄ　ｍで消化され
たＤＮＡ断片を０．１ｕｎｉｔのＴ４ＤＮＡリガーゼを
含む突出末端連結バッファー２０ｍ中で混合し、１６℃
、１２時間インキュベートして連結した。この連結した
ＤＮＡの一部を用いて、コンピテントな大腸菌ＪＭ１０
３株を形質転換をさせ、これを０．０５χＸ−ｇａｌ及
び０．５ｍＭＩＰＴＧを含む０，６χソフトアガー２０
艷中で混合し、Ａｌｌ１ｐ培地上で３７℃、　１５時間
培養した。

育成した大腸菌コロニー中で白色のものを選択し、前述
の方法を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。

これらのコロニーより抽串したＤＮＡの一部を、Ｈｉｎ
ｄＩ［［とＰｓｔｌで完全に消化し、１％ＡＧＥで分離
して、ｐＵｃ１２に連結したＤＮＡ断片の大きさが０．
６ｋｂｐＯものを選んだ。

このＤＮＡ断片を含むｐＵｃ１２を、５ｕｎｉｔの制限
酵素Ｔａｑｌを含む中堀濃度制限酵素バッファー５０ｐ
ｌ中で、６５℃、２時間インキエベートし、６％のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）でＤＮＡ断片
を分離した。泳動パターンより、ワクチニアウィルスＨ
ｉｎｄｌ［［・Ｊフラグメント上の遺伝子転写開始部位
及び翻訳開始部位を含むＨｉｎｄｌｌｌ−Ｒｓａｌ−Ｄ
ＮＡ断片が連結したｐＵｃ１２を選択し、これをｐＺｌ
と命名した。

３、ｐＺ２の構築（第１図） ２籍のワクチニアウィルスＨｉｎｄｌｉ・Ｊ断片が連結
したｐＢＲ３２２を５ｕｎｉｔの制限酵素Ｘｈｏｌを含
む高塩濃度制限酵素バッフｙ−（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ（ｐＨ７，５）−１００ｓＭＮａＣＩ−１０ｍＭＭ
ｇＣ１ｇ−１ｍＭＤＴＴ）５０ｕ１中で完全に消化した
後、等量のフェノールで抽出し、エタノール沈澱でＤＮ
Ａを回収した。

これを、２ｕｎｉｔのＴ４ＤＮＡポリメラーゼを含むＴ
４ＤＮＡポリメラーゼバフフｙ　−（６７＋＋ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）−６，７ｍＭＭｇＣｌ　ｚ−
１ｍＭＤＴＴ−６，７＋ｓＭＥＤＴＡ−０．３ｗＭｄＡ
ＴＰ−０，３ｍＭｄＣＴＰ−０，３＋＋＋ＭｄＧＴＰ−
０，３ｍＭｄＴＴＰ）　２０ｍ中で３７℃。

３０分間インキエベートして平滑末端を形成した。フェ
ノール抽出し、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した
後、末端がリン酸化されたＥｃｏＲＩリンカ−と１ｕｎ
ｉｔのＴ４ＤＮＡリガーゼを含む平滑末端連結バッファ
ー６０ｄ中で混合し、１６℃、１２時間インキュベート
して連結した。

再びフェノール抽出し、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収した後、５ｕｎｉｔのＥｃｏＲＩを含むＥｃｏＲ■
バッファー５０Ｉ１１中でＤＮＡを完全に消化した。こ
れを４％ＰＡＧＥで分離し、約１ｋｂｐのＤＮＡ断片部
をゲルより切り出し、密閉した透析膜中で電気泳動を行
うことにり、ゲルからＤＮＡ断片を透析膜中に溶出し、
この溶液からエタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。

次に２４のｐＢＲ３２５を５　ｕｎｉｔのＥｃｏＲｒを
含むＥｃｏＲ１バッファー５０ｕ１中で完全に消化した
後、フェノール抽出し、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収した。ＥｃｏＲ１部位で開裂し直線状になったＤＮ
Ａを、前述の方法を用いて脱リン酸化し、同様に回収し
た。

ＥｃｏＲＩ消化末端が脱リン酸化したｐＢＲ３２５０、
ＩＩ！ｇと、先に準備したＤＮＡ断片をＱ、１ｕｎｉｔ
のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む突出末端連結バッファー２
０μ！中で混合し、１６℃、１２時間インキュベートし
て連結した。この連結したＤＮＡを用いて、コンピテン
トな大腸菌ＤＨ−１株を形質転換させ、Ｔｃ培地上で３
７℃、　１８時間培養した。これをベルベットを用いて
１０■／ｒｎｌのクロランフェニコールと１．５％の寒
天を含むＬ−ｂｒｏｔｈ培地に転写し、３７℃、１２時
間培養した後、テトラサイクリン耐性でクロランフェニ
コール感受性の苗を選択した。これらの菌から前述の方
法を用いてプラスミドＤＮＡを抽出し、その一部を５ｕ
ｎｉｔのＥｃｏＲＩを含むＥｃｏＲ［バッフｙ　　５０
ｐｌ中で完全に消化した後、１％ＡＧＥで分離すること
により、ｐＢＲ３２５Ｋ連結したＤＮＡの大きさが１ｋ
ｂｐのものを選んだ。

このＤＮＡ断片を含むｐＢＲ３２５を、５　ｕｎｉｔの
Ｔａｑｌを含む生塩濃度制限酵素バッファー５０μｌ中
で６５℃、２時間インキュベートし、完全°に消化した
後、６％ＰＡＧＥでＤＮＡ断片を分離した。泳動パター
ンより、ワクチニアウィルスＨ４ｎｄｌｌｌ・Ｊフラグ
メント中のＴＫカルボキシル末端をコードする部分とＴ
Ｋ遺伝子転写終止部位を含むＥｃｏＲＩ　−Ｘｈｏ　Ｉ
　−ＤＮＡ断片がＥｃｏＲ１部位で連結したｐＢＲ３２
５を選択した。

このプラスミドＤＮＡ　２ｎを５ｕｎｉｔのＥｃｏＲ［
を含むＥｃｏＲＩバッファー中で完全に消化し、１％八
へＥによりＤＮＡ断片を分離した。ｐＢＲ３２５Ｋ連結
したＤＮＡ断片部位をアガロースゲルより切り出し、密
閉した透析膜中で電気泳動を行うことにより、ゲルから
ＤＮＡ断片を透析膜中に溶出し、この溶液からエタノー
ル沈澱によりＤＮＡを回収した。

次に、２４のｐＺｌを５ｕｒ＋ｉｔのＥｃｏＲＩを含む
ＥｃｏＲＩバフファー５０ｔ１１中で完全に消化し、等
量のフェノールで抽出後、エタノール沈澱により回収し
た。

ＥｃｏＲ１部位で開裂し直線状になったＤＮＡを前述の
方法を用いて脱リン酸化し、フェノール抽出後、エタノ
ール沈澱により回収した。

ＥｃｏＲＩ消化末端が脱リン酸化した０、１■のｐｚｌ
と、先に準備したＤＮＡ断片をＯ，１ｕｎｉｔのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを含む末端連結バッファー２０ｐ１中で、
１６℃、１２時間インキュベートして連結した。この連
結したＤＮＡを用いて、コンピテントな大腸菌ＤＨ−１
株を形質転換させ、Ａ＋＊ｐ培地上で、３７℃、　１８
時間培養した。　Ｌ−ｂｒｏｔｈ培地上に育成した薗の
中から、目的のＤＮＡ断片が連結したｐＺｌを含む菌を
選択するために、コロニーハイプリダイゼイションを行
った。

その方法は、Ｌ−ｂｒｏｔｈ培地上に育成した菌を、滅
菌したニトロセルロース紙に転写し、０．５ＭＮａＯＨ
で７分間、ｌ　ＭＴｒｉｓ（ｐＨ６，８）−０，６ＭＮ
ａＣ＋溶液で１分間２回、０．５ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７，
４）−１，５ＭＮａＣ＋溶液で５分間インキュベートし
た後、クロロフォルムで２回、０．３ＭＮａＣｌで１回
洗った。乾燥したニトロセルロース紙を８０℃。

３時間焼き、０．０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６，５
）、　４倍５ＳＣ（０，６ＭＮａＣ１−０，０６Ｍクエ
ン酸三ナトリウム）、５倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ　（０，２
χウシ血清アルブミン−０，２χフィコール−〇、２χ
ポリビニルピロリドン）及び２４ｎ／ｍＡ変性サケＤＮ
Ａから成る溶液中で、４２℃、４時間インキュベートし
た０次に、先にｐＺｌと連結したＤＮＡ断片と同じＤＮ
Ａ断片１ｇに３２Ｐを二ックトランスレーシヲンによっ
て標識したものを準備し、１００℃、５分間で変性させ
た後に、ニトロセルロース紙をインキエベートしている
溶液中に加え、４２℃、１２時間インキュベートした。

これを２倍５ＳＣ−０，１χＳＯ５溶液で数回、０．１
倍５ＳＣ−０，１χＳＯＳ溶液で５１℃、１５分間洗浄
した後、オートラジオグラフィにかけ、Ｘ線フィルム上
にスポットがあられれた菌を元のＬ−ｂｒｏｔｈ培地上
から選び、前述の方法を用いてプラスミドＤＮＡを抽出
した。

ｐＺｌに連結したＤＮＡ断片の方向を決定するために、
これらのプラスミドＤＮＡの一部を５ｕｎｉｔのＴａｑ
ｌを含む中温濃度制限酵素バフファー５０１１１中で、
６５℃、２時間インキュベートし完全に消化した。６％
ＰＡＧＥでＤＮＡ断片を分離し、泳動パターンより、ｐ
Ｚｌに連結したＤＮＡ断片上のＴＫ遺伝子部が、ｐＺｌ
上のＴＫ遺伝子部と連結しているものを選び、これをｐ
Ｚ２と命名した。

４　、　７．５Ｋｄａｌｔｏｎ蛋白質プロモーターを含
む５ａｉｌＤＮＡ断片の単離 ワクチニアウィルス（ＷＲ株）のウィルス粒子より抽出
した２躍のＤＮＡを、１０ｕｎｉｔの制限酵素５ａｌｒ
を含む５ａｃｌバツフｙ　−（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ（ｐＨ８，０）−１５０ｍＭＮａＣＩ−７ｍＭＭｇＣ
Ｉｚ−１ｉＭＤＴＴ）５０ｍ中で完全に消化した後、等
量のフェノールで抽出し、エタノール沈澱によりＤＮＡ
を回収した。これを、０．６％ＡＧＥで分離し、１ｋｂ
ｐ前後のＤＮＡ断片部をゲルより切り出し、密閉した透
析膜中で電気泳動を行うことにより、ＤＮＡ断片をゲル
から透析膜中に溶出し、この溶液からエタノール沈澱に
よりＤＮＡを回収した。

次に、２〜のｐＢＲ３２２を５ｕｎｉｔの５ａｌｌで完
全に消化し、フェノール抽出してエタノール沈澱により
回収した＊５ａｌｌ消化部位で開裂し直線状になったＤ
ＮＡを前述の方法を用いて脱リン酸化し、常法によりＤ
ＮＡを回収した。

Ｓａ目消化末端が脱リン酸化した０、１ＲのｐＢＲ３２
２と、先に調整したＤＮＡ断片を０．１ｕｎｉｔのＴ４
ＤＮＡリガーゼを含む突出末端連結バッファー２０４中
で混合し、１６℃、１２時間インキエベートして連結し
た。この連結したＤＮＡを用いて、コンピテントな大腸
菌ＤＨ−１株を形質転換させ、ＡＩＩＩｐ培地上で、３
７℃、１８時間培養した。これをベルベントを用いてＴ
ｃ培地に転写し、３７℃、１２時間培養した後、アンピ
シリン耐性、テトラサイタリン感受性の国を選択し、こ
れらの菌から前述の方法を用いて、プラスミドＤＮＡを
抽出した。その一部を５ｕｎｉｔのＴａｑｌを含む生塩
濃度制限酵素バッファー５０ｄ中で６５℃。

２時間インキエベートし完全に消化した後、６％ＰＡＧ
Ｅを用いて、これらＤＮＡ断片を分離し、泳動パターン
から７．５Ｋｄａｌｔｏｎ蛋白質プロモーターを含む５
ａｌｌ−ＤＮＡ断片が連結したｐＢＲ３２２を選択した
。さらに末端の一部のＤＮＡ配列を決定し、同ＤＮＡ断
片であることをＷ１認した。

５、ｐＺ３の構築（第２図） ７．５Ｋｄａｌｔｏｎ蛋白質プロモーターを含むＳａｌ
　Ｉ　−ＤＮＡ断片が連結した２ｎのｐＢＲ３２２を、
５ｕｎ１１のＴａｑｌを含む中堀濃度制限酵素バッファ
ー５０ｔｌＩ中で、６５℃、２時間インキエベートし、
完全にＤＮＡを消化した０等量のフェノールで抽出し、
エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した後、６％ＰＡＧ
ＥによりＤＮＡ断片を分離し、？　、５Ｋｄａｌｔｏｎ
蛋白質のプロモーター、転写開始部位及び翻訳開始部位
を含む約０．３４ｋｂｐのＤＮＡ断片部をゲルより切り
出し、密閉した透析膜中で電気泳動を行うことにより、
ＤＮＡ断片をゲルから透析膜中に溶出し、この溶液から
エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。

これを、２ｕｎｉｔの７４ＤＮＡポリメラーゼを含むＴ
４ＤＮＡポリメラーゼバッファー２０ｔｔｌ中で、３７
℃。

３０分間インキュベートし、平滑末端を形成した。フェ
ノール抽出し、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した
後、末端がリン酸化されたＰｓｔｌリンカ−と、１ｕｎ
ｉｔのＴ４ＤＮＡリガーゼを含む平滑末端連結パンファ
ー６０ｄ中で混合し、１６℃、　１２時間インキエベー
トした。再び等量のフェノールを加え抽出し、エタノー
ル沈澱でＤＮＡを回収した。これを５ｕｎｉｔのＰｓｔ
ｌを含むＰｓｔｌバッファー５０Ｊ中で完全に消化し、
余剰のＰｓｔＩリンカ−を前述の方法を用いて除去した
。

次に、２ｎのｐＺ２を５　ｕｎｉｔのＰｓｔｌを含むＰ
ｓｔ■パンファー５０ハ中で完全に消化し、等量のフェ
ノールで抽出し、エタノール沈澱でＤＮＡを回収した。

ＰｓｔＩ消化部位で開裂し直線状になったｐＺ２を前述
の方法を用いて脱リン酸化し、フェノール抽出後、エタ
ノール沈澱により回収した。Ｐａｔｌ末端が脱リン酸化
した０、１にのｐＺ２と、先に準備したＰｓｔｌリンカ
−が連結したＤＮＡ断片を、Ｑ、１ｕｎｉｔのＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを含む突出末端連結バッファー２０ｉ１１中
で混合し、１６℃、１２時間インキエベートした。

この連結したＤＮＡを用いてコンピテントな大腸菌ＤＩ
（−１を形質転換させ、Ａ＋ｓｐ培地上で３７℃、１８
時間培養した。この中から目的のＤＮＡ断片が連結した
ｐＺ２を含む菌を選択するために、ｓａｐで標識した７
　、５Ｋｄａｌｔｏｎ蛋白質遺伝子を含むＤＮＡ断片を
準備し、コロニーハイブリダイゼイシッンを行った。

？、５ＫｄａＨｏｎ蛋白質遺伝子を含むＤＮＡ断片が連
結したｐＺ２を含む菌より、前述の方法でプラスミドＤ
ＮＡを抽出した。連結したＤＮＡ断片の方向をしらべる
ために、抽出したＤＮＡの一部を、５ｕｎｉｔの制限酵
素ＨｐａＩＩを含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ
７，５）−１０ｓ＋ＭＭｇｃ１ｚ−１ｍＭ　ＤＴＴ溶液
５０ｉ１１中で完全に消化し、６％ＰＡＧＥにより、？
　、５Ｋｄａｌｔｏｎ蛋白質′のプロモーターの方向が
、ＴＫ遺伝子のプロモーターに対して正方向に連結して
いるものを選び、これをｐＺ３と命名した。

６、　　ｐＺ３Ｅ−８、ｐ　Ｚ　３　Ｅ−１０，ｐ　Ｚ
　３　Ｂ−１２（Ｆ）構築（第４図及び第５図） 日本脳炎ウィルス（ＪａＯ＾ｒ−５９８２株）のＣ抗原
、ｐｒｅＭ抗原、Ｍ抗原及びＥ抗原をコードする遺伝子
のＣＤＮＡ　（Ｓ　２２　：　Ｇｅｎｅ、　４８１９５
−２０１　（１９８６））　２ｔｒｔを、５ｕｎｉｔの
制限酵素ＢｇｌＩ［及び５ｕｎｉｔの制限酵素Ｍｌｕｌ
を含む高塩濃度制限酵素バッファー中で完全に消化し、
等量のフェノールで抽出後、エタノールによりＤＮＡを
回収した。

このＤＮＡ断片を１％ＡＧＥで分離し、Ｍ抗原の一部と
Ｅ抗原の全部の遺伝子をコードしているＤＮＡ断片（１
７２２ｂｐ）をゲルから切り出し、密閉した透析膜中で
電気泳動を行うことによりＤＮＡ断片部をゲルより透析
膜中に溶出し、この溶液からエタノール沈澱によりＤＮ
Ａ断片を回収した。

これを、２ｕｎｉｔの７４ＤＮＡポリメラーゼを含むＴ
４ＤＮＡポリメラーゼバッファー２０ｄ中で３７℃。

３０分間インキエベートして平滑末端を形成した後、フ
ェノール抽出してエタノール沈澱によりＤＮＡを回収し
、これを３等分した。

その各々に末端がリン酸化された長さの異なる３種類の
ＢａｍＨｒリンカ−（８ｎ＋ｅｒ、　１０ｍｅｒ、　１
２ｍｅｒ）を加え、それぞれ１ｕｎｉｔのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを含む平滑末端連結バフファー６０ｊｄ中で混合
し、１６℃、１２時間インキエベートして連結した。そ
れぞれ常法によりＤＮＡ断片を回収し、５ｕｎｉｔの制
限酵素ＢａｍＨｒを含む高塩濃度制限酵素バッファー５
０４中で完全に消化し、前述の方法を用いて余剰なりａ
ｍＨＩリンカ−を除去した。

これより、長さの異なる３種類のＢａｍＨＩリンカ−が
連結したＥ抗原遺伝子を含むＤ’ＮＡ断片を用いて３種
類のプラスミドを構築し、それぞれの組み換え体ワクチ
ニアウィルスを作成するが、これは、３種類の組み換え
体ワクチニアウィルスの７．５Ｋｄａｌｔｏｎ蛋白質遺
伝子とその下流の日本脳炎ウィルスＥ抗原量白質遺伝子
からの転写産物から翻訳される融合産物のうち、少なく
ともどれか１つが本来のＥ抗原蛋白質のアミノ酸配列を
もつことを期待するためである。

次に、２ｎのｐＺ３を５ｕｎｉｔのＢａｍＨＩを含む高
塩濃度制限酵素バッファー５０ｐｌ中で完全に消化し、
フェノール抽出後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収
した。ＢａＩＩＨ１部位で開裂し直線状になったＤＮＡ
を前述の方法を用いて脱リン酸化した。

ＢａｍＨＩ末端が脱リン酸化した０、１パのｐＺ３と、
先に０！備した３種類の３ｎｍＨｒリンカーが付加した
ＤＮＡ断片をそれぞれ０．１ｕｎｉｔのＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを含む突出末端連結パンファー２０４中で混合し、
１６℃、１２時間インキエベートした。この各々の連結
したＤＮＡを用いて、コンピテントな大腸面ＤＨ−１株
を形質転換させ、Ａｍｐ培地上で３７℃、１８時間培養
した。

この中から、Ｅ抗原の遺伝子を含むＤＮＡ断片と連結し
たｐＺ３を含む閉を選択するために３ｔｐを標識したＥ
抗原の遺伝子を含むＤＮＡ断片を準備し、それぞれコロ
ニーハイブリダイゼイシ賓ンを行った。

Ｅ抗原の遺伝子を含むＤＮＡが連結したｐＺ３を含む菌
より、前述の方法でプラスミドＤＮＡを抽出した。連結
したＤＮＡ断片の方向を決定するため、抽出したＤＮＡ
の一部を５ｕｎｉｔの制限酵素５ａｃｌを含む１０ｍＭ
Ｔｒ　ｉｓ　−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）−７ｍＭＭｇＣ
１ｔ　−２０ｍＭＭＣｌ　−Ｉｎ＋ＭＤＴＴ溶液５０４
中で完全に消化し、１％ＡＧＥでＤ　Ｎ　Ａ断片を分離
した。

泳動パターンからＥ抗原遺伝子がｐＺａ内の７．５Ｋ　
ｄａ　ｌ　ｔｏｎ蛋白質の遺伝子プロモーターに対し、
正方向に連結しているものを選び、Ｅ抗原遺伝子に付加
したＢａｍＨＩリンカ−が８抛ｅｒ、　１抛ｅｒ及び１
２ｍｅｒであるものを、それぞれｐＺ３Ｅ−８、ｐＺ３
ｇ　−１０及びｐＺ３Ｅ−１２と命名した。

７、ｐＺ４の構築（第３図） ２４のｐｚ２を、１５ｕｎｉｔの制限酵素Ｘｂａ１を含
む高塩濃度制限酵素バッファー５０ｐＩ中で部分消化（
３７℃、１２分間）した後、等量のフェノールで抽出し
、エタノール沈澱により回収した。これを１％ＡＧＥで
分離し、４．３ｋｂｐのＤＮＡ断片部分をゲルより切り
出した＊ｐＺ２はＸｂａｌにより完全に消化されると、
０．５ｋｂｐと３．７ｋｂｐの２つの断片に分離するが
、部分消化を行った場合、一方の制限酵素部位のみが消
化された４、３ｋｂｐの中間体を生じる。この４．３ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片をゲルを密閉した透析膜中で電気泳動
を行うことによりＤＮＡ断片をゲルから透析膜中に溶出
し、この溶液からエタノール沈澱によりＤＮＡを回収し
た。

これを２ｕｎｉｔの７４ＤＮＡポリメラーゼを含むＴ４
ＤＮＡポリメラーゼバッフｙ−２０ｔｄ中で、３７℃。

３０分間インキエベートして平滑末端を形成した。フェ
ノール抽出し、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した
後、前述の方法を用いて末端の脱リン酸化を行った。

次に、先に単離した７、５Ｋ蛋白質プロモーターを含む
５ａｌｌＤＮＡ断片が連結した２遁のｐＢＲ３２２を５
ｕｎｉｔのＲｓａＴを含む生塩濃度制限酵素バッフｙ−
５０Ｊ中で完全に消化し、フェノール抽出後、エタノー
ル沈澱によりＤＮＡを回収した。

これをＨｉｎｃ　Ｕを含む高塩濃度制限酵素バッファー
５０Ｊｄ中で完全に消化し、同様にＤＮＡを回収した。

得られたＤＮＡ断片を６％ＰＡＧＥにより分離し、約２
５ｏｂｐのＤＮＡ断片をゲルより切り出した。透析膜を
用いた電気泳動によりＤＮＡをゲルより抽出し、エタノ
ール沈澱で回収した。

このＤＮＡ断片と、先に準備した０、１ｎのｐＺ２由来
のＤＮＡ断片を１ｕｎｉｔのＴ４ＤＮＡリガーゼを含む
平滑末端連結バッファー６０ｄ中で混合し、１６℃。

１２時間インキエベートした。この連結したＤＮＡを用
いて、コンピテントな大腸菌ＤＨ−１を形質転換させ、
Ａｍｐ培地で３７℃、１８時間培養した。この中から目
的のＤＮＡ断片を含むｐＺ２を選択するために、Ｓａｐ
で標識された７、５Ｋ蛋白質プロモーターを含むＤＮＡ
断片を準備し、コロニーハイブリダイゼーションを行っ
た。

７．５Ｋ蛋白質プロモーターを含むＤＮＡ断片が連結し
たｐＺ２を含む菌より、前述の方法でプラスミドＤＮＡ
を抽出し、その一部を５ｕｎｉｔのＴａｑｌを含む中堀
濃度制限酵素バッファー５０ｄ中で完全に消化した。こ
れを６％ＰＡＧＥで分離し、泳動パターンから、ｐＺ−
２のＴＫ遺伝子の上流のＸｂａ１部位にＴＫ遺伝子のプ
ロモーターに対して正方向に７．５Ｋ蛋白質プロモータ
ーが連結しているものを選び、これをＩ）Ｚ４と命名し
た。

８、ｐＺ４Ｅ−８、ｐＺ４Ｅ−１０、ｐＺ４Ｂ−１２の
構築（第４図及び第６図） ２ＲのＩ）Ｚ４を、５　ｕｎｉｔのＢａｍＨＩを含む高
塩濃度制限酵素バッファー５０４中で完全に消化した後
、等量のフェノールで抽出し、エタノール沈澱によりＤ
ＮＡを回収した。ＢａｍＨ１部位で開裂し直線状になっ
たＤＮＡを前述の方法を用いて脱リン酸化し、同様にし
てＤＮＡを回収した。

次に、第６項で作製した３種類の長さの異なるＢａｍＨ
ｒリンカ−が連結した日本脳炎ウィルスＥ蛋白質遺伝子
を含むＤＮＡ断片と同様なりＮＡ断片を、それぞれ０．
１ｕｎｉｔの７４ＤＮＡポリメラーゼを含む突出末端連
結バッフｙ−２０１１１中で、０．１にのＢａ＋＊ＨＩ
末端が脱リン酸化したｐＺ４と混合し、１６℃、１２時
間インキエベートした。このそれぞれの連結したＤＮＡ
を用いてコンピテントな大腸薗ＤＨ−１株を形質転換さ
せ、Ａｍｐ培地上で３７℃、１８時間培養した。

この中から、Ｅ蛋白質遺伝子を含むＤＮＡ断片と連結し
たｐＺ４を、第６項同様、コロニーハイブリダイゼーシ
ョンにより選択し、前述の方法を用いてプラスミドＤＮ
Ａを抽出した。連結したＤＮＡの方向を決定するため、
抽出したＤＮＡの一部を５　ｕｎｉｔの制限酵素５ａｃ
ｌを含む５ａｃｌバツフア一５０ｍ中で完全に消化し、
１％ＡＧＥでＤＮＡ断片を分離した。

泳動パターンから、Ｅ蛋白質抗原の遺伝子がｐＺ４内の
７．５Ｋ蛋白質プロモーターに対して正方向に連結して
いるものを選び、Ｅ蛋白質遺伝子に付加したＢａ＋ｍＨ
Ｉリンカ−が８ｍａｒ＋　Ｌｏｗｅｒ及び１２ｍｅｒで
あるものを、それぞれｐＺ４Ｅ−８、ｐＺ４Ｂ−１０及
びｐＺ４Ｅ−１２と命名した。

９、＆ｌｌみ換え体ワクチニアウィルスの作製直径６ｃ
ｍの培養シャーレ上に、ＲＫ１３細胞を育成させ、ワク
チニアウィルス（ＬＣ１６１１８株）を０．０２５Ｐ、
Ｆ、Ｕ、／細胞で感染させた。感染後２時間目に、培養
液を除去し、Ｈａｐｅｓバッフｙ−（０，２７ｍＭＮａ
Ｃ＋−５＋＊ＭＫＣＩ−０，７ｍＭＮａ＊ＨＰＯｅ−０
．２χブドウＩ！−４２＋５ＭＮ−２−ハイドロキシエ
チルとベリジン（ｐＨ７，２））中で、終濃度１２５ｍ
ＭのＣａＣ１□の添加により５Ｒのサケ精子ＤＮＡと共
に沈澱を形成している１鱈のｐ２３Ｅ−８、ｐＺ３Ｅ−
１０Ｓｐ　２３　Ｅ−１２、ｐＺ４Ｅ−８、ｐＺ４Ｅ　
−１０及びｐＺ４Ｂ−１２をそれぞれワクチニアウィル
ス感染ＲＫ−１３細胞上に滴下した。

３７℃で１時間インキエベートした後、５％ウシ胎児血
清を含むイーグルＭＥＭ　ｄ−を加え、３７℃、二酸化
炭素インキュベーター内で培養した。４８時間後に、培
養シャーレごと凍結し、融解後、細胞分画を超音波によ
り破砕し、低速遠心により核を除去した上滑を培養上滑
分画と混合し、ウィルス懸濁液とした。

１０、組み換え体ワクチニアウィルスの選択それぞれの
ウィルス懸濁液を１０倍ずつ段階希釈しその０．１−を
、２４ｗｅｌｌプレート内で単層を形成しているフィッ
シャーラット由来のＴＫ−細胞Ｆ　２４０８に感染させ
た。２５ｎ／−のブロモデオキシウリジン（ＢｕｄＲ）
を含むｌＯ％ウシ胎児血清加ＤＭＥＭを加え、３７℃、
二酸化炭素インキュベーター内で培養した。４８時間後
に、０．６％アガロース、　１０％０％ウシ胎清及び２
５ＩＮ／ｄＢｕｄＲを含むＤＭＥＭを各ｗｅｌｌにｌｄ
ずつ重層して２４時間後に、０．０６χニユートラルレ
ツド、０．６χアガロース、１０χウシ胎児血清、２５
ｎ／＋ａｆｆｉＢｕｄＲを含むＤＭＥＭを各−ｅｌｌに
１−ずつ重層したｍ　ｗｅｌｌ内に染め出されたプラー
クを滅菌したパスツールピペットを用いて単離し、別に
準備した２４ｗａｌｌプレート内のＦ　２４０８細胞に
感染させ、３７℃、二酸化炭素インキエベーター内でウ
ィルスを増殖させた。

１１、＆Ｈみ換え体ワクチニアウィルスによる日本脳炎
ウィルス抗原の発現 上記第１Ｏ項で得られたＴＫ−のワクチニアウィルスを
、スライドグラス上で培養したＦ　２４０Ｂ細胞にｍ、
ｏ、ｉ、−０，０１で感染させ、二酸化炭素インキエベ
ーター内で３７℃、２４時間培養した。その後、感染細
胞を風乾し、氷冷したメタノール中で１０分間固定した
。

これを再び風乾し、１００倍に希釈した抗日本脳炎ウィ
ルスウサギ血清（抗ＪＥＶ血清）又は非免疫のウサギ血
清と反応させた。リン酸塩緩衝液中で１０分間洗い、次
に５０倍に希釈した抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣと３７℃
で２０分間反応させた。再びリン酸塩緩衝液中で１０分
間洗い、螢光顕微鏡下で観察した。

ｐ２３Ｅ−８、ｐ２３Ｅ−１０、ｐＺ３Ｂ−１２、ｐＺ
４Ｅ−８、ｐＺ４Ｅ−１０及びｐ２４Ｅ−１２との組み
換えによって作製されたＴＫ−の組み換えワクチニアウ
ィルスを、それぞれＶｐＺ３Ｂ−８、ＶｐＺ３Ｅ−１０
、ＶｐＺ３Ｂ−１２、ＶｐＺ４Ｂ−８、ＶｐＺ４Ｂ−１
０及びＶｐＺ４Ｅ−１２と命名し、試験結果を第１表に
示す。

第１表 抗ＪＥＶ血清　　非免疫血清 ＶｐＺ３Ｅ−８−− ＶｐＺ３Ｅ−１０＋＋　　　　　　　−ＶｐＺ３Ｂ−１
２−− ＶｐＺ４Ｂ−８＋　　　　　　　　− Ｖ［）２４Ｅ−１０−− ＶｐＺ４Ｅ−１２−− 対照（ＬＣ１６ｍ８株）−一 （作用及び効果） 上記の第１表のうち、抗ＪＥｖ血清を用いた場合の螢光
顕微鏡下真の一例を第７乃至９図に示す。

第１表及び第７乃至９図から明らかなように、３種の長
さのリンカ−を用いて作製した組み換えワクチニアウィ
ルスの中で、ＴＫ遺伝子中に７．５Ｋ蛋白質プロモータ
ー（Ｐ　？、　Ｓ）が挿入されているｐＺａＥシリーズ
（第５図）ではｌ　Ｑｍｅｒのリンカ−をつけたもの、
また、Ｐｌ、、がＴＫ遺伝子の上流に挿入されているｐ
Ｚ４Ｅシリーズ（第６図）では３ｎ＋ｅｒのリンカ−を
つけたものが本来の正しいリーディング・フレームを持
つものであった。

以上のように、本発明組み換えワクチニアウィルスは外
来の日本脳炎Ｅ蛋白質を効率的に発現するため、日本脳
炎に対するワクチンとして有用である。

この組み換えウィルスによるワクチンは、現行のワクチ
ンのように、膜物質の混入による中枢神経障害を引き起
こす心配がなく安全に使用でき、また、マウス等の生き
ている動物を用いて製造する必要がなくなり、無駄な動
物を殺すことなく安価で簡単にワクチンを製造できるた
め、多くの面で有用性が高いものである。

また、本発明組み換えワクチニアウィルスを培養細胞等
に感染させることによって、該細胞に抗原蛋白質を製造
させることができ、効率的に日本脳炎抗原蛋白質を入手
することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はワクチニアウィルスのＴＫ遺伝子部分を組み込
んだプラスミド（ｐＺ２）、第２図はｐＺ２のＴＫ遺伝
子部分の中に７．５Ｋ蛋白質プロモーターを挿入したプ
ラスミド（ｐＺ３）、第３図はｐＺ２のＴＫ遺伝子部分
の上流に７．５Ｋ蛋白質プロモーターを挿入したプラス
ミド（ｐＺ４）の製造方法を図示したものである。 第４図は、日本脳炎ウィルスのＥ構造蛋白質遺伝子を含
み３種の長さのリンカ−を有するｃＤＮＡ（Ｅ断片）の
製造方法を示した図である。 第５図はｐＺ３にＥ断片を、第６図はｐＺ４にＥ断片を
組み込んで最終的に得た挿入プラスミドを示したもので
ある。 第７乃至９図は、抗ＪＥＶ血清を用いて日本脳炎ウィル
ス構造蛋白質の発現を確認した螢光顕微鏡写真の一例で
ある。 代理人　（６８９１）　　弁理士　村山佐武部第１図 第２図 第３図 第４図 日本脳炎ウィルスＥ蛋白質遺伝子 り°ンカー 第５図 第６図 脈と 手続ネ甫正書（方式）（＋） １．事件の表示 昭和６２年特許願第２７５９８２号 ２、発明の名称 大阪市東区平野町２丁目１０番地 日本臓器製薬株式会社 代表者小西甚右衛門 ４、代理人 大阪市東区平野町２丁目１０番地 （発進口　昭和６３年１月２６日） ６、補正の対象 図面（第７図、第８図及び第９図）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）日本脳炎ウィルスの構造蛋白質をコードする遺伝
   子のｃＤＮＡを含有する組み換えワクチニアウイルス。
2. （２）構造蛋白質が実質的にＥ構造蛋白質である特許請
   求の範囲第１項に記載の組み換えワクチニアウイルス。
3. （３）ｃＤＮＡがワクチニアウイルスのプロモーターの
   制御下にある特許請求の範囲第１項に記載の組み換えワ
   クチニアウイルス。
4. （４）ワクチニアウイルスのプロモーターが７．５Ｋ蛋
   白質遺伝子のプロモーターである特許請求の範囲第３項
   に記載の組み換えワクチニアウイルス。
5. （５）ｃＤＮＡがワクチニアウイルスの非必須遺伝子中
   に挿入されている特許請求の範囲第１項に記載の組み換
   えワクチニアウイルス。
6. （６）非必須遺伝子がチミジンキナーゼ遺伝子である特
   許請求の範囲第５項に記載の組み換えワクチニアウイル
   ス。
7. （７）日本脳炎ウィルスの構造蛋白質をコードする遺伝
   子のｃＤＮＡを含有するプラスミド。
8. （８）構造蛋白質が実質的にＥ構造蛋白質である特許請
   求の範囲第７項に記載のプラスミド。
9. （９）大腸菌プラスミドである特許請求の範囲第７項に
   記載のプラスミド。
10. （１０）日本脳炎ウィルスの構造蛋白質をコードする遺
    伝子のｃＤＮＡを含有する組み換えワクチニアウイルス
    を含有する日本脳炎ワクチン。