JPS6239530A - ボルデテラ・ブロンキセプチカの粉状ワクチン製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は？ルデテラ・プロンキセプチ力（Ｂｏｒｄｅｔ
ｅｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）の粉状ワク
チン製造法に関する。

〔発明の背景〕

♂ルデテラ・プロンキセゾチカは、ブタ伝染性萎縮性鼻
炎の原因菌でダラム陰性昭の一つとして公知であり、前
記菌に感染発病したゲタは鼻腔粘膜に慢性の炎症をおこ
し、病勢が進むに従い、鼻甲介および上顎骨が萎縮し、
後遺症として一部のブタにいわゆる「鼻曲シ」あるいは
「ちんづら」がみられる。

感染率は高く死亡率低いが、成長の遅延、飼料効率の低
下が認められ、養豚に及ぼす被害は甚大である。

また本店に対するワクチンとしては、液状のものが市販
されており、その感染防御効果は認められている。一般
的方法に従って製造されるワクチンには、病原微生物を
ホルマリン等の化学的手段を用いて死菌化する不活化ワ
クチンと、病原微生物を生物学的手段を用いて弱毒化す
る弱毒化ワクチントカあり、前記ゲルデテラ・プロンキ
セプチカ菌についての前記市販ワクチンもこれら前記に
属する。

しかしこれらのワクチンは、微生物由来のタン・母りイ
糖、脂質などを含んでいる等の理由から、抗原性を長期
に亘って維持することが困難である。

そこで長期保存のためには、凍結乾燥、凍結、冷蔵保存
等の条件が採用されるが、このうち最も保存効果の優れ
たものとされる凍結乾燥法では、これを実施するために
多大な設備投資が必要になりまた電力消費も大きいとい
う問題がある。

このような現状から、抗原性の寿命が長期に亘るワクチ
ンの簡便な製造法の提供が望まれる。

また前記病原閑に対するワクチンの製造に際して望まれ
る他の課題は、製造されたワクチンの運搬、取扱い性の
容易化を実現することである。従来の液状または凍結乾
燥ワクチンでは、大量運搬に難があったり特殊な運搬手
段が必要になるからである。

〔発明の目的〕

本発明は、前述した従来ワクチンとは異なり、ホルマリ
ンで歯の感染性と毒素を不活化した菌液から、特定の極
性溶媒を使用することによって？ルデテラ・プロンキセ
ゾチカ菌の回収を図ると共に、更に極性溶媒又はエーテ
ルを使用した簡便なる方法により菌の脱水乾燥を図り、
抗原性の寿命が長期に亘る粉状ワクチンを提供すること
を目的とする。

また本発明の別の目的は、常温下でも保存できる粉状ワ
クチンを提供するところにある。

ここで粉状ワクチンとは、ボルデテラ・プロンキセグチ
カの感染性を不活化し、脱水して乾燥粉状とした抗原を
いう。

〔発明の概要〕

而して前記した目的を実現するためになされた本発明方
法の特徴は、ボルデテラ・プロンキセ！チカ菌のホルマ
リン不活化培養菌液（あるいはこれより沈殿分離した前
記菌をＮａＣｌ添加緩衝液又は生理食塩水に懸濁させた
菌液）に、該菌液の２〜６倍量の極性溶媒を加えて生成
する沈殿を回収し、回収した沈殿を極性溶媒又はエーテ
ルにＳ濁させて再度沈殿を回収し、これを減圧下で乾燥
させるところにある。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明においては、ボルデテラ・プロンキセグチカ菌を
含む液を製造材料として下記操作を順次に行なうことに
より、感染性の不活化された抗原が脱水乾燥された粉状
のものとして好適に製造される。

（ａ）　　極性溶媒を用いた菌の回収 （ｂ）　　極性溶媒又はエーテルを用いた菌の脱水乾燥 製造材料 本発明において使用される製造材料には、ボルデテラ・
グロンキセプチカの培養菌液が用いられる。

ワクチンに混入する培地成分等を積極に分離除去する場
合には、遠心法を用いて培養菌液中の培地成分を除去し
、得られた菌分画をＮａＣｌを含む緩衝液（リン酸塩緩
衝液、トリス塩酸緩衝液等）又は生理食塩水に懸濁させ
た菌液を用いてもよい。

菌の培養は一般的方法に従って行なわれるが、使用され
る培地の一例を示せば次の通りである。

培地：１０００−中 カゼイン製ペプトン　　　　　１７１ 大豆製イブトン　　　　　　　　３．９イースト・エキ
ストラクト　　　　　５ｇ塩化ナトリウム　　　　　　
　　５Ｉ リン酸二カリウム　　　　　　　　２．５ｇぶどう糖　
　　　　　　　　　　２．５ｇ菌の不活化および回収 菌の不活化は、前記製造材料としての菌液に、通常０．
２５Ｖ／Ｖ％ホルマリンを加えて３７°で一夜装置する
ことで行なわれる。

菌の回収においては、上記不活化菌液に極性溶媒を加え
て攪はんした後、所定時間静置し、沈澱が生じて沈澱と
上清が明確に区分できる時点で上清を除去し、沈澱を回
収する。

前記極性溶媒としては、メタノール、エタノール、アセ
トンが挙げられる。

前記菌液に加えるべき極性溶媒は、冷却して用いること
が望ましい。また菌液に対して加えるべき量は通常は２
〜６倍量、好ましくは２〜３倍量とされる。

極性溶媒を加えることにより、菌液中の懸濁物は誘電率
の低下に伴なって凝集沈澱を生じるが、極性溶媒の加え
る量が少ないと沈澱の生成が充分でなく、反対に多すぎ
る場合には、得られる沈澱が塊状のものとなって次段の
脱水乾燥の操作の際に、充分な脱水が達成されないこと
になる。

なお、菌の回収のためには、前記極性溶媒の他に硫ｒＲ
アンモニウム、ポリエチレングリコール等も使用できる
が、次段の脱水乾燥の操作に先立ってこれらの除去操作
を行なう必要があるため、簡便な製造方法を実現する目
的から適当でない。

また極性溶媒を加えることで生成される沈澱分画は、一
般的には遠心分離により回収されるが、その他口紙、ホ
ロファイバー、メンツレインフィルター等を用いた口過
によってもよい。

また沈澱と上澄みの明確な区分を得るには、極性溶媒を
加えた溶液を少なくとも１時間以上、好ましくけ２〜３
時間程度靜置することが望ましい。

菌の脱水乾燥 菌の脱水乾燥においては、前記により回収された菌の沈
澱分画を有機溶媒に懸濁させた後、沈澱を回収して減圧
下で乾燥する。

前記溶媒としては、菌の回収操作において使用される極
性溶媒（メタノール、エタノール、アセトン）、又はエ
ーテルが使用されるが、極性溶媒の場合、菌の回収で用
いたものと同一であることは要しない。

前記の溶媒は、冷却して用いることが望ましい。

菌の沈澱ｔ−Ｓ濁させる前記溶媒の量は特に制限されな
いが、製造に用いた菌液の約半量程度浜されることが望
ましい場合が多い。

また沈澱の回収は、一般的には遠心分離又は口過によっ
て行なわれる。なお沈澱の回収に先立って懸濁液は１時
間程度以上、好ましくは２〜３時間静置することがよい
。

減圧乾燥は、回収した沈澱より溶媒を蒸散させるもので
あり、減圧（真空）容器内に前記回収した沈澱を収容さ
せて行なわれる。

以上の菌の脱水乾燥の操作は、前段における菌の回収の
操作による緩やかな脱水作用に相まって・製造されるワ
クチンの好適な乾燥を実現するが、必要ならば脱水乾燥
の操作を２回以上繰り返して行なうようにしてもよい。

前述した菌の回収および脱水乾燥によって製造された粉
状ワクチンは、これをマウスに接種することで行なった
検定試験において好適な感染防御効果を示すことが確認
された。

また粉状ワクチンは、２２’Ｃ’を越えない条件の下で
抗原性の安定な保存が可能であり、４℃以下の最適条件
下では、２年以上に亘り長期保存もできる。

本発明方法の７０−シートを一例として示すと次の通り
である。

粉状ワクチンの作製行程率１ 培養菌液　５００１Ｉ／ ホルマリン　Ｌ２５− 添加、３７℃−夜装置 ↓ １２０００ｒｐｍ　　。

２０分遠心して菌を 洗浄車２ ↓ ↓　　　　　　　　　　　　　　　　↓−ルまたは冷ア
セト ンに＠濁し、０−４ ℃で２〜３時間靜置＊６ ↓ １２０００ｒｐｍ　　。

２０分遠心 ↓ 沈殿を減圧下で乾燥率７ ↓ ４℃で保存＊８ ＊１　全行程は０〜４℃で行なわれる。

本２　菌以外の培地成分が略除去される。

＊Ｓ　リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ　） ＮａＣｌａ、ｏ１！ ＫＣｌ　　　　　　Ｏ，２ｇ Ｎａ２Ｈ’ＰＯ４１，１５９ ＫＨｉ・Ｐ○４０．２．Ｆ 上記試薬を蒸留水に溶解して１，０００−とし、その５
００−に菌を懸濁させる。

木４　菌を略１００％回収した含水状態の沈澱物。

＊５　菌を略１００チ回収し、菌以外の培地成分もいく
らか含む含水状態の沈澱物。

＊６　本操作以降は、沈殿率４．沈澱本５について共通
。

＊７　真空デシケータ内に一夜収容。

＊８　乾燥した粉状のワクチンのまま。

〔発明の実施例〕

（培養菌液） ？ルテテラ・プロンキセプチカ１Ｎ−４０株１相菌につ
いて、前記−例として示した液体培地により、３７℃、
通気、攪はんの条件で１７時間培養した後、ホルマリン
を添加して不活化して培養菌液を作製した。

？ルデテラ・グロンキセデチカＮ−４０株は武田薬品工
業株式会社福知山農場より分与されたものである。

（乾燥粉状ワクチンの製造） 前記した培養菌液を製造材料として、前述のフローシー
トの手順に従い粉状ワクチ／ｌ−製造した。

その結果を表１に示す。いずれのロフトも培養菌液から
回収した沈澱をリン酸緩衝食塩液＊９で懸濁した菌液を
使用し、菌の回収および脱水乾燥のためにはアセトンを
使用した。

（粉状ワクチンの力価試験法） 製造された粉状ワクチン、ロット３の０．２■を、２．
５りの水酸化アルミニウムダル本１０を含むリン酸塩緩
衝液（ｐＦ（７，２〜７．４）０．２−に溶解し、こ　
　　゛れをマウスの腹腔内に注射した。注射後２週目に
３〜４Ｘ１０ＣＦＵのゲルデテラ・プロンキセデチカＮ
−４０を腹腔内に注射し、その後１週間生死を観察する
ことで行なった（表２−１参照）。

また、同ワクチンを生後１力月以内のゲルデテラ・プロ
ンキセグチカに対する抗体フリーの子豚２頭の筋肉内に
１−を注射し、３週間後に採血し抗体を測定することで
行なった（表２−２参照）。

＊９　リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ　） Ｎａ０１　　　　　　　　　　Ｂ、０ＩｉＫＣＩ　　　
　　　　　　　　Ｏ，Ｉ Ｎａ　２ＨＰＯ４１，１５１！ ＫＷ２ＰＯ４０，２，９ 上記試薬を蒸留水に溶解して１０００−とする。

＊１０　水酸化アルミニウムダル 硫酸アルミニウム　　　　１４９．１ アンモニア水　　　　８５．３ｍ 上記試薬を蒸留水に溶解して１０００−とする。

なお粉状ワクチンの力価判定は、マウスの生死の結果を
、ワクチン非接種群について同様の菌感染を行なったも
のを対照として、その生死を対比することで行なった（
表２−１．２−２参照）。

また粉状ワクチンの抗原性の長時間安定性を判定するた
めに、一定期間保存後の粉状ワクチン、ロット１および
２について前記試験を同様に行なった。

なお、ワクチン注射後２遇目のマウスについて、全採血
し血清中の凝集抗体価も測定した（表２−３．２−４参
照）。

表２−１ 表２−２ さらに、ブタでは１頭を非接種対照として凝集抗体価を
測定した。抗原は〆ルデテラ・グロンキセプチカＮ４０
株の■相菌死菌液をＭｃＦａｒｌａｎｄ混濁管＆５の濃
度にＰＢＳで希釈したものを使用した◎その結果は表３
に示した通りである。

表　　３ 以上の表２−１〜２−４および表３に示された結果から
、本発明よりなる粉状ワクチンは対照との比較において
、マウスの生死および凝集抗体価のいずれにおいても抗
原性が確認され、また長期保存後においても抗原性は維
持されていた。ブタにおいても表３の通りであり、抗原
性が確認された。

〔発明の効果〕

本発明によれば、抗原性の寿命が長期に亘って安定し、
かつ製造設備も安価なものによって得られる粉体ワクチ
ンが提供され、♂ルデテラ・プロンキセ！チカの感染防
禦用ワクチンとしての有用性は極めて高く、その効果は
大なるものである。

本　　多　小　平　　麿−７ｉ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ポルデテラ・ブロンキセプチカ菌のホルマリン不活化培
   養菌液に、あるいはこれより沈殿分離した前記菌をＮａ
   Ｃｌ添加緩衝液又は生理食塩水に懸濁させた菌液に、該
   菌液の２〜６倍量の極性溶媒を加えて生成する沈殿を回
   収し、回収した沈殿を極性溶媒又はエーテルに懸濁させ
   て再度沈殿を回収し、これを減圧下で乾燥させることを
   特徴とするポルデテラ・ブロンキセプチカの粉状ワクチ
   ン製造法。