JPS61143326A - 酵素−洗浄剤抽出ストレプトコツカス・エクイワクチンの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素の消化および洗浄剤の処理を用件蛋白質
物質を調製すること、およびこの物質を感染に対するワ
クチンとして使用することに関する。

ｌユ旦ユと呼ぶ）は、・ランスフィールド（Ｌａｎｃｅ
ｆｉｅｌｄ）の群Ｃのストレプトコッカス（Ｓｔ　ｒ’
ｅｐｔ　ｏｃｏｃｃｕｓ）として分類される０例えば、
バーゲイ（ｎｅｒｇｅｙ）のマニュアル・オプ・ディタ
ーミニティブーバクテリオロジー（Ｍａｎｕａｌ　　ｏ
ｆ　　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｔｉｖｅ　　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ）（第８版）４９８ページ（１９７４）参照
、それは「伝染性熱病（Ｓｔｒａｎｇｌｅｓ）Ｊと呼ば
れるウマの重い呼吸器の病気の病原因子として認識され
ている。この病気は世界の大部分において地方流行病で
あり、そして米国において流行している。

レースおよびショウのウマは、移動のストレスおよび新
しい接触体への暴露のために、反復した感染をとくに受
けやすい、この病気は粘液膜状の鼻の排出物、３９．４
〜４１．１℃（１０３〜１０６″Ｆ）の体温、および上
方の呼吸器の粘膜の重い炎症を伴なって開始する。それ
は最終的にリンパ膣炎および膿瘍の形成に進行し、時に
は十分に重くなって空気の取入れを制限しそして動物を
窒息させる。伝染性熱病はしばしば４〜６週間続くので
、状態の広範な損失（体重の損失）を起こす。

ウマの５ｔｒｅｐ、　　ｅｑｕｉの感染の衰弱作用およ
びある場合には致死作用のために、活性免疫化の目的で
使用することができる互」ニー見」エエｅｑｕｉワクチ
ンを調製する試みが多年にわたってなされてきている。

不幸なことには、互±相性が認められており、そのため
注射部位における重い膨化およびが生成しそして膿瘍を
形成することさえある。これらの既知の反応性は免疫化
互ｔｒｅｐ、　　ｅｑｕｉ生産物の開発および／または
商業的使用を失望させる傾向があった。しかしながら、
２種類の伝染性熱病ワクチンを商業的に事実入手するこ
とが可能である。第１の商用生産物は全培養物の化学的
に不活性化されたＳｔ　ｒｅＬユ　ｅｑｕｉ調製物［Ｆ
ｔ、ドッグ・コーポレーション（Ｄｏｄｇｅ　　Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔ　ｉ。

ｎ）から供給される］であった、第２の商用生産物は、
ｒＳｔｒｅｐ、　　ｅｑｕｉから誘導された精製抗原の
濃縮された水酸化アルミニウムー吸着懸濁液」と記載さ
れる細胞不含Ｍ様タンパク賀ワクチン［ブオウフス・ウ
ェルカム・カンパニー（Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ　　Ｗｅｌ
ｌｃｏｍｅ　　Ｃ０、）から入手可能］であった。この
ワクチンを調製する方法は、米国特許第３，７９３，１
５０号および米国特許第３，８５２，４２０号に記載さ
れていると考えられる。５ｔｒｅｐ、　　ｅユニｉから
のこのような「Ｍ様タンパク質」の精製は、また、文献
：Ｊ、Ｂ、ウールコック（Ｗｏｏｌｃｏｃｋ）、インフ
ェクション拳アンド・イムノロジー（Ｉｎｆｅｃｔ、ａ
ｎｄ　　Ｉ　ｍｍｕｎ、）、１９７４年７月、１１６−
１２２ページに記載されている。ここで使用されている
ように、ｒＭ様タンパク質」という表現は、群Ａのスト
レプトコツカス属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）のＭ様
タンパク質に分子量および活性が類似すると思われる５
ｔｒｅｐ、　　ｅｑｕｉＩＴａ体の免疫原蛋白質（類）
を意味する。

Ｍ様タンパク質と呼ぶ互」−り見」よ−　ｅｑｕｉの有
機体の細胞壁上の蛋白質がバクテリアの抗原性部分であ
るという理論は１文献：Ｓ、に、スリバスタバ（Ｓｒｉ
ｖａｓｔａｖａ）およびり。

Ａ、バルヌム（Ｂａｒｎｕｍ）、カナディアン・ジャー
ナル・オブ・コンパレイテイブ・メデイシン（ｃａｎ、
Ｊ、Ｃｏｍｐ、Ｍｅｄ、）、Ｖ。

１．４６．５１−５６ページ、１９８２、Ｓ。

Ｋ、スリバスタバ（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ）およびり、
Ａ、バルヌム（Ｂａｒｎｕｍ）、アメリカン・ジャーナ
ルΦオブ・ベテリナリー争リサーチ（Ａｍ、Ｊ、Ｖｅｔ
、Ｒｅｓ、）、Ｖｏｌ、４４．４１−４５ページおよび
Ｅ、Ｄ、エリクソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）およびＮ、Ｌ
、ノルクロス（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ）、カナディアン・ジ
ャーナル・オブ・コンパレイティブ・メディシン（ｃａ
ｎ、Ｊ、Ｃｏｍｐ、Ｍｅｄ、）、Ｖｏｌ、３９゜１１０
−１１５ページ、１９７５．すべての以前の研究におい
て、このＭ様タンパク質は、旦↓工１Ｌユ　見ユ且ユ有
機体から、この有機体を低いｐＨ条件（ｐＨ２）および
高い温度（９５〜１００℃）に所定の時間（１０〜１５
分）暴露することによって抽出された。これはＭ様タン
パク質を調製する「熱抽出」法と呼ばれてきた。蛋白質
はこれらの条件下に沈殿し、そしてこの溶液のｐＨをｐ
Ｈ７以上に上げることによって可溶化され今回、Ｍ様タ
ンパク質を５ｔｒｅｐ−見ユニｉ有機体から取り出す改
良された方法をわれわれは開発した。その詳細をここに
記載する。

今回、抗原性Ｍ様タンパク質を５ｔｒｅｐ。

ｆｆｌユ培養物から２工程において分解酵素の消化を使
用し、次いでアニオン系洗浄剤で処理することにより効
率よく取り出すことができること、およびこの抽出物を
使用してΣ支工見上ユ　旦ｕｉによる感染に対してウマ
を免疫化するとき有効なワクチンを調製できることが発
見された。この抗原調製物の効能は、１９８２年１２月
３０日提出の「ストレプトコッカスの調製物の効能の決
定（Ｄｉｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　Ｐｏｔｅｎｃｙｏｆ　　
５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏ
ｎ）」と題する特許出願Ｓ、Ｎ、４５４．９０６号に記
載される方法を使用して決定され、そしてここに記載す
るウマの対抗研究におＩ／％て確証された。

ストレプトコッカス（Ｓｔ　ｒｅｐｔ　ｏｃｏｃｃＵＳ
）のＭ様タンパク質の本発明の酵素抽出の手順は、スト
レプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ。

ｃ　ｃ　ｕ　ｓ）の培養物を生長誘導条件（例えば。

３７℃において適当な培地中）下に生長させ、次いで細
胞を濃縮する（遠心分離または濾過）ことを含む、細胞
濃縮物を適当な緩衝液で希釈または洗浄する０次いで、
溶菌酵素、例えば、ムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓ
ｉｎ）を細胞濃縮物に添加し、そして細胞壁の部分の酵
素溶解のために十分な温度および時間でインキュベーシ
ョンする。部分的溶解（ｐａｒｔｉａｌ　　１ｙｓｉｓ
）は、Ｍ−タンパク質を引続く洗浄剤抽出に有効とする
が、Ｍ−タンパク質に悪影響を与えないために十分な溶
解を意味する。一般に、これはΣ１工見ヱユ　ｅｑｕｉ
培養物を溶解酵素に３７℃において原培養物体積の１　
ｍ　ｌにつき約１〜１０単位の酵素濃度で約２４時間以
下暴露することによって達成できることが発見された０
次いで、アニオン系洗浄剤、例えば、ラウリル硫酸ナト
リウムまたはジオクチルスルホコハク酸ナトリウムを細
胞濃縮物へ添加し、そしてインキュベーションして５ｔ
ｒｅｐ、　　ｅｑｕｉの細胞抽出処理を完結する０次い
で、細胞および細胞破片を遠心分離または濾過により除
去し、そして最終細胞不含抗原溶液を濾過または化学処
理により滅菌する。この細胞不含抗原溶液は免疫原性で
あり、３ｔｒｅｐ。

見Ｕユ有機体による感染に対してウマを免疫化するため
に有用であり、そして次の特性を有する：　２５．００
０〜７５．０００ダルトンの分子量；約９５℃への熱安
定性；およびトリプシン感受性。

本発明の方法において使用する好ましい溶菌酵素はムタ
ノリシン（Ｎ−７セチルムラミダーゼ）であり、これは
ストレプトマイセス・グロビスボｚｌ、＝Ｘ（Ｓｔｒｅ
　　ｔｏｍｙｃｅｓ　　ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）の培
養物濾液かち得られ、そしてシクグマ働ケミカル・カン
パニー（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　　Ｃ
ｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、６３１７８）および大
日本製薬会社（大阪）から商業的に入手可能である。ス
トレプトコッカス（Ｓｔ　ｒｅｐｔ　ｏｃｏｃｃｕｓ）
（１）細胞壁を溶解する方法としてムタノリシンを用い
る研究は、Ｍ様タンパク質の回収以外の目的で実施され
てきている。これらの研究の文献は、次の通りである：
に、ヨハガワ（Ｙｏｈａｇａｗａ）ら、抗微生物剤およ
び化学療法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　　Ａｇｅｎ
ｔｓ　　ａｎｄ　　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）、１９
７４年５月、１５６−１６５ページ、Ｇ、Ｂ、カラング
ー（ｃａｌａｎｄａｒ）。

インフェクション・アンド・イムノロジー（Ｉｎｆｅｃ
ｔ、ａｎｄ　　Ｉｍｍｕｎ、）、１９８０年６月、１０
３３−１０３７ページ、およびＢ。

Ｊ、デクエニンク（ＤｅＣｕｅｎｉｎｃｋ）ら。

インフェクション・アンド・イムノロジー（Ｉｎｆｅｃ
ｔ、ａｎｄ　　Ｉｍｍｕｎ、）、１９８２年２月、５７
２−５８２ページ、ムタノリシンおよび他の溶菌酵素（
グリコシダーゼ）、例えば、卵白リソチームは、バクテ
リアの細胞壁のＮ−７セチルグルコサミン類およびＮ−
アセチルムラミン酸残基類の線状配列に作用すると考え
られる。

−Ｘ１１− １、　アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ、ン
（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏ　ｃｋｖ　ｉ　１１　ｅ
　、Ｍｄ　、　２０８５２）にＡＴＣＣＮｏ、３９，５
０６で受託されている互」−Ｌ！」エエ　１エユユを使
用した。化学的に規定された培地［１，ヴアン・デ・リ
ジｙ（ｖａｎ　　ｄｅ　　Ｒｉ　　ｊ　　ｉｎ）、イン
フェクション・アンド・イムノロジー（Ｉｎｆｅｃｔ、
ａｎｄ　　Ｉｍｍｕｎ　、）、２７　：　４４４−４４
８．１９８０］中で１１エヱ上１１１旦ユを３７℃にお
いて１６時間生長させる。

２、　止１工見上ユ　且ユ旦ユを交差流濾過により１０
〜５０倍に濃縮した。ＮａＯＨでＰＨ６，５に調節した
０４１モルのトリズマ（Ｔｒ　ｉ　ｚｍａ）　−ＨＣ１
！ｌ衝液の添加により、細胞を洗浄する。

３、　洗浄した５ｔｒｅｐ、　　見ユ且ユを交差流濾過
により２０〜１００倍に濃縮する。

４、　　ムタノリシンを５．０００単位／ｍｌ溶液とし
て濃縮細胞に添加して、原培養物溶液の１ｍｉにつき５
単位の最終酵素濃度にする。３７℃で１６時間インキュ
ベーションする。

５、　１０％のラウリル硫酸ナトリウムを０．０５％の
最終濃度に添加する。３７℃で３０分インキュベーショ
ンする。

６、５ｔｒｅｐ、　　ｅｑｕｉの細胞および細胞破片を
交差流濾過または遠心分離により除去する。

７、　フィルターの流出液を０．２ミクロンのフィルタ
ーに通して滅菌し、そして４℃に保持する。

この実施例に従い調製された抗原を、前述のマウス結合
力アッセイにより効力について試験した。アッセイにお
いて、ワクチンの抗原性を抗血清物質の対照のＬＤ５０
を超えるＬＤ５０の増加により測定する。このＬＤ５０
が大きく増加すればするほど、ワクチンの抗原性は大き
く増加する０表１はこのアッセイにより試験したワクチ
ンの結果を示す、ｌ：２００程度に大きく希釈した抗原
は結合力をなお示すことに注意すべきである。

表１ ワクチン調製物のマウス　合力の結 ワクチンの　　　　　　　　　抗血清物質の対照調製に
用い　マウスＬＤ５０　　を超えるＬＤ５０たれ　希釈
　　（ｉｏ　　　　　の増口（ｌｏｇｌ：１００　　　
８．０　　　　　４．６１：１５０　　　６．５　　　
　　３．１１：２００　　　４．７　　　　　１．３抗
血清物質 の対照　　　　　３．４　　　　　− 陰性対照　　　　８．２　　　　　− 酵素−洗浄剤処理が抗原の回収（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）
に寄与する重要な因子であることを立証するために、次
の実験を実施した： １、　　Ｓｔ工ｒｅλエ　ｅｑｕｉを生長させ、次いで
細胞を遠心分離により収穫した。

２、　細胞を緩衝液中に再懸濁し、そして懸濁液の７リ
コートを次の方法で処理した：（すべての場合において
、細胞は遠心分離による処理に従い除去し、そして上澄
み液を０．２ミクロンの滅菌フィルターを通して濾過し
た。） Ａ、　　＠濁液を５０℃で１６時間インキュベーション
し、次いで０−０ ５％のラウリル硫酸ナトリウム （ＳＬＳ）を添加し、そして懸濁 液を３７℃に３０分間保持した。

Ｂ、　　０．０５％のＳＬＳの添加後、懸濁液を３７℃
で３０分間インキュ ベージ履ンした。

Ｃ１０，０５％のＳＬＳの添加後、懸 濁液を３７℃で１６時間インキュ ベーションした。

Ｄ、　　５単位／ｍｌのムタノリシンの添加後、懸濁液
を５０℃で１６時間 インキュベーションした。

Ｅ、　　　５単位／ｍｌのムタノリシンの添加後、懸濁
液を５０℃で１６時間 イン、キュベーションし１次いで ０゜０５％のＳＬＳの添加後３７ ℃で３０分間インキュベーション した、′ Ｆ、　　　ｐＨを０．２にＷｌｔｆＬ？、後、懸濁液を
９５℃に１５分間加熱した。

懸濁液を冷却し、モしてｐＨを ７．０に調節した。

次いで、これらの調製物（Ａ−Ｆ）の各々をマウス結合
力アッセイにおいて試験して、開放された抗原の量を決
定した。結果（表２）が示すように、洗浄剤単独または
熱との組み合わせ（Ａ、Ｂ、　Ｃ）は抗原を取り出さな
い、５０℃においてインキュベーションしたムタノリシ
ン（Ｄ）は、ムタノリシンと洗浄剤との組み合わせ（Ｅ
）と比較すると、最小量の抗原を取り出す、事実、後者
の技術（Ｅ）は、この表に示す結合力の結果の基づくと
、米国特許第３，７９３，１５０号および米国特許第３
，８５２，４２０号に記載されている熱酸抽出（熱抽出
）法（Ｆ）と同じようによく抗原を取り出すように思わ
れる。

ロ　　　　　　　　　　Ｏａ′１ ・　　・　　　　１１ ＣＩＪ　　　　吟− ｃｏ　　　　　　　　　ｎｔｎ　　　　　ｃｏ　　　　
　ｈＯＱ −り　− ・・　　　　　　　　　　・・　　・・　　　　　１１
ρ ト　　　　　ネ 巨ｅ’）　　　　　　膿 童１− ｃｏ　的　　　　　　　　　　　壓 −−ｐ　　　ズ 、り　　り　　０ へ０ｃＱＩＬ　　　二　口 ムクノリシン−洗浄剤法を使用する他の研究は、最近、
抗原の取り出しが５０℃におけるよりも３７℃において
いっそう効果的であることを示した。したがって、表１
に示し試験したワクチンを調製するために使用いた現在
の方法は、３７℃のこの好ましい低い温度において確立
された。マウス結合力アッセイにおいて測定されたワク
チンの抗原性を確証するために、表１に示すワクチンを
使用してウマにおいてワクチンの効能の研究を実施した
。ウマに３週間の間隔でワクチンを２回投与し、次いで
有毒の５ｔｒｅｐ、　　ｅｑｕｉで対抗した。ワクチン
の効能は、対抗後に観測される臨床的症候の減少により
測定した。臨床指数値を、効能の評価の目的で伝染性熱
病の症候に割り当てた。これらの臨床指数値を表３に示
し、そして確ウマに対抗後に観測された各日の症候につ
いて割り当てた。ウマの観測は対抗後４９日間隔日に実
施した。

−友ユー 伝染性熱病の症候に割り当てた臨床指数値症候　　　　
　　　　　　　　　臨床指数値膿瘍　　　　　　　　　
　　　　２０点白血球の係数 〉５０％の増加　　　　　　　　　　５点＞１００％の
増加　　　　　　　　１０点温度 ３８．９−３９．１”０　　　　　　１点（１０２，０
−１０２，４″Ｆ） ３９．２−３９．９℃　　　　　　５点（１０２，５−
１０３，９〒） ＞４０℃（１０４下）　　　　　　１０点９の排出物 中程度　　　　　　　　　　　　　　５点高度　　　　
　　　　　　　　　　１０点ワクチンの効能の研究の結
果は、４９日間の観測期間の間評価された臨床指数値の
蓄積として表４に示されている。臨床指数の減少は、ま
た、ワクチン接種しない対照群に比較して、ワクチン群
の指数の減少百分率として表４に示されている。

これらのデータが示唆するように、効能のよいワクチン
は５ｔｒｅｐ、　　見ユニ１の酵素−洗浄剤抽出を用い
て生産することができる。

−人洟 ｉ 数 臨床的症候　　ワクチン　　　ワクチン１：１００　　
１：１５０ 合計 群の合計　　　８１９　　　　１２３５平均値　　　　
２８．２　　　４２．６減少％　　　　６４％　　　　
４６％ 暖瘍 群の合計　　　１８０　　　　４２０ 平均値　　　　６．２　　　　１４．５減少％　　　　
８５％　　　　６５％ ＢＣ 群の合計　　　３７５　　　　４７０ 平均値　　　　１２．９　　　１６．２の効能の研究 ワクチン　　ワクチン接種 １：２００　　　Ｌない対照 ５６．６　　　８１．８ ２８％　　　　− ２４，３４１，３ ４１％　　　　− ２０，９２７，３ Ｎ　呻　　　　　　　　　　　　　凶 Ｎ　　・　　　　　　　　　　　ロ　　・ｌ　　　ｃＩ
Ｊトｌ　　　ｈ　ＯＪ　ＩＮ　　　Ｎ　ｔ’−０−Ｉ　
Ｃ”）　０次　　　　　０　■　　　　　　　−〇−の
　　・　次　　　　　　−・　次 啼　　〜トロ　　−呻口 膿−Ｃｏ−ａ：１ＩＮＯ 罵　　１ヰ＋贋　　燻砿降１ 上に開示したように、種々の変更が当業者には考えられ
るであろう、したがって、上の特定の実施例は開示した
発明がなされた時の最良の方法の例示であると解釈すべ
きであり、そして本発明は特許請求の範囲によってのみ
限定されるべきである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程： （ａ）￥ストレプトコッカス・エクイ￥（￥Ｓｔｒｅｐ
   ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ￥）を生長誘導条件下に生
   長させ、 （ｂ）工程（ａ）のバクテリアを細胞壁を部分的に溶解
   するために十分な条件下に溶菌酵素に暴露し、 （ｃ）工程（ｂ）の部分的に溶解された生産物を、１種
   または２種以上の免疫原性Ｍ様タンパク質を上澄み液の
   中に抽出するために十分な条件下に、アニオン系洗浄剤
   に暴露し、 （ｄ）可溶性の抽出されたＭ様タンパク質の上澄み液を
   バクテリアの細胞および細胞破片から分離し、 （ｅ）工程（ｄ）の生産物を滅菌する、 からなることを特徴とするウマを￥ストレプトコッカス
   ・エクイ￥（￥Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ
   ￥）バクテリアに対して免疫化するとき有用な細胞不含
   抗原溶液の調製方法。 ２、工程（ｂ）の酵素がムタノリシンであり、そして暴
   露が３７℃において原培養物体積の１ｍｉにつき１〜１
   ０単位の酵素濃度で約２４時間以下である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３、工程（ｃ）の洗浄剤がラウリル硫酸ナトリウムであ
   り、そして暴露が３７℃において０．０１〜０．１０％
   の洗浄剤濃度で約６０分以下である特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ４、工程（ｄ）の分離が遠心分離または濾過による特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ５、工程（ｅ）の滅菌が工程（ｄ）の生産物を０．２ミ
   クロンのフィルターに通過させこと、あるいは適当な化
   学滅菌剤を添加することを含む特許請求の範囲第１項記
   載の方法。