CZ289530B6 - Streptococcus equi a vakcína s jeho obsahem - Google Patents

Streptococcus equi a vakcína s jeho obsahem Download PDF

Info

Publication number
CZ289530B6
CZ289530B6 CZ1997214A CZ21497A CZ289530B6 CZ 289530 B6 CZ289530 B6 CZ 289530B6 CZ 1997214 A CZ1997214 A CZ 1997214A CZ 21497 A CZ21497 A CZ 21497A CZ 289530 B6 CZ289530 B6 CZ 289530B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
vaccine
strain
streptococcus equi
virus
mice
Prior art date
Application number
CZ1997214A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ21497A3 (cs
Inventor
Orla Mary Hartford
Timothy James Foster
Antonius Arnodus Christiaan Jacobs
Original Assignee
The Provost Fellows And Scholars Of The College Of
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8223610&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ289530(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by The Provost Fellows And Scholars Of The College Of filed Critical The Provost Fellows And Scholars Of The College Of
Publication of CZ21497A3 publication Critical patent/CZ21497A3/cs
Publication of CZ289530B6 publication Critical patent/CZ289530B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

P°edkl dan °e en se t²k iv ho oslaben ho kmene bakterie Streptococcus equi, patogenu, kter² zp sobuje onemocn n strangles u kon . e en se tak t²k vakc ny proti strangles, zp sobu v²roby takov vakc ny a pou it kmene pro v²robu takov vakc ny.\

Description

Streptococcus equi a vakcína s jeho obsahem
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká kmene Streptococcus equi a vakcíny s jeho obsahem.
Dosavadní stav techniky
Streptococcus equi je již dlouho znám jako příčina akutního onemocnění horního respiračního traktu u koní (Sweeney a další, Compendium Equine 9: 689-693 (1987)). Toto vysoce nakažlivé onemocnění je charakterizováno horečkou, hlenohnisavým výtokem z nosu, onemocněním mízních uzlin a následnou tvorbou abscesů mízních uzlin na hlavě a krku (Sweeney a další, Compendium Equine 9: 845-851 (1087)).
Zduření lymfatických uzlin je často tak těžké, že dojde k zúžení dýchacích cest. Tento jev vysvětluje anglický název onemocnění, strangles.
Onemocnění je smrtelné pouze v malém množství případů, jak se popisuje u: (Sigmund, O. H. a Fraser, C. M. red.: The Měrek Veterinary Manual, 5. vydání Měrek and Company lne., Rahway, N. J.: 313-315 (1979)).
Naproti tomu nemocnost je obvykle vysoká a může být u vnímavých populací až 100 %.
Vakcíny proti tomuto onemocnění jsou známy už dlouho (Bazely, P. L.; Austr. Vet. J. 16: 243 (1940)) a (Bazely, P. L.; Austr. Vet. J. 18: 141-155 (1942)).
Dosud jsou k dispozici pouze dva druhy vakcín: a) vakcíny, založené na klasických bakterinech a b) podjednotkové vakcíny, založené na imunogenním proteinu, proteinu M.
Oba typy vakcín mají své vážné nevýhody. Bakteriny jsou známy pro jejich nepříznivé reakce a poskytnutí relativně nízkého stupně ochrany (Subcommittee on the Efficacy of Strangles Bacterin, Report, Američan Association of Equine Practitioners). Protein M byl pokládán za slabý antigen, který poskytuje dostatečnou imunologickou odezvu po vícenásobné injekci. (Shrivastava, S. K. a Bamum, D. A.; Can. J. Comp. Med. 49: 351-356 (1985)) (Woolcock, J. B.: Austr. Vet. J. 51: 554-559 (1975)).
Navíc je u těchto vakcín doba trvání imunity relativně krátká; další vakcíny pro zesílení účinku by měly být aplikovány alespoň jednou za rok (Sweeney a další, Compendium Equine 9: 845-851 (1987)).
Klasické vakcíny založené na bakterinech nebo podjednotkách jsou například dostupné u firmy Forth Dodge Laboratories and Coopers Animal Health. Patent popisující bakterin vlastní například firma Mobay Company (US patent 4,944,942).
Pokud se koně přirozeně infikují živým virulentním kmenem Streptococcus equi z terénu, vyvolá se u nich dlouhodobá imunita. Tak je tomu dokonce v tom případě, když infekce proběhne bez klinických příznaků (Woolcock, J. B.: Austr. Vet. J. 51: 554-559 (1975)). To v principu znamená, že vakcinace živým oslabeným kmenem by byla velmi výhodná proti vakcinaci s dosud používanými inaktivovanými nebo podjednotkovými vakcínami. Dosud však není komerčně dostupná žádná vakcína s živou oslabenou bakterií.
-1 CZ 289530 B6
Je znám pouze jeden patent (EP 0 230 456), ve kterém se popisuje vakcína, založená na určitém živém oslabeném kmenu Streptococcus equi. Na trh však dosud nebyly uvedeny žádné komerční vakcíny založené na tomto patentu, ačkoliv patentovaný kmen již existuje 10 let.
Vakcína podle patentu EP 0 230 456, ačkoliv je lepší než existující bakterinové a podjednotkové vakcíny, má několik vážných nedostatků:
a) Oslabení je založeno na chemicky indukovaných nedefinovaných mutacích vgenomu kmene vakcíny. Tyto mutace jsou téměř jistě bodové mutace z důvodu použitého mutagenu nitrosoguanidinu. Bodové mutace jsou náchylné ke zpětným mutacím a tím k obnovení virulence. Vysoce výhodný by byl proto oslabený kmen, u kterého by bylo oslabení způsobeno dobře definovanou nevratnou delecí podstatné části, a proto neschopný znovuobnovení virulence.
b) Vakcína je založena na nezapouzdřeném kmenu: screening byl prováděn na nezapouzdřené kolonie. Základem vakcíny je ztráta virulence. Jako důsledek, vakcína založená na této ztrátě nebude chránit proti zřejmému faktoru virulence, tj. pouzdru.
Živá vakcína obsahuje pouzdro, a proto poskytuje výhodnější kompletnější ochranu.
c) Vakcína není zcela bezpečná pro hříbata. Proto však nejnáchylnější k onemocnění jsou zvířata, měla by být očkována ve velmi mladém věku. Proto by byla vysoce výhodná vakcína, která by byla pro hříbata zcela bezpečná.
Podstata vynálezu
Překvapivě bylo zjištěno, že nový kmen, odvozený ze standardního typu izolovaného z terénu má výše uvedené výhodné vlastnosti. Nový kmen byl odvozen z virulentního kmene izolovaného v přírodě, kmene TW, který byl izolován z klinicky nemocného koně.
Nový kmen byl vybrán podle toho, že obsahuje ve svém genomu rozsáhlou deleci, což ve srovnání s rodičovským kmenem TW způsobu jeho oslabení. Protože delece má velikost přibližně 1 kb, možnost, že nastane reverze na virulentní kmen je zanedbatelná. Kmen si zachovává svoje pouzdro. Jak je ukázáno v příkladech, je bezpečný také pro hříbata.
Vynález poskytuje kmen Streptococcus equi TW 928, uložený pod depozitním číslem CBS 813.95 ve sbírce Centraalbureau voor Schimmelcultures, P.O. box 273, 3740 AG Baam, Nizozemí.
Vynález se dále týká mikrobiologicky čisté kultuiy obsahující bakterie podle uloženého kmenu. Není nutno zdůrazňovat, že zahrnuty jsou rovněž další generace bakterií z uloženého řetězce. Kultura může být například získána růstem uvedené bakterie při teplotě mezi 30 a 41 °C. Bakterie může růst například v médiu M17 (11 obsahuje 5g tryptózy, 5g neutralizovaného sojového peptonu, 2,5 g kvasničného extraktu, 5 g hovězího extraktu, 10 g glukózy, 0,5 g kyseliny askorbové, 19 g Na2(B-)glycerofosfátu, 0,25 g MgSO4 χ 7H2O, pH 7,0 až 7,2).
Vynález dále poskytuje živou vakcínu pro potírání streptokokové infekce u koní. Tato vakcína obsahuje oslabené živé bakterie Streptococcus equi kmene TW 928, uložené pod depozitním číslem CBS 813.95 u Centraalbureau voor Schimmelcultures at Baam, Nizozemí a farmaceuticky přijatelný nosič. Tímto nosičem může být jednoduše voda, ale může také obsahovat kultivační tekutinu, ve které byly bakterie kultivovány. Dalším vhodným nosičem je například roztok fyziologického roztoku.
Vakcínu podle předkládaného vynálezu je možno podávat v různých formách. Může být například podávána parenterálně, například intramuskulámě, subkutánně nebo intradermálně,
-2CZ 289530 B6 může být také podávána orálně nebo intranazálně. Nosní sliznice je nejobvyklejší vstupní branou pro infekce Streptococcus equi. Proto je nos nejpřirozenějším místem pro aplikaci oslabené živé vakcíny podle vynálezu. Navíc místo aplikace má výhodu, že jej lze snadno dosáhnout, a vakcína může být podávána například ve formě spreje. Ve výhodné formě je tedy vakcína podle předkládaného vynálezu vhodná pro intranazální aplikaci.
Vakcína může obsahovat jakoukoliv dávku bakterie, dostatečnou pro vyvolání imunologické odpovědi. Vhodnými dávkami jsou například dávky mezi 103 a 109 bakterií.
Pro svůj oslabený charakter může být vakcína použita pro ochranu koní v jakémkoli věku, včetně novorozených koní. Z praktických důvodů se vakcína obvykle podává v mladém věku, například ve věku mezi jedním a dvanácti měsíci.
Existuje několik způsobů ukládání živých organismů. Dobře známé je například ukládání v lednici. Často používané je také skladování při -70 °C v pufru s obsahem glycerolu. Bakterie je možno také uchovávat v kapalném dusíku. Dalším způsobem konzervace je lyofilizace. Lyofilizované bakterie mohou být skladovány a udržovány životaschopné po mnoho let. Teploty skladování lyofílizovaných bakterií mohou být i více stupňů nad nulou, aniž by se škodlivě projevily na životaschopnosti. Lyofilizaci je možno provádět dobře známými standardními postupy. Do lyofilizaci je možno provádět dobře známými standardními postupy. Do lyofílizovaných kultur je možno také popřípadě přidat prospěšné aditivní látky, jako například odstředěné mléko, trehalózu, želatinu nebo bovinní sérový albumin. Ve výhodném provedení je proto vakcína v lyofilizované formě.
V dalším provedení obsahuje vakcína podle předkládaného vynálezu další oslabený patogen nebo antigenní materiál z dalšího patogenu. Takovým patogenem může například být další bakterie nebo parazit. Může také být virového původu. Obvykle bude jiným patogenem nebo jeho antigenním materiálem koňský patogen. Vakcína podle vynálezu obsahující takový další oslabený patogen nebo antigenní materiál z dalšího patogenu má výhodu, že indukuje ochranu proti několika infekcím současně. Koňské patogeny nebo jejich antigenní materiály, které mohou být s výhodou přidány, je například původce Potomacké horečky, Rhodococcus equi, Clostridium tetani. Mycobacterium pseudomallei, virus vesikulámí stomatitidy, virus Bomské nemoci, virus koňské chřipky, virus africké nemoci koní, virus koňské arteritidy, koňský herpetický virus 1-4, virus infekční anémie, virus koňské encefalomyelitidy a virus japonské encefalitidy B.
Vakcína může také obsahovat adjuvans. Adjuvans jsou nespecifické stimulátory imunitního systému. Zvyšují imunologickou odpověď hostitele na pronikající patogen. Příklady v oboru známých adjuvans jsou Freundovo kompletní a nekompletní adjuvans, vitamin E, neiontové blokové polymery, muramyldipeptidy, látky ISCOM (immune stimulating complexes, například EP 109942), Quill A, minerální olej, rostlinný olej a Carbopol (homopolymer). Pro aplikaci na sliznice jsou zvláště vhodná adjuvans například termolabilní toxin E. coli (LT) nebo cholerový toxin (CT).
Vakcína může navíc obsahovat jeden nebo více stabilizátorů. Vakcína může obsahovat také jeden nebo více vhodných emulgátorů, například Spán nebo Tween.
Vynález také poskytuje způsob výroby vakcíny. Tyto způsoby zahrnují například smísení bakterií Streptococcus equi kmene TW 928 a farmaceuticky přijatelného nosiče.
Předkládaný vynález se týká použití Streptococcus equi kmene TW 928, uloženého pod depozitním číslem CBS 813,95 u Centraalbureau voor Schimmelcultures at Baam, Nizozemí pro výrobu vakcíny pro potírání streptokokových infekcí u koní.
-3CZ 289530 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad I
Výběr mutantního kmene
V terénu se vyskytující kmen Streptococcus equi byl izolován z koně s klinickými známkami onemocnění strangles.
Kmen byl ponechán růst přes noc na krevním agaru aerobně při 37 °C a potom jím bylo inokulováno médium M17 (1 1 obsahuje 5 g tryptózy, 5 g neutralizovaného sojového peptonu, 2,5 g kvasničného extraktu, 5 g hovězího extraktu, 10 g glukózy, 0,5 g kyseliny askorbové, 19 g Na2(B-)glycerofosfátu, 0,25 g MgSO4 * 7 H2O, pH 7,0 až 7,2) a suspenze byla vystavena různým technikám mutace DNA. Klasické způsoby mutace byly popsány například v: Carlton, B. C. a Brown, B. J. v Manual of Methods for Generál Bacteriology (red. Gerhardt a další) Američan Society for Microbiology, Washington D. C., str. 226 (1981). Techniky mutace založené na rekombinanční technologii DNA jsou popsány v Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6 (1989).
Byly vybrány mutanty, obsahující delece detekované pomocí standardní polyakrylamidové gelové elektroforézy restrikčních fragmentů (v oboru známé, viz například Maniatis) při porovnání s rodičovským kmenem TW. byl vybrán kmen s delecí o velikosti 1 kb, označený TW 928, který byl testován na vlastnosti oslabení, jak se popisuje v následujících příkladech.
Příklad II
Příprava vakcíny
Streptococcus equi kmen TW 928 a standardní rodičovský kmen TW byly ponechány růst aerobně přes noc při 37 °C na krevním agaru a potom jimi bylo inokulováno médium M17. Pro studie vakcinace/podávání byly kmeny kultivovány 6 hod při teplotě 37 °C a pH 7,4 ve 100 ml média Ml7, centrifugovány a resuspendovány v PBS. Celkový počet buněk byl zjištěn v počítací komůrce a počet životaschopných buněk byl zjištěn počítáním po vysetí na plotny. Kultury použité pro vakcinaci/testování imunity obsahovaly přibližně 109 bakterií/ml nebo desetinásobné ředění této suspenze.
Příkladní
Bezpečnostní testy vakcínového kmene TW 928 u myši
V tomto příkladu byla na myši testována míra oslabení mutantu TW 928 Streptococcus equi ve srovnání se standardním kmenem TW. Různé koncentrace CFU mutantního kmene a rodičovského standardního kmene TW byly aplikovány intranazálně nebo intraperitoneálně do myši a byla zaznamenávána úmrtnost.
Pokusná zvířata
Myš BALB/c, věk 8 týdnů, zdroj IFFA-Credo.
-4CZ 289530 B6
Průběh experimentu
První skupině 19 myši starých 8 týdnů bylo intranazálně podáno 50 μΐ Streptococcus equi testovacího kmene TW a skupině 20 myší byl intranazálně podán kmen Streptococcus equi TW 928 (viz tabulka 1).
Šesti skupinám po 10 myších ve věku 8 týdnů bylo intraperitoneálně podáno 250 μΐ testovací kultury Streptococcus equi kmene TW v desetinásobném zředění a šesti skupinám po 10 myších stejné množství kmene Streptococcus equi TW 928 (viz tabulka 1). Po podání byla zaznamenávána úmrtnost v průběhu 35 dnů.
Kultury pro vakcinaci/testování imunity
Jak kmen Streptococcus equi TW, tak i TW 928, rostly aerobně při 37 °C přes noc na krevním agaru a potom byly zaoěkovány do média Ml7. Pro vakcinaci/testování imunity byly použity čerstvé kultury (staré 5 až 6 hod), obsahující přibližně 109 bakterií/ml nebo jejich desetinásobné zředění. Celkový počet byl stanoven v počítací komůrce a počet životaschopných buněk byl zjišťován vysetím na plotny. Skutečné dávky vakcinace/podání (viz tabulka 1).
Výsledky:
Výsledky po intraperitoneálním a intranazálním testování imunity podáním kmene TW nebo TW 928 8 týdnů staiým myším jsou uvedeny v tabulce 2. LD50 mutantního kmene po intraperitoneálním podání se jevily ve srovnání se standardním kmenem přibližně 104x vyšší. Podobně po intranazální aplikaci se jevil mutantní kmen výrazně oslabenější ve srovnání se standardním typem. Při vysokých dávkách obou kmenů uhynuly myši v průběhu 24 hod, pravděpodobně díky předávkování toxických látek. Při nižších dávkách standardního kmene uhynula většina myší 5 až 9 dnů po podání testovací látky, pravděpodobně díky infekci (tabulka 2). Naopak při nižších dávkách mutantního kmene neuhynula žádná myš později než 2 dny po testování imunity (s výjimkou 3 myší ze 60), což ukazuje na to, že mutantní kmen ve většině případů nezpůsobuje fatální infekci (a zároveň je méně infekční ve srovnání se standardním typem). Po intranazálním testování imunity podáním standardního typu většina myší uhynula mezi 5 a 8 dny po podání v důsledku infekce, protože všechny tyto myši vykazovaly vážné neurologické příznaky. Naopak po intranazálním testování imunity podáním mutantního kmene uhynuly pouze 3 myši z 20 v průběhu 24 hod, a to pravděpodobně v důsledku předávkování toxickými látkami spíše než v důsledku infekce (tabulka 2).
Příklad IV
Test ochrany vakcinačním kmenem TW 928 u myši
V tomto příkladu byla na myších testována potenciální imunogenicita mutanty Streptococcus equi. Zvířatům s imunitou indukovanou mutantním kmenem po intranazální vakcinaci byla podána letální intranazální látka standardního rodičovského kmene TW. Myším byly intranazálně podávány různé koncentrace CFU mutantního kmene a rodičovského standardního kmene TW a byla zaznamenávána úmrtnost. Zvířatům s imunitou indukovanou dvěma intranazálními vakcinacemi kmenem TW 928 byl podán standardní kmen TW (1 týden po zesilující vakcinaci).
Pokusná zvířata
Myší BALB/c, věk 6 týdnů, zdroj IFFA-Credo.
-5CZ 289530 B6
Umístění
Týden před začátkem experimentu byly myši umístěny v klecích (10 myší/klec) v izolačních boxech s negativním tlakem pro aklimatizaci. Skupina 21 myší byla umístěna v čistém prostoru 5 do 9 týdnů věku (den podsání pro testování imunity) = nevakcinovaná kontrolní skupina.
Průběh experimentu
Ve stáří 6 týdnů byly čtyřem skupinám po 10 myších intranazálně podány různé preparáty kmene 10 Streptococcus equi TW v množství 50 μΐ: 1. úplná kultura, 2. úplná kultura 10* zředěná kultivačním médiem, 3. buňky (ve stejné koncentraci jako kultura), suspendované vPBS nebo 4. buňky v PBS v desetinásobném zředění vůči kultuře (viz tabulka 3). Stejný postup byl proveden pro Streptococcus equi kmen TW 928 stím rozdílem, že pro buňky v PBS a v koncentraci stejné jako u kultury bylo použito 30 myší (viz tabulka 3). Skupina 21 myší 15 (umístěná odděleně v čistém prostoru) byla ponechána bez podání buněk. Po podání byla v průběhu 14 dnů zaznamenávána úmrtnost. Ve věku 8 týdnů dostala zvířata, která přežila podání TW 928, opět intranazální dávku (zesilující) mutantního kmene, jak je popsáno pro první podání čerstvě připravených preparátů. Po zesilující dávce byla úmrtnost zaznamenávána po dobu 7 dnů. Ve věku 9 týdnů (1 týden po zesilující dávce) byl zvířatům, která přežila, podán intranazálně 20 kmen Streptococcus equi TW, stejně jako kontrolní skupině, a v průběhu 14 dnů byla zaznamenávána úmrtnost (viz tabulka 3).
Kultury pro vakcinaci/testování imunity
Oba kmeny Streptococcus equi rostly přes noc aerobně při 37 °C na krevním agaru a potom jimi bylo inokulováno médium Ml7. Pro vakcinaci/testování imunity byly čerstvé kultury (staré 5 až 6 hod) nebo (čerstvě centrifugované) buňky suspendovány v PBS v koncentraci přibližně 109 bakterií/ml nebo v desetinásobném ředění této kultury. Celkový počet byl stanoven v počítací komůrce a počet životaschopných buněk byl zjišťován vysetím na plotny. Pro skutečné dávky při 30 vakcinaci/testování imunity viz tabulka 3.
Výsledky:
Výsledky po intranazálním podání standardního kmene nebo mutantního kmene jsou uvedeny 35 v tabulce 4. Prakticky všechny myši, kterým byly při testování imunity podávány různé preparáty standardního typu TW uhynuly, zatímco po intranazálním podávání mutantního kmene TW 928 uhynulo pouze 7 ze 60 (všechny kromě jedné v průběhu 24 hod) myší (tabulka 4). Dva týdny po prvním podání byla myším, které přežily podání mutantního kmene, podána zesilující dávka. Všechny myši ošetřené zesilující dávkou přežily do podání s výjimkou tří myší ze skupiny 40 TW 928 v PBS. Jeden týden po zesilující vakcinaci byla zvířatům, která přežila, stejně jako skupině 21 kontrolních myší, intranazálně podána testovací dávka kmene standardního typu. Po testování imunity uhynuly všechny kontrolní myši, zatímco různým způsobem vakcinované myši vykázaly různé stupně ochrany, až do 91 % (tabulka 5). Míra ochrany se zdá být závislá na dávce, protože myši vakcinované 10x zředěnými preparáty měly menší stupeň ochrany. Dva 45 týdny po testování imunity více než polovina vakcinovaných myší, které přežily, odstranila bakterie z krku a ve většině případů se jevily sterilní i mozky (tabulka 6).
Závěr
Z výsledků příkladů III a IV je možné vyvodit, že ve srovnání s rodičovským standardním kmenem TW je kmen Streptococcus equi TW 928 výrazně oslaben při testování na myši (jak při intranazálním, tak i při intraperitoneálním podání). Navíc indukovala dvě intranazální podání mutantního kmene ochranu proti letálnímu intranazálnímu testování imunity kmenem standardního typu.
-6CZ 289530 B6
Tabulka 1. Průběh experimentu u příkladu III
Podání v 8 týdnech věku
Počet myší Způsob podání Kmen CFU/dávka
19 inl TW 3,1 x 107
20 IN TW 928 3,4 χ 107
10 ipc TW Ί,Ί χ 106
10 IP TW 7,7 χ 105
10 IP TW 7,7 x 104
10 IP TW 7,7 χ 103
10 IP TW 7,7 χ 102
10 IP TW 7,7 χ 101
10 IP TW 928 4,3 χ 107
10 IP TW928 4,3 χ 106
10 IP TW 928 4,3 χ 105
10 IP TW928 4,3 χ 104
10 IP TW928 4,3 χ 103
10 IP TW 928 4,3 χ 102
15 Kontrola bez podání
a ND = intranazálně (50 μΐ) b ND = intraperitoneálně (250 μΐ)
Tabulka 2: Úmrtnost po testování imunity/vakcinaci kmenem Streptococcus equi TW 928
Počet myší Způsob podání Kmen CFU/dávka Celková úmrtnost
19 IN TW 3,1 χ 107 19
20 IN TW 928 3,4 χ 107 3
10 IP TW Ί,Ί x 106 10
10 IP TW Ί,Ί χ 105 10
10 IP TW Ί,Ί χ 104 10
10 IP TW Ί,Ί χ 103 10
10 IP TW 7,7 χ 102 8
10 IP TW 7,7 χ 10' 6
10 IP TW928 4,3 χ 106 10
10 IP TW 928 4,3 χ 105 3
10 IP TW 928 4,3 χ 104 1
10 IP TW 928 4,3 χ 103 0
10 IP TW928 4,3 χ 102 0
LD50, IP podání, kmen TW
7,7 χ 101 CFU (Reed & Munch) 5,3 χ 101 CFU (Probit analysis, Finney) LD 50, IP podání, kmen TW928
7,0 χ 105 CFU (Reed & Munch) 4,9 χ 105 CFU (Probit analysis, Finney)
Tabulka 3. Experimentální uspořádání příkladu 4
Počet myší Intranazální podávání (50 μΐ) v 6 týdnech věku Intranazální podávání (50 μΐ) v 8 týdnech věku Intranazální podávání (50 μΐ) v 9 týdnech věku
kmen CFU/dávka kmen CFU/dávka kmen CFU/dávka
10 10 10 10 10 10 30 10 21 TW, celá kultura TW, celá kultura 10 x* TWvPBS TWvPBS 10 xb TW 928, celá kultura TW 928, celá kultura 10 χί TW 928 v PBS TW928vPBX 10 xb neošetřená kontrola 2,3 x 10’ 2,3 x 107 2,1 x 10’ 2,1 x 107 2,5 x 108 2,5 x 107 0,9 x 108 0,9 x 107 TW 928, celá kultura TW 928, celá kultura 10 x* TW 928 v PBS TW 928 v PBX 10 xb neošetřená kontrola 2,3 x 10’ 2,3 x 107 2,8 x i O8 2,8 x 107 TW, celá kultura TW, celá kultura TW, celá kultura TW, celá kultura TW, celá kultura 3,7 x 108 3,7 x 108 3,7 x 108 3,7 x 10’ 3,7 x 10’
a 10 * ředěno v kultivačním médiu b 10 x ředěno v PBS
Tabulka 4. Úmrtnost po testování imunity/vakcinaci kmenem Streptococcus equi TW nebo TW 928
Intranazální podání (50μ1) v 6 týdnech věku CFU/dávka Počet myší Celková úmrtnost % úmrtnosti
TW, celá kultura 2,3 x 108 10 10 100
TW, celá kultura 10x 2,3 x 107 10 10 100
TW v PBS 2,1 x 108 10 10 100
TWvPBS 10x 2,1 x 107 10 6 60
TW 928, celá kultura 2,5 x 108 10 2 20
TW 928, celá kultura 10x 2,5 x 107 10 0 0
TW 928 v PBS 0,9 x 108 30 5 17
TW 928 v PBS 10x 0,9 x 107 10 0 0
Tabulka 5. Úmrtnost myší po vakcinaci Streptococcus equi kmen TW 928 a testování imunity kmenem TW
Intranazální podání S.equi TW 928 v T=0 a T=2 týdny Počet myší v T=3 týdny3 Celková úmrtnost % ochrany
Celá kultura 8 1/8 87,5
Celá kultura 10x 10 3,10 70
V PBS 22 2/22 91
V PBS 10x 10 6/10 40
Nevakcinované kontroly 21 21/21 0
a den podávání kmene TW, myši ve věku 9 týdnů
-8CZ 289530 B6
Tabulka 6. Výsledky reizolace bakterií u přeživších myší 14 dnů po testování imunity (viz tabulka 5)
Intranazální podání S.equi TW 928 v T=0 a T=2 týdny Počet myší Reizolace S.equi z Celkem pozitivní
krk mozky
Celá kultura 7 3 1 3/7
Celá kultura 10* 7 2 1 3/7
VPBS 20 7 3 9/20
VPBS 10x 4 1 1 2/4
Nevakcinovaná kontrola 0 - - -
Příklad V: Testy bezpečnosti vakcinačního kmene TW 928 u koní
Kmen Streptococcus equi TW 928 byl na bezpečnost tetován u 6 sérologicky negativních koní.
Zvířata
Šest koní, věk 7 a 8 měsíců, dosud nepřišli do styku s onemocněním strangles.
V akc inace/podán í
V T = 0 bylo všech 6 koní vystaveno kontinuálnímu aerosolu kmene TW 928 s použitím nebulizátoru Devilbiss (nastaven na maximální výkon), vybaveným ústním adaptérem. Každý kůň byl vystaven aerosolu 10 min (přibližně 20 ml zředěné šestihodinové kultury, obsahující přibližně 109 CFU/ml bylo použito pro každého koně). Potom byla kultura aplikována intranazálně (5 ml/nozdra) s použitím silikonové hadičky (25 cm) a 10 ml stříkačky. Kultura se skládala ze šestihodinové kultury v médiu M17 s obsahem 2,3 x 109 DFU/ml, která byla těsně před použitím zředěna sterilním NaCl 3*. Zředění bylo nutné pro dosažení dobrého aerosolu.
V průběhu 10 min bylo přivedeno do aerosolu přibližně 23 ml této kultury.
Klinické vyšetření
Klinické vyšetření koní bylo prováděno před vakcinací a dvakrát v týdnu po vakcinaci.
Vyšetření po smrti
V čase 4 týdny po vakcinaci byli všichni koně usmrceni a vyšetřeni. Z každého koně byly odebrány výtěry na bakteriologické vyšetření z hrdelního vaku, hrtanu, průdušnice, podčelistních lymfatických uzlin, zahltanových lymfatických uzlin, příušních lymfatických uzlin atracheobronchiálních lymfatických uzlin a dále ze všech abnormalit (poškození) ať pro strangles typických nebo ne. Hrdelní vak, hrtan a průdušnice byly vytřeny přímo a rozetřeny na krevní agar. Vzorky tkáně (například lymfatických uzlin) byly vypáleny, byl proveden výřez sterilním skalpelem a materiál byl rozetřen na krevní agar. Plotny s krevním agarem byly inkubovány aerobně při 37 °C 18 až 24 hodin. Bylo získáno několik hemolytických kolonií (nebo různých morfologických typů, pokud byly přítomny), které byly testovány setem API-strep a ve zkumavkách se 4 cukry, sorbitolem, ribózou, laktózou a trehalózou.
Vzorky tkání pro histologické vyšetření byly odebrány z hrdelního vaku, podčelistních lymfatických uzlin, zahltanových lymfatických uzlin, příušních lymfatických uzlin a tracheobronchiálních lymfatických uzlin a dále z průdušnice nebo plicní tkáně v případě abnormalit.
-9CZ 289530 B6
Výsledky
Klinické příznaky
Na modelu testu bezpečnosti aerosolu s použitím rodičovského standardního kmenu TW se u vnímavých koní vyvíjejí typické znaky strangles v průběhu 5 až 7 dnů, charakterizované náhlými vysokými teplotami (větší než 40 °C) a tvorbou abscesů na podčelistních a hltanových lymfatických uzlinách. U koní z předchozího experimentu po vakcinace nebyly žádné tyto příznaky pozorovány. Teploty nepřekročily 39,5 °C kromě koně 97, který měl 18 dnů po ío vakcinaci 39,7 °C. Podčelistní lymfatické uzliny všech koní se v průběhu experimentu zdály normální kromě koně 101, u kterého se levá podčelistní lymfatická uzlina zdála mírně zvětšená 2 dny a 16 dnů po vakcinaci, a u kterého se pravá podčelistní lymfatická uzlina zdála mírně zvětšená 11 dnů po vakcinaci. Na rozdíl od podčelistních lymfatických uzlin, zahltanové lymfatické uzliny mohou být vyšetřeny pohmatem pouze nepřímo. Kromě koně č. 98 se 15 zahltanová oblast všech koní zdála v průběhu několika dnů mírně až středně zvětšená.
Izolace bakterií z nosních výplachů
Po vakcinaci bylo Streptococcus equi z koní izolováno s obtížemi. Pouze u koní 100 a 101 byla 20 bakterie znovu izolována z nosních výplachů v průběhu experimentu a u koně 96 pouze při jedné příležitosti (viz tabulka 7).
Vyšetření a bakteriologie po smrti
Čtyři týdny po vakcinaci bylo 6 koní usmrceno a vyšetřeno včetně bakteriologického vyšetření. Žádný z koní nevykazoval známky strangles, tj. všechny lymfatické uzliny se jevily normální a ze žádného z koní (s výjimkou nosního výplachů v den usmrcení) nebyl Streptococcus equi izolován.
Tabulka 7. Reizolace Streptococcus equi z nosních výplachů
Reizolace Streptococcus equi (C -U/ml) v době
Kůň číslo T=0 T=1 týden T=2 týdny T=3 týdny T=4 týdny
96 — — 1 x 103 —
97 — — — - -
98 — - — — -
99 — — — —
100 — 2χ 105 <nP 1 x 104 4χ 104
101 - 2 x 104 8 x 106 - 2 x 106
Histologické vyšetření
Histologické vyšetření čelistních, hltanových, příušních a trachobronchiálních lymfatických uzlin potvrdilo makroskopická zjištění: nebyly nalezeny žádné známky strangles, tj. žádná tvorba abscesů. Téměř všechny vyšetřované lymfatické uzliny byly popisovány jako reaktivní lymfoidní tkáň se střední folikulámí (germinální centra) hyperplasií, která je znakem antigenní stimulace 40 horního respiračního traktu.
Závěr
Výsledky jasně ukazují, že deleční mutant Streptococcus equi kmen TW 928 je u koní bezpečný.

Claims (10)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Streptococcus equi kmen TW 928, uložený pod depozitním číslem CBS 813.95.
  2. 2. Mikrobiologicky čistá kultura obsahující bakterie, vyznačující se tím, že kultura obsahuje Streptococcus equi kmen TW 928 podle nároku 1.
  3. 3. Živá vakcína pro potlačování streptokokových infekcí u koní, vyznačující se tím, že obsahuje Streptococcus equi kmen TW 928 podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.
  4. 4. Vakcína podle nároku 3, vyznačuj ící se tím, že je ve formě vhodné pro intranazální podávání.
  5. 5. Vakcína podle nároku 3 nebo 4, v y z n a č u j í c í se tím, že je v lyofilizované formě.
  6. 6. Vakcína podle některého z nároků 3 až 5, vyznačující se tím, že navíc obsahuje další oslabený patogen nebo antigenní materiál z dalšího patogenu.
  7. 7. Vakcína podle nároku 6, vyznačující se tím, že uvedený patogen je zvolen ze skupiny původce Potomacké horečky, Rhodococcus equi, Clostridium tetani, Mycobacterium pseudomallei, virus vesikulámí stomatitidy, virus Bomské nemoci, virus koňské chřipky, virus africké nemoci koní, virus koňské arteritidy, koňský herpetický virus 1-4, virus infekční anémie, virus koňské encefalomyelitidy a virus japonské encefalitidy B.
  8. 8. Vakcína podle některého z nároků 3 až 7, vyznačující se tím, že obsahuje adjuvans.
  9. 9. Způsob výroby vakcíny podle některého z nároků 3 až 8, vyznačující se tím, že zahrnuje smísení bakterie Streptococcus equi kmen TW 928 a farmaceuticky přijatelného nosiče.
  10. 10. Použití kmene Streptococcus equi TW 928, uloženého pod depozitním číslem CBS 813.95 pro výrobu vakcíny pro potírání streptokokové infekce u koní.
CZ1997214A 1996-01-25 1997-01-23 Streptococcus equi a vakcína s jeho obsahem CZ289530B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP96200171 1996-01-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ21497A3 CZ21497A3 (cs) 1998-03-18
CZ289530B6 true CZ289530B6 (cs) 2002-02-13

Family

ID=8223610

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ1997214A CZ289530B6 (cs) 1996-01-25 1997-01-23 Streptococcus equi a vakcína s jeho obsahem

Country Status (16)

Country Link
US (1) US5895654A (cs)
EP (1) EP0786518B1 (cs)
JP (1) JP3911058B2 (cs)
AT (1) ATE219511T1 (cs)
AU (1) AU703942B2 (cs)
BR (1) BRPI9700768B8 (cs)
CA (1) CA2195935C (cs)
CZ (1) CZ289530B6 (cs)
DE (1) DE69713408T2 (cs)
DK (1) DK0786518T3 (cs)
ES (1) ES2179261T3 (cs)
NZ (1) NZ314091A (cs)
PL (1) PL187163B1 (cs)
PT (1) PT786518E (cs)
RU (1) RU2194752C2 (cs)
ZA (1) ZA97452B (cs)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2243730C (en) * 1997-07-29 2009-12-22 Akzo Nobel N.V. Streptococcus equi vaccine
US6682745B1 (en) 1998-07-28 2004-01-27 Christiaan Antonius Arnoldus Jacobs Use of bacterium for manufacture of a vaccine
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US20080050367A1 (en) * 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
DE1033998T1 (de) * 1997-12-03 2001-05-23 Brigham And Women's Hospital, Boston Methode zur unterdrückung von beta-amyloid-verwandten veränderungen in alzheimer
FR2775601B1 (fr) * 1998-03-03 2001-09-21 Merial Sas Vaccins vivants recombines et adjuves
ES2214217T3 (es) * 1999-01-26 2004-09-16 Akzo Nobel N.V. Utilizacion de bacterias vivas atenuadas para la preparacion de una vacuna de administracion por la submucosa.
US6541458B1 (en) 1999-07-16 2003-04-01 Merial Feline calicivirus genes and vaccines in particular recombinant vaccines
FR2796397B1 (fr) * 1999-07-16 2006-09-01 Merial Sas Genes de calicivirus felin et vaccins notamment vaccins recombines
US6420407B1 (en) 1999-09-16 2002-07-16 Gerald Horn Ophthalmic formulation which modulates dilation
US6730065B1 (en) 2000-09-15 2004-05-04 Ocularis Pharma, Inc. Night vision composition
US8889112B2 (en) * 1999-09-16 2014-11-18 Ocularis Pharma, Llc Ophthalmic formulations including selective alpha 1 antagonists
US20020082288A1 (en) * 1999-09-16 2002-06-27 Gerald Horn Ophthalmic formulations comprising an imidazoline
US20060211753A1 (en) * 2000-11-03 2006-09-21 Ocularis Pharma, Inc. Method and composition which reduces stimulation of muscles which dilate the eye
GB2370770B (en) * 2001-01-03 2005-06-01 Simon Connolly Uses of Streptococcus Vaccines
AR052051A1 (es) 2004-12-15 2007-02-28 Neuralab Ltd Anticuerpos ab humanizados usados en mejorar la cognicion
US8784810B2 (en) * 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
JP5889529B2 (ja) * 2007-07-27 2016-03-22 ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・ユーシー アミロイド原性疾患の処置
JO3076B1 (ar) * 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
GB0801326D0 (en) 2008-01-24 2008-03-05 Animal Health Trust Vaccines
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
GB201209014D0 (en) * 2012-05-22 2012-07-04 Moredun Res Inst Vaccine
CA2899339C (en) 2013-02-01 2021-07-06 Ocularis Pharma, Llc Aqueous ophthalmic solutions of phentolamine and medical uses thereof
US9089560B2 (en) 2013-02-01 2015-07-28 Ocularis Pharma, Llc Methods and compositions for daily ophthalmic administration of phentolamine to improve visual performance
EP3057613A1 (en) 2013-10-17 2016-08-24 Zoetis Services LLC Methods and compositions for treatment of s. equi infection
EP2949340A1 (en) * 2014-05-30 2015-12-02 IDT Biologika GmbH Vaccine composition against Streptococcus suis infection
GB2564481B (en) * 2017-07-14 2019-10-23 4D Pharma Leon S L U Process
JP2022505950A (ja) 2018-10-26 2022-01-14 オキュフィア・ファーマ・インコーポレイテッド 老眼、散瞳、および他の眼障害の治療のための方法および組成物
CN115368310A (zh) 2021-05-18 2022-11-22 奥库菲尔医药公司 合成甲磺酸酚妥拉明的方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4110433A (en) * 1976-04-23 1978-08-29 Philips Roxane, Inc. Equine rhinopneumonitis virus
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
US4582798A (en) * 1984-11-23 1986-04-15 Miles Laboratories, Inc. Preparation and use of enzyme-detergent extracted Streptococcus equi vaccine
AR241545A1 (es) 1985-07-12 1992-08-31 Cornell Res Foundation Inc Un metodo para preparar una cepa de s. equi avirulenta a.t.c.c. 53186 para equinos.
US4788059A (en) * 1985-07-15 1988-11-29 Coopers Animal Health, Inc. Equine strangles vaccine and the method of preparing and using the same
IL86583A0 (en) * 1987-06-04 1988-11-15 Molecular Eng Ass Vaccine containing a derivative of a microbe and method for the production thereof
US5294441A (en) * 1987-06-04 1994-03-15 Washington University Avirulent microbes and uses therefor: salmonella typhi
US5468485A (en) * 1987-06-04 1995-11-21 Washington University Avirulent microbes and uses therefor
WO1989003427A1 (en) * 1987-10-07 1989-04-20 Washington University A method of maintaining a desired recombinant gene in a genetic population of cells
EP0626452B1 (en) * 1993-05-17 1999-08-11 Akzo Nobel N.V. Vaccine against Streptococcus suis infection
DE69417717T2 (de) * 1993-12-20 1999-10-07 Akzo Nobel N.V., Arnheim/Arnhem Impstoff zum Schutze von Pferden gegen Pferdeherpesvirus-Infektionen

Also Published As

Publication number Publication date
CA2195935C (en) 2006-06-27
EP0786518A1 (en) 1997-07-30
US5895654A (en) 1999-04-20
ATE219511T1 (de) 2002-07-15
PT786518E (pt) 2002-10-31
ZA97452B (en) 1997-08-15
DE69713408D1 (de) 2002-07-25
BRPI9700768B1 (pt) 2008-11-04
BRPI9700768B8 (pt) 2016-11-16
JP3911058B2 (ja) 2007-05-09
BR9700768A (pt) 1998-11-03
AU703942B2 (en) 1999-04-01
CA2195935A1 (en) 1997-07-26
NZ314091A (en) 1998-06-26
AU1234697A (en) 1997-08-07
DE69713408T2 (de) 2002-11-21
PL318095A1 (en) 1997-08-04
DK0786518T3 (da) 2002-09-16
EP0786518B1 (en) 2002-06-19
ES2179261T3 (es) 2003-01-16
CZ21497A3 (cs) 1998-03-18
PL187163B1 (pl) 2004-05-31
RU2194752C2 (ru) 2002-12-20
JPH09215492A (ja) 1997-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ289530B6 (cs) Streptococcus equi a vakcína s jeho obsahem
JP3040467B2 (ja) 不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ・バクテリンおよびその使用方法
JP2004536106A (ja) マイコプラズマ・ボビスワクチンおよび動物の肺炎を減少させる方法
US6585981B1 (en) Temperature-sensitive live vaccine for Mycoplasma hyopneumoniae
US20060251674A1 (en) Formulations and process for production of Bordetella bronchiseptica P68 antigen and vaccines
EP0036995B1 (en) Veterinary vaccines for pasteurellosis
JP3178720B2 (ja) パスツレラ・ムルトシダのトキソイドワクチン
JP4563520B2 (ja) ストレプトコッカス・エキワクチン
US4328210A (en) Modified Pasteurella bacteria and vaccines prepared therefrom
US4388299A (en) Modified pasteurella bacteria and vaccines prepared therefrom
US20060110411A1 (en) Streptococcus equi vaccine compositions and method of use
CA2312296C (en) Pasteurella multocida toxoid vaccines
Kang Studies on Protective Immunity Against Bordetella bronchiseptica Infection
AU2001277207A2 (en) Temperature-sensitive live vaccine for mycoplasma hyopneumoniae
MXPA98006044A (en) Streptococcus vaccine e

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20170123