CZ21497A3

CZ21497A3 - Streptococcus equi a vakcina s jeho obsahem

Info

Publication number: CZ21497A3
Application number: CZ97214A
Authority: CZ
Inventors: Orla Mary Hartford; Timothy James Foster; Antonius Arnodus Christiaan Jacobs
Original assignee: The Provost Fellows And Scholars Of The College Of The Holy Undivided Trinity Of Queen Elisabeth Near Dublin
Priority date: 1996-01-25
Filing date: 1997-01-23
Publication date: 1998-03-18
Also published as: JPH09215492A; DE69713408T2; JP3911058B2; ES2179261T3; RU2194752C2; CA2195935A1; ZA97452B; US5895654A; AU1234697A; ATE219511T1; BRPI9700768B1; DE69713408D1; CZ289530B6; PL187163B1; BR9700768A; PL318095A1; BRPI9700768B8; CA2195935C; PT786518E; NZ314091A

Description

Streptococcus equi a vakcina s jeho obsahem

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nového kmene Streptococcus equi a vakcíny s jeho obsahem.

Dosavadní stav techniky

Streptococcus equi je již dlouho znám jako příčina akutního onemocnění horního respiračního traktu u koní (Sweeney a další, Compendium Equine 9: 689 - 693 (1987)). Toto vysoce nakažlivé io onemocnění je charakterizováno horečkou, hlenohnisavým výtokem z nosu, onemocněním mízních uzlin a následnou tvorbou abscesů mízních uzlin na hlavě a krku (Sweeney a další, Compendium Equine

9: 845 - 851 (1087)).

Zduření lymfatických uzlin je často tak těžké, že dojde k zúžení is dýchacích cest. Tento jev vysvětluje anglický název onemocnění, strangles.

Onemocnění je smrtelné pouze v malém množství případů, jak se popisuje u: (Sigmund, O. H. a Fraser, C. M. red.; The Merck Veterinary Manual, 5. vydání Merck and Company lne., Rahway, N. J.:

313 - 315 (1979)).

Naproti tomu nemocnost je obvykle vysoká a může být u vnímavých populací až 100 %.

Vakcíny proti tomuto onemocnění jsou známy už dlouho (Bazely, P. L.; Austr. Vet. J. 16: 243 (1940)) a (Bazely, P. L.; Austr. Vet. J. 18:

141 - 155 (1942)).

• · · · · · • » · »····» • · · · · ··· ······· · · ·

Dosud jsou k dispozici pouze dva druhy vakcin: a) vakciny, založené na klasických bakterinech a b) podjednotkové vakciny, založené na imunogenním proteinu, proteinu M.

Oba typy vakcin mají své vážné nevýhody. Bakteriny jsou známy 5 pro jejich nepříznivé reakce a poskytnutí relativně nízkého stupně ochrany (Subcommittee on the Efficacy of Strangles Bacterin, Report, American Association of Equine Practitioners). Protein M byl pokládán za slabý antigen, který poskytuje dostatečnou imunologickou odezvu po vícenásobné injekci. (Shrivastava, S. K. a Barnum, D. A.; Can. J.

Comp. Med. 49: 351 - 356 (1985)) (Wooicock, J. B.: Austr. Vet. J. 51:

554 - 559 (1975)).

Navíc je u těchto vakcin doba trvání imunity relativně krátká; další vakciny pro zesílení účinku by měly být aplikovány alespoň jednou za rok (Sweeney a další, Compendium Equine 9: 845 - 851 is (1987)).

Klasické vakciny založené na bakterinech nebo podjednotkách jsou například dostupné u firmy Forth Dodge Laboratories and Coopers Animal Health. Patent popisující bakterin vlastní například firma Mobay Company (US patent 4,944,942).

2o Pokud se koně přirozeně infikují živým virulentním kmenem

Streptococcus equi z terénu, vyvolá se u nich dlouhodobá imunita.

Tak je tomu dokonce v tom případě, když infekce proběhne bez klinických příznaků (Wooicock, J. B.: Austr. Vet. J. 51: 554 - 559 (1975)). To v principu znamená, že vakcinace živým oslabeným kmenem by byla velmi výhodná proti vakcinaci s dosud používanými inaktivovanými nebo podjednotkovými vakcínami. Dosud však není komerčně dostupná žádná vakcína s živou oslabenou bakterií.

Je znám pouze jeden patent (EP 0.230.456), ve kterém se popisuje vakcína, založená na určitém živém oslabeném kmenu

3o Streptococcus equi. Na trh však dosud nebyly uvedeny žádné • * · · ·····« • · · · · · ·· Μ • · » · · · • 4» · Ο · · · · · • · β · · ♦ · · ······· « · λ komerční vakciny založené na tomto patentu, ačkoliv patentovaný kmen již existuje 10 let.

Vakcína podle patentu EP 0.230.456, ačkoliv je lepší než existující bakterinové a podjednotkové vakciny, má několik vážných nedostatků:

a) Oslabení je založeno na chemicky indukovaných nedefinovaných mutacích v genomu kmene vakciny. Tyto mutace jsou téměř jistě bodové mutace z důvodu použitého mutagenu nitrosoguanidinu. Bodové mutace jsou náchylné ke zpětným mutacím ío a tím k obnovení virulence. Vysoce výhodný by byl proto oslabený kmen, u kterého by bylo oslabení způsobeno dobře definovanou nevratnou deleci podstatné části, a proto neschopný znovuobnovení virulence.

b) Vakcína je založena na nezapouzdřeném kmenu: screening byl prováděn na nezapouzdřené kolonie. Základem vakciny je ztráta virulence. Jako důsledek, vakcína založená na této ztrátě nebude chránit proti zřejmému faktoru virulence, tj. pouzdru.

Živá vakcína obsahuje pouzdro, a proto poskytuje výhodnější kompletnější ochranu.

c) Vakcína není zcela bezpečná pro hříbata. Protože však nejnáchylnější k onemocnění jsou zvířata, měla by být očkována ve velmi mladém věku. Proto by byla vysoce výhodná vakcína, která by byla pro hříbata zcela bezpečná.

Podstata vynálezu

Překvapivě bylo zjištěno, že nový kmen, odvozený ze standardního typu izolovaného z terénu má výše uvedené výhodné vlastnosti. Nový kmen byl odvozen z virulentního kmene izolovaného v přírodě, kmene TW, který byl izolován z klinicky nemocného koně.

• · · · • Λ · · · » • · ·· *· *

Nový kmen byl vybrán podle toho, že obsahuje ve svém genomu rozsáhlou deleci, což ve srovnání s rodičovským kmenem TW způsobuje jeho oslabení. Protože delece má velikost přibližně 1 kb, možnost, že nastane reverze na virulentní kmen je zanedbatelná.

Kmen si zachovává svoje pouzdro. Jak je ukázáno v příkladech, je bezpečný také pro hříbata.

Vynález poskytuje kmen Streptococcus equi TW 928, uložený pod depozitním číslem CBS 813.95 ve sbírce Centraalbureau voor Schimmelcultures, P. O. box 273, 3740 AG Baam, Nizozemí.

io Vynález se dále týká mikrobiologicky čisté kultury obsahující bakterie podle uloženého kmenu. Není nutno zdůrazňovat, že zahrnuty jsou rovněž další generace bakterií z uloženého řetězce. Kultura může být například získána růstem uvedené bakterie při teplotě mezi 30 a 41 °C. Bakterie může růst například v médiu M17 (1 I obsahuje 5 g is tryptózy, 5 g neutralizovaného sojového peptonu, 2,5 g kvasničného extraktu, 5 g hovězího extraktu, 10 g glukózy, 0,5 g kyseliny askorbové, 19 g Na₂(B-)glycerofosfátu, 0,25 g MgSO₄ x 7H₂O, pH 7,0 až 7,2).

Vynález dále poskytuje živou vakcínu pro potírání streptokokové infekce u koní. Tato vakcína obsahuje oslabené živé bakterie Streptococcus equi kmene TW 928, uložené pod depozitním číslem CBS 813.95 u Centraalbureau voor Schimmelcultures at Baam, Nizozemí a farmaceuticky přijatelný nosič. Tímto nosičem může být jednoduše voda, ale může také obsahovat kultivační tekutinu, ve které byly bakterie kultivovány. Dalším vhodným nosičem je například roztok fyziologického roztoku.

Vakcínu podle předkládaného vynálezu je možno podávat v různých formách. Může být například podávána parenterálně, například intramuskulámě, subkutánně nebo intradermálně, může být

3o také podávána orálně nebo intranazálně. Nosní sliznice je nejobvyklejší vstupní branou pro infekce Streptococcus equi. Proto • · · · • · · · · · je nos nejpřirozenějším místem pro aplikaci oslabené živé vakcíny podle vynálezu. Navíc místo aplikace má výhodu, že jej lze snadno dosáhnout, a vakcína může být podávána například ve formě spreje. Ve výhodné formě je tedy vakcína podle předkládaného vynálezu vhodná pro intranazální aplikaci.

Vakcína může obsahovat jakoukoliv dávku bakterie, dostatečnou pro vyvolání imunologické odpovědi. Vhodnými dávkami jsou například dávky mezi 10³ a 10⁹ bakterií.

Pro svůj oslabený charakter může být vakcína použita pro 10 ochranu koní v jakémkoli věku, včetně novorozených koní. Z praktických důvodů se vakcína obvykle podává v mladém věku, například ve věku mezi jedním a dvanácti měsíci.

Existuje několik způsobů ukládání živých organismů. Dobře známé je například ukládání v lednici. Často používané je také skladování při - 70 °C v pufru s obsahem glycerolu. Bakterie je možno také uchovávat v kapalném dusíku. Dalším způsobem konzervace je lyofilizace. Lyofilizované bakterie mohou být skladovány a udržovány životaschopné po mnoho let. Teploty skladování lyofilizovaných bakterií mohou být i více stupňů nad nulou, aniž by se škodlivě

2o projevily na životaschopnosti. Lyofilizaci je možno provádět dobře známými standardními postupy. Do lyofilizovaných kultur je možno také popřípadě přidat prospěšné aditivní látky, jako například odstředěné mléko, trehalózu, želatinu nebo bovinní sérový albumin. Ve výhodném provedení je proto vakcína v lyofilizované formě.

V dalším provedení obsahuje vakcína podle předkládaného vynálezu další oslabený patogen nebo antigenní materiál z dalšího patogenů. Takovým patogenem může například být další bakterie nebo parazit. Může také být virového původu. Obvykle bude jiným patogenem nebo jeho antigenním materiálem koňský patogen.

3o Vakcína podle vynálezu obsahující takový další oslabený patogen nebo antigenní materiál z dalšího patogenů má výhodu, že indukuje ···» ochranu proti několika infekcím současně. Koňské patogeny nebo jejich antigenní materiály, které mohou být s výhodou přidány, je například původce Potomacké horečky, Rhodococcus equi,

Clostridium tetani, Mycobacterium pseudomallei, virus vesikulární stomatitidy, virus Bornské nemoci, virus koňské chřipky, virus africké nemoci koní, virus koňské arteritidy, koňský herpetický virus 1 - 4, virus infekční anémie, virus koňské encefalomyelitidy a virus japonské encefalitidy B.

Vakcina může také obsahovat adjuvans. Adjuvans jsou io nespecifické stimulátory imunitního systému. Zvyšují imunologickou odpověď hostitele na pronikající patogen. Příklady v oboru známých adjuvans jsou Freundovo kompletní a nekompletní adjuvans, vitamin E, neiontové blokové polymery, muramyldipeptidy, látky ISCOM (immune stimulating complexes, například EP 109942), Quill A, is minerální olej, rostlinný olej a Carbopol (homopolymer). Pro aplikaci na sliznice jsou zvláště vhodná adjuvans například termolabiiní toxin

E. coli (LT) nebo cholerový toxin (CT).

Vakcina může navíc obsahovat jeden nebo více stabilizátorů. Vakcina může obsahovat také jeden nebo více vhodných emulgátorů,

2o například Spán nebo Tween.

Vynález také poskytuje způsob výroby vakcíny. Tyto způsoby zahrnují například smísení bakterií Streptococcus equi kmene TW 928 a farmaceuticky přijatelného nosiče.

Předkládaný vynález se také týká použití Streptococcus equi 25 kmene TW 928, uloženého pod depozitním číslem CBS 813,95 u Centraalbureau voor Schimmelcultures at Baam, Nizozemí pro výrobu vakcíny pro potírání streptokokových infekcí u koní.

• · · ·

- 7 Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výběr mutantního kmene

V terénu se vyskytující kmen Streptococcus equi byl izolován z 5 koně s klinickými známkami onemocnění strangles.

Kmen byl ponechán růst přes noc na krevním agaru aerobně při 37 °C a potom jím bylo inokulováno médium M17 (1 I obsahuje 5 g tryptózy, 5 g neutralizovaného sojového peptonu, 2,5 g kvasničného extraktu, 5 g hovězího extraktu, 10 g glukózy, 0,5 g kyseliny io askorbové, 19 g Na₂(B-)glycerofosfátu, 0,25 g MgSO₄ x 7H₂O, pH 7,0 až 7,2) a suspenze byla vystavena různým technikám mutace DNA. Klasické způsoby mutace byly popsány například v: Carlton, B. C. a Brown, B. J. v Manual of Methods for General Bacteriology (red. Gerhardt a další) American Society for Microbiology, Washington D. is C., str. 226 (1981). Techniky mutace založené na rekombinanční technologii DNA jsou popsány v Maniatis, Molecular Cloning, Cold

Spring Harbour Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6 (1989).

Byly vybrány mutanty, obsahující delece detekované pomocí standardní polyakrylamidové gelové elektroforézy restrikčních fragmentů (v oboru známé, viz například Maniatis) při porovnání s rodičovským kmenem TW. Byl vybrán kmen s delecí o velikosti 1 kb, označený TW 928, který byl testován na vlastnosti oslabení, jak se popisuje v následujících příkladech.

Příklad II

Příprava vakciny

Streptococcus equi kmen TW 928 a standardní rodičovský kmen TW byly ponechán růst aerobně přes noc při 37 °C na krevním agaru a potom jimi bylo inokulováno médium M17. Pro studie • · · »

« · · * 9 9 ·»· · • · » • · · 9 9 · vakcinace/podávání byly kmeny kultivovány 6 hod při teplotě 37 °C a pH 7,4 ve 100 ml média M17, centrifugovány a resuspendovány v PBS. Celkový počet buněk byl zjištěn v počítací komůrce a počet životaschopných buněk byl zjištěn počítáním po vysetí na plotny.

Kultury použité pro vakcinaci/testování imunity obsahovaly přibližně 10⁹ bakterií/ml nebo desetinásobné ředění této suspenze.

Příklad III

Bezpečnostní testy vakcínového kmene TW 928 u myši ίο V tomto příkladu byla na myši testována míra oslabení mutantu

TW 928 Streptococcus equi ve srovnání se standardním kmenem TW. Různé koncentrace CFU mutantního kmene a rodičovského standardního kmene TW byly aplikovány intranazáině nebo intraperitoneálně do myši a byla zaznamenávána úmrtnost.

¹⁵ Pokusná zvířata

Myš BALB/c, věk 8 týdnů, zdroj IFFA-Credo.

Průběh experimentu

První skupině 19 myší starých 8 týdnů bylo intranazáině podáno 50 μΙ Streptococcus equi testovacího kmene TW a skupině 20 myší

2o byi intranazáině podán kmen Streptococcus equi TW 928 (viz tabulka 1).

Šesti skupinám po 10 myších ve věku 8 týdnů bylo intraperitoneálně podáno 250 μΙ testovací kultury Streptococcus equi kmene TW v desetinásobném zředění a šesti skupinám po 10 myších stejné množství kmene Streptococcus equi TW 928 (viz tabulka 1). Po podání byla zaznamenávána úmrtnost v průběhu 35 dnů.

Kultury pro vakcinaci/testování imunity

Jak kmen Streptococcus equi TW, tak i TW 928, rostly aerobně při 37 °C přes noc na krevním agaru a potom byly zaočkovány do «· · 9

- 9 média M17. Pro vakcinaci/ testování imunity byly použity čerstvé kultury (staré 5 až 6 hod), obsahující přibližně 10⁹ bakterií/ml nebo jejich desetinásobné zředění. Celkový počet byl stanoven v počítací komůrce a počet životaschopných buněk byl zjišťován vysetím na plotny. Skutečné dávky vakcinace/podání (viz tabulka 1).

Výsledky.

Výsledky po intraperitoneálním a intranazálním testování imunity podáním kmene TW nebo TW 928 8 týdnů starým myším jsou io uvedeny v tabulce 2. LD₅₀ mutantního kmene po intraperitoneálním podání se jevily ve srovnání se standardním kmenem přibližně 10⁴ x vyšší. Podobně po intranazální aplikaci se jevil mutantní kmen výrazně oslabenější ve srovnání se standardním typem. Při vysokých dávkách obou kmenů uhynuly myši v průběhu 24 hod, pravděpodobně is díky předávkování toxických látek. Při nižších dávkách standardního kmene uhynula většina myší 5 až 9 dnů po podání testovací látky, pravděpodobně díky infekci (tabulka 2). Naopak při nižších dávkách mutantního kmene neuhynula žádná myš později než 2 dny po testování imunity (s výjimkou 3 myší ze 60), což ukazuje na to, že mutantní kmen ve většině případů nezpůsobuje fatální infekci (a zároveň je méně infekční ve srovnání se standardním typem). Po intranazálním testování imunity podáním standardního typu většina myší uhynula mezi 5 a 8 dny po podání v důsledku infekce, protože všechny tyto myši vykazovaly vážné neurologické příznaky. Naopak po intranazálním testování imunity podáním mutantního kmene uhynuly pouze 3 myši z 20 v průběhu 24 hod, a to pravděpodobně v důsledku předávkování toxickými látkami spíše než v důsledku infekce (tabulka 2).

φ · · · • φ Φ · · · · φ φ Φ « ···«··· · · » potenciální s imunitou

Příklad IV

Test ochrany vakcinačním kmenem TW 928 u myši

V tomto příkladu byla na myších testována imunogenicita mutanty Streptococcus equi. Zvířatům indukovanou mutantním kmenem po intranazální vakcinaci byla podána letální intranazální látka standardního rodičovského kmene TW. Myším byly intranazálně podávány různé koncentrace CFU mutantního kmene a rodičovského standardního kmene TW a byla zaznamenávána úmrtnost. Zvířatům s imunitou indukovanou dvěma 10 intranazálními vakcinacemi kmenem TW 928 byl podán standardní kmen TW (1 týden po zesilující vakcinaci).

Pokusná zvířata

Myší BALB/c, věk 6 týdnů, zdroj IFFA-Credo.

Umístění is Týden před začátkem experimentu byly myši umístěny v klecích (10 myší/klec) v izolačních boxech s negativním tlakem pro aklimatizaci. Skupina 21 myší byla umístěna v čistém prostoru do 9 týdnů věku (den podsání pro testování imunity) = nevakcinovaná kontrolní skupina.

2o Průběh experimentu

Ve stáří 6 týdnů byly čtyřem skupinám po 10 myších intranazálně podány různé preparáty kmene Streptococcus equi TW v množství 50 μΙ: 1) úplná kultura, 2) úplná kultura 10 x zředěná kultivačním médiem, 3) buňky (ve stejné koncentraci jako kultura), suspendované v PBS nebo 4) buňky v PBS v desetinásobném zředění vůči kultuře (viz tabulka 3). Stejný postup byl proveden pro Streptococcus equi kmen TW 928 s tím rozdílem, že pro buňky v PBS a v koncentraci stejné jako u kultury bylo použito 30 myší (viz tabulka 3). Skupina 21 myší (umístěná odděleně v čistém prostoru) byla ponechána bez podání buněk. Po podání byla v průběhu 14 dnů

zaznamenávána úmrtnost. Ve věku 8 týdnů dostala zvířata, která přežila podání TW 928, opět intranazální dávku (zesilující) mutantního kmene, jak je popsáno pro první podání čerstvě připravených preparátů. Po zesilující dávce byla úmrtnost zaznamenávána po dobu

7 dnů. Ve věku 9 týdnů (1 týden po zesilující dávce) byl zvířatům, která přežila, podán intranazálně kmen Streptococcus equi TW, stejně jako kontrolní skupině, a v průběhu 14 dnů byla zaznamenávána úmrtnost (viz tabulka 3).

Kultury pro vakcinaci/ testování imunity io Oba kmeny Streptococcus equi rostly přes noc aerobně při °C na krevním agaru a potom jimi bylo inokulováno médium M17. Pro vakcinaci/ testování imunity byly čerstvé kultury (staré 5 až 6 hod) nebo (čerstvě centrifugované) buňky suspendovány v PBS v koncentraci přibližně 10⁹ bakterií/ml nebo v desetinásobném ředění is této kultury. Celkový počet byl stanoven v počítací komůrce a počet životaschopných buněk byl zjišťován vysetím na plotny. Pro skutečné dávky při vakcinaci/ testování imunity viz tabulka 3.

Výsledky:

Výsledky po intranazálním podání standardního kmene nebo

2o mutantního kmene jsou uvedeny v tabulce 4. Prakticky všechny myši, kterým byly při testování imunity podány různé preparáty standardního typu TW uhynuly, zatímco po intranazálním podávání mutantního kmene TW 928 uhynulo pouze 7 ze 60 (všechny kromě jedné v průběhu 24 hod) myší (tabulka 4). Dva týdny po prvním podání byla myším, které přežily podání mutantního kmene, podána zesilující dávka. Všechny myši ošetřené zesilující dávkou přežily do podání s výjimkou tří myší ze skupiny TW 928 v PBS. Jeden týden po zesilující vakcinaci byla zvířatům, která přežila, stejně jako skupině 21 kontrolních myší, intranazálně podána testovací dávka kmene standardního typu. Po testování imunity uhynuly všechny kontrolní myši, zatímco různým způsobem vakcinované myši vykázaly různé

- 12 »·· · « r * stupně ochrany, až do 91 % (tabulka 5). Míra ochrany se zdá být závislá na dávce, protože myši vakcinované 10 x zředěnými preparáty měly menší stupeň ochrany. Dva týdny po testování imunity více než polovina vakcinovaných myší, které přežily, odstranila bakterie z krku a ve většině případů se jevily sterilní i mozky (tabulka 6).

Závěr

Z výsledků příkladů III a IV je možné vyvodit, že ve srovnání s rodičovským standardním kmenem TW je kmen Streptococcus equi io TW 928 výrazně oslaben při testování na myši (jak při intranazálním, tak i při intraperitoneálním podání). Navíc indukovala dvě intranazální podání mutantního kmene ochranu proti letálnímu intranazálnímu testování imunity kmenem standardního typu.

Tabulka 1. Průběh experimentu u příkladu III

	Podání v 8 týdnech věku
Počet myší	Způsob podání	Kmen	CFU/dávka
19	IN^b	TW	3,1 x 10⁷
20	IN	TW 928	3,4 x 10⁷
10	IP°	TW	7,7 x 10⁶
10	IP	TW	7,7 x 10⁵
10	IP	TW	7,7 x 10⁴
10	IP	TW	7,7 x 10³
10	IP	TW	7,7 x 10²
10	IP	TW	7,7 x 10¹
10	IP	TW 928	4,3 x 10⁷
10	IP	TW 928	4,3 x 10⁶
10	IP	TW 928	4,3 x 10⁵
10	IP	TW 928	4,3 x 10⁴
10	IP	TW 928	4,3 x 10³
10	IP	TW 928	4,3 x 10²
15	Kontrola bez podání

³ ND = intranazálně (50 μΙ) ^b IP = intraperitoneálně (250 μΙ)

Tabulka 2: Úmrtnost po testování imunity/vakcinaci kmenem

·· · · «	• «·	99 · · « ·
•
•	•	• ·	• · ·
•	• ·	• ·	9 99 9 9
• ·	•	• ·	9 9
··	99 9	99 9 99 9 ·	99 9

Streptococcus equi TW 928

Počet myší	Způsob podání	Kmen	CFU/dávka	Celková úmrtnost
19	IN	TW	3,1 x 10⁷	19
20	IN	TW 928	3,4 x 10⁷	3
10	IP	TW	7,7 x 10⁶	10
10	IP	TW	7,7 x 10⁵	10
10	IP	TW	7,7 x 10⁴	10
10	IP	TW	7,7 x 10³	10
10	IP	TW	7,7 x 10²	8
10	IP	TW	7,7 x 10¹	6
10	IP	TW 928	4,3 x 10⁶	10
10	IP	TW 928	4,3 x 10⁵	3
10	IP	TW 928	4,3 x 10⁴	1
10	IP	TW 928	4,3 x 10³	0
10	IP	TW 928	4,3 x 10²	0

LD50, IP podání, kmen TW

7,7 x 10¹ CFU (Reed & Munch) 5,3 x 10¹ CFU (Probit analysis, Finney)

LD50, IP podání, kmen TW 928

7,0 x 10⁵ CFU (Reed & Munch) 4,9 x 10⁵ CFU (Probit analysis, Finney) • · · · · ·

I

Lf)

V □

tj ro .z >1—

CL

Έ '(0 σ

'«5 >1_ o

CL <n zs

Έ '10 +4 c

<D £

ΙΟ) cl

X

Lil ra

JO ra I—· σ>

>

o

LO

'£ '(0 >

ra tj o

CL ra

N ra c

ra co >

o

Lf) c

'to >

'to

TJ o

CL 'to

N ro c

ro to >

o

LO c

'to >

'to

TJ o

CL 'to

N to c

to to

y.

>

'to

TJ

Ll o

«Ο

O co

O (O o

IO o

X

0«_ co’

X l'co

X h-_ co’

X o-_ co’

X

o.

co’ □

JZ ><u >

-C υ

tU

c.

TJ '>»

JZ >ťU >

X

O <D

C

TJ '>» □

jz . ><1) >

sz o

tu c

TJ tu <>o >« o > CL £ c

<D £ JZ · to

JZ >

'to

TJ o

u.

o c

tu £

JZ to jz >

'to

TJ

Ll o

c ťU £

JZ

(0	to	ra	ro	ra
i_	L.	i—		s_
3	3	o	3	3
**				**
3	3	3	3	3
JZ		JZ	JZ	JZ
TO	to	to	TO	TO
<U	tu	tu	tu	tu
O	o	o	o	O

o	o	o	o
i^-	T“	c^-	T^-
X	X	X	X
co	co	co	00
oí	oí	oí	oí

ra □

□

JZ ra s_

JZ to 'to —

O) o

co

Ol

CD tu o

co’

Ol

CD ω

CQ

CL >

OO

Ol

CD

X o

X

CQ

CL >

CO

Ol

CD ra o

I_ *»* c o JZ 'to c (U >♦—< tu >to o tu c

co o	h- o	¢0 O	O	OO o	h- o	00 O	O
ir·	T^-	v-	τ—	V“	i-	τ-	T^-
X	X	X	X	X	X	Χ	X
co	co_	T“	v-	lf)	UO	σ>	OO
oí	oí	c\í	oí	OÍ	oí	o’	o’

to

JZ 'ra tu o

x o

v to !_ □

JZ 'ra tu o

ω

CQ

o.

>

X o

ω

CQ

CL >

ra ra

J

TO το tu <u °

O

CO

Ol

CD co

Ol

CD ω

CQ

QL >

OO

Ol

CD

X o

X

CQ

Q.

>

CO

Ol σ>

£ 1 1— H ra o

i—

C

O

JZ 'to c

tu ,1— tu >tn o

(U c

x ředěno v kultivačním médiu ^b 10 x ředěno v PBS o

co

Ol

Tabulka 4. Úmrtnost po testování imunity / vakcinaci kmenem

Streptococcus equi TW nebo TW 928 ···♦ •· 9 99 9

99 99 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 999 9

9 9 9 9 9 9

9 99 9 999 9999 ·· 9

Intranazální podání (50μί)	CFU/	Počet	Celková	%
v 6 týdnech věku	dávka	myší	úmrtnost	úmrtnosti
TW, celá kultura	2,3 x 10⁸	10	10	100
TW, celá kultura 10x	2,3 x 10⁷	10	10	100
TW v PBS	2,1 x 10⁸	10	10	100
TW v PBS 10x	2,1 x 10⁷	10	6	60
TW 928, celá kultura	2,5 x 10⁸	10	2	20
TW 928, celá kultura 10x	2,5 x 10⁷	10	0	0
TW 928 v PBS	0,9 x 10⁸	30	5	17
TW 928 v PBS 10x	0,9 x 10⁷	10	0	0

Tabulka 5. Úmrtnost myší po vakcinaci Streptococcus equi kmen TW

928 a testování imunity kmenem TW

Intranazální podání S.equi TW 928 v T=0 a T=2 týdny	Počet myší v T=3 týdny³	Celková úmrtnost	% ochrany
Celá kultura	8	1/8	87,5
Celá kultura 10 x	10	3/10	70
V PBS	22	2/22	91
V PBS 10 x	10	6/10	40
Nevakcinované kontroly	21	21/21	0

den podání kmene TW, myši ve věku 9 týdnů ·· ····

- 17Tabulka 6. Výsledky reizolace bakterií u přeživších myší 14 dnů po testování imunity (viz tabulka 5)

Intranazální podání S.equi TW 928 v T=0 a T=2 týdny	Počet myší	Reizolace S.equi z	Celkem pozitivní
krk	mozky
Celá kultura	7	3	1	3/7
Celá kultura 10 x	7	2	1	3/7
V PBS	20	7	3	9/20
V PBS 10 x	4	1	1	2/4
Nevakcinovaná kontrola	0	-	-	-

Příklad V: Testy bezpečnosti vakcinačního kmene TW 928 u koní

Kmen Streptococcus equi TW 928 byl na bezpečnost testován u 6 sérologicky negativních koní.

Zvířata

Šest koní, věk 7 a 8 měsíců, dosud nepřišli do styku s onemocněním strangles.

io Vakcinace/podání

V T = 0 bylo všech 6 koní vystaveno kontinuálnímu aerosolu kmene TW 928 s použitím nebulizátoru Devilbiss (nastaven na maximální výkon), vybaveným ústním adaptérem. Každý kůň byl vystaven aerosolu 10 min (přibližně 20 ml zředěné šestihodinové kultury, obsahující přibližně 10⁹ CFU/ml bylo použito pro každého koně). Potom byla kultura aplikována intranazálně (5 ml/nozdra) s použitím silikonové hadičky (25 cm) a 10 ml stříkačky. Kultura se skládala ze šestihodinové kultury v médiu M17 s obsahem 2,3 χ 10⁹CFU/ml, která byla těsně před použitím zředěna sterilním NaCI 3 x.

Zředění bylo nutné pro dosažení dobrého aerosolu. V průběhu 10 min bylo přivedeno do aerosolu přibližně 23 ml této kultury.

- 18 ·· ···· • · · 9 9 4

4 4 • · *♦ ·

Klinické vyšetření

Klinické vyšetření koní bylo prováděno před vakcinací a dvakrát v týdnu po vakcinací.

Vyšetření po smrti

V čase 4 týdny po vakcinací byli všichni koně usmrceni a vyšetřeni. Z každého koně byly odebrány výtěry na bakteriologické vyšetření z hrdelního vaku, hrtanu, průdušnice, podčelistních lymfatických uzlin, zahltanových lymfatických uzlin, příušních lymfatických uzlin a tracheobronchiálních lymfatických uzlin a dále ze io všech abnormalit (poškození) ať pro strangles typických nebo ne. Hrdelní vak, hrtan a průdušnice byly vytřeny přímo a rozetřeny na krevní agar. Vzorky tkáně (například lymfatických uzlin) byly vypáleny, byl proveden výřez sterilním skalpelem a materiál byl rozetřen na krevní agar. Plotny s krevním agarem byly inkubovány aerobně při is 37 °C 18 až 24 hodin. Bylo získáno několik hemolytických kolonií (nebo různých morfologických typů, pokud byly přítomny), které byly testovány setem APl-strep a ve zkumavkách se 4 cukry, sorbitolem, ribózou, laktózou a trehalózou.

Vzorky tkání pro histologické vyšetření byly odebrány z hrdelního vaku, podčelistních lymfatických uzlin, zahltanových lymfatických uzlin, příušních lymfatických uzlin a tracheobronchiálních lymfatických uzlin a dále z průdušnice nebo plicní tkáně v případě abnormalit.

Výsledky

Klinické příznaky

Na modelu testu bezpečnosti aerosolu s použitím rodičovského standardního kmenu TW se u vnímavých koní vyvíjejí typické znaky strangles v průběhu 5 až 7 dnů, charakterizované náhlými vysokými teplotami (větší než 40 °C) a tvorbou abscesů na podčelistních a

3o hltanových lymfatických uzlinách. U koní z předchozího experimentu ···· · · ·· ·♦ ···· • ·· ·»*·»· · 9 9 9 · · · ·

9 9 9 9 9 999 » • · · · · · · *· 999 999 9999 «· ·

- 19 po vakcinaci nebyly žádné tyto příznaky pozorovány. Teploty nepřekročily 39,5 °C kromě koně 97, který měl 18 dnů po vakcinaci 39,7 °C. Podčelistní lymfatické uzliny všech koní se v průběhu experimentu zdály normální kromě koně 101, u kterého se levá podčelistní lymfatická uzlina zdála mírně zvětšená 2 dny a 16 dnů po vakcinaci, a u kterého se pravá podčelistní lymfatická uzlina zdála mírně zvětšená 11 dnů po vakcinaci. Narozdíl od podčelistních lymfatických uzlin, zahltanové lymfatické uzliny mohou být vyšetřeny pohmatem pouze nepřímo. Kromě koně č. 98 se zahltanová oblast io všech koní zdála v průběhu několika dnů mírně až středně zvětšená.

Izolace bakterií z nosních výplachů

Po vakcinaci bylo Streptococcus equi z koní izolováno s obtížemi. Pouze u koní 100 a 101 byla bakterie znovu izolována z nosních výplachů v průběhu experimentu a u koně 96 pouze při jedné is příležitosti (viz tabulka 7).

Vyšetření a bakteriologie po smrti

Čtyři týdny po vakcinaci bylo 6 koní usmrceno a vyšetřeno včetně bakteriologického vyšetření. Žádný z koní nevykazoval známky strangles, tj. všechny lymfatické uzliny se jevily normální a ze žádného z koní (s výjimkou nosního výplachů v den usmrcení) nebyl Streptococcus equi izolován.

·· 99 9999 • ♦ · · · • a · · • · 99 9 9

9 9

9999 99 9

-20 Tabulka 7. Reizolace Streptococcus equi z nosních výplachů

	Reizolace Streptococcus equi (CFU/míi v době
Kůň číslo	T=0	T=1 týden	T=2 týdny	T=3 týdny	T=4 týdny
96	-	-	1 x 10³	-
97	-	-	-	-	-
98	-	-	-	-	-
99	-	-	-	-	-
100	-	2x 10⁵	< 10²	1 x 10⁴	4 x 10⁴
101	-	2 x 10⁴	8 x 10⁶	-	2 x 10⁶

Histologické vyšetření

Histologické vyšetření čelistních, hltanových, příušních a 5 tracheobronchiálních lymfatických uzlin potvrdilo makroskopická zjištění: nebyly nalezeny žádné známky strangles, tj. žádná tvorba abscesů. Téměř všechny vyšetřované lymfatické uzliny byly popisovány jako reaktivní lymfoidní tkáň se střední folikulární (germinální centra) hyperplasií, která je znakem antigenní stimulace io horního respiračního traktu.

Závěr

Výsledky jasně ukazují, že deleční mutant Streptococcus equi kmen TW 928 je u koní bezpečný.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1· Streptococcus equi kmen TW 928, jak je uložený pod depozitním číslem CBS 813.95 u Centraalbureau voor Schimmelcultures at Baam, Nizozemí.
2. Mikrobiologicky čistá kultura obsahující bakterie, vyznačující se tím, že kultura obsahuje

Streptococcus equi kmen TW 928 podle nároku 1.
3. Živá vakcína pro potlačování streptokokových infekcí u koní, vyznačující se tím, že uvedená vakcína obsahuje Streptococcus equi kmen TW 928 podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.
4. Vakcína podle nároku 3, vyznačující se tím, že je vhodná pro intranazální podávání.
5. Vakcína podle nároku 3 nebo 4, vyznačující se tím, že je v lyofilizované formě.
6. Vakcína podle některého z nároků 3 až 5, vyznačující se tím, že navíc obsahuje další oslabený patogen nebo antigenní materiál z dalšího patogenů.
7. Vakcína podle nároku 6, vyznačující se tím, ž e uvedený patogen je zvolen ze skupiny původce ·· ···» ···· • ·· • ·· ······ · • · · · · · · • · · · · · ··· * • · · · · · · ·· ·*· ··· ♦ ··· ·* ·

-22 Potomacké horečky, Rhodococcus equi, Clostridium tetani, Mycobacterium pseudomallei, virus vesikulární stomatitidy, virus Bornské nemoci, virus koňské chřipky, virus africké nemoci koní, virus koňské arteritidy, koňský herpetický virus 1

5 - 4, virus infekční anémie, virus koňské encefalomyelitidy a virus japonské encefalitidy B.
8. Vakcina podle některého z nároků 3 až 7, vyznačující se tím, že obsahuje adjuvans.

o
9. Způsob výroby vakciny podle některého z nároků 3 až 8, vyznačující se tím, že zahrnuje smísení bakterie Streptococcus equi kmen TW 928 a farmaceuticky přijatelného nosiče.
10. Použití kmene Streptococcus equi TW 928, uloženého pod depozitním číslem CBS 813.95 u Centraalbureau voor Schimmelcultures at Baam, Nizozemí pro výrobu vakciny pro potírání streptokokové infekce u koní.