JP4563520B2 - ストレプトコッカス・エキワクチン - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ワクチン製造のための生弱毒化ストレプトコッカス・エキ（Streptococcus equi）の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ストレプトコッカス・エキは長い間、ウマの上気道の急性疾患の原因として知られてきた（Sweeney et al, Compendium Equine 9: 689-693 (1987)）。この高度に感染性の病気は熱、粘膿性鼻漏、リンパ腺症、及び続く頭及び首のリンパ節の濃瘍により特徴づけられる（Sweeney et al, Compendium Equine 9: 845-851 (1987)）。
【０００３】
リンパ節の腫れはしばしば厳しく、気道が閉塞されるようになる。この症状は疾病の一般名腺疫（strangles）を説明している。この病気は、ジグムント（Sigmund, O.H. and Fraser, C.M. eds.: The Merck Veterinary Manual, 5th Ed. Merck and Company Inc., Rahway, N.J.: 313-315(1979)）に述べられているように、致命的症例はごく僅かに過ぎない。これに対して、罹病率は一般的に高く、感受性母集団で１００％に達することがある。
【０００４】
この病気に対するワクチンはもちろん長い間、知られてきた（Bazely, P.L., Austr. Vet. J. 16. 243 (1940)及びBazely, P.L., Austr. Vet. J. 18. 141-155 (1942)）。
【０００５】
最近まで、２種類のワクチン、すなわちａ）古典的バクテリン（bacterin、細菌ワクチン）に基くもの、及びｂ）免疫抗原タンパク質であるＭ―タンパク質に基くサブユニットワクチンのみが利用されてきた。両種のワクチンはそれぞれ重大な欠点を有する。バクテリンは有害な作用があり、比較的小さな保護しか得られないことが知られている（米国馬医師協会腺疫バクテリシン有効性小委員会報告書）。スリバスタバ及びバーナム（Slivastava and Barnum, Can. J. Comp. Med. 45: 20-25 (1981)）は、市販及び自己死滅全細胞ワクチンは、腺疫に対して保護するに十分な水準の抗体を誘発する能力がないことを示した。
【０００６】
ウールコック（Woolcock, Austr. Vet. J. 51: 554-559 (1975)）は，１０日間隔の３用量のワクチン投与スキームが少なくとも部分的保護を得るために欠かせないことを示した。ボシュビッツ（Boschwitz, Cornell Vet. 81 : 25-36 (1991)）は、ストレプトコッカス・エキの主要免疫抗原サブユニットであるＭ―タンパク質について、この抗原に対する抗体はウマを自然または実験的な感染から保護するには不十分であるという結論に達した。
【０００７】
全細胞とＭサブユニットワクチンの両方を比較した比較研究において、スリバスタバ及びバーナム（Slivastava and Barnum, Can. J. Comp. Med. 49: 351-356 (1981)）は再び、この種のワクチンの非常に弱い結果を報じており、十分な抗体力価を得るには繰返し追加ワクチン接種が必要であり、又高力価の寿命は短い。更なる追加ワクチン接種を少なくとも１年に１回与えるべきである（Sweeney et al, Compendium Equine 9: 845-851 (1987)）。更に、抗体力価と保護の間には殆ど相関がない。死滅したストレプトコッカス・エキを腹腔 又は経口的に投与した最近の研究でも、生ストレプトコッカス・エキのチャレンジ（免疫感作）に対してごく部分的な保護を記述しているのみである（Wallace et al, Vet. Immunol. and Immunopath. 48. 139-154 (1995)）。バクテリン又はサブユニットに基く古典的ワクチンは例えば、フォース ドッジ ラボラトリーズ（Forth Dodge Laboratories）、クーパーズ アニマル ヘルス（Coopers Animal Health）及びザ モーベイ カンパニー（the Mobay Company）（米国特許第４，９４４，９４２号）を通じて入手可能である。
【０００８】
文献による多くの証拠が、ストレプトコッカス・エキに対する免疫は全身的よりむしろ局所的であることを示している。ストレプトコッカス感染に対する保護付与における局所免疫の際立った重要性は、例えば、ベッセン（Bessen )及びフィシェッティ（Fischetti）により、J. Exp. Medicine, 167: 1945-1950 (1988)及びInfect. and Immun. 56: 2555-2672 (1988)においてよく記述されている。
【０００９】
例えばベマデッテ（Bemadette , J. Gen. Microbiol. 137: 2125-2133 (1991)）により総括されたごとく、局所免疫は粘膜抗体により媒介されることが明確になっている。
【００１０】
また、鼻咽頭はストレプトコッカス・エキの侵入の自然な入口であるので、ワクチン接種の成功には鼻咽頭免疫応答の刺激が必然的に要求されることが、今や一般的に認められている（Galan et al., Inf. Immun. 47: 623-628 (1985); Galan et al., Inf. Immun. 54: 202-206 (1986); Timoney et al., In Kimura, Y., Kotami. S., Shiokawa, Y.(ed.). Recent advances in streptococci and streptococcal diseases, Reed Books, Danbury, N.H.）。
【００１１】
よく確立された鼻咽頭の免疫応答の直接刺激の重要性は、ワクチンの鼻腔内投与のみが部分保護を少なくとも与えるとする最近の意見の一因となっている。
【００１２】
鼻腔内に与えられる生弱毒化ワクチンの一般的問題は、ワクチンが鼻腔内に留まらず、くしゃみなどににより漏洩消散することにある。これは、殆どのワクチンウイルスが環境に拡散すること、及びワクチン接種の十分な水準を確保するために過剰用量を与えなければならないことの２つの理由で望ましくない。しかしこれらの欠点は、上に動機づけられたごとく、鼻腔内ワクチン接種が少なくとも部分保護を得るための唯一の方法であると現在考えられているので、実用上許容されている。
【００１３】
生弱毒化菌株は、我々の知る限りではＷＯ／８７／００４３６に記述されるもののみである。この出願において、他経路のワクチン接種及び／又はサブユニットワクチンの使用は無効であることが知られているので、生ストレプトコッカス・エキによる鼻腔内／経口ワクチン接種が保護を可能とする唯一の方法であることが、もう一度述べられている。しかし、このワクチンの欠点はそれが被包されてない突然変異体であることである。従って、細菌のリポ多糖部に対する免疫応答は得られない。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
上述の生弱毒化ワクチンにおいて遭遇する問題を克服するのが本発明の目的である。
【００１５】
驚くべきことに、今、鼻咽頭免疫応答の直接誘発の重要性に関する最近の意見を無視して、もし生弱毒化ストレプトコッカス・エキ菌株に基くワクチンを局所でなく全身に投与すると、腺疫に対し実質的に完全な保護が得られることを発見した。この非常に高水準の保護は、同じ弱毒化生菌株が鼻腔内に投与されたときに得られる保護の度合いが著しく完全性に乏しい事から考えると、予期しなかったより遥かに大きいものである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ストレプトコッカス・エキ（Streptococcus equi）感染に対抗する全身投与用ワクチンの製造のための、ストレプトコッカス・エキ菌種の生弱毒化細菌の使用を提供する。
【００１７】
全身投与は局所投与と対立するものと考えられている。現在ストレプトコッカス・エキに対するワクチン接種の唯一の有効な方法と考えられている局所投与は、粘膜上へのワクチンの投与を意味する。粘膜は、外界と直接接触し、例えば、消化管、鼻咽頭及び膣に見出される。いくつかの局所投与、すなわち鼻腔内、口内及び膣内投与が現在使われている。
【００１８】
本発明の関する投与経路である全身投与は、ワクチンがワクチン接種される動物の真皮（dermis）内または真皮下に投与される。全身投与の周知の例は、筋肉内ワクチン接種及び皮下（subcutaneous）投与である。他の全身ワクチン接種は例えば皮内（intradermal）ワクチン接種、静脈ワクチン接種及び腹腔内ワクチン接種である。皮内ワクチン接種は、ワクチンを皮膚上に置いた高圧ノズルを経て噴霧し、容易に投与することができるので、現在、ワクチン接種の魅力的方法となっている。他の魅力的なワクチン接種の方法は筋肉内ワクチン接種である。第一に、多くの医者がこのワクチン接種の方法に習熟しているからである。更に、筋肉内ワクチン接種はワクチンが筋肉から血液に徐々に放出される利点がある。その結果、免疫系は長期間にわたりワクチンにより刺激を受ける。
【００１９】
従って、好ましい形態においては、本発明は筋肉内投与用のワクチン製造のためのストレプトコッカス・エキ種の生弱毒化細菌の使用に関する。
【００２０】
生弱毒化ワクチンはしばしば相対的に高い水準の毒性を残している。毒性レベルが高いほど、誘発免疫レベルは高い。一方、明らかに、高い毒性レベルは、ウイルス性ワクチン菌株の病原性効果が野外感染のそれに近づく不利益がある。生ストレプトコッカス・エキワクチンによるワクチン接種は実際上、免疫部における副作用と良好な保護、又は免疫副作用がないこととワクチンの効果は低いことの間の均衡をとることを意味する。従って、一方で十分な保護を与え、かつ他方でワクチン接種部位の副作用を避ける生弱毒化ストレプトコッカス・エキのワクチン接種の方法は非常に望ましい。
【００２１】
今、軟組織の粘膜下へのワクチン接種が、思いがけなくこの問題を解決することを発見した。生弱毒化ワクチンをこの組織に投与すると、全身投与経路の全ての利点は保持され、加えて投与部位における局所反応が無いかまたは少ししかないことを見出した。このワクチン接種の適切な組織は、例えば口である。この組織は全て粘膜層である。これら組織でのワクチン接種は、全身的に行うことが可能であり、従って粘膜層の下に行うことができる。粘膜下の組織のワクチン接種は一般的に粘膜下（submucosal）ワクチン接種と呼ばれる。
【００２２】
従って、他の好ましい形態においては、本発明は、粘膜下投与用のワクチンの製造のためのストレプトコッカス・エキ種の生弱毒化細菌の使用に関する。
【００２３】
ワクチン接種を口内で行う時は、ワクチンは好ましくは頬もしくは上唇又は下唇に粘膜下へ投与される。口の周囲で、馬の唇は、動物の取扱の点からワクチン接種に最も容易な場所である。従って、更に好ましい形態では、本発明は、唇投与用のワクチンの製造のためのストレプトコッカス・エキ種の生弱毒化細菌の使用に関する。
【００２４】
【発明の実施の形態】
生弱毒化ストレプトコッカス菌株として、認容できない副作用を起こさない水準で弱毒化した性質を有する菌株はどれでも使用することができる。弱毒化した性質は、異なる温度下での生育、変異原性剤の存在下での生育、高エネルギー、紫外線その他の照射等の古典的弱毒変異法により、得ることができる。弱毒化した性質は、ＤＮＡ組換え技術、例えば菌力因子の除去によっても得ることが可能である。
【００２５】
ワクチンの製造中に、医薬的に許容可能なキャリヤーを添加することもできる。一つの可能なキャリヤーは生理的塩類溶液である。他の医薬的に許容可能なキャリヤーは例えば細菌増殖に使われる増殖培地である。
【００２６】
もし望まれるならば、アジュバントならびにＴｗｅｅｎ(R)及びＳｐａｎ(R)のごとき一種以上の乳化剤を生ワクチンに配合する。適切なアジュバントは、例えばビタミン―Ｅアセテート溶解性塩、アルミニウム−ヒドロキシド、−ホスフェート又は−オキシド、Ｂａｙｏｌ(R)及びＭａｒｃｏｌ５２(R)のごとき（鉱）油乳化液、ならびにサポニンである。
【００２７】
このように、更により好ましい本発明の実施様態においては、上述のワクチン製造のために、生弱毒化細菌に加えてアジュバントが使用される。
【００２８】
それより更により好ましい本発明の実施様態においては、生弱毒化細菌に加え、他の病原体、又は他の病原体からの抗原物質がこのワクチン製造のために使用される。かかる病原体は、例えば他の細菌又は寄生体であることができる。それはウイルス由来であることができる。通常、他の病原体又はその抗原物質はウマ病原体であろう。かかる追加の弱毒化病原体又は他の弱毒化病原体からの抗原物質を含むワクチンは、同時に複数の感染に対して保護を誘発する利点を有する。
【００２９】
更に良い形態では、病原体又はその抗原物質は、ポトマック発熱体（Potomac fever agent）、ロドコッカス エキ（Rhodococcus equi）、クロストリジウムテタニ（Clostridium tetanii）、ミコバクテリウム シュウドマレイ（Mycobacterium pseudomallei）、ストレプトコッカス ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）、水疱性口内炎ウイルス、ボルナ（Borna）病ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、アフリカウマ病ウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、ウマヘルペスウイルス１〜４、感染性貧血症ウイルス、ウマ脳脊髄炎ウイルス、及びＢ型日本脳炎ウイルスの群から選択される。
【００３０】
最も好ましい形態においては、本発明によるワクチンの製造に使われる細菌は、欧州特許出願第０７８６５１８号で開示されたストレプトコッカス・エキ（Streptococcus equi）ＴＷ９２８菌株である。この菌株はこの出願に関係して、番号ＣＢＳ８１３．９５でオランダ国、バーン所在のケントラールビューロ フォール シンメルクルチュール（the Centraalbureau vorr Schimmelcultures, P.O. box 273, 3740 AG, Baarn, The Netherlands）に寄託されている。
【００３１】
生弱毒化ストレプトコッカス・エキを貯蔵するいくつかの方法がある。例えば冷蔵庫保存は、周知の方法である。またグリセロールを含む緩衝液に入れて−７０℃で保存する方法がよく使われる。細菌は液体窒素中でも保存することができる。冷凍乾燥も他の保存方法である。凍結乾燥細菌は数年間貯蔵し生存のまま保存が可能である。凍結乾燥細菌の貯蔵温度は、生存を害することなく十分０℃以上であることが可能であろう。凍結乾燥は周知の標準的凍結乾燥手法により実施することが可能である。例えばスキムミルク、トレハロース、ゼラチン又はウシ血清アルブミンのごとき任意の有益な添加物を凍結乾燥工程で添加することが可能であろう。従って、最も好ましい形態においては、製造されたワクチンは凍結乾燥形態である。
【００３２】
与え得る用量は、弱毒化レベルに部分的に依存している。一般的に言えば、１０3〜１０10の範囲の用量が適切な用量である。ワクチンは原則として全ての適切な筋肉に投与することが可能であるが、最も便宜的には首、後及び前足の筋肉に投与する。
【００３３】
【実施例】
実施例１：
生弱毒化ワクチンの調製：
生弱毒化ストレプトコッカス・エキＴＷ９２８菌株を、
トリプトース ５．０ｇ
中性大豆ペプトン ５．０ｇ
酵母エキス ２．５ｇ
ビーフエキス ５．０ｇ
Ｄ―グルコース １０．０ｇ
アスコルビン酸 ０．５ｇ
Ｂ―グリセロール燐酸 １９．０ｇ
硫酸マグネシウム７Ｈ2Ｏ ０．２５ｇ
蒸留水 １リットル
を含む培地中で標準条件下で増殖させた。
【００３４】
生弱毒化菌株として使う時は、上記培地中細菌を投与した。不活性ワクチンとして与える時は、細胞を最初に０．０２％塩化ベンザルコニウム中で不活性化した。
【００３５】
実験設計：
腺疫の病歴を持たない１２頭のウマ（１３〜１６カ月齢）を各３頭の４群に分割した。０、２１及び４２日に、群Ｉのウマは、１０9.5ＣＦＵ／ｍｌを含む生ストレプトコッカス・エキワクチン２×１ｍｌ（各鼻孔当り１ｍｌ）を、鼻腔内にワクチン接種した。群ＩＩのウマは、同じ生ストレプトコッカス・エキワクチン２ｍｌを、首の筋肉内にワクチン接種し、群ＩＩＩのウマは、サポニンアジュバント中に５×１０9ＣＦＵ／ｍｌを含む不活性全細胞ワクチン２ｍｌを、首の筋肉内にワクチン接種した。群ＩＶの３頭はワクチン無接種のチャレンジ対照として、無処理のままとした。５６日に、全１２頭は、１０9.3ＣＦＵ／ｍｌのストレプトコッカス・エキ菌株Ａｒｎｉｃａ培養物３ｍｌで鼻腔内にチャレンジを受けた。直腸温度を少なくとも週２回チャレンジ前及びチャレンジ後に測定した。全実験期間中、ウマの異常有無を生物技術員が毎日観察した。各ワクチン接種の後、毎日ウマの局所または全身反応を、どの反応も２日間続いて消失するまで観察した。獣医による臨床的試験を、規則的に、チャレンジ前及びチャレンジ後毎日実施した。チャレンジ後１〜４週間に（臨床的徴候及び／又は状態に依って）ウマを屠殺し、腺疫の徴候に特別な注意を払い完全な死体研究に処し、ストレプトコッカス・エキの再単離のための試料を採取した。
【００３６】
臨床的徴候：
最初のワクチン接種前１ヶ月に、ウマを一緒に居住させて微生物フローラを交換した。最初のワクチン接種日に、ウマは臨床的徴候は無いか又は僅かな上気道の徴候（例えば鼻漏）を示したが、その後は良い状態であった。ワクチン接種後（チャレンジまで）、ウマは臨床的徴候はなく、又ワクチン接種前と同じ上気道の徴候を示した。
【００３７】
チャレンジの後、対照ウマの全３頭、鼻腔内生ワクチン接種したウマの全３頭、及び不活性ワクチンを筋肉内ワクチン接種したウマ全３頭は、突然の高温、頭及び首のリンパ節の腫れ、及び粘膿性鼻漏（最後者の群は対照群と比較して僅かに少なかった）により特徴付けられる明らかな腺疫の徴候を示した。著しく対照的に、筋肉内生ワクチン接種ウマは完全に腺疫の徴候が見られなかった。観察された唯一の徴候は、時折り軽度の上気道の徴候（すなわちチャレンジ及び／又はワクチン接種前に観察されたものと同じ徴候）であった。臨床採点システムを表１に記述した。臨床採点を表２に総括した。チャレンジ後の全臨床採点は、チャレンジ後の各観察日の臨床採点を各生存日数について合計して得た。
【００３８】
結果：表２から明らかなごとく、生弱毒化ストレプトコッカス・エキワクチンによる筋肉内ワクチン接種はウイルス性ストレプトコッカス・エキのチャレンジ感染の臨床効果を９８％減少させるが、一方、同じワクチンの鼻腔内ワクチン接種は臨床効果を僅か２６％しか減少させない。同じワクチン菌株の不活性細胞のワクチン接種はチャレンジ効果を３９％減少させる。
【００３９】
生弱毒化ストレプトコッカス・エキワクチンの筋肉内ワクチン接種は鼻腔内ワクチン接種又は不活性ワクチンのワクチン接種と違って、毒性ストレプトコッカス・エキ菌株による感染に対して実質的に完全な保護を与える。
【００４０】
鼻洗液中のβ―溶血ストレプトコッカス菌（β-haemolytic streptococci）
チャレンジ後の最初の週に、ストレプトコッカス・エキを数頭のウマから少数を単離した。その後、筋肉に生ワクチン接種したウマを除いて、頻度と数は著しく増加し、多分破れたリンパ節膿瘍に由来する膿性鼻漏の存在と相関があるようであった。これら単離物を同定して、ＰＣＲを使いチャレンジした菌株であることを確認した。
【００４１】
結果：生弱毒化ストレプトコッカス・エキワクチンの筋肉内施用はワクチンの環境への流出を防止し、改善された用量の可能性を提供する。
【００４２】
死体試験、微生物学及び組織学
死体知見は臨床知見を確認した。すなわち、筋肉生ワクチン接種ウマ全３頭は、完全に腺疫の巨視的又は顕微鏡的徴候が無く、ワクチン接種注射部位を除いてストレプトコッカス・エキは再単離されなかったが、他の全てのウマ（ウマ番号３５を除いて）は一つ以上の（著しく）拡張した膿性のリンパ節を示し、これからストレプトコッカス・エキが単離された。ウマ番号３５の咽後リンパ節の顕微鏡試験結果はこのウマも（中度の）リンパ節炎を有し、ここからもストレプトコッカス・エキが単離された。
【００４３】
結果：死体試験結果は、全く、チャレンジ後の臨床知見と一致した。
【００４４】
実施例２：
生弱毒化ストレプトコッカス・エキワクチンによるウマの粘膜下唇ワクチン接種
この実験では唇中の粘膜下に投与した生ストレプトコッカス・エキ菌株ワクチンの安全性と効果を試験した。
【００４５】
粘膜下唇投与のためのストレプトコッカス・エキ・ワクチンの調製
凍結乾燥ワクチンのバイアル瓶内容物を１．０ｍｌの蒸留水に溶解した。１用量＝２００μｌの再構成ワクチン。
【００４６】
再構成ワクチン力価は、初回ワクチン接種について３．０×１０9、追加ワクチン接種について１．２×１０9ＣＦＵ／ｍｌとした。
【００４７】
試験システム
動物：１０頭のシェトランド形ウマ（ストレプトコッカス・エキに対し血清陰性、９〜１１カ月齢、腺疫病歴なし）を実験に使用した。
【００４８】
実験構成：
ワクチン接種／チャレンジ
２週間の順応期間後、５頭のウマを唇中の粘膜下に（上唇に２スポット、下唇に２スポット；１スポット当り２００ｍｌ）生弱毒化ワクチン菌株をワクチン接種した。５頭の他のウマに対してはワクチン菌株をワクチン接種しなかった。初回ワクチン接種後４週間に、５頭のワクチン接種を上述のごとく追加した。追加ワクチン接種後２週間に、全てのウマに鼻腔内でストレプトコッカス・エキ菌株Ａｒｍｉｃａでチャレンジした。
【００４９】
ワクチン接種後、ウマを毎日、全身及び局所反応について観察した。実験の終期又は重症の臨床徴候の場合はより早い時期にウマを殺し、死体研究に処した。
【００５０】
追加ワクチン接種の２週間後に、全てのウマに鼻腔内チャレンジ（各鼻孔中に、Ｍ１７培地＋グルコース中の２ｍｌの新鮮な６時間培養の野生型ストレプトコッカス・エキ菌株Ａｍｉｃａ）を行った。生菌数は、プレート計数によりチャレンジ後直ちに測定した。生菌数は７．７×１０8ＣＦＵ／ｍｌであった。
【００５１】
局所及び全身反応
ワクチン接種の日（直前）、６時間後、及びその後は実験期間中、規則的に、全身及び局所反応についてウマを観察した。
【００５２】
直腸温度
一日前、当日（ワクチン接種の直前及び６時間後）、ワクチン接種後１日及び同２日、及びチャレンジ後規則的に（死亡まで）、直腸温度を生物技術者が測定した。
【００５３】
結果
ワクチン接種の反応
生弱毒化ワクチン菌株によるワクチン接種後６時間に、直腸温度の上昇が観察された。平均温度は、ワクチン接種後に対照と比較して±１℃、ワクチン接種前温度と比較し±１．７℃上昇した。翌日、温度は正常に復した。
【００５４】
ワクチン接種後、ウマは良い状態に見え、正常な食欲を有し、ワクチン接種後６時間の直腸温度への影響以外の更なる全身反応は観察されなかった。
【００５５】
ワクチン菌株の両ワクチン接種後に小さい一過性局所反応が観察された。殆どの反応は初回ワクチン接種後３週間、追加ワクチン接種後２週間で消滅した。
【００５６】
死体試験及び細菌学
死体試験を実施した結果、ワクチン接種したウマは腺疫がなく保護されていることが判った。他の全てのウマは腺疫、すなわち咽後リンパ節中の膿瘍（これからストレプトコッカス・エキを再単離した）又は 更に慢性段階の腺疫を示す繊維症咽後リンパ節（そこには膿瘍が既に（部分的に）解消していた）を有した。
【００５７】
ワクチン接種部位には残留又は局所的な組織反応は観察されなかった。
【００５８】
考察
これらの結果から、生弱毒化ストレプトコッカス・エキワクチンが、腺疫に対して完全な保護を誘発し（５頭／５頭のウマが完全に保護された）、他の全てのウマは腺疫を有したことは明白である。
【００５９】
弱毒化菌株によるワクチン接種後に、ウマは良い状態にあり、正常の食欲を有し、更にワクチン接種後６時間の直腸温度の上昇の他に更なる全身反応は観察されなかった。更に、ワクチン接種後、僅かに小さい一過性局所反応が観察されたがこれは完全に解消した（残留又は局所組織障害／反応は死体試験において観察されなかった）。
【００６０】
結論
唇における弱毒化生ワクチン菌株による粘膜下ワクチン接種は、腺疫に対し完全な保護を誘発し安全についても認容される。
【００６１】
【表１】
【００６２】
【表２】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ワクチン製造のための生弱毒化ストレプトコッカス・エキ（Streptococcus equi）の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ストレプトコッカス・エキは長い間、ウマの上気道の急性疾患の原因として知られてきた（Sweeney et al, Compendium Equine 9: 689-693 (1987)）。この高度に感染性の病気は熱、粘膿性鼻漏、リンパ腺症、及び続く頭及び首のリンパ節の濃瘍により特徴づけられる（Sweeney et al, Compendium Equine 9: 845-851 (1987)）。
【０００３】
リンパ節の腫れはしばしば厳しく、気道が閉塞されるようになる。この症状は疾病の一般名腺疫（strangles）を説明している。この病気は、ジグムント（Sigmund, O.H. and Fraser, C.M. eds.: The Merck Veterinary Manual, 5th Ed. Merck and Company Inc., Rahway, N.J.: 313-315(1979)）に述べられているように、致命的症例はごく僅かに過ぎない。これに対して、罹病率は一般的に高く、感受性母集団で１００％に達することがある。
【０００４】
この病気に対するワクチンはもちろん長い間、知られてきた（Bazely, P.L., Austr. Vet. J. 16. 243 (1940)及びBazely, P.L., Austr. Vet. J. 18. 141-155 (1942)）。
【０００５】
最近まで、２種類のワクチン、すなわちａ）古典的バクテリン（bacterin、細菌ワクチン）に基くもの、及びｂ）免疫抗原タンパク質であるＭ―タンパク質に基くサブユニットワクチンのみが利用されてきた。両種のワクチンはそれぞれ重大な欠点を有する。バクテリンは有害な作用があり、比較的小さな保護しか得られないことが知られている（米国馬医師協会腺疫バクテリシン有効性小委員会報告書）。スリバスタバ及びバーナム（Slivastava and Barnum, Can. J. Comp. Med. 45: 20-25 (1981)）は、市販及び自己死滅全細胞ワクチンは、腺疫に対して保護するに十分な水準の抗体を誘発する能力がないことを示した。
【０００６】
ウールコック（Woolcock, Austr. Vet. J. 51: 554-559 (1975)）は，１０日間隔の３用量のワクチン投与スキームが少なくとも部分的保護を得るために欠かせないことを示した。ボシュビッツ（Boschwitz, Cornell Vet. 81 : 25-36 (1991)）は、ストレプトコッカス・エキの主要免疫抗原サブユニットであるＭ―タンパク質について、この抗原に対する抗体はウマを自然または実験的な感染から保護するには不十分であるという結論に達した。
【０００７】
全細胞とＭサブユニットワクチンの両方を比較した比較研究において、スリバスタバ及びバーナム（Slivastava and Barnum, Can. J. Comp. Med. 49: 351-356 (1981)）は再び、この種のワクチンの非常に弱い結果を報じており、十分な抗体力価を得るには繰返し追加ワクチン接種が必要であり、又高力価の寿命は短い。更なる追加ワクチン接種を少なくとも１年に１回与えるべきである（Sweeney et al, Compendium Equine 9: 845-851 (1987)）。更に、抗体力価と保護の間には殆ど相関がない。死滅したストレプトコッカス・エキを腹腔 又は経口的に投与した最近の研究でも、生ストレプトコッカス・エキのチャレンジ（免疫感作）に対してごく部分的な保護を記述しているのみである（Wallace et al, Vet. Immunol. and Immunopath. 48. 139-154 (1995)）。バクテリン又はサブユニットに基く古典的ワクチンは例えば、フォース ドッジ ラボラトリーズ（Forth Dodge Laboratories）、クーパーズ アニマル ヘルス（Coopers Animal Health）及びザ モーベイ カンパニー（the Mobay Company）（米国特許第４，９４４，９４２号）を通じて入手可能である。
【０００８】
文献による多くの証拠が、ストレプトコッカス・エキに対する免疫は全身的よりむしろ局所的であることを示している。ストレプトコッカス感染に対する保護付与における局所免疫の際立った重要性は、例えば、ベッセン（Bessen )及びフィシェッティ（Fischetti）により、J. Exp. Medicine, 167: 1945-1950 (1988)及びInfect. and Immun. 56: 2555-2672 (1988)においてよく記述されている。
【０００９】
例えばベマデッテ（Bemadette , J. Gen. Microbiol. 137: 2125-2133 (1991)）により総括されたごとく、局所免疫は粘膜抗体により媒介されることが明確になっている。
【００１０】
また、鼻咽頭はストレプトコッカス・エキの侵入の自然な入口であるので、ワクチン接種の成功には鼻咽頭免疫応答の刺激が必然的に要求されることが、今や一般的に認められている（Galan et al., Inf. Immun. 47: 623-628 (1985); Galan et al., Inf. Immun. 54: 202-206 (1986); Timoney et al., In Kimura, Y., Kotami. S., Shiokawa, Y.(ed.). Recent advances in streptococci and streptococcal diseases, Reed Books, Danbury, N.H.）。
【００１１】
よく確立された鼻咽頭の免疫応答の直接刺激の重要性は、ワクチンの鼻腔内投与のみが部分保護を少なくとも与えるとする最近の意見の一因となっている。
【００１２】
鼻腔内に与えられる生弱毒化ワクチンの一般的問題は、ワクチンが鼻腔内に留まらず、くしゃみなどににより漏洩消散することにある。これは、殆どのワクチンウイルスが環境に拡散すること、及びワクチン接種の十分な水準を確保するために過剰用量を与えなければならないことの２つの理由で望ましくない。しかしこれらの欠点は、上に動機づけられたごとく、鼻腔内ワクチン接種が少なくとも部分保護を得るための唯一の方法であると現在考えられているので、実用上許容されている。
【００１３】
生弱毒化菌株は、我々の知る限りではＷＯ／８７／００４３６に記述されるもののみである。この出願において、他経路のワクチン接種及び／又はサブユニットワクチンの使用は無効であることが知られているので、生ストレプトコッカス・エキによる鼻腔内／経口ワクチン接種が保護を可能とする唯一の方法であることが、もう一度述べられている。しかし、このワクチンの欠点はそれが被包されてない突然変異体であることである。従って、細菌のリポ多糖部に対する免疫応答は得られない。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
上述の生弱毒化ワクチンにおいて遭遇する問題を克服するのが本発明の目的である。
【００１５】
驚くべきことに、今、鼻咽頭免疫応答の直接誘発の重要性に関する最近の意見を無視して、もし生弱毒化ストレプトコッカス・エキ菌株に基くワクチンを局所でなく全身に投与すると、腺疫に対し実質的に完全な保護が得られることを発見した。この非常に高水準の保護は、同じ弱毒化生菌株が鼻腔内に投与されたときに得られる保護の度合いが著しく完全性に乏しい事から考えると、予期しなかったより遥かに大きいものである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ストレプトコッカス・エキ（Streptococcus equi）感染に対抗する全身投与用ワクチンの製造のための、ストレプトコッカス・エキ菌種の生弱毒化細菌の使用を提供する。
【００１７】
全身投与は局所投与と対立するものと考えられている。現在ストレプトコッカス・エキに対するワクチン接種の唯一の有効な方法と考えられている局所投与は、粘膜上へのワクチンの投与を意味する。粘膜は、外界と直接接触し、例えば、消化管、鼻咽頭及び膣に見出される。いくつかの局所投与、すなわち鼻腔内、口内及び膣内投与が現在使われている。
【００１８】
本発明の関する投与経路である全身投与は、ワクチンがワクチン接種される動物の真皮（dermis）内または真皮下に投与される。全身投与の周知の例は、筋肉内ワクチン接種及び皮下（subcutaneous）投与である。他の全身ワクチン接種は例えば皮内（intradermal）ワクチン接種、静脈ワクチン接種及び腹腔内ワクチン接種である。皮内ワクチン接種は、ワクチンを皮膚上に置いた高圧ノズルを経て噴霧し、容易に投与することができるので、現在、ワクチン接種の魅力的方法となっている。他の魅力的なワクチン接種の方法は筋肉内ワクチン接種である。第一に、多くの医者がこのワクチン接種の方法に習熟しているからである。更に、筋肉内ワクチン接種はワクチンが筋肉から血液に徐々に放出される利点がある。その結果、免疫系は長期間にわたりワクチンにより刺激を受ける。
【００１９】
従って、好ましい形態においては、本発明は筋肉内投与用のワクチン製造のためのストレプトコッカス・エキ種の生弱毒化細菌の使用に関する。
【００２０】
生弱毒化ワクチンはしばしば相対的に高い水準の毒性を残している。毒性レベルが高いほど、誘発免疫レベルは高い。一方、明らかに、高い毒性レベルは、ウイルス性ワクチン菌株の病原性効果が野外感染のそれに近づく不利益がある。生ストレプトコッカス・エキワクチンによるワクチン接種は実際上、免疫部における副作用と良好な保護、又は免疫副作用がないこととワクチンの効果は低いことの間の均衡をとることを意味する。従って、一方で十分な保護を与え、かつ他方でワクチン接種部位の副作用を避ける生弱毒化ストレプトコッカス・エキのワクチン接種の方法は非常に望ましい。
【００２１】
今、軟組織の粘膜下へのワクチン接種が、思いがけなくこの問題を解決することを発見した。生弱毒化ワクチンをこの組織に投与すると、全身投与経路の全ての利点は保持され、加えて投与部位における局所反応が無いかまたは少ししかないことを見出した。このワクチン接種の適切な組織は、例えば口である。この組織は全て粘膜層である。これら組織でのワクチン接種は、全身的に行うことが可能であり、従って粘膜層の下に行うことができる。粘膜下の組織のワクチン接種は一般的に粘膜下（submucosal）ワクチン接種と呼ばれる。
【００２２】
従って、他の好ましい形態においては、本発明は、粘膜下投与用のワクチンの製造のためのストレプトコッカス・エキ種の生弱毒化細菌の使用に関する。
【００２３】
ワクチン接種を口内で行う時は、ワクチンは好ましくは頬もしくは上唇又は下唇に粘膜下へ投与される。口の周囲で、馬の唇は、動物の取扱の点からワクチン接種に最も容易な場所である。従って、更に好ましい形態では、本発明は、唇投与用のワクチンの製造のためのストレプトコッカス・エキ種の生弱毒化細菌の使用に関する。
【００２４】
【発明の実施の形態】
生弱毒化ストレプトコッカス菌株として、認容できない副作用を起こさない水準で弱毒化した性質を有する菌株はどれでも使用することができる。弱毒化した性質は、異なる温度下での生育、変異原性剤の存在下での生育、高エネルギー、紫外線その他の照射等の古典的弱毒変異法により、得ることができる。弱毒化した性質は、ＤＮＡ組換え技術、例えば菌力因子の除去によっても得ることが可能である。
【００２５】
ワクチンの製造中に、医薬的に許容可能なキャリヤーを添加することもできる。一つの可能なキャリヤーは生理的塩類溶液である。他の医薬的に許容可能なキャリヤーは例えば細菌増殖に使われる増殖培地である。
【００２６】
もし望まれるならば、アジュバントならびにＴｗｅｅｎ(R)及びＳｐａｎ(R)のごとき一種以上の乳化剤を生ワクチンに配合する。適切なアジュバントは、例えばビタミン―Ｅアセテート溶解性塩、アルミニウム−ヒドロキシド、−ホスフェート又は−オキシド、Ｂａｙｏｌ(R)及びＭａｒｃｏｌ５２(R)のごとき（鉱）油乳化液、ならびにサポニンである。
【００２７】
このように、更により好ましい本発明の実施様態においては、上述のワクチン製造のために、生弱毒化細菌に加えてアジュバントが使用される。
【００２８】
それより更により好ましい本発明の実施様態においては、生弱毒化細菌に加え、他の病原体、又は他の病原体からの抗原物質がこのワクチン製造のために使用される。かかる病原体は、例えば他の細菌又は寄生体であることができる。それはウイルス由来であることができる。通常、他の病原体又はその抗原物質はウマ病原体であろう。かかる追加の弱毒化病原体又は他の弱毒化病原体からの抗原物質を含むワクチンは、同時に複数の感染に対して保護を誘発する利点を有する。
【００２９】
更に良い形態では、病原体又はその抗原物質は、ポトマック発熱体（Potomac fever agent）、ロドコッカス エキ（Rhodococcus equi）、クロストリジウムテタニ（Clostridium tetanii）、ミコバクテリウム シュウドマレイ（Mycobacterium pseudomallei）、ストレプトコッカス ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）、水疱性口内炎ウイルス、ボルナ（Borna）病ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、アフリカウマ病ウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、ウマヘルペスウイルス１〜４、感染性貧血症ウイルス、ウマ脳脊髄炎ウイルス、及びＢ型日本脳炎ウイルスの群から選択される。
【００３０】
最も好ましい形態においては、本発明によるワクチンの製造に使われる細菌は、欧州特許出願第０７８６５１８号で開示されたストレプトコッカス・エキ（Streptococcus equi）ＴＷ９２８菌株である。この菌株はこの出願に関係して、番号ＣＢＳ８１３．９５でオランダ国、バーン所在のケントラールビューロ フォール シンメルクルチュール（the Centraalbureau vorr Schimmelcultures, P.O. box 273, 3740 AG, Baarn, The Netherlands）に寄託されている。
【００３１】
生弱毒化ストレプトコッカス・エキを貯蔵するいくつかの方法がある。例えば冷蔵庫保存は、周知の方法である。またグリセロールを含む緩衝液に入れて−７０℃で保存する方法がよく使われる。細菌は液体窒素中でも保存することができる。冷凍乾燥も他の保存方法である。凍結乾燥細菌は数年間貯蔵し生存のまま保存が可能である。凍結乾燥細菌の貯蔵温度は、生存を害することなく十分０℃以上であることが可能であろう。凍結乾燥は周知の標準的凍結乾燥手法により実施することが可能である。例えばスキムミルク、トレハロース、ゼラチン又はウシ血清アルブミンのごとき任意の有益な添加物を凍結乾燥工程で添加することが可能であろう。従って、最も好ましい形態においては、製造されたワクチンは凍結乾燥形態である。
【００３２】
与え得る用量は、弱毒化レベルに部分的に依存している。一般的に言えば、１０3〜１０10の範囲の用量が適切な用量である。ワクチンは原則として全ての適切な筋肉に投与することが可能であるが、最も便宜的には首、後及び前足の筋肉に投与する。
【００３３】
【実施例】
実施例１：
生弱毒化ワクチンの調製：
生弱毒化ストレプトコッカス・エキＴＷ９２８菌株を、
トリプトース ５．０ｇ
中性大豆ペプトン ５．０ｇ
酵母エキス ２．５ｇ
ビーフエキス ５．０ｇ
Ｄ―グルコース １０．０ｇ
アスコルビン酸 ０．５ｇ
Ｂ―グリセロール燐酸 １９．０ｇ
硫酸マグネシウム７Ｈ2Ｏ ０．２５ｇ
蒸留水 １リットル
を含む培地中で標準条件下で増殖させた。
【００３４】
生弱毒化菌株として使う時は、上記培地中細菌を投与した。不活性ワクチンとして与える時は、細胞を最初に０．０２％塩化ベンザルコニウム中で不活性化した。
【００３５】
実験設計：
腺疫の病歴を持たない１２頭のウマ（１３〜１６カ月齢）を各３頭の４群に分割した。０、２１及び４２日に、群Ｉのウマは、１０9.5ＣＦＵ／ｍｌを含む生ストレプトコッカス・エキワクチン２×１ｍｌ（各鼻孔当り１ｍｌ）を、鼻腔内にワクチン接種した。群ＩＩのウマは、同じ生ストレプトコッカス・エキワクチン２ｍｌを、首の筋肉内にワクチン接種し、群ＩＩＩのウマは、サポニンアジュバント中に５×１０9ＣＦＵ／ｍｌを含む不活性全細胞ワクチン２ｍｌを、首の筋肉内にワクチン接種した。群ＩＶの３頭はワクチン無接種のチャレンジ対照として、無処理のままとした。５６日に、全１２頭は、１０9.3ＣＦＵ／ｍｌのストレプトコッカス・エキ菌株Ａｒｎｉｃａ培養物３ｍｌで鼻腔内にチャレンジを受けた。直腸温度を少なくとも週２回チャレンジ前及びチャレンジ後に測定した。全実験期間中、ウマの異常有無を生物技術員が毎日観察した。各ワクチン接種の後、毎日ウマの局所または全身反応を、どの反応も２日間続いて消失するまで観察した。獣医による臨床的試験を、規則的に、チャレンジ前及びチャレンジ後毎日実施した。チャレンジ後１〜４週間に（臨床的徴候及び／又は状態に依って）ウマを屠殺し、腺疫の徴候に特別な注意を払い完全な死体研究に処し、ストレプトコッカス・エキの再単離のための試料を採取した。
【００３６】
臨床的徴候：
最初のワクチン接種前１ヶ月に、ウマを一緒に居住させて微生物フローラを交換した。最初のワクチン接種日に、ウマは臨床的徴候は無いか又は僅かな上気道の徴候（例えば鼻漏）を示したが、その後は良い状態であった。ワクチン接種後（チャレンジまで）、ウマは臨床的徴候はなく、又ワクチン接種前と同じ上気道の徴候を示した。
【００３７】
チャレンジの後、対照ウマの全３頭、鼻腔内生ワクチン接種したウマの全３頭、及び不活性ワクチンを筋肉内ワクチン接種したウマ全３頭は、突然の高温、頭及び首のリンパ節の腫れ、及び粘膿性鼻漏（最後者の群は対照群と比較して僅かに少なかった）により特徴付けられる明らかな腺疫の徴候を示した。著しく対照的に、筋肉内生ワクチン接種ウマは完全に腺疫の徴候が見られなかった。観察された唯一の徴候は、時折り軽度の上気道の徴候（すなわちチャレンジ及び／又はワクチン接種前に観察されたものと同じ徴候）であった。臨床採点システムを表１に記述した。臨床採点を表２に総括した。チャレンジ後の全臨床採点は、チャレンジ後の各観察日の臨床採点を各生存日数について合計して得た。
【００３８】
結果：表２から明らかなごとく、生弱毒化ストレプトコッカス・エキワクチンによる筋肉内ワクチン接種はウイルス性ストレプトコッカス・エキのチャレンジ感染の臨床効果を９８％減少させるが、一方、同じワクチンの鼻腔内ワクチン接種は臨床効果を僅か２６％しか減少させない。同じワクチン菌株の不活性細胞のワクチン接種はチャレンジ効果を３９％減少させる。
【００３９】
生弱毒化ストレプトコッカス・エキワクチンの筋肉内ワクチン接種は鼻腔内ワクチン接種又は不活性ワクチンのワクチン接種と違って、毒性ストレプトコッカス・エキ菌株による感染に対して実質的に完全な保護を与える。
【００４０】
鼻洗液中のβ―溶血ストレプトコッカス菌（β-haemolytic streptococci）
チャレンジ後の最初の週に、ストレプトコッカス・エキを数頭のウマから少数を単離した。その後、筋肉に生ワクチン接種したウマを除いて、頻度と数は著しく増加し、多分破れたリンパ節膿瘍に由来する膿性鼻漏の存在と相関があるようであった。これら単離物を同定して、ＰＣＲを使いチャレンジした菌株であることを確認した。
【００４１】
結果：生弱毒化ストレプトコッカス・エキワクチンの筋肉内施用はワクチンの環境への流出を防止し、改善された用量の可能性を提供する。
【００４２】
死体試験、微生物学及び組織学
死体知見は臨床知見を確認した。すなわち、筋肉生ワクチン接種ウマ全３頭は、完全に腺疫の巨視的又は顕微鏡的徴候が無く、ワクチン接種注射部位を除いてストレプトコッカス・エキは再単離されなかったが、他の全てのウマ（ウマ番号３５を除いて）は一つ以上の（著しく）拡張した膿性のリンパ節を示し、これからストレプトコッカス・エキが単離された。ウマ番号３５の咽後リンパ節の顕微鏡試験結果はこのウマも（中度の）リンパ節炎を有し、ここからもストレプトコッカス・エキが単離された。
【００４３】
結果：死体試験結果は、全く、チャレンジ後の臨床知見と一致した。
【００４４】
実施例２：
生弱毒化ストレプトコッカス・エキワクチンによるウマの粘膜下唇ワクチン接種
この実験では唇中の粘膜下に投与した生ストレプトコッカス・エキ菌株ワクチンの安全性と効果を試験した。
【００４５】
粘膜下唇投与のためのストレプトコッカス・エキ・ワクチンの調製
凍結乾燥ワクチンのバイアル瓶内容物を１．０ｍｌの蒸留水に溶解した。１用量＝２００μｌの再構成ワクチン。
【００４６】
再構成ワクチン力価は、初回ワクチン接種について３．０×１０9、追加ワクチン接種について１．２×１０9ＣＦＵ／ｍｌとした。
【００４７】
試験システム
動物：１０頭のシェトランド形ウマ（ストレプトコッカス・エキに対し血清陰性、９〜１１カ月齢、腺疫病歴なし）を実験に使用した。
【００４８】
実験構成：
ワクチン接種／チャレンジ
２週間の順応期間後、５頭のウマを唇中の粘膜下に（上唇に２スポット、下唇に２スポット；１スポット当り２００ｍｌ）生弱毒化ワクチン菌株をワクチン接種した。５頭の他のウマに対してはワクチン菌株をワクチン接種しなかった。初回ワクチン接種後４週間に、５頭のワクチン接種を上述のごとく追加した。追加ワクチン接種後２週間に、全てのウマに鼻腔内でストレプトコッカス・エキ菌株Ａｒｍｉｃａでチャレンジした。
【００４９】
ワクチン接種後、ウマを毎日、全身及び局所反応について観察した。実験の終期又は重症の臨床徴候の場合はより早い時期にウマを殺し、死体研究に処した。
【００５０】
追加ワクチン接種の２週間後に、全てのウマに鼻腔内チャレンジ（各鼻孔中に、Ｍ１７培地＋グルコース中の２ｍｌの新鮮な６時間培養の野生型ストレプトコッカス・エキ菌株Ａｍｉｃａ）を行った。生菌数は、プレート計数によりチャレンジ後直ちに測定した。生菌数は７．７×１０8ＣＦＵ／ｍｌであった。
【００５１】
局所及び全身反応
ワクチン接種の日（直前）、６時間後、及びその後は実験期間中、規則的に、全身及び局所反応についてウマを観察した。
【００５２】
直腸温度
一日前、当日（ワクチン接種の直前及び６時間後）、ワクチン接種後１日及び同２日、及びチャレンジ後規則的に（死亡まで）、直腸温度を生物技術者が測定した。
【００５３】
結果
ワクチン接種の反応
生弱毒化ワクチン菌株によるワクチン接種後６時間に、直腸温度の上昇が観察された。平均温度は、ワクチン接種後に対照と比較して±１℃、ワクチン接種前温度と比較し±１．７℃上昇した。翌日、温度は正常に復した。
【００５４】
ワクチン接種後、ウマは良い状態に見え、正常な食欲を有し、ワクチン接種後６時間の直腸温度への影響以外の更なる全身反応は観察されなかった。
【００５５】
ワクチン菌株の両ワクチン接種後に小さい一過性局所反応が観察された。殆どの反応は初回ワクチン接種後３週間、追加ワクチン接種後２週間で消滅した。
【００５６】
死体試験及び細菌学
死体試験を実施した結果、ワクチン接種したウマは腺疫がなく保護されていることが判った。他の全てのウマは腺疫、すなわち咽後リンパ節中の膿瘍（これからストレプトコッカス・エキを再単離した）又は 更に慢性段階の腺疫を示す繊維症咽後リンパ節（そこには膿瘍が既に（部分的に）解消していた）を有した。
【００５７】
ワクチン接種部位には残留又は局所的な組織反応は観察されなかった。
【００５８】
考察
これらの結果から、生弱毒化ストレプトコッカス・エキワクチンが、腺疫に対して完全な保護を誘発し（５頭／５頭のウマが完全に保護された）、他の全てのウマは腺疫を有したことは明白である。
【００５９】
弱毒化菌株によるワクチン接種後に、ウマは良い状態にあり、正常の食欲を有し、更にワクチン接種後６時間の直腸温度の上昇の他に更なる全身反応は観察されなかった。更に、ワクチン接種後、僅かに小さい一過性局所反応が観察されたがこれは完全に解消した（残留又は局所組織障害／反応は死体試験において観察されなかった）。
【００６０】
結論
唇における弱毒化生ワクチン菌株による粘膜下ワクチン接種は、腺疫に対し完全な保護を誘発し安全についても認容される。
【００６１】
【表１】
【表２】
Claims (7)
- ストレプトコッカス・エキ（Streptococcus equi）種の生弱毒化細菌をワクチンとして非ヒト動物に粘膜下投与することを含むストレプトコッカス・エキ感染に対する予防または治療方法。
- ワクチンを唇に投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 生弱毒化細菌に加えてアジュバントが上記ワクチンに含まれることを特徴とする請求項１ないし２のいずれかに記載の方法。
- 生弱毒化細菌に加え、他の弱毒化病原体、又は他の病原体からの抗原物質が上記ワクチンに含まれることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
- 上記他の弱毒化病原体又は上述の他の病原体からの抗原物質が、ポトマック発熱体（Potomac fever agent）、ロドコッカス・エキ（Rhodococcus equi）、クロストリジウム・テタニ（Clostridium tetanii）、ミコバクテリウム・シュウドマレイ（Mycobacterium pseudomallei）、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）、水疱性口内炎ウイルス、ボルナ（Borna）病ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、アフリカウマ病ウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、ウマヘルペスウイルス１〜４、感染性貧血症ウイルス、ウマ脳脊髄炎ウイルス、及びＢ型日本脳炎ウイルスの群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
- 上述の細菌が番号ＣＢＳ８１３．９５で寄託されたストレプトコッカス・エキ（Streptococcus equi）ＴＷ９２８菌株であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
- ワクチンが凍結乾燥形態であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。
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