JPS6231299B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、ヒト血液のような生物学的液体メジ
ウム中の抗原性を有するウイルス（すなわちウイ
ルス抗原）または赤血球もしくは細胞抗原もしく
は抗体を検知または同定するための分析方法に関
する。 医学的分析において、細胞または粒子によつて
運搬される抗原の性質、および血清学的メジウム
中に抗体またはウイルス抗原の性質の正確な定量
は重要な問題のひとつである。これは特に、供血
者の血液が将来の受血者の血液と適合性を有する
かどうかを確認することが重要な輸血に際して用
いられる。 両血液系の間の非適合性は、一方の血液系の血
漿が、他方の血液系中の赤色小体または赤血球の
膜にある補体構造単位もしくは「抗原単位」もし
くは「抗原」上に固定される、「抗体」と呼ばれ
る分子を含むことになる。この種の抗原は「赤血
球抗原」と呼ばれる。ある抗原粒子にのみ固定さ
れ得る抗体は、その抗原に「特異的な」抗体と呼
ばれる。赤血球により運搬される抗原単位に固定
された場合、抗体は赤血球を凝集させ、破壊しま
たは決定的な障害を与え、その結果、輸血中に不
慮の疾病を生ずることがある。 供血者の血液が、ウイルス抗原（すなわち抗原
性を有するウイルス）またはある疾患と特異的に
対応する抗体を検知することによつて同定される
疾患を受血者に伝搬しないことを確認するのも重
要である。この種の疾患のひとつに輸血後肝炎が
ある。この疾患は供血者の血液がHBs抗原を運搬
するHBウイルスと呼ばれるウイルスを持つ場合
に受血者に起こる。 受血者に非適合性反応または疾患を起こし得る
抗体、細胞抗原または抗原性を有するウイルス
（すなわちウイルス抗原）を検知するため、供血
者および受血者の血液を検査することがきわめて
重要であることは、上述の点からも明らかであ
る。 したがつて、輸血に際しては、検知法の感度が
十分に高いことが重要である。さらに、赤血球も
しくは細胞抗原、抗体またはウイルス（ウイルス
抗原）の特異性の定量に誤りを生じる危険があつ
てはならない。 説明を明確にするため、以下、本明細書におけ
る用語の一部について定義する。 「抗原性を有するウイルス」とは公知の特異的
抗体と反応するウイルスを意味する。以下、これ
は「抗原性を有するウイルス」というほか、もつ
と簡単に、「ウイルス」または「ウイルス抗原」
とも呼ぶ。 「免疫グロブリン」はある動物種から得られる
蛋白分子であり、単純な抗原活性または単純な抗
体活性、あるいは同時に両活性を有し、すなわち
抗原および抗体である。どの動物種の場合も、ヒ
トでも他の動物でも（たとえばヤギ、モルモツト
またはウサギ）、免疫グロブリンにはいくつかの
免疫化学的種類がある。すなわち、Ａと呼ばれる
種類に属する免疫グロブリン（IgAを略す）、Ｇ
と呼ばれる種類に属する免疫グロブリン（IgGと
略す）等である。一般に、免疫化学的種類Ｘ、動
物種からの免疫グロブリンはIgXと示す。 本明細書において用いられる「試験血清」の語
は、ある種の動物種からのある免疫化学的種類に
属する免疫グロブリンたとえばヒトＧ型免疫グロ
ブリン（IgG）であつて、同一種のある動物群す
なわちこの場合ヒトにおいて特定赤血球または細
胞抗原に対して特異的抗体活性を有する免疫グロ
ブリンを含有する血清（または溶液）を意味す
る。この場合、あえてある動物群といつたが、血
清学の分野ではよく知られているように、ある１
種の赤血球または細胞抗原が与えられた動物種の
すべてに存在するとは限らず、通常、ある群を形
成する一部の動物にのみ存在するからである。 同様に、「試験小体」、「試験細胞」または「試
験粒子」の語は、ある動物種からの抗原単位を有
し、その抗原単位はそれに特異的に対応する抗原
単位を運搬する免疫グロブリンに固定される小
体、細胞または粒子を指す。 「抗グロブリン」とは、動物種と異なり、
IgXに対する特異的抗体活性を持つ免疫グロブ
リンを供給する動物種の免疫血清を意味する。
抗グロブリンはIg抗IgX、また混同しない場
合には単に抗IgXと呼ぶことにする。 血漿もしくは血清（または赤血球）中の抗体
（または赤血球抗原）の存在の決定にクームス反
応を用いることは公知である。この公知方法は以
下のとおりで、ヒト血液サンプルの血漿が特定の
抗体たとえば特異的抗Ｄ抗体を含むかどうか、言
い換えれば「Ｄ」抗原に特異的な免疫グロブリン
（その一部は免疫化学的種類Ｇに属し、「IgG」と
呼ぶことにする）を含むかどうかを決定するとき
に用いられる。分析すべき血漿を、Ｄ抗原単位を
有する赤血球すなわち検討しようとしている抗体
に特異的な抗原活性を有する赤血球とともに試験
管中でインキユベートする。血漿中に存在する特
異的抗体の免疫グロブリンは接触期間内に、小体
上の相当する抗原単位に固定される。得られた反
応メジウムを洗浄し、ついで抗グロブリンたとえ
ば抗IgGヒト免疫グロブリンを与えるヤギ血清と
インキユベートする。インキユベーシヨン中に抗
グロブリンによつて供給されたヤギ免疫グロブリ
ンはその特異的抗ヒト単位により、赤血球に特異
的な抗原単位に固定されているヒト免疫グロブリ
ンに固定される。インキユベーシヨン後、反応メ
ジウムを遠心分離する。検討しようとしている特
異的抗Ｄ抗体が実際、血漿中に存在した場合に
は、これから、抗グロブリンにより与えられた免
疫グロブリンによつて、赤血球の凝集を生じる。
これは次の結合鎖、すなわち、赤血球（Ｄ抗
原）／特異的抗Ｄヒト免疫グロブリン／ヒト抗免
疫グロブリン／特異的抗Ｄヒト免疫グロブリン／
（Ｄ抗原）赤血球の産生によるものである。凝集
は、凝集赤血球の試験管底部への沈着の形で生じ
るが、この沈着は非凝集性赤血球の沈着と容易に
識別できるとは限らない。陰性反応では、すなわ
ち特異的抗Ｄ抗体を含まない血漿の場合には、非
凝集性赤血球は均一な懸濁液に復するのに対し、
陽性反応では赤血球は比較的長い集団となつて互
に粘着したままである。 この方法は長時間の複雑な反応を包含し、また
感度が悪い場合もあつて危険である。 細胞によつて運搬される抗原の性質を正確に決
定する必要は臓器移植の場合にも生じる。リンパ
球がHLA系抗原と呼ばれるいくつかの数の抗原
を運搬することは公知である。外科的移植に先立
つて、供給者と受給者のリンパ球の間に少なくと
も理論的な組織適合性があることを確認するため
に、両者のリンパ球によつてどのようなHLA抗
原が運搬されているかを知ることが必須である。
両リンパ球に適合性がなければ、移植は不可能で
ある。リンパ球が持つている可能性のあるHLA
系抗原は種類が多いので、存在するHLA抗原の
特異的性質を決定するためには、多数の基本反応
（たとえば100種）が実施されなければならない。
この操作は、リンパ球細胞が少量しか使用でき
ず、微量反応しか利用できないので、一層困難で
ある。 現在、一部のウイルスまたはウイルス抗原（た
とえばHBs抗原）は放射免疫法で検出されている
が、この方法はきわめて高価で、公害問題を生じ
るので、関係官庁の許可を要する。 本発明の目的は、ウイルス抗原、赤血球もしく
は細胞抗原もしくは抗体の検出のため、生物学的
メジウムたとえばヒト血液サンプルを分析する方
法において、生物学的液体メジウム中のあらゆる
種類のウイルス抗原および血液サンプル中のあら
ゆる種類の赤血球または細胞抗原または抗体を検
出するのに適した、一般に使用できる方法を提供
するにある。 本発明の他の目的は、上記種類の高感度分析法
において、公知方法に比しはるかに優れ、対象の
ウイルス抗原、赤血球もしくは細胞抗原もしくは
抗体に対し感度がきわめて高い分析法を提供する
にある。通常、分析法は、検出できるウイルス抗
原および赤血球または細胞抗原または抗体量が小
であるほど感度が高いといわれ、各種の全特異的
抗原または抗体を誤りなく、すなわち混同するこ
となく検知することができるほど特異性が高いと
いわれる。いい換えれば、特定の特異性を有する
ウイルス抗原を他の特異性を有するウイルス抗原
と混同してはならず、同様のことが赤血球または
細胞抗原または抗体の検出の場合にもいえる。 本発明の他の目的は公害を生じない分析方法を
提供するにある。 本発明の他の目的は結果を得るまでに要する時
間を短縮できる分析方法を提供するにある。 本発明の他の目的は、反応試薬を著しく節約で
きる分析方法を提供するにある。 本発明は、細胞または粒子と血清間の免疫学的
反応およびこの処理後の細胞または粒子と抗グロ
ブリン間の免疫学的反応を用いる生物学的メジウ
ム中のウイルス抗原または赤血球もしくは細胞抗
原もしくは抗体の検出または同定のための分析方
法において、細胞または粒子を含む反応メジウム
と抗グロブリンを、対称軸上の壁に収斂点または
頂点を有し、抗グロブリンと免疫反応を行い得る
分子をその壁に固定させた容器にとり、ついでこ
の反応メジウムを、上述の軸に実質的に平行な遠
心力により、少なくとも陽性反応すなわち同定す
べき抗原または抗体を含む生物学的メジウムのサ
ンプルに対して行われる分析反応を示す細胞は１
次の結合力すなわち抗グロブリンを含む免疫学的
結合力に２次の力が加わつて容器壁に累進的に粘
着されまたは粘着を維持され、一方遠心分離の終
わりに陰性反応を示す細胞は２次の結合力による
以外は壁に粘着されないような条件下に遠心分離
し、ついで２次の結合力（陰性細胞を容器壁に結
合させる力）を破壊するに十分であるが１次およ
び２次の結合力の和（陽性細胞を容器壁に結合さ
せる力）は破壊し得ないような遠心力の適用によ
り陰性細胞は容器の頂点に集めることを特徴とす
る方法である。 以下に定義する本発明の方法は、特殊な反応す
なわち「免疫付着」を包含する。この反応は、反
応指示現象が、(a)細胞、赤血球または粒子と、(b)
抗原または抗体活性を有する分子のマツトでカバ
ーされた容器底部との間の付着であることからそ
のように呼ばれる。付着は小体、細胞または粒子
と容器の間の抗原／抗体結合によつて生じる免疫
的なものである。 本発明の方法は、公知方法に比べて、著しい感
度の上昇をもたらす（フアクター100から1000ま
で）ことが明らかにされている。また分析結果を
得るための時間を著しく短縮させ、従来は１時間
を要していた、たとえば血中の赤血球抗原または
抗体の検出のような緊急の診断を６分で行うこと
が可能になる。本発明の方法では必要な試薬量を
著しく節約することもでき、これはとくに、リン
パ球細胞や稀少な特殊試験血清のような高価な試
薬を用いる場合に重要である。 さらに、本発明の方法は放射活性を利用するも
のではなく、放射免疫法に比べてはるかに安価で
あるばかりか、公害を生ずることもない。 本発明をより明瞭にするため、以下に実例を挙
げ添付の図面を参照しながら本発明をさらに詳細
に説明する。 第１図ないし第９ａ図は、血液サンプル中の
HBs抗原の検出の場合を例に、本発明方法の各工
程を図式的に示したものである。 第１０図は遠心分離中に細胞にかけられる力を
示す図である。 第１１図ないし第１４ｂ図は、ヒト血液サンプ
ルの赤血球中のＤ抗原を検出する場合を例に、本
発明方法の各工程を図式的に示したものである。 第１５図ないし第１８図は遠心分離図である。 本発明方法の適用例１ 本発明方法の第１の態様を以下に第１図ないし
第９ａ図を参照しながら説明する。この例は、ヒ
ト血液サンプルの血清（または血漿）がHBsウイ
ルス抗原、略してHBs抗原を含むかどうかを明ら
かにするために本方法を用いた例である。 (a) 本方法の最初の工程は、容器の底面を細胞ま
たは粒子の付着または非付着性を起こすように
調製する工程である。 容器の底部はその対称軸上に収斂低点を有し
この場合、たとえばPVC（ポリ塩化ビニル）
製のプラスチツクカツプ１でＶ型断面を有する
底部２を持つ。底部２は免疫グロブリン３すな
わちIgXのマツトで覆われていて、この場合
それは免疫化学種類Ｇに属するヤギ免疫グロブ
リンすなわちIgGである（第１図）。ヤギIgG免
疫グロブリン３は図中では白色長方形として示
してある。 IgGは各種の化学的方法でプラスチツクカツ
プ上に固定させることができる。たとえば、プ
ラスチツクとIgG分子の間にカルボジイミド結
合を作らせる、また、IgGをプラスチツクに単
に吸着させるなどの方法がある。 添加するIgGの濃度にはとくに限定はないが
反応の感度は表面に固定された免疫グロブリン
の濃度に依存するので、最高の感度が達成され
るように、カツプの底部を免疫グロブリンで飽
和させるに十分な量を含有する溶液を用いる。
ヤギIgG免疫グロブリンがカツプの底部に固定
されたのち、IgGで被覆されたカツプを生理的
溶液たとえば９％食塩溶液で洗浄し、カツプ上
に固定されないで残つているIgGを除去する。
カツプは生理的溶液を数回通して洗浄する。 少量の生理的溶液をカツプの底部に残し、プ
ラスチツクカツプ上に固定されたIgGが乾燥す
るのを防止する。この方法で、IgGのマツトは
数時間活性を維持する。 (b) 次に細胞または粒子（反応性細胞または粒子
とも呼ぶ）を、反応が陽性であるか陰性である
かによりすなわち分析すべき血清がHBs抗原を
含むか含まないかにより付着または非付着を示
すように調整する。本例では、細胞はヒツジ赤
血球で図には４として示した。 免疫グロブリンは赤血球４に固定され、カツ
プに固定されたIgX免疫グロブリンと同一動
物種からの同一免疫化学種類のものでなければ
ならない。その一部は、HBs抗原に対して抗体
活性も持たねばならない。赤血球は塩化第二ク
ロムで処理され、蛋白分子に固定できるように
なつているので、同時に免疫グロブリンが固定
され有利である。すなわち、本例では抗HBsヤ
ギIgG免疫グロブリンが赤血球に固定され、こ
れは陰影を施した長方形５として図に示した。
この工程（IgGの赤血球への固定）は第２図に
模式的に示した。 抗HBsヤギIgG免疫グロブリンは精製HBs抗
原を注射したヤギ血清から得られる。 かくして調製された赤血球は「試薬赤血球」
である。もちろん、赤血球の代わりに他種の細
胞または粒子を使用でき、それに免疫グロブリ
ンを固定させることができる。 (c) このようにして調製し、生理的溶液に懸濁さ
せたのち、ヒツジ赤血球４を分析すべき血液サ
ンプルの血清または血漿とインキユベートし
て、HBs抗原を含むかどうかを明らかにする。
実際には、使用する血漿はたとえば２％または
１％に希釈される。 調製したカツプの外部で行われるインキユベ
ーシヨン反応は前工程で調整したヒツジ赤血球
の懸濁液と血液サンプルの血清を接触させるも
ので、インキユベーシヨンは常温で数分ないし
数十分行われる。インキユベーシヨン工程は第
３図に模式的に示した。HBs抗原は細かい陰影
を施した卵型分子６である。 分析すべき血清にHBs抗原が存在する場合は
抗原分子６は、すでに赤血球４に固定されてい
る抗HBsIgG５に固定される。第３図に模式的
に示したように、赤血球に固定された抗
HBsIgG分子の周囲に沈着し、抗HBsIgG分子
との間の空間に立体的滞留を生じる。 分析すべき血清がHBs抗原を含まない場合は
反応は起こらず、赤血球はHBsヤギIgG免疫グ
ロブリンを固定させた前工程の末期におけると
同一の状態を維持し、抗HBsIgG分子の周囲に
立体的滞留は生じない。 かくして生成した赤血球は、インキユベーシ
ヨン容器中数回生理的溶液で洗浄するのが有利
である（溶液を加え、懸濁させ、遠心分離し、
沈降させ、上澄液を除去するなど）。 (d) 次に、底部２にヤギIgG３のマツトを保持す
るカツプ１に、インキユベートし、洗浄したヒ
ツジ赤血球を加え、同時に抗グロブリンすなわ
ちカツプおよび赤血球に固定された免疫グロブ
リンに対して特異的抗体活性を有する免疫グロ
ブリン、抗IgX Ig免疫グロブリンを含有
する免疫血清を加える。本例では、ヤギ抗IgG
ウサギ免疫グロブリンＧ（IgG）を含有する抗
ヤギ―ウサギ抗グロブリンを加える。この免疫
グロブリンは第４ａ図および第４ｂ図に小さい
黒い長方形７として模式的に示した。第４ａ図
は陽性反応を、一方第４ｂ図は陰性反応を示し
ている。 また、赤血球の懸濁液をまずカツプに加え、
ついで抗グロブリンを加えることもできる。 抗グロブリン免疫グロブリンはヤギIgGに対
して少なくとも２価の抗体単位を有する。すな
わちヤギ抗IgGウサギIgGは１個の抗体単位で
カツプの底部に固定されたヤギIgG分子と反応
し、一方他の単位で赤血球に固定された抗HBs
ヤギIgG分子と反応できる。ヤギIgG免疫グロ
ブリンに対し特異的抗体活性を有する免疫グロ
ブリンは、ヤギIgG好ましくは精製IgGを注射
された異種動物（本例ではウサギ）の血清から
供給される。 以下に説明するように、本方法では比較的高
濃度の抗グロブリンが用いられる。たとえば、
クームス法で少なくとも強度128を示すヤギ抗
IgG免疫グロブリンがそのまま、またはわずか
に希釈して（希釈比1/2または1/4）使用され
る。 インキユベーシヨン（「抗グロブリン」イン
キユベーシヨン）は後に説明する理由で短時間
でなければならないので、インキユベーシヨン
中、カツプはたえず撹拌し、懸濁液中、抗グロ
ブリンと赤血球の均一な混合物とすることが好
ましい。 (e) 抗グロブリンインキユベーシヨンにつづいて
遠心分離を行う。あらかじめ処理したヒツジ赤
血球とインキユベートした血清サンプルがHBs
を含むか含まないかによる付着または非付着を
明らかにするためには、遠心分離は正確な条件
下に実施しなければならない。カツプの回転軸
１ｂに垂直な軸１ａの回りにカツプを回転させ
ることによつて行う遠心分離は、第１工程また
は「被覆」工程を含み、この工程は抗グロブリ
ンインキユベーシヨン開始後、すなわち赤血球
懸濁液と抗グロブリンをカツプ中に加えたのち
速やかに開始し、カツプに固定されたIgG３ま
たは赤血球に固定されたIgG５のごく一部のみ
が抗グロブリンのヤギ抗IgGIgG７と反応した
時点で開始しなければならない。第１の遠心分
離工程は、ヤギIgGの10％が抗グロブリンのヤ
ギ抗IgG免疫グロブリンと反応するまでには少
なくとも開始することが好ましい。実際上、遠
心分離は抗グロブリンインキユベーシヨン開始
後数秒ないし数十秒の間に開始する。 第１の遠心工程の間、懸濁ヒツジ赤血球と抗
グロブリンを含む反応メジウムはカツプの底表
面２に対して押えつけられ、処理しインキユベ
ートしたヒツジ赤血球によつて運搬される抗
HBsヤギIgG５はプラスチツク上に固定された
ヤギIgG３と対面して位置し、赤血球は、IgG
５およびIgG３に固定される抗グロブリンの免
疫グロブリン７によつてカツプの底部に急速
に、まず粘着させられる。急速な初期付着は、
反応が陽性であつても陰性であつても、すなわ
ち赤血球が抗HBsヤギIgG５によつてHBs抗原
分子に固定されても固定されてなくても起こ
る。これは第１の中等度の遠心速度B1を用い
ることによつて達成される。この速度に後に述
べる方法により決定される。 第５ａ図および第5b図は被覆工程の間の赤
血球とカツプ底部２の対面表面を拡大した図で
ある。第５ａ図は陽性反応の場合であり、第５
ｂ図は陰性反応の場合である。 いずれの場合ともに、抗グロブリン免疫グロ
ブリンはそのヤギIgGに対する抗体特異性によ
り、赤血球に固定されたIgG５とカツプ底部に
固定されたヤギIgG３の間にくる。赤血球の底
部表面２へのゆるやかな付着を生ずるこの被覆
工程の間に、プラスチツクと赤血球の間に回廊
ないしは凹所が生ずる。この回廊は形成される
IgG５／Ig７／IgG３の鎖によつて決定される
ものである。この回廊は他のIg７分子が接近す
るのを制限する斗の役目をする。 上述のように、回廊は、陽性反応すなわちヒ
ツジ赤血球４がIgG５を介してHBs抗原分子６
を固定し得た場合にも、赤血球４がウイルス抗
原分子を固定し得なかつた場合にも生じる。し
かしながら、陽性反応の場合には（第６ａ図参
照）、回廊はウイルス抗原分子によつてさえぎ
られているのに対し、陰性反応では（第６ｂ図
参照）回廊はさえぎられていない。 実際には、第１の遠心分離工程は約200ｇ
（ｇは重力加速度）の加速で、約40ないし60秒
行われる。反応は頂角120゜のカツプ中で行わ
れる。 (f) 次に、遠心分離を数分間停止させる。この停
止期に遊離Ig７分子は、被覆操作の間に生成し
た回廊中を流れ、残つた遊離赤血球IgG５また
は基質IgG３に固定される。この相（すなわち
遠心分離の停止期）は事実上、抗グロブリンイ
ンキユベーシヨンの延長である。 第１の遠心工程においてもたらされた適度の
被覆の間に、容器に固定されたIgG、抗IgG分
子および赤血球に固定されたIgGで作られた結
合鎖が容器と赤血球の間に形成されることが明
らかにされた。本発明に関する実験中、上述の
配置は過剰の抗IgG分子の存在において、容器
に固定されたIgG、抗Ig分子、…抗IgG分子お
よび赤血球に固定されたIgGよりなる配置に比
し、エネルギー的により不安定であることを発
見した。したがつて、抗グロブリンインキユベ
ーシヨンを続けると、容器からの赤血球の脱着
を生ずるIgG／抗IgG／IgG配置よりも、最終的
に多数のIgG／抗IgG…抗IgG／IgG配置を生ず
る。本発明はこの発見を利用している。 反応メジウムが静止しているき、抗グロブリ
ンインキユベーシヨンが続き、ヤギ抗IgG７は
ヤギIgG３または５と反応して、最も安定な配
置を形成する。 しかしながら、前述したように、赤血球とプ
ラスチツクの間に生じた回廊は陰性反応の場合
よりも陽性反応の場合に著しくさえぎられ、陰
性反応において形成した回廊（第6b図参照）
の方が陽性反応（第6a図参照）の場合よりも遊
離分子Ig７の流れが大きい。したがつて、回廊
中の赤血球およびプラスチツクの対面表面は、
陽性反応の場合よりも陰性反応の場合の方がよ
り急速にIg７（赤血球IgG５またはプラスチツ
クIgG３に固定された）によつて飽和される。
しばらくすると、陰性反応の場合（第７ｂ
図）、赤血球およびプラスチツクの対面表面は
多数の以下のような配置を示すようになる。 プラスチツク＋ヤギIgG３／ヤギ抗IgGウサ
ギIg７…ヤギ抗IgGウサギIg７／ヤギIgG５＋
赤血球 類似の性質を持つ２個の分子が互に対面する
ので、この配置はプラスチツク＋ヤギIgG３／
ヤギ抗IgGウサギIg７／ヤギIgG５＋赤血球よ
りなる完全分子橋の形成を生じることのみが可
能である。 抗グロブリンインキユベーシヨンの延長時に
生成される配置は大部分この種のもので、急速
な初期付着を生ずる被覆上工程時にプラスチツ
クと赤血球の間に生成する分子橋はも早、付着
を維持するに十分なだけ存在せず、脱着を生じ
る。 一方、陽性反応の場合（第７ａ図）、対面す
る赤血球とプラスチツクのIg７による飽和はは
るかに遅く、したがつて、陰性反応で脱着が起
こるときまでには、抗IgG分子のIgGへの固定
は赤血球を脱着するのに十分なレベルまで達し
ていない。 すなわち、遠心分離停止相の長さまたは抗グ
ロブリンインキユベーシヨンの延長を調整する
ことにより、陰性反応の場合には対面した赤血
球とプラスチツク表面のIg７分子による飽和は
脱着を起こすのに十分であるが、陽性反応の場
合にはそうでないようにすることができる。 (g) これにつづいて、速度V1より大きい速度V2
で行われる最後の遠心分離工程がある。この遠
心分離工程は陽性反応と陰性反応の間の差を利
用する。速度V2は、その場合の遠心力がIg７
でほぼ飽和されている赤血球すなわち陰性反応
を示す赤血球をカツプ頂部１０に落としてそこ
に集める（第８ｂ図参照）が、陽性反応を示し
た赤血球は分子橋すなわちプラスチツク＋ヤギ
IgG３／ヤギ抗IgウサギIg／ヤギIgG５＋赤血
球が維持されるため、カツプ壁に固定されたま
まである（第８ａ図参照）。抗グロブリンのIg
７における飽和量が脱着を起こすに十分になら
ない前に抗グロブリンインキユベーシヨン工程
が停止され、上述の分子橋が保護されるからで
ある。 実際には、頂角120゜の円錐型カツプを用い
る場合、第２の遠心分離は加速約500ｇで約40
秒行われる。 すなわち、陽性反応の場合、すなわち、イン
キユベートした血清サンプルが実際にHBs抗原
を含むときは、赤血球はIgG３、Ig７および
IgG５を介してカツプの底部に固定されたまま
である。この場合、カツプをその１Ｂ軸に沿つ
て観察すれば、均一な単層の赤血球がカツプ底
部全体に分布し、付着を生じていることがわか
る。 一方、血清の分析サンプルがHBs抗原を含ま
ない場合、前述のように赤血球はカツプの頂部
に引かれ、そこで集められる。したがつてカッ
プをその軸に沿つて観察すると、赤血球の微小
沈着が観察され（第９ｂ図）、付着は生じてい
ない。 試薬の使用量にはとくに制限はない。たとえ
ば径１ないし７mmのカツプに加える液体の容量
は15ないし250μである。赤血球の懸濁液と
抗グロブリンは等容加えるのが有利である。 本発明方法の記述に示したように、一部の工程
は正確に実施しなければならない。 用いる抗グロブリンの濃度は、後述する本発明
方法の第２サンプル適用を参考に、工程ｂ）で得
られる試薬赤血球のIgG表面濃度によつて決ま
る。 濃度は(a)第１遠心分離工程時の容器への赤血球
の急速な初期付着、ならびに(b)工程ｂ）に関連し
て前述したように必要な場合は陰性反応における
赤血球の脱着を生じる過剰の抗IgG分子を与える
だけ十分高くなければならない。しかも、抗グロ
ブリンの濃度は被覆工程時に赤血球と容器との間
の分子橋の過剰生成を妨げるよう中等度のもので
なければならない。陰性反応でも、この種の橋が
小回廊を形成し、遠心分離停止期に抗IgG分子の
流れを妨害するからである。 免疫付着反応期には、抗グロブリン濃度に依存
するゾーン現象、すなわち免疫付着反応の感度が
ある抗グロブリン濃度に応じて最大値の周辺を著
しく変動する現象が、遠心分離前の抗グロブリン
とIgGの接触時間に依存するゾーン現象とともに
認められている。以下に説明するように、接触時
間によるゾーン現象は、抗グロブリン濃度による
ゾーン現象よりも、反応の感度に重要な影響を与
える。 抗グロブリンインキユベーシヨン時、抗グロブ
リンによつて供給される抗IgG分子は、(a)赤血球
に固定されたIgGおよび(b)プラスチツクカツプに
定されたIgGに固定され、固定された抗IgG分子
の数はインキユベーシヨン時間による。前述のよ
うに、抗グロブリンインキユベーシヨン相は第１
の遠心分離工程または被覆工程について行われ
る。インキユベーシヨン時間が長くなると、それ
に応じて、すでに赤血球に固定されている抗IgG
分子は静置工程の間に、類似分子すなわちプラス
チツクに固定されている抗IgG分子に対面しやす
くなる。この配置（赤血球＋IgG／抗IgG…抗
IgG／IgG＋プラスチツク）はカツプの底部の赤
血球被覆時にもたらされ、赤血球のプラスチツク
付着に対し明らかに逆効果を与える。抗グロブリ
ンインキユベーシヨン時間が長くなるほど抗粘着
配置は増大し、その結果、付着の変化すなわち反
応の感度は抗グロブリンインキユベーシヨンの時
間に比例して低下する。 しかしながら、感度は、インキユベーシヨン時
間０のときに最大ではなく、付着が物理的に得ら
れて確認できるものであれば、いくらかの抗IgG
分子がすでに末端結合のひとつに、すなわち赤血
球に固定されたIgGまたはプラスチツクに固定さ
れたIgGに、被覆の時点で固定されていなければ
ならない。実際、このわずかな抗IgG分子が固定
されるには数秒またはその何分の１かで十分であ
る。 このきわめて短いインキユベーシヨン時間は実
験的に決定できる。抗グロブリンインキユベーシ
ヨンの直前、すなわち被覆工程において、反応が
陽性であれ陰性であれ、付着を生じる。したがつ
て、上述の各方法工程を陰性反応について、すな
わち本例ではHBs抗原を含まない血清サンプルを
用いて行うと、適当なインキユベーシヨンの持続
は被覆工程において100％の付着が達成される時
間である。 抗グロブリンインキユベーシヨン時には、免疫
付着は、プラスチツクに固定されたIgGの表面濃
度のわずかな低下および抗IgG分子からまだ自由
なIgGにきわめて感受性が高い。 すでに述べたように、遠心工程は複雑で、多く
の相で行われ、それぞれが反応に特定の機械的効
果を有する。この遠心分離相期に必要な正確な条
件について詳細に説明する前に、遠心分離期に生
じる力について、第１０図を参照しながら説明す
る。 赤血球Ｈまたはその他の任意の、付着または非
付着を明らかにするべく用いられる細胞もしくは
粒子を、カツプの回転軸１ｂに垂直な軸１ａの回
りに回転して遠心分離すると、粒子はカツプ軸１
ｂに平行な遠心力Fcを受ける。他のパラメータ
ーについては以下に述べるとおりである。 １ 円錐型カツプの母線と遠心力の方向に垂直な
面へのその投影の間の角α、これを傾斜角と呼
ぶ。 ２ 赤血球の質量ｍ ３ 速度Vrpmの遠心操作を適用したときのｇの
数ｎ ４ その速度を適用された時間ｔ ５ 赤血球をプラスチツクに対し保持する非特異
性力（FNS）の合計。この合計は、赤血球を
プラスチツクに引きつける静電力、この反応に
包含される主たる特異性を防害する特異性を持
つ免疫化学的結合、および分離を妨げる力（細
胞または粒子はカツプ内の不規則性や傾斜位置
における隣接細胞または粒子のような位置的障
害を受ける）である。 ６ 赤血球をカツプ傾斜に対して保持する力
（FS）の合計。この力はプラスチツクに赤血球
を固定する結合鎖、すなわちIgG（プラスチツ
クに結合）／抗IgG分子／IgG（赤血球に結
合）によつて生じる。 ７ 速度Vrpmで赤血球に加えられる被覆力、す
なわち遠心力の円錐面に垂直な成分により赤血
球をプラスチツクに対し押しつける力、被覆力
（Fp）はｎ×ｍ×cosαに等しい。 ８ 速度Vrpmで赤血球を加えられる剥離力、す
なわち遠心力の円錐面に平行な成分により、粒
子を引き離そうとする力が加えられる。この剥
離力（Fd）はｎ×ｍ×sinαに等しい。 これらを全般的に考慮して、各遠心分離工程で
起こる現象が説明できる。 前例において、第１の遠心分離工程または被覆
工程においては、赤血球の急速な初期付着を得る
ことが試みられ、プラスチツクと赤血球の対面表
面間に回廊が形成された。すでに説明したように
この回廊はさらに抗IgG分子が接近するのを制限
する斗として作用する。 したがつて、第１の遠心分離の速度V1は、陽
性反応であれ陰性反応であれ、すべての反応で全
赤血球が粘着するのに十分な力Ｆp1が選択され
る。速度V1は、赤血球をカツプ底部に保持する
結合力よりも剥離力Ｆd1が大きくならないように
選択される。 赤血球がプラスチツクに粘着した場合、回廊は
次の工程において遠心分離が停止されまたは著し
い低速度で続けられた場合、斗として働くこと
ができなければならない。したがつて、速度V1
は赤血球をカツプ底部に対して過剰に押しつける
ことから被覆操作を防止できるように十分低くな
ければならない。もし被覆操作が強すぎ、赤血球
がプラスチツクに対して押しつけられると、陰性
反応の場合でも回廊がつぶされてしまう。遊離抗
IgG分子はも早、プラスチツクと赤血球の間を流
れ得ず、赤血球とプラスチツクの対面表面が抗
IgG分子により飽和されることは妨げられる。こ
の飽和現象については、本方法の各工程に関連し
て述べたとおりである。 一方、被覆工程の速度V1があまりに低すぎる
と、反応成分すなわち小体に固定されたIgGとプ
ラスチツクに固定されたIgGが十分に接近せず、
付着は不十分で適当な回廊は形成されない。 第２の遠心分離工程は、速度V1より大きな速
度V2で行われる。第２工程は被覆工程の直後に
開始するのではなく、すでに説明したようにある
休止時間をおき、抗グロブリンインキユベーシヨ
ンを延長する。遠心分離力V2は、抗グロブリン
インキユベーシヨン延長工程間に多数の抗IgG分
子を固定した赤血球、すなわち陰性反応の特徴を
示す赤血球がカツプ底部の頂部１０に追いやるの
に十分であるが、陰性反応を示す赤血球、すなわ
ちすでに説明したように抗グロブリンインキユベ
ーシヨン延長工程後、遠心分離休止後にもカツプ
底部壁に粘着している赤血球を移動させてはなら
ない。結局、速度V2は、赤血球に適用される剥
離力Ｆd2が非特異的結合力の合計よりも大で、陰
性反応の赤血球をカツプ底部に維持する力だけよ
りも大である剥離力を生じる。しかしながら、力
Ｆd2は、陽性反応の赤血球をカツプに保持する非
特異性結合力および特異性結合力の和FNS＋FS
より大であつてはならない。 この場合、陰性反応の赤血球のみが離れ、カツ
プの頂部に集められ、一方、陽性反応の赤血球は
粘着したままである。これが、陽性および陰性反
応間に著しく明瞭な識別性を生じるのである。 したがつて、遠心分離に含まれる前述のパラメ
ーターについて最良の結果を与える至適値は、研
究される各系ごとに、すなわち試薬細胞および試
薬粒子の特定の種類、検知されるウイルス抗原、
ならびに反応に含まれるIgXおよび抗IgXI分子
ごとに決定される。剥離力Ｆdと被覆力Ｆpの比、
すなわち剥離の可能性はｎ×ｍ×ｓｉｎα／ｎ×ｍ×ｃ
ｏｓαすなわち tanαに等しい。すなわち、この値は傾斜角αに
のみ依存する。 α＝０゜であればtanαは０で、剥離の可能性
はない。一方、α＝90゜であればtanαは無限大
で剥離の可能性が無限大であり、付着したまま残
る可能性はない。 したがつて、剥離力と被覆力の比を変えて、試
薬細胞または粒子、またその場合のウイルス抗原
ならびにIgGおよび抗IgGI分子に適合させ、第
２の遠心工程において陰性反応を示す試薬細胞ま
たは粒子を特異的に剥離するような中間の値の角
αを用いることができる。 すなわち、至適条件で操作を行うためには、問
題の反応に最も適した傾斜角αを有するカツプを
選択できるように、傾斜角の異なるカツプのセツ
トを用いるのが有利である。 各種性質および特異性を有するウイルス抗原を
検出しなければならない多数の異種サンプルの分
析のための反応は、同一の遠心分離条件で、すな
わち同じ遠心力を適用して行い、各分析用異種サ
ンプルについて選んだカツプが第２の遠心分離工
程で適当な遠心力を選択することにより陰性反応
試薬細胞または粒子を剥離できるような傾斜角α
の底部を有するかどうかを検討すればよい。 したがつて、本発明はＶ状底面を有し、円錐頂
角が異なる、たとえば80゜から140゜まで10゜お
きに異なるカツプのセツトをも提供する。 すなわち、前述の血液サンプル中のHBsウイル
ス抗原の検知例では、円錐状底部を有し、頂角
120゜のカツプを用いるのが有利である。 第１５図は、ヒト血液サンプル中のHBs抗原を
検出する反応における各遠心分離工程を例示する
ものである。免疫付着反応は円錐状底部を有し、
頂角120゜のカツプ中で行われる。縦軸は適用し
た遠心力をｇで示し、横軸は時間を秒で示してい
る。 血清サンプルとインキユベートした赤血球およ
び抗グロブリンよりなる反応メジウムを、底部を
ヤギIgGで被覆したカツプに加え、抗グロブリン
インキユベーシヨンを行わせる。前述のように、
カツプはインキユベーシヨンの間たえず振盪し、
たとえば、回転軸に平行な往復運動を行わせる。
これが第１５図にとして示した振盪および抗グ
ロブリンインキユベーシヨン工程である。本例で
は、この工程は遠心力4gで行われる。この値の
遠心力は赤血球の降下またはカツプ底部の被覆に
は影響を与えない。4gを15秒間維持する。 次に遠心加速を急激に200gまで上昇させ、反
応メジウムをカツプに加えてから60秒後までこの
値に維持する。すなわち、15秒後に赤血球降下の
第相が始まり、赤血球はすべて30秒目までにカ
ツプの底部に触れる。遠心分離を200gで続け、
降下相に続く工程では赤血球の被覆がカツプの
底部に形成される。赤血球は陽性反応を示すもの
も陰陽性反応を示すものもすべてカツプの底部に
粘着し、底表面と赤血球被覆の間に過回廊を生
じる。 60秒後から、まだ反応メジウム中を自由に移動
しているヤギ抗IgG分子の、プラスチツクおよび
赤血球間への拡散相が始まる。前述のように、こ
の工程（第１５図の工程）は抗グロブリンイン
キユベーシヨンの延長である。この工程では加速
8gの遠心力がかけられる。この値は、前工程
で生じた回廊がつぶれない遠心効果である。工程
の間に、赤血球とカツプ底部の対面表面はヤギ
抗IgG分子により徐々に飽和される。飽和の効
果、陰性反応赤血球が脱着するようになる閾値に
は300秒後に達する。 最終工程（すなわち陰性反応赤血球があれば、
これをカツプム頂部に集める工程）は、遠心分離
加速を急速に500ｇに上昇させることにより行わ
れる。この値は、抗グロブリンの飽和の結果、工
程の末期には事実上脱着していた陰性反応赤血
球を移動させるのに十分である。この最終工程
（工程Ｖ）において、前工程で脱着していた赤血
球が急速に集められる。 最終遠心分離工程は、陰性反応の場合、脱着し
た赤血球の百分率が真の陰性反応の割合を示唆す
るようになれば停止できる。本例の場合、最終遠
心分離工程は340秒目に停止させた。 各工程のパラメーター（すなわち遠心分離速度
と持続時間）の値は、前もつて、同一試薬を用い
典型的陰性反応に対する試験で決定できる。最良
の結果を与えた試験から、実際の分析反応に用い
るパラメーターの値を決定する。 別法として、反応中の遠心分離を変化させ、こ
の方法をサンプルの分析反応が行われているカツ
プと陰性対照反応が行われているカツプとで同時
に行い、各遠心回転間にストロボ閃光で照射す
る。 対照反応カツプの底部の拡大像を、たとえば１
秒おきにテレビカメラで撮影し、分析する。生成
した微小沈着像の表面および不透明度を測定し、
微小沈着の生長曲線を対照の陰性反応で得られた
微小沈着の曲線と比較する。ついで、陰性対照反
応における微小沈着の生長曲線が対照の生長曲線
に相当するように遠心分離速度および時間をコン
トロールする。 遠心分離は分析された微小沈着の面が、真の陰
性反応の識別閾値の場合と少なくとも等しい像を
剥離赤血球によつて示すようなつたときである。
この像は以下の方法により決定する。 陰性対照反応に対する前試験の間に、真の陰性
反応について有効な最小サイズ、すなわち識別、
測定、再現が可能な微小沈着中に含まれる赤血球
の百分率を測定した。次に、この陰性反応に対す
る標準偏差σを求めた。陰性反応に対する得られ
た識別閾値は微小沈着中に集められた赤血球の百
分率が上述の陰性反応に対する有効百分率に標準
偏差の２倍を加えた値に等しいときに生じる。同
様に陽性反応の識別閾値は微小沈着中に集められ
た赤血球の百分率が、陰性反応に対する有効百分
率から標準偏差の２倍を差引いた値に等しいとき
に生じる。 たとえば、陰性反応に対する微小沈着中の赤血
球の平均百分率が12％、標示偏差が３％の場合陰
性反応の識別閾値は12％＋２×３％＝18％であ
る。したがつて、分析反応から生じた微小沈着の
表面が、脱着されカツプ頂点に集められた赤血球
の18％またはそれ以上に相当するようになつたと
き、反応は陰性であると考えてよい。陽性反応に
対する識別閾値は12％−２×３％＝６％に等し
い。したがつて、分析の結果生じた微小沈着の表
面が、微小沈着中に赤血球６％またはそれ以下の
場合に相当するならば、反応は陽性であると考え
てよい。微小沈着の表面が赤血球６〜18％に相当
する場合は、反応は疑わしく、再検査が必要であ
る。 以上、ヒト血液サンプル中のHBsウイルス抗原
の存在を検出する場合を例に、本発明の適用第１
例について述べたが、同一方法が、試薬細胞また
は粒子の性質、カツプの底部および前述の細胞ま
たは粒子の固定されるIgXの性質、ならびに抗
IgXI分子の性質を適当に選択することにより、
血液サンプル中の他の任意のウイルス抗原の検出
に使用できることはいうまでもない。 本発明の方法は、血液以外の生物学的メジウム
たとえば睡液または尿にも適用することができ、
また、ウイルス抗原よりもつと一般的に、分子抗
原と呼ばれ、細胞に固定されず、抗原性を有する
遊離分子の抗原にも、包含される各反応が適当に
改変され、すなわち試薬細胞または粒子、細胞ま
たは粒子およびカツプに固定される免疫グロブリ
ン、抗グロブリンおよびその他の各反応パラメー
ターに関し適当な改変が行われれば、適用可能な
ことも当然である。 本発明方法の第２の適用例 次に、ヒト血液サンプルからの赤血球が、Ｄ抗
原活性を有するか否かについて検討する場合の本
発明方法使用例を第１１図ないし第１４ｂ図を参
照しながら説明する。この活性を有する赤血球は
Rh陽性患者に生じ、一方、この活性を持たない
赤血球はRh陰性患者に相当する。 以下は第２例の第１の態様である。 ａ 第１例と同様、第１工程は基質の表面が細胞
の付着または非付着を示すように調整する工程
である（第１１，１２図）。 基質は、たとえばPVC（ポリ塩化ビニル）
製の、Ｖ型底部２２を持つプラスチツクカツプ
２１である。 底部２２は一層の免疫グロブリン２３で被覆
されていて、これは同一動物種からの同一免疫
化学種類に属する、赤血球中の検知すべき抗原
の特異的抗体免疫グロブリンでなければならな
い。たとえば、ヒト赤血球の膜表面に存在する
Ｄ抗原を検出する場合、この抗原の特異的抗体
は抗Ｄ抗体単位を有する、とくにＧ型のヒト免
疫グロブリンである。したがつて、Ｇ型ヒト免
疫グロブリン（ヒトIgG）をカツプの底部に固
定しなければならない。ヒトIgGは白い長方形
２３として示した。 第１例の場合と同じ条件でIgGをプラスチツ
クカツプに固定させる。IgGがカツプ底面に固
定されたのち、９％食塩溶液で洗浄し、固定さ
れていないIgGを完全に除く。 加えるIgGの濃度には限定はない。たとえば
１mg／ml溶液を用い、固定される量よりも過剰
の量を用いるのが好ましい。 少量の生理的溶液を基質の底部に保持させ、
プラスチツク上のIgG層が乾燥するのを防止す
る。 ｂ 本例では、分析される細胞は、ヒト血液サン
プルよりの赤血球で生理的溶液に浸漬されてい
る。これをカツプの外部で、検知すべき抗原に
特異的な試験血清、すなわち公知の（抗Ｄ）抗
体特異性を有し、赤血球によつて運搬されるＤ
抗原基に固定され得るIgG分子を含む血清と数
分ないし数十分、常温で接触させる。実際には
２％または１％希釈血液サンプルから得られる
赤血球の懸濁液を使用する。第１３ａ図の右側
には、分析される赤血球が陽性であり、Ｄ抗原
を有する（赤血球２４の膜上に点で示した）場
合のインキユベーシヨン工程を図解的に示し
た。赤血球の抗原基は試験血清からの抗Ｄ抗体
IgG分子２５を固定する。抗体IgG２５免疫グ
ロブリンは陰影を付した長方形で示してあり、
複合体２６を形成する。 第１３ｂ図は同じ工程で、赤血球２４′が陰
性、すなわちＤ基を持たない場合の同様な図で
ある。この場合、赤血球２４′は抗DIgG２５を
固定しない。 インキユベーシヨンのあとには、インキユベ
ーシヨン容器内での生理的溶液による何回も
（たとえば３回）のすすぎ操作よりなる一連の
洗浄操作を行うのが有利である。各すすぎ操作
は、生理的溶液の添加、懸濁液の形成、遠心分
離、沈降、上澄液の除去よりなる操作のセツト
である。生成物は洗浄され、遊離IgG２５を含
まないメジウム中に浸漬されたインキユベート
赤血球である。 ｃ 次に、インキユベートし、洗浄された赤血球
をカツプ２１中に（その底部はヒトIgG２３で
被覆されている）、抗グロブリンすなわち、ヒ
トIgGに対する抗体基を含む動物免疫グロブリ
ン２７の溶液と同時に加える。抗グロブリン免
疫グロブリンは図中に黒い長方形で示した。 別法として、赤血球の懸濁液をまずカツプに
加え、ついで抗グロブリンを加えてもよい。 本例の場合、用いた抗グロブリンは、ヒト
IgGを注射された、ヤギの免疫血清である。免
疫血清は、ヒトIgGに対してすくなくとも２価
の抗体基を有する免疫グロブリン（ヒト抗IgG
ヤギIgと呼ぶ）を与える。したがつて、ヒト抗
IgGヤギIgはカツプ底部に固定されたヒトIgG
に固定できる１個の抗体基と赤血球に固定され
たヒトIgGに固定できる、他の基をゆうする。 免疫付着反応の感度は抗グロブリンの濃度に
関係するので、この場合は抗グロブリンを高濃
度で使用した。この現象は次のように説明でき
るかもしれない。いかに長時間抗グロブリンイ
ンキユベーシヨンを続けても、赤血球またはカ
ツプに対し固定されるIgGの飽和は、いずれも
100％よりはるかに小である。赤血球の被覆の
形成は多数の異型IgG分子、すなわちカツプま
たは赤血球に固定されたIgGの集合を生ずる。
しかしながら、赤血球が付着によつて固定され
ない限りは、すなわち抗グロブリン分子が赤血
球に固定されたIgGとプラスチツクに固定され
たIgGの間に橋を形成するまでは、赤血球は
IgGで被覆されたカツプの傾斜した底部を移動
しまたはスライドして、任意の２個の異型IgG
分子の接近はきわめて短時間しか続かず、この
時間は赤血球上のIgG表面濃度と反対に変化す
る。すなわち、抗グロブリン分子との二重反応
に距離が好ましい時間はきわめて短い。抗グロ
ブリン分子から最も近い２個の異型IgG分子へ
の平均距離が抗グロブリン分子の平均接近時間
に対して長すぎ、２個の異型IgG分子が好まし
い距離内に接近する有効時間より平均接近時間
が短いと反応は起こらない。平均接近時間は抗
グロブリンの濃度を増大させることにより、明
らかに減少する。 赤血球におけるIgGの表面濃度はあらかじめ
知ることはできないから、赤血球がきわめて低
いIgG表面濃度を示しても、抗IgG分子が赤血
球上のわずかなIgGと反応でき、付着させるよ
うに抗グロブリンは高濃度で用いなければなら
ない。ついでに、反応の感度に対する抗グロブ
リン濃度の影響は、ウイルス抗原たとえばHBs
抗原を検知する場合には小さい。それは、この
場合、試薬赤血球におけるIgG表面濃度が比較
的高レベルに固定されているからである。 たとえば、クームス法において少なくとも力
価128を有するヒト抗IgG抗グロブリンをその
まま、またはわずかに希釈して使用する。実際
には、抗グロブリンは他の公知分析方法、とく
に赤血球凝集を含むクームス反応における感度
について至適になるように希釈される。 すなわち、工程ｂ後に得られた赤血球懸濁液
はカツプ中で抗グロブリンとインキユベートさ
れる。必要に応じて、この間、カツプは振盪さ
れる。 ｄ インキユベーシヨンについで行われる遠心分
離は正確に調整された条件下に実施されねばな
らない。赤血球が陽性か陰性かにより、赤血球
が付着するかまたはそれが妨げられるようにデ
ザインされているからである。 本方法の第１例について前述したように、抗
グロブリンインキユベーシヨンはきわめて短時
間でなければならない。したがつて遠心分離は
反応メジウム（すなわち赤血球の懸濁液と抗グ
ロブリン）をカツプに加えてから数秒ないし数
十秒後、すなわちカツプの底部（IgG２３）ま
たは赤血球（IgG２５）に固定されたきわめて
わずかなIgGが抗グロブリンのヒト抗IgG Ig分
子によつて占拠されたにすぎない。十分短時間
内に開始される。 遠心分離はカツプ２１の回転軸２１ｂに垂直
な軸２１ａの周囲に回転することにより、以下
の２段階に行われる。 第１の段階では、反応メジウムがカツプの底
面２２に対し分布し押しつけられ、赤血球／
IgG複合体が生成していればそのすべて、また
は抗Ｄ試験血清とのインキユベーシヨンによつ
て改変されていない赤血球のすべてが、プラス
チツクに固体されたIgGに対して運ばれる。こ
れは赤血球をカツプの頂点３０に運ぶには不十
分な第１の遠心分離速度V1の適用により行わ
れる。 前述の一般的考慮にしたがい、第１の遠心分
離段階の速度は、その場合の剥離力Ｆd1が、赤
血球をカツプの底部に保持している非特異的結
合力を破壊するには不十分なように選択され
る。赤血球は粘着され、抗グロブリンのヒト抗
IgG分子があれば、プラスチツク底部に固定さ
れたヒトIgGと赤血球によつて運ばれたヒト
IgGの間に橋を形成できるような位置に存在す
る。この被覆工程は、すでに陽性IgG赤血球複
合体に結合されたヒト抗IgG分子が、プラスチ
ツク上のまだ利用できるIgG部位の方向、すな
わちプラスチツクと赤血球の間の分子橋を完成
するのに都合のよい位置移動するためにも用い
られる。 第１の遠心分離速度V1は、プラスチツクと
赤血球の間の分子橋が形成され、完成されるの
に十分な時間維持される。分子橋は以下の結合
鎖よりなるものである。 プラスチツク＋IgG２３／抗グロブリン２
７／IgG２５／陽性赤血球２４ 実際には、この反応は円錐頂角120゜のカツ
プ中において、第１の遠心分離段階は加速約
200ｇ、約１分間の条件で行われる。 ｅ 次に速度V1より大きい速度V2での第２遠心
分離段階が行われる。第２段階は陽性および陰
性反応間の差を明らかにする工程である。速度
V2は生じた遠心力が陰性赤血球をカツプ頂部
３０に移動させ、そこに集める（第１４ｂ図参
照）、陽性赤血球はIgG２３、ヒト抗IgG分子２
７およびIgG２５によりカツプ壁に付着したま
まである（第１４ａ図参照）ように選択され
る。速度V2はすなわち、遠心分離によつて生
ずる剥離力Ｆd2が陰性赤血球をカツプ底部に保
持させる非特異性結合力FNSの合計よりも大
きく、しかしながら陽性赤血球をカツプ底部に
保持させる非特異性結合力および特異性結合力
の和（すなわち、FNS＋FS）より小であるよ
うに選ばれる。 実際には、反応は頂角120゜のカツプ中で行
い、第２の遠心分離操作は、加速約1600ｇにお
いて、数秒ないし数十秒行われる。 分析の結果は反応後直ちに明らかである。 陽性反応の場合、すなわち分析された赤血球
が実際に抗原Ｄ活性を有する場合は、赤血球／
IgG複合体２６はヒト抗IgG分２７（第１４ａ
図）およびヒトIgG２３によりカツプの底部に
粘着されたままである。カツプを軸２１ｂに沿
つて観察した場合（第１４ａ図の右部参照）に
は、カツプの全底面を通じて赤血球の均一な単
層がみられ、すなわち付着が起こつている。 一方、分析された赤血球が抗原Ｄ活性を持た
ない場合は、第２の遠心分離段階でカツプ頂部
３０の方向に移動され、そこに集められる。カ
ツプを軸方向に観察すると、赤血球よりなる微
小沈着３１の形成が認められる（第14b図の右
部）。付着は起こつていない。 使用する試薬量には制限はない。たとえば、
径１ないし７mmのカツプの場合、加える液体量
は15ないし250μである。赤血球懸濁液と抗
グロブリンは等容加えるのが有利である。 以上、赤血球にＤ抗原基があるかどうかの検討
に本発明方法を適用する例を示した。しかしなが
ら、この方法は同一条件で、ヒト血液サンプルの
血清または血漿が特異的抗Ｄ抗体を含むかどうか
を明らかにするにも使用できる。この場合、分析
すべき血清を特異的Ｄ抗原活性を有することが既
知の試験赤血球とインキユベートする。分析され
た血清が特異的抗Ｄ抗体を含む場合は、血清によ
つて供給された特異性抗Ｄ抗体免疫グロブリンが
赤血球上のＤ抗原基に固定される。 次にこうしてインキユベートされた赤血球を洗
浄し、前述のように抗グロブリンと同時に容器中
に加え、ついで前述したように遠心分離工程に付
す。 もし反応が陽性であれば、すなわち分析された
血清が実際に特異性抗Ｄ抗体を含有すれば、プラ
スチツク＋IgG／抗IgG／IgGおよび赤血球の間に
分子橋を生成し、均一な単層の赤血球がカツプの
底表面に形成、粘着される。一方、分析された血
清が特異的抗Ｄ抗体を含まない場合、反応は陰性
で、カツプの底部に粘着し得なかつた赤血球は反
応の末期にはカツプ頂部の微小沈着に集められ
る。 以上本発明の方法を血清または血漿中に特異的
に抗Ｄ抗体または赤血球によつて運搬されるＤ抗
原基の検出について述べたが、本発明の方法は、
血漿中の他の任意の赤血球抗原または他の任意の
抗体の検出に使用することができる。検出が特定
の赤血球抗原に対して行われ、赤血球が現実に抗
原活性を持つかどうかを明らかにすることが所望
される場合、赤血球を、検討される抗原に特異的
であることが既知の抗体を含む試験血清とインキ
ユベートする。逆に、血漿が特定の抗体を含むか
どうかを知りたい場合は、血清を、検討される抗
体に相当する抗原活性を有することが既知の試験
赤血球とインキユベートする。 試験赤血球は、検出すべき抗体に特異的な抗原
基を持たせることができる。また、試験赤血球は
検出すべき抗体に特異的な抗原基が固定された異
種細胞または適当な粒子たとえばプラスチツク粒
子または細胞もしくは粒子で代用することもでき
る。 ついで前述した各種工程を、必要に応じて各操
作パラメーターを改変して実施し、たとえば遠心
分離は付着が起こるか起こらないかを明らかにで
きるように行う。 本発明によるこの第２の例は、任意の細胞抗原
たとえばリンパ球によつて運搬される抗原または
血小板形成抗原の検出に対しても、適当な試薬す
なわち試験血清、カツプの底部に固定される免疫
グロブリンおよび抗グロブリンが選択されれば使
用できる。 本発明のこの第２例は、以下に述べる変法によ
つても実施できる。前例と同様、ヒト血液サンプ
ル中の赤血球がＤ抗原抗体を持つか持たないかを
決定する場合について述べる。 ａ 前述の方法と同様、第１工程はプラスチツク
カツプの円錐状底部をヒトIgGすなわち次工程
に用いられる特異的Ｄ抗原抗体におけると同じ
動物種からの同一免疫化学的種類の免疫グロブ
リンで被覆されるように調製する。 ｂ 次に、前法と同様、分析する赤血球を適当な
生理的溶液に懸濁し、カツプ以外の容器中で、
既知の特異的抗Ｄ抗体を含む試験血清（抗Ｄ試
験血清）とインキユベートする。試験血清とイ
ンキユベートしたのち、赤血球は生理的溶液で
洗浄するのが有利である。 ｃ 次に、上のように処理した赤血球を抗グロブ
リンすなわちヒト抗IgG免疫グロブリンを供給
した動物免疫血清とインキユベートする（カツ
プ外部で前述したように）。このインキユベー
シヨンは常温たとえば20℃において、最高率の
少なくとも高百分率の赤血球固定IgG分子が
（陽性の場合）がそれに付着するヒト抗IgG分
子と反応するのに十分な時間行われる。インキ
ユベーシヨンは20分間続けるのが有利である。 この場合、抗グロブリンは、前述したと同じ
理由で、高濃度において用いるのが有利であ
る。本例の場合、用いた抗グロブリンはクーム
ス法で少なくとも力価128を示し、希釈すると
してもわずかに希釈して用いる（希釈比1/2ま
たは1/4）。 ｄ このインキユベーシヨン期の終わりに、赤血
球懸濁液および抗グロブリンよりなる反応メジ
ウムを、底部をヒトIgGで被覆したカツプに移
す。 ｅ 次に、直ちにカツプをその回転軸に垂直な軸
の回りに回転して第１の遠心分離工程に付す。
遠心分離は赤血球をカツプ底部に押しつけるに
は十分であるが、陰性および陽性赤血球のいず
れをもカツプ壁に対して保持させている非特異
的結合力を破壊しないような速度V1で行われ
る。したがつて、速度V1は、生じる剥離力が
非特異的結合力FNSの合計よりも小であるよ
うに決定される。速度V1はカツプ底部に固定
されたヒトIgG、ヒト抗IgG分子および赤血球
のＤ抗原基に特異的に固定されたヒトIgGより
なる分子鎖が形成されるのに十分な時間適用さ
れる。時間は検出すべき抗原または抗体の性質
にしたがつて選択される。本例の場合、遠心分
離は加速約200ｇで約１分行われる。 ｆ 次に第１の態様と同様、第２の遠心分離操作
が行われる。 遠心分離速度はV2に上昇させる。すでに述
べたように、生じる剥離力は、非特異的力によ
るほかはカツプに結合されていない赤血球すな
わち陰性赤血球をカツプ頂部に移動させるに十
分であるが、Ｄ抗原基をもつた赤血球は移動さ
せない、すなわち陽性赤血球をカツプの傾斜表
面にプラスチツク＋ヒトIgG／ヒト抗IgG／抗
ＤヒトIgG／赤血球のＤ抗原よりなる完全分子
橋によつて保持する特異的結合力FSと非特異
的結合力FNSの和は破壊できないように速度
V2を選ぶ。 認められる結果は前述の場合と同じで、反応
が陽性であれば付着が起こり、カツプ底部に分
布した赤血球の均一な単層がカツプの回転軸に
沿つて観察される。一方、反応が陰性の場合に
は付着が起こらず、カツプ頂部に微小沈着が認
められる。 第２の態様と前述の態様との主たる相違は、抗
グロブリンインキユベーシヨンすなわちあらかじ
め試験血清とインキユベートされた赤血球とヒト
抗IgG分子のインキユベーシヨンを第１の遠心分
離工程の直後にヒトIgGで被覆されたカツプ中で
実施せず、カツプの外部で行い、インキユベーシ
ヨン後に得られた反応メジウムは遠心分離される
までカツプに加えない。本例の場合、プラスチツ
クに固定されたヒトIgG分子と反応するヒト抗
IgG分子の百分率と、赤血球に固定されたヒト
IgG分子と反応するヒト抗IgG分子の百分率の間
に最大の不均斉を得ることを目的とした。理想的
条件では、プラスチツクに固定され、ヒト抗IgG
分子によつて占拠されたヒトIgG分子の百分率は
０％に等しく、赤血球に固定され、ヒト抗IgG分
子によつて占拠されたヒトIgG分子の百分率が最
大になる。もちろん最大値は赤血球をヒト抗IgG
分子を介して互に直接凝集させた場合に得られる
値より小である。 付着反応の最高感度は、各結合末端すなわちプ
ラスチツクに固定されたIgGと、赤血球に固定さ
れたIgGに結合する抗IgG分子の分布の最大の不
均斉がカツプ底面に赤血球がはじめて押しつけら
れたとき、すなわち第１の遠心工程の開始時に達
成されたとき生じるように思われる。不均斉は
IgGの表面濃度が低い結合末端が上より大きい割
合の抗IgG分子を固定するものでなければならな
い。本例では、免疫グロブリンがプラスチツクに
飽和まで結合しているので、プラスチツクはより
高いIgG表面濃度を持つから、IgGの低表面濃度
を持つ結合端は赤血球である。 この種の抗グロブリンインキユベーシヨンは
「不均斉」と呼ばれる。一方、第１の態様におけ
る抗グロブリンインキユベーシヨンは各IgG結合
端が同時に抗グロブリンに接触させられるので
「均斉」と呼ばれる。 赤血球もしくは細胞または抗体抗原が同定され
る場合、不均斉抗グロブリンインキユベーシヨン
がカツプの外部で行われ、ここで免疫付着反応を
生じる場合は、均斉抗グロブリンインキユベーシ
ヨンで得られる感度の200倍もの感度を生じる。 したがつて、不均斉抗グロブリンインキユベー
シヨンを含む等２の態様はとくに、分析すべき血
清中に同定される特定抗体がきわめて少量である
か、または細胞抗原が分析すべき赤血球上できわ
めて低い表面密度しか示さないという理由からき
わめて少数のIg免疫グロブリンたとえばIgGが赤
血球に固定されるにすぎず、反応が困難とされて
いる場合に好ましい。 不均斉抗グロブリンインキユベーシヨンを含む
方法は、分析すべき血清をＤ抗原活性を有するこ
とが既知の試験赤血球とインキユベートし、つい
で上述の操作を行うことにより、この血清が特異
的抗Ｄ抗体を含むかどうかを明らかにするために
使用することもできる。 この方法は、Ｄ抗原以外の赤血球抗原の同定、
また一般に全種類の細胞抗原たとえばリンパ球ま
たは血小板形成抗原の同定にも使用できる。この
場合、遠心分離パラメーターおよび免疫付着反応
に用いられる試薬は、分析すべき血清系に適当に
適合させればよい。同様に、この方法は血漿また
は血清中の任意の種類の抗原を同定するのに使用
できる。 血漿中の赤血球もしくは細胞抗原または抗体を
同定するために用いた本発明方法の上述例では、
付着または非付着を明らかにするのに２工程の遠
心分離工程を用い、第２工程で第１工程より高速
度を用いた。 また、遠心分離は、全小体、たとえば少なくと
も一時的に容器の底壁に粘着させる赤血球に対し
て１回の加速で行う方法もある。加速は、徐々に
累進的に壁から脱着される小体が容器頂部に集め
られるように行う。この小体は、プラスチツクに
固定される免疫グロブリン、抗体グロビリン分子
および小体に固定される免疫グロブリンよりなる
分子鎖を形成し得ず底部壁に付着しなかつたもの
である。この場合、１回の遠心分離工程の間には
加速は陰性および陽性反応上体の両者に関係する
特異的結合力を破壊するための平均に相当する値
よりわずかに大きく保持した。非特異的結合力は
陰性反応小体を保持するのみの力である。加速ま
たは遠心分離速度は低いから、全小体はカツプ底
部に分子橋形成に十分な時間押しつけられ、分子
橋は陰性反応小体の場合より急速に発育し、完成
される。同じ遠心分離速度を十分長時間保持する
と、分子橋を形成できないためカツプ底部に粘着
できなかつた小体はすべてカツプ底部壁から徐々
に剥離され、一方、陽性反応小体は分子橋を形成
できるので、底部壁に粘着したままである。 ヒト血液サンプル中の赤血球のＤ抗原活性を検
知する場合、そして分析は円錐頂角120゜のカツ
プ中で行われる場合、１回の遠心分離工程は加速
約250ｇで約400秒間行われる。 上述の赤血球抗原または抗体を同定するための
反応に用いられる３種の遠心分離計画図を第１６
ないし第１８図に示す。各図とも縦軸はｇで適用
した遠心力を示し、横軸は遠心分離時間を秒で示
す。免疫付着反応は円錐型底部を有し、頂角120
゜のカツプ中で行われた。 第１の遠心分離図（第１６図）は均斉抗グロブ
リンインキユベーシヨンの場合に相当し、カツプ
は０秒でわずかに加速され（すなわち赤血球の懸
濁液および抗グロブリンを含む反応メジウムをカ
ツプ中に加えたのち）、カツプはその回転軸に平
行な軸の回りに回転され、加速は本例の場合４ｇ
である。この相は０秒から15秒まで続け、速度
は赤血球を落下させるのには不十分で、赤血球は
カツプの底部に急速に吸着されるので、抗グロブ
リンインキユベーシヨン工程である。必要に応じ
て、カツプ中の反応メジウムを同時に撹拌するこ
ともできる。 次に、遠心分離加速を非特異的結合力FNSの
みを破壊するための平均レベル以下の値に急速に
上昇させる。この平均レベルが230ｇと評価され
た場合（本例ではヒト血液サンプル中の赤血球上
のＤ抗原活性を検出するのが目的である）、遠心
分離加速は200ｇに上げられる。15秒ないし30秒
の工程の間に、赤血球はカツプの底部方向に移動
し、30秒にはすべて底部に到達する。 遠心分離加速は60秒後まで200ｇに保持され
る。工程すなわち30秒から60秒までの間赤血球
はカツプ底部に押しつけられ、この間、分子橋を
形成できる場合はプラスチツクと赤血球の間に分
子橋が形成され、実際には60秒後までに全分子橋
が完成する。 次に、遠心分離加速は急速に、すべての非特異
的結合力を破壊するに十分な値に増大させる。こ
れはカツプに陰性赤血球を保持するだけの力であ
る。もちろん、加速は陽性反応をプラスチツクに
対し保持させる非特異的結合力と特異的結合力を
合した力を破壊する値より小さい値でなければな
らない。本例の場合、加速は1600ｇに上昇させ
る。したがつて最終工程（工程）の間、非特異
的結合力がプラスチツクに対して赤血球を保持さ
せる唯一の力である場合、これが破壊される。こ
の工程では、剥離された赤血球が急速に集められ
る。遠心分離は84秒後に最終的に停止させる。 この遠心分離図は、わずかな改変はともかく、
不均斉抗グロブリンインキユベーシヨンが行われ
る方法にも適用できる。この場合、工程（すな
わちカツプ中での撹拌および抗グロブリンインキ
ユベーシヨン）は、抗グロブリンインキユベーシ
ヨンがカツプ外部において、抗グロブリンとあら
かじめ試験血清とインキユベートした赤血球（ま
たは分析すべき血清を試験赤血球と）の間で行わ
れるので省略される。不均斉抗グロブリンインキ
ユベーシヨン完了後、反応メジウムをカツプに移
し、直ちに加速200ｇの第１の遠心分離に付す。 赤血球抗原または抗体の同定のための反応に適
用できる第２の種類の遠心分離を第１７図に示し
た。 第１６図の場合のように、15秒目まできわめて
低加速の遠心分離（本例では４ｇ）が適用され
る。工程の均斉抗グロブリンインキユベーシヨ
ンの間は必要に応じてカツプを撹拌する。 15秒後に遠心分離加速を急速に増大させる。本
例の場合、非特異的結合力のみを破壊する平均レ
ベルに相当する値よりもわずかに大きな値に増大
させる。本例の場合、平均レベルは230ｇと推定
され、加速は250ｇに上昇させる。15秒と30秒の
間に、赤血球は下降し（工程）、30秒後にはす
べてがカツプ底部に接触する。遠心分離加速は
250ｇ、すなわち非特異的結合力を破壊するに必
要な平均レベルよりわずかに大きく維持される。
相に続いて直ちに行われる相では非特異的結
合力は徐々に、おだやかに破壊される。非特異的
結合力が赤血球をプラスチツクに保持する唯一の
力であり、赤血球が最も小さい非特異的結合力を
有する陰性反応フラクシヨンに属する場合であ
る。したがつて、この工程は剥離された細胞が
徐々に累進的に集められる工程を伴う。本例では
捕集速度はきわめて低く、赤血球が降下したのち
もカツプ底部に対して十分な時間押しつけられた
ままでいて、分子橋を形成することが可能な場合
はその形成が行われる。細胞が剥離されるよりも
分子橋の形成が急速に行われる。遠心分離加速は
依然として250ｇに保持されているので、分子橋
を形成可能な場合はある時間後にそれが完成さ
れ、一方、カツプ底部に特異的に結合していない
赤血球は徐々に剥離を続ける。相は比較的長時
間続けられ、たとえば410秒後に停止させる。 本例に適用された剥離方法はきわめておだやか
であり、結果は著しく高感度である。これは赤血
球とプラスチツクの間の弱い結合を含む反応に対
してとくに適している。 第１８図は生育反応に呼応して遠心分離をコン
トロールした場合に相当する。この方法は、(a)分
析すべきサンプルの反応を行うカツプ、および(b)
陰性対照反応を行うカツプ中で同時に行われ、遠
心分離の各回転ごとにストロボ閃光で照射され
る。 コントロールの方法はHBs抗原の検出に関連し
て前述した方法とほぼ同じである。陰性対照反応
におけるカツプ底部の拡大像を、たとえば１秒に
１回、テレビカメラにとり分析する。すなわち、
陰性対照反応中に形成した微小沈着像の表面およ
び不透明性を、あらかじめ行われた典型的陰性反
応における微小沈着の表面および不透明性と比較
する。 第１８図は赤血球または細胞抗原または抗体の
同定のための反応で、非特異的結合力のみを破壊
する平均レベルが遠心分離加速450ｇに相当する
場合に適用した遠心分離計画図である。この遠心
分離図は、特性をあらかじめ知り得ない血清系
（とくに非特異的結合力の破壊のための平均レベ
ル）に適用することができる。 前述のように、この方法は均斉抗グロブリンイ
ンキユベーシヨンを包含する。その場合、遠心分
離加速は15秒まで４ｇに保持し、すなわち小体ま
たは細胞をカツプ底部に対して落下させまたは急
速に押しつけるには低すぎる値に保つ。これは抗
グロブリンインキユベーシヨン工程で、この
間、カツプは必要に応じ撹拌する。 15秒後、遠心分離加速を急速に200ｇに上昇さ
せる。15秒と30秒の間に、細胞または小体はカツ
プの急速に落下する（工程）。次に60秒まで工
程が行われる。この間に、細胞または小体の被
覆がカツプの底部に形成され、形成可能な分子橋
はすべて、カツプ底部と細胞または小体間に形成
される。 被覆工程の末期すなわち60秒後には、加速を
100ｇだけ上げ、300ｇで30秒間遠心分離する（工
程）。90秒後、陰性対照反応の微小沈着の表面
および不透明性を測定し、典型的対照陰性反応と
比較する。対照微小沈着の測定された表面および
不透明性が典型的対照陰性反応の場合より小であ
れば、300ｇの加速は非特異的結合力を破壊する
には小さすぎたということになる。 したがつて、遠心分離加速をさらに100ｇだけ
上げ、400ｇで30秒間遠心分離する（工程）。
120秒後に対照微小沈着の表面および不透明性を
測定し、典型的対照陰性反応の場合と比較する。
この場合、非特異的結合力を破壊する平均レベル
は450ｇであつて、400ｇで遠心分離したのちに得
られた陰性対照の微小沈着の表面および不透明性
を測定した結果は依然として典型的対照微小沈着
より低い。陰性対照反応でも、赤血球は非特異的
結合力によつてカツプに結合し、剥離されない。 したがつて、遠心分離加速をさらに100ｇ増加
させて500ｇとした（工程）。30秒後、すなわち
開始から150秒目に、陰性対照反応の微小沈着の
表面および不透明性を再び測定し、典型的対照の
微小沈着の場合と比較する。本例の場合、非特異
的結合力を破壊するための平均レベルを越え、陰
性対照反応で得られた微小沈着は少なくとも典型
的微小沈着の場合に匹敵する表面および不透明性
を有する。すなわち、120秒後から非特異的結合
力が破壊され、赤血球が剥離されると同時に集め
られる工程が始まる。遠心分離加速は500ｇに保
持し、遠心分離は陰性対照反応からの微小沈着の
表面および不透明性が、真の反応を表す剥離赤血
球量に相当するようになつた時点で最終的に遠心
分離を停止する。この場合、遠心分離は330秒後
に停止される。 陽性および陰性反応の間の識別閾値はHBs抗原
の検出方法に関連して前述したと同様にして決定
される。 すなわち、微小沈着に集められ、真の陰性反応
を示す赤血球の百分率が、前述の実験によつて決
定されたように12％であり、標準偏差が３％であ
る場合、真の陰性反応の識別閾値は、前述したよ
うに、微小沈着に集められた18％の赤血球に相当
し、一方、陽性反応の識別閾値は微小沈着に集め
られた６％の赤血球に相当する。 本発明の方法は、検知すべき特定の赤血球抗原
もしくは細胞抗原または特定の抗体の割合を定量
的に測定するのに利用することもできる。得られ
た微小沈着の表面および／または不透明性は、分
析されるメジウム中に存在する抗原または抗体量
に依存するからである。したがつて、陽性反応に
おいて生成した微小沈着の表面および／または不
透明性を測定すれば、単に標準生成物の範囲で得
られた相当する値またはあらかじめ作成した検量
線と比較することにより、メジウム中に存在する
抗原または抗体量を決定できる。 本発明の方法による第２例は、第１例の場合と
同様、同一の遠心分離条件で、各種性質および特
異性を有する赤血球抗原もしくは細胞抗原または
抗体の同定に適用することができる。 理由は前述したように、剥離の可能性はカツプ
底部の傾斜にのみ依存するからである。したがつ
て、問題の各反応ごとに反応に最も適当な傾斜を
有するカツプを選べばよいからである。傾斜は選
ばれた遠心分離速度において陰性反応細胞または
粒子のみが剥離されるように選択される。
ウム中の抗原性を有するウイルス（すなわちウイ
ルス抗原）または赤血球もしくは細胞抗原もしく
は抗体を検知または同定するための分析方法に関
する。 医学的分析において、細胞または粒子によつて
運搬される抗原の性質、および血清学的メジウム
中に抗体またはウイルス抗原の性質の正確な定量
は重要な問題のひとつである。これは特に、供血
者の血液が将来の受血者の血液と適合性を有する
かどうかを確認することが重要な輸血に際して用
いられる。 両血液系の間の非適合性は、一方の血液系の血
漿が、他方の血液系中の赤色小体または赤血球の
膜にある補体構造単位もしくは「抗原単位」もし
くは「抗原」上に固定される、「抗体」と呼ばれ
る分子を含むことになる。この種の抗原は「赤血
球抗原」と呼ばれる。ある抗原粒子にのみ固定さ
れ得る抗体は、その抗原に「特異的な」抗体と呼
ばれる。赤血球により運搬される抗原単位に固定
された場合、抗体は赤血球を凝集させ、破壊しま
たは決定的な障害を与え、その結果、輸血中に不
慮の疾病を生ずることがある。 供血者の血液が、ウイルス抗原（すなわち抗原
性を有するウイルス）またはある疾患と特異的に
対応する抗体を検知することによつて同定される
疾患を受血者に伝搬しないことを確認するのも重
要である。この種の疾患のひとつに輸血後肝炎が
ある。この疾患は供血者の血液がHBs抗原を運搬
するHBウイルスと呼ばれるウイルスを持つ場合
に受血者に起こる。 受血者に非適合性反応または疾患を起こし得る
抗体、細胞抗原または抗原性を有するウイルス
（すなわちウイルス抗原）を検知するため、供血
者および受血者の血液を検査することがきわめて
重要であることは、上述の点からも明らかであ
る。 したがつて、輸血に際しては、検知法の感度が
十分に高いことが重要である。さらに、赤血球も
しくは細胞抗原、抗体またはウイルス（ウイルス
抗原）の特異性の定量に誤りを生じる危険があつ
てはならない。 説明を明確にするため、以下、本明細書におけ
る用語の一部について定義する。 「抗原性を有するウイルス」とは公知の特異的
抗体と反応するウイルスを意味する。以下、これ
は「抗原性を有するウイルス」というほか、もつ
と簡単に、「ウイルス」または「ウイルス抗原」
とも呼ぶ。 「免疫グロブリン」はある動物種から得られる
蛋白分子であり、単純な抗原活性または単純な抗
体活性、あるいは同時に両活性を有し、すなわち
抗原および抗体である。どの動物種の場合も、ヒ
トでも他の動物でも（たとえばヤギ、モルモツト
またはウサギ）、免疫グロブリンにはいくつかの
免疫化学的種類がある。すなわち、Ａと呼ばれる
種類に属する免疫グロブリン（IgAを略す）、Ｇ
と呼ばれる種類に属する免疫グロブリン（IgGと
略す）等である。一般に、免疫化学的種類Ｘ、動
物種からの免疫グロブリンはIgXと示す。 本明細書において用いられる「試験血清」の語
は、ある種の動物種からのある免疫化学的種類に
属する免疫グロブリンたとえばヒトＧ型免疫グロ
ブリン（IgG）であつて、同一種のある動物群す
なわちこの場合ヒトにおいて特定赤血球または細
胞抗原に対して特異的抗体活性を有する免疫グロ
ブリンを含有する血清（または溶液）を意味す
る。この場合、あえてある動物群といつたが、血
清学の分野ではよく知られているように、ある１
種の赤血球または細胞抗原が与えられた動物種の
すべてに存在するとは限らず、通常、ある群を形
成する一部の動物にのみ存在するからである。 同様に、「試験小体」、「試験細胞」または「試
験粒子」の語は、ある動物種からの抗原単位を有
し、その抗原単位はそれに特異的に対応する抗原
単位を運搬する免疫グロブリンに固定される小
体、細胞または粒子を指す。 「抗グロブリン」とは、動物種と異なり、
IgXに対する特異的抗体活性を持つ免疫グロブ
リンを供給する動物種の免疫血清を意味する。
抗グロブリンはIg抗IgX、また混同しない場
合には単に抗IgXと呼ぶことにする。 血漿もしくは血清（または赤血球）中の抗体
（または赤血球抗原）の存在の決定にクームス反
応を用いることは公知である。この公知方法は以
下のとおりで、ヒト血液サンプルの血漿が特定の
抗体たとえば特異的抗Ｄ抗体を含むかどうか、言
い換えれば「Ｄ」抗原に特異的な免疫グロブリン
（その一部は免疫化学的種類Ｇに属し、「IgG」と
呼ぶことにする）を含むかどうかを決定するとき
に用いられる。分析すべき血漿を、Ｄ抗原単位を
有する赤血球すなわち検討しようとしている抗体
に特異的な抗原活性を有する赤血球とともに試験
管中でインキユベートする。血漿中に存在する特
異的抗体の免疫グロブリンは接触期間内に、小体
上の相当する抗原単位に固定される。得られた反
応メジウムを洗浄し、ついで抗グロブリンたとえ
ば抗IgGヒト免疫グロブリンを与えるヤギ血清と
インキユベートする。インキユベーシヨン中に抗
グロブリンによつて供給されたヤギ免疫グロブリ
ンはその特異的抗ヒト単位により、赤血球に特異
的な抗原単位に固定されているヒト免疫グロブリ
ンに固定される。インキユベーシヨン後、反応メ
ジウムを遠心分離する。検討しようとしている特
異的抗Ｄ抗体が実際、血漿中に存在した場合に
は、これから、抗グロブリンにより与えられた免
疫グロブリンによつて、赤血球の凝集を生じる。
これは次の結合鎖、すなわち、赤血球（Ｄ抗
原）／特異的抗Ｄヒト免疫グロブリン／ヒト抗免
疫グロブリン／特異的抗Ｄヒト免疫グロブリン／
（Ｄ抗原）赤血球の産生によるものである。凝集
は、凝集赤血球の試験管底部への沈着の形で生じ
るが、この沈着は非凝集性赤血球の沈着と容易に
識別できるとは限らない。陰性反応では、すなわ
ち特異的抗Ｄ抗体を含まない血漿の場合には、非
凝集性赤血球は均一な懸濁液に復するのに対し、
陽性反応では赤血球は比較的長い集団となつて互
に粘着したままである。 この方法は長時間の複雑な反応を包含し、また
感度が悪い場合もあつて危険である。 細胞によつて運搬される抗原の性質を正確に決
定する必要は臓器移植の場合にも生じる。リンパ
球がHLA系抗原と呼ばれるいくつかの数の抗原
を運搬することは公知である。外科的移植に先立
つて、供給者と受給者のリンパ球の間に少なくと
も理論的な組織適合性があることを確認するため
に、両者のリンパ球によつてどのようなHLA抗
原が運搬されているかを知ることが必須である。
両リンパ球に適合性がなければ、移植は不可能で
ある。リンパ球が持つている可能性のあるHLA
系抗原は種類が多いので、存在するHLA抗原の
特異的性質を決定するためには、多数の基本反応
（たとえば100種）が実施されなければならない。
この操作は、リンパ球細胞が少量しか使用でき
ず、微量反応しか利用できないので、一層困難で
ある。 現在、一部のウイルスまたはウイルス抗原（た
とえばHBs抗原）は放射免疫法で検出されている
が、この方法はきわめて高価で、公害問題を生じ
るので、関係官庁の許可を要する。 本発明の目的は、ウイルス抗原、赤血球もしく
は細胞抗原もしくは抗体の検出のため、生物学的
メジウムたとえばヒト血液サンプルを分析する方
法において、生物学的液体メジウム中のあらゆる
種類のウイルス抗原および血液サンプル中のあら
ゆる種類の赤血球または細胞抗原または抗体を検
出するのに適した、一般に使用できる方法を提供
するにある。 本発明の他の目的は、上記種類の高感度分析法
において、公知方法に比しはるかに優れ、対象の
ウイルス抗原、赤血球もしくは細胞抗原もしくは
抗体に対し感度がきわめて高い分析法を提供する
にある。通常、分析法は、検出できるウイルス抗
原および赤血球または細胞抗原または抗体量が小
であるほど感度が高いといわれ、各種の全特異的
抗原または抗体を誤りなく、すなわち混同するこ
となく検知することができるほど特異性が高いと
いわれる。いい換えれば、特定の特異性を有する
ウイルス抗原を他の特異性を有するウイルス抗原
と混同してはならず、同様のことが赤血球または
細胞抗原または抗体の検出の場合にもいえる。 本発明の他の目的は公害を生じない分析方法を
提供するにある。 本発明の他の目的は結果を得るまでに要する時
間を短縮できる分析方法を提供するにある。 本発明の他の目的は、反応試薬を著しく節約で
きる分析方法を提供するにある。 本発明は、細胞または粒子と血清間の免疫学的
反応およびこの処理後の細胞または粒子と抗グロ
ブリン間の免疫学的反応を用いる生物学的メジウ
ム中のウイルス抗原または赤血球もしくは細胞抗
原もしくは抗体の検出または同定のための分析方
法において、細胞または粒子を含む反応メジウム
と抗グロブリンを、対称軸上の壁に収斂点または
頂点を有し、抗グロブリンと免疫反応を行い得る
分子をその壁に固定させた容器にとり、ついでこ
の反応メジウムを、上述の軸に実質的に平行な遠
心力により、少なくとも陽性反応すなわち同定す
べき抗原または抗体を含む生物学的メジウムのサ
ンプルに対して行われる分析反応を示す細胞は１
次の結合力すなわち抗グロブリンを含む免疫学的
結合力に２次の力が加わつて容器壁に累進的に粘
着されまたは粘着を維持され、一方遠心分離の終
わりに陰性反応を示す細胞は２次の結合力による
以外は壁に粘着されないような条件下に遠心分離
し、ついで２次の結合力（陰性細胞を容器壁に結
合させる力）を破壊するに十分であるが１次およ
び２次の結合力の和（陽性細胞を容器壁に結合さ
せる力）は破壊し得ないような遠心力の適用によ
り陰性細胞は容器の頂点に集めることを特徴とす
る方法である。 以下に定義する本発明の方法は、特殊な反応す
なわち「免疫付着」を包含する。この反応は、反
応指示現象が、(a)細胞、赤血球または粒子と、(b)
抗原または抗体活性を有する分子のマツトでカバ
ーされた容器底部との間の付着であることからそ
のように呼ばれる。付着は小体、細胞または粒子
と容器の間の抗原／抗体結合によつて生じる免疫
的なものである。 本発明の方法は、公知方法に比べて、著しい感
度の上昇をもたらす（フアクター100から1000ま
で）ことが明らかにされている。また分析結果を
得るための時間を著しく短縮させ、従来は１時間
を要していた、たとえば血中の赤血球抗原または
抗体の検出のような緊急の診断を６分で行うこと
が可能になる。本発明の方法では必要な試薬量を
著しく節約することもでき、これはとくに、リン
パ球細胞や稀少な特殊試験血清のような高価な試
薬を用いる場合に重要である。 さらに、本発明の方法は放射活性を利用するも
のではなく、放射免疫法に比べてはるかに安価で
あるばかりか、公害を生ずることもない。 本発明をより明瞭にするため、以下に実例を挙
げ添付の図面を参照しながら本発明をさらに詳細
に説明する。 第１図ないし第９ａ図は、血液サンプル中の
HBs抗原の検出の場合を例に、本発明方法の各工
程を図式的に示したものである。 第１０図は遠心分離中に細胞にかけられる力を
示す図である。 第１１図ないし第１４ｂ図は、ヒト血液サンプ
ルの赤血球中のＤ抗原を検出する場合を例に、本
発明方法の各工程を図式的に示したものである。 第１５図ないし第１８図は遠心分離図である。 本発明方法の適用例１ 本発明方法の第１の態様を以下に第１図ないし
第９ａ図を参照しながら説明する。この例は、ヒ
ト血液サンプルの血清（または血漿）がHBsウイ
ルス抗原、略してHBs抗原を含むかどうかを明ら
かにするために本方法を用いた例である。 (a) 本方法の最初の工程は、容器の底面を細胞ま
たは粒子の付着または非付着性を起こすように
調製する工程である。 容器の底部はその対称軸上に収斂低点を有し
この場合、たとえばPVC（ポリ塩化ビニル）
製のプラスチツクカツプ１でＶ型断面を有する
底部２を持つ。底部２は免疫グロブリン３すな
わちIgXのマツトで覆われていて、この場合
それは免疫化学種類Ｇに属するヤギ免疫グロブ
リンすなわちIgGである（第１図）。ヤギIgG免
疫グロブリン３は図中では白色長方形として示
してある。 IgGは各種の化学的方法でプラスチツクカツ
プ上に固定させることができる。たとえば、プ
ラスチツクとIgG分子の間にカルボジイミド結
合を作らせる、また、IgGをプラスチツクに単
に吸着させるなどの方法がある。 添加するIgGの濃度にはとくに限定はないが
反応の感度は表面に固定された免疫グロブリン
の濃度に依存するので、最高の感度が達成され
るように、カツプの底部を免疫グロブリンで飽
和させるに十分な量を含有する溶液を用いる。
ヤギIgG免疫グロブリンがカツプの底部に固定
されたのち、IgGで被覆されたカツプを生理的
溶液たとえば９％食塩溶液で洗浄し、カツプ上
に固定されないで残つているIgGを除去する。
カツプは生理的溶液を数回通して洗浄する。 少量の生理的溶液をカツプの底部に残し、プ
ラスチツクカツプ上に固定されたIgGが乾燥す
るのを防止する。この方法で、IgGのマツトは
数時間活性を維持する。 (b) 次に細胞または粒子（反応性細胞または粒子
とも呼ぶ）を、反応が陽性であるか陰性である
かによりすなわち分析すべき血清がHBs抗原を
含むか含まないかにより付着または非付着を示
すように調整する。本例では、細胞はヒツジ赤
血球で図には４として示した。 免疫グロブリンは赤血球４に固定され、カツ
プに固定されたIgX免疫グロブリンと同一動
物種からの同一免疫化学種類のものでなければ
ならない。その一部は、HBs抗原に対して抗体
活性も持たねばならない。赤血球は塩化第二ク
ロムで処理され、蛋白分子に固定できるように
なつているので、同時に免疫グロブリンが固定
され有利である。すなわち、本例では抗HBsヤ
ギIgG免疫グロブリンが赤血球に固定され、こ
れは陰影を施した長方形５として図に示した。
この工程（IgGの赤血球への固定）は第２図に
模式的に示した。 抗HBsヤギIgG免疫グロブリンは精製HBs抗
原を注射したヤギ血清から得られる。 かくして調製された赤血球は「試薬赤血球」
である。もちろん、赤血球の代わりに他種の細
胞または粒子を使用でき、それに免疫グロブリ
ンを固定させることができる。 (c) このようにして調製し、生理的溶液に懸濁さ
せたのち、ヒツジ赤血球４を分析すべき血液サ
ンプルの血清または血漿とインキユベートし
て、HBs抗原を含むかどうかを明らかにする。
実際には、使用する血漿はたとえば２％または
１％に希釈される。 調製したカツプの外部で行われるインキユベ
ーシヨン反応は前工程で調整したヒツジ赤血球
の懸濁液と血液サンプルの血清を接触させるも
ので、インキユベーシヨンは常温で数分ないし
数十分行われる。インキユベーシヨン工程は第
３図に模式的に示した。HBs抗原は細かい陰影
を施した卵型分子６である。 分析すべき血清にHBs抗原が存在する場合は
抗原分子６は、すでに赤血球４に固定されてい
る抗HBsIgG５に固定される。第３図に模式的
に示したように、赤血球に固定された抗
HBsIgG分子の周囲に沈着し、抗HBsIgG分子
との間の空間に立体的滞留を生じる。 分析すべき血清がHBs抗原を含まない場合は
反応は起こらず、赤血球はHBsヤギIgG免疫グ
ロブリンを固定させた前工程の末期におけると
同一の状態を維持し、抗HBsIgG分子の周囲に
立体的滞留は生じない。 かくして生成した赤血球は、インキユベーシ
ヨン容器中数回生理的溶液で洗浄するのが有利
である（溶液を加え、懸濁させ、遠心分離し、
沈降させ、上澄液を除去するなど）。 (d) 次に、底部２にヤギIgG３のマツトを保持す
るカツプ１に、インキユベートし、洗浄したヒ
ツジ赤血球を加え、同時に抗グロブリンすなわ
ちカツプおよび赤血球に固定された免疫グロブ
リンに対して特異的抗体活性を有する免疫グロ
ブリン、抗IgX Ig免疫グロブリンを含有
する免疫血清を加える。本例では、ヤギ抗IgG
ウサギ免疫グロブリンＧ（IgG）を含有する抗
ヤギ―ウサギ抗グロブリンを加える。この免疫
グロブリンは第４ａ図および第４ｂ図に小さい
黒い長方形７として模式的に示した。第４ａ図
は陽性反応を、一方第４ｂ図は陰性反応を示し
ている。 また、赤血球の懸濁液をまずカツプに加え、
ついで抗グロブリンを加えることもできる。 抗グロブリン免疫グロブリンはヤギIgGに対
して少なくとも２価の抗体単位を有する。すな
わちヤギ抗IgGウサギIgGは１個の抗体単位で
カツプの底部に固定されたヤギIgG分子と反応
し、一方他の単位で赤血球に固定された抗HBs
ヤギIgG分子と反応できる。ヤギIgG免疫グロ
ブリンに対し特異的抗体活性を有する免疫グロ
ブリンは、ヤギIgG好ましくは精製IgGを注射
された異種動物（本例ではウサギ）の血清から
供給される。 以下に説明するように、本方法では比較的高
濃度の抗グロブリンが用いられる。たとえば、
クームス法で少なくとも強度128を示すヤギ抗
IgG免疫グロブリンがそのまま、またはわずか
に希釈して（希釈比1/2または1/4）使用され
る。 インキユベーシヨン（「抗グロブリン」イン
キユベーシヨン）は後に説明する理由で短時間
でなければならないので、インキユベーシヨン
中、カツプはたえず撹拌し、懸濁液中、抗グロ
ブリンと赤血球の均一な混合物とすることが好
ましい。 (e) 抗グロブリンインキユベーシヨンにつづいて
遠心分離を行う。あらかじめ処理したヒツジ赤
血球とインキユベートした血清サンプルがHBs
を含むか含まないかによる付着または非付着を
明らかにするためには、遠心分離は正確な条件
下に実施しなければならない。カツプの回転軸
１ｂに垂直な軸１ａの回りにカツプを回転させ
ることによつて行う遠心分離は、第１工程また
は「被覆」工程を含み、この工程は抗グロブリ
ンインキユベーシヨン開始後、すなわち赤血球
懸濁液と抗グロブリンをカツプ中に加えたのち
速やかに開始し、カツプに固定されたIgG３ま
たは赤血球に固定されたIgG５のごく一部のみ
が抗グロブリンのヤギ抗IgGIgG７と反応した
時点で開始しなければならない。第１の遠心分
離工程は、ヤギIgGの10％が抗グロブリンのヤ
ギ抗IgG免疫グロブリンと反応するまでには少
なくとも開始することが好ましい。実際上、遠
心分離は抗グロブリンインキユベーシヨン開始
後数秒ないし数十秒の間に開始する。 第１の遠心工程の間、懸濁ヒツジ赤血球と抗
グロブリンを含む反応メジウムはカツプの底表
面２に対して押えつけられ、処理しインキユベ
ートしたヒツジ赤血球によつて運搬される抗
HBsヤギIgG５はプラスチツク上に固定された
ヤギIgG３と対面して位置し、赤血球は、IgG
５およびIgG３に固定される抗グロブリンの免
疫グロブリン７によつてカツプの底部に急速
に、まず粘着させられる。急速な初期付着は、
反応が陽性であつても陰性であつても、すなわ
ち赤血球が抗HBsヤギIgG５によつてHBs抗原
分子に固定されても固定されてなくても起こ
る。これは第１の中等度の遠心速度B1を用い
ることによつて達成される。この速度に後に述
べる方法により決定される。 第５ａ図および第5b図は被覆工程の間の赤
血球とカツプ底部２の対面表面を拡大した図で
ある。第５ａ図は陽性反応の場合であり、第５
ｂ図は陰性反応の場合である。 いずれの場合ともに、抗グロブリン免疫グロ
ブリンはそのヤギIgGに対する抗体特異性によ
り、赤血球に固定されたIgG５とカツプ底部に
固定されたヤギIgG３の間にくる。赤血球の底
部表面２へのゆるやかな付着を生ずるこの被覆
工程の間に、プラスチツクと赤血球の間に回廊
ないしは凹所が生ずる。この回廊は形成される
IgG５／Ig７／IgG３の鎖によつて決定される
ものである。この回廊は他のIg７分子が接近す
るのを制限する斗の役目をする。 上述のように、回廊は、陽性反応すなわちヒ
ツジ赤血球４がIgG５を介してHBs抗原分子６
を固定し得た場合にも、赤血球４がウイルス抗
原分子を固定し得なかつた場合にも生じる。し
かしながら、陽性反応の場合には（第６ａ図参
照）、回廊はウイルス抗原分子によつてさえぎ
られているのに対し、陰性反応では（第６ｂ図
参照）回廊はさえぎられていない。 実際には、第１の遠心分離工程は約200ｇ
（ｇは重力加速度）の加速で、約40ないし60秒
行われる。反応は頂角120゜のカツプ中で行わ
れる。 (f) 次に、遠心分離を数分間停止させる。この停
止期に遊離Ig７分子は、被覆操作の間に生成し
た回廊中を流れ、残つた遊離赤血球IgG５また
は基質IgG３に固定される。この相（すなわち
遠心分離の停止期）は事実上、抗グロブリンイ
ンキユベーシヨンの延長である。 第１の遠心工程においてもたらされた適度の
被覆の間に、容器に固定されたIgG、抗IgG分
子および赤血球に固定されたIgGで作られた結
合鎖が容器と赤血球の間に形成されることが明
らかにされた。本発明に関する実験中、上述の
配置は過剰の抗IgG分子の存在において、容器
に固定されたIgG、抗Ig分子、…抗IgG分子お
よび赤血球に固定されたIgGよりなる配置に比
し、エネルギー的により不安定であることを発
見した。したがつて、抗グロブリンインキユベ
ーシヨンを続けると、容器からの赤血球の脱着
を生ずるIgG／抗IgG／IgG配置よりも、最終的
に多数のIgG／抗IgG…抗IgG／IgG配置を生ず
る。本発明はこの発見を利用している。 反応メジウムが静止しているき、抗グロブリ
ンインキユベーシヨンが続き、ヤギ抗IgG７は
ヤギIgG３または５と反応して、最も安定な配
置を形成する。 しかしながら、前述したように、赤血球とプ
ラスチツクの間に生じた回廊は陰性反応の場合
よりも陽性反応の場合に著しくさえぎられ、陰
性反応において形成した回廊（第6b図参照）
の方が陽性反応（第6a図参照）の場合よりも遊
離分子Ig７の流れが大きい。したがつて、回廊
中の赤血球およびプラスチツクの対面表面は、
陽性反応の場合よりも陰性反応の場合の方がよ
り急速にIg７（赤血球IgG５またはプラスチツ
クIgG３に固定された）によつて飽和される。
しばらくすると、陰性反応の場合（第７ｂ
図）、赤血球およびプラスチツクの対面表面は
多数の以下のような配置を示すようになる。 プラスチツク＋ヤギIgG３／ヤギ抗IgGウサ
ギIg７…ヤギ抗IgGウサギIg７／ヤギIgG５＋
赤血球 類似の性質を持つ２個の分子が互に対面する
ので、この配置はプラスチツク＋ヤギIgG３／
ヤギ抗IgGウサギIg７／ヤギIgG５＋赤血球よ
りなる完全分子橋の形成を生じることのみが可
能である。 抗グロブリンインキユベーシヨンの延長時に
生成される配置は大部分この種のもので、急速
な初期付着を生ずる被覆上工程時にプラスチツ
クと赤血球の間に生成する分子橋はも早、付着
を維持するに十分なだけ存在せず、脱着を生じ
る。 一方、陽性反応の場合（第７ａ図）、対面す
る赤血球とプラスチツクのIg７による飽和はは
るかに遅く、したがつて、陰性反応で脱着が起
こるときまでには、抗IgG分子のIgGへの固定
は赤血球を脱着するのに十分なレベルまで達し
ていない。 すなわち、遠心分離停止相の長さまたは抗グ
ロブリンインキユベーシヨンの延長を調整する
ことにより、陰性反応の場合には対面した赤血
球とプラスチツク表面のIg７分子による飽和は
脱着を起こすのに十分であるが、陽性反応の場
合にはそうでないようにすることができる。 (g) これにつづいて、速度V1より大きい速度V2
で行われる最後の遠心分離工程がある。この遠
心分離工程は陽性反応と陰性反応の間の差を利
用する。速度V2は、その場合の遠心力がIg７
でほぼ飽和されている赤血球すなわち陰性反応
を示す赤血球をカツプ頂部１０に落としてそこ
に集める（第８ｂ図参照）が、陽性反応を示し
た赤血球は分子橋すなわちプラスチツク＋ヤギ
IgG３／ヤギ抗IgウサギIg／ヤギIgG５＋赤血
球が維持されるため、カツプ壁に固定されたま
まである（第８ａ図参照）。抗グロブリンのIg
７における飽和量が脱着を起こすに十分になら
ない前に抗グロブリンインキユベーシヨン工程
が停止され、上述の分子橋が保護されるからで
ある。 実際には、頂角120゜の円錐型カツプを用い
る場合、第２の遠心分離は加速約500ｇで約40
秒行われる。 すなわち、陽性反応の場合、すなわち、イン
キユベートした血清サンプルが実際にHBs抗原
を含むときは、赤血球はIgG３、Ig７および
IgG５を介してカツプの底部に固定されたまま
である。この場合、カツプをその１Ｂ軸に沿つ
て観察すれば、均一な単層の赤血球がカツプ底
部全体に分布し、付着を生じていることがわか
る。 一方、血清の分析サンプルがHBs抗原を含ま
ない場合、前述のように赤血球はカツプの頂部
に引かれ、そこで集められる。したがつてカッ
プをその軸に沿つて観察すると、赤血球の微小
沈着が観察され（第９ｂ図）、付着は生じてい
ない。 試薬の使用量にはとくに制限はない。たとえ
ば径１ないし７mmのカツプに加える液体の容量
は15ないし250μである。赤血球の懸濁液と
抗グロブリンは等容加えるのが有利である。 本発明方法の記述に示したように、一部の工程
は正確に実施しなければならない。 用いる抗グロブリンの濃度は、後述する本発明
方法の第２サンプル適用を参考に、工程ｂ）で得
られる試薬赤血球のIgG表面濃度によつて決ま
る。 濃度は(a)第１遠心分離工程時の容器への赤血球
の急速な初期付着、ならびに(b)工程ｂ）に関連し
て前述したように必要な場合は陰性反応における
赤血球の脱着を生じる過剰の抗IgG分子を与える
だけ十分高くなければならない。しかも、抗グロ
ブリンの濃度は被覆工程時に赤血球と容器との間
の分子橋の過剰生成を妨げるよう中等度のもので
なければならない。陰性反応でも、この種の橋が
小回廊を形成し、遠心分離停止期に抗IgG分子の
流れを妨害するからである。 免疫付着反応期には、抗グロブリン濃度に依存
するゾーン現象、すなわち免疫付着反応の感度が
ある抗グロブリン濃度に応じて最大値の周辺を著
しく変動する現象が、遠心分離前の抗グロブリン
とIgGの接触時間に依存するゾーン現象とともに
認められている。以下に説明するように、接触時
間によるゾーン現象は、抗グロブリン濃度による
ゾーン現象よりも、反応の感度に重要な影響を与
える。 抗グロブリンインキユベーシヨン時、抗グロブ
リンによつて供給される抗IgG分子は、(a)赤血球
に固定されたIgGおよび(b)プラスチツクカツプに
定されたIgGに固定され、固定された抗IgG分子
の数はインキユベーシヨン時間による。前述のよ
うに、抗グロブリンインキユベーシヨン相は第１
の遠心分離工程または被覆工程について行われ
る。インキユベーシヨン時間が長くなると、それ
に応じて、すでに赤血球に固定されている抗IgG
分子は静置工程の間に、類似分子すなわちプラス
チツクに固定されている抗IgG分子に対面しやす
くなる。この配置（赤血球＋IgG／抗IgG…抗
IgG／IgG＋プラスチツク）はカツプの底部の赤
血球被覆時にもたらされ、赤血球のプラスチツク
付着に対し明らかに逆効果を与える。抗グロブリ
ンインキユベーシヨン時間が長くなるほど抗粘着
配置は増大し、その結果、付着の変化すなわち反
応の感度は抗グロブリンインキユベーシヨンの時
間に比例して低下する。 しかしながら、感度は、インキユベーシヨン時
間０のときに最大ではなく、付着が物理的に得ら
れて確認できるものであれば、いくらかの抗IgG
分子がすでに末端結合のひとつに、すなわち赤血
球に固定されたIgGまたはプラスチツクに固定さ
れたIgGに、被覆の時点で固定されていなければ
ならない。実際、このわずかな抗IgG分子が固定
されるには数秒またはその何分の１かで十分であ
る。 このきわめて短いインキユベーシヨン時間は実
験的に決定できる。抗グロブリンインキユベーシ
ヨンの直前、すなわち被覆工程において、反応が
陽性であれ陰性であれ、付着を生じる。したがつ
て、上述の各方法工程を陰性反応について、すな
わち本例ではHBs抗原を含まない血清サンプルを
用いて行うと、適当なインキユベーシヨンの持続
は被覆工程において100％の付着が達成される時
間である。 抗グロブリンインキユベーシヨン時には、免疫
付着は、プラスチツクに固定されたIgGの表面濃
度のわずかな低下および抗IgG分子からまだ自由
なIgGにきわめて感受性が高い。 すでに述べたように、遠心工程は複雑で、多く
の相で行われ、それぞれが反応に特定の機械的効
果を有する。この遠心分離相期に必要な正確な条
件について詳細に説明する前に、遠心分離期に生
じる力について、第１０図を参照しながら説明す
る。 赤血球Ｈまたはその他の任意の、付着または非
付着を明らかにするべく用いられる細胞もしくは
粒子を、カツプの回転軸１ｂに垂直な軸１ａの回
りに回転して遠心分離すると、粒子はカツプ軸１
ｂに平行な遠心力Fcを受ける。他のパラメータ
ーについては以下に述べるとおりである。 １ 円錐型カツプの母線と遠心力の方向に垂直な
面へのその投影の間の角α、これを傾斜角と呼
ぶ。 ２ 赤血球の質量ｍ ３ 速度Vrpmの遠心操作を適用したときのｇの
数ｎ ４ その速度を適用された時間ｔ ５ 赤血球をプラスチツクに対し保持する非特異
性力（FNS）の合計。この合計は、赤血球を
プラスチツクに引きつける静電力、この反応に
包含される主たる特異性を防害する特異性を持
つ免疫化学的結合、および分離を妨げる力（細
胞または粒子はカツプ内の不規則性や傾斜位置
における隣接細胞または粒子のような位置的障
害を受ける）である。 ６ 赤血球をカツプ傾斜に対して保持する力
（FS）の合計。この力はプラスチツクに赤血球
を固定する結合鎖、すなわちIgG（プラスチツ
クに結合）／抗IgG分子／IgG（赤血球に結
合）によつて生じる。 ７ 速度Vrpmで赤血球に加えられる被覆力、す
なわち遠心力の円錐面に垂直な成分により赤血
球をプラスチツクに対し押しつける力、被覆力
（Fp）はｎ×ｍ×cosαに等しい。 ８ 速度Vrpmで赤血球を加えられる剥離力、す
なわち遠心力の円錐面に平行な成分により、粒
子を引き離そうとする力が加えられる。この剥
離力（Fd）はｎ×ｍ×sinαに等しい。 これらを全般的に考慮して、各遠心分離工程で
起こる現象が説明できる。 前例において、第１の遠心分離工程または被覆
工程においては、赤血球の急速な初期付着を得る
ことが試みられ、プラスチツクと赤血球の対面表
面間に回廊が形成された。すでに説明したように
この回廊はさらに抗IgG分子が接近するのを制限
する斗として作用する。 したがつて、第１の遠心分離の速度V1は、陽
性反応であれ陰性反応であれ、すべての反応で全
赤血球が粘着するのに十分な力Ｆp1が選択され
る。速度V1は、赤血球をカツプ底部に保持する
結合力よりも剥離力Ｆd1が大きくならないように
選択される。 赤血球がプラスチツクに粘着した場合、回廊は
次の工程において遠心分離が停止されまたは著し
い低速度で続けられた場合、斗として働くこと
ができなければならない。したがつて、速度V1
は赤血球をカツプ底部に対して過剰に押しつける
ことから被覆操作を防止できるように十分低くな
ければならない。もし被覆操作が強すぎ、赤血球
がプラスチツクに対して押しつけられると、陰性
反応の場合でも回廊がつぶされてしまう。遊離抗
IgG分子はも早、プラスチツクと赤血球の間を流
れ得ず、赤血球とプラスチツクの対面表面が抗
IgG分子により飽和されることは妨げられる。こ
の飽和現象については、本方法の各工程に関連し
て述べたとおりである。 一方、被覆工程の速度V1があまりに低すぎる
と、反応成分すなわち小体に固定されたIgGとプ
ラスチツクに固定されたIgGが十分に接近せず、
付着は不十分で適当な回廊は形成されない。 第２の遠心分離工程は、速度V1より大きな速
度V2で行われる。第２工程は被覆工程の直後に
開始するのではなく、すでに説明したようにある
休止時間をおき、抗グロブリンインキユベーシヨ
ンを延長する。遠心分離力V2は、抗グロブリン
インキユベーシヨン延長工程間に多数の抗IgG分
子を固定した赤血球、すなわち陰性反応の特徴を
示す赤血球がカツプ底部の頂部１０に追いやるの
に十分であるが、陰性反応を示す赤血球、すなわ
ちすでに説明したように抗グロブリンインキユベ
ーシヨン延長工程後、遠心分離休止後にもカツプ
底部壁に粘着している赤血球を移動させてはなら
ない。結局、速度V2は、赤血球に適用される剥
離力Ｆd2が非特異的結合力の合計よりも大で、陰
性反応の赤血球をカツプ底部に維持する力だけよ
りも大である剥離力を生じる。しかしながら、力
Ｆd2は、陽性反応の赤血球をカツプに保持する非
特異性結合力および特異性結合力の和FNS＋FS
より大であつてはならない。 この場合、陰性反応の赤血球のみが離れ、カツ
プの頂部に集められ、一方、陽性反応の赤血球は
粘着したままである。これが、陽性および陰性反
応間に著しく明瞭な識別性を生じるのである。 したがつて、遠心分離に含まれる前述のパラメ
ーターについて最良の結果を与える至適値は、研
究される各系ごとに、すなわち試薬細胞および試
薬粒子の特定の種類、検知されるウイルス抗原、
ならびに反応に含まれるIgXおよび抗IgXI分子
ごとに決定される。剥離力Ｆdと被覆力Ｆpの比、
すなわち剥離の可能性はｎ×ｍ×ｓｉｎα／ｎ×ｍ×ｃ
ｏｓαすなわち tanαに等しい。すなわち、この値は傾斜角αに
のみ依存する。 α＝０゜であればtanαは０で、剥離の可能性
はない。一方、α＝90゜であればtanαは無限大
で剥離の可能性が無限大であり、付着したまま残
る可能性はない。 したがつて、剥離力と被覆力の比を変えて、試
薬細胞または粒子、またその場合のウイルス抗原
ならびにIgGおよび抗IgGI分子に適合させ、第
２の遠心工程において陰性反応を示す試薬細胞ま
たは粒子を特異的に剥離するような中間の値の角
αを用いることができる。 すなわち、至適条件で操作を行うためには、問
題の反応に最も適した傾斜角αを有するカツプを
選択できるように、傾斜角の異なるカツプのセツ
トを用いるのが有利である。 各種性質および特異性を有するウイルス抗原を
検出しなければならない多数の異種サンプルの分
析のための反応は、同一の遠心分離条件で、すな
わち同じ遠心力を適用して行い、各分析用異種サ
ンプルについて選んだカツプが第２の遠心分離工
程で適当な遠心力を選択することにより陰性反応
試薬細胞または粒子を剥離できるような傾斜角α
の底部を有するかどうかを検討すればよい。 したがつて、本発明はＶ状底面を有し、円錐頂
角が異なる、たとえば80゜から140゜まで10゜お
きに異なるカツプのセツトをも提供する。 すなわち、前述の血液サンプル中のHBsウイル
ス抗原の検知例では、円錐状底部を有し、頂角
120゜のカツプを用いるのが有利である。 第１５図は、ヒト血液サンプル中のHBs抗原を
検出する反応における各遠心分離工程を例示する
ものである。免疫付着反応は円錐状底部を有し、
頂角120゜のカツプ中で行われる。縦軸は適用し
た遠心力をｇで示し、横軸は時間を秒で示してい
る。 血清サンプルとインキユベートした赤血球およ
び抗グロブリンよりなる反応メジウムを、底部を
ヤギIgGで被覆したカツプに加え、抗グロブリン
インキユベーシヨンを行わせる。前述のように、
カツプはインキユベーシヨンの間たえず振盪し、
たとえば、回転軸に平行な往復運動を行わせる。
これが第１５図にとして示した振盪および抗グ
ロブリンインキユベーシヨン工程である。本例で
は、この工程は遠心力4gで行われる。この値の
遠心力は赤血球の降下またはカツプ底部の被覆に
は影響を与えない。4gを15秒間維持する。 次に遠心加速を急激に200gまで上昇させ、反
応メジウムをカツプに加えてから60秒後までこの
値に維持する。すなわち、15秒後に赤血球降下の
第相が始まり、赤血球はすべて30秒目までにカ
ツプの底部に触れる。遠心分離を200gで続け、
降下相に続く工程では赤血球の被覆がカツプの
底部に形成される。赤血球は陽性反応を示すもの
も陰陽性反応を示すものもすべてカツプの底部に
粘着し、底表面と赤血球被覆の間に過回廊を生
じる。 60秒後から、まだ反応メジウム中を自由に移動
しているヤギ抗IgG分子の、プラスチツクおよび
赤血球間への拡散相が始まる。前述のように、こ
の工程（第１５図の工程）は抗グロブリンイン
キユベーシヨンの延長である。この工程では加速
8gの遠心力がかけられる。この値は、前工程
で生じた回廊がつぶれない遠心効果である。工程
の間に、赤血球とカツプ底部の対面表面はヤギ
抗IgG分子により徐々に飽和される。飽和の効
果、陰性反応赤血球が脱着するようになる閾値に
は300秒後に達する。 最終工程（すなわち陰性反応赤血球があれば、
これをカツプム頂部に集める工程）は、遠心分離
加速を急速に500ｇに上昇させることにより行わ
れる。この値は、抗グロブリンの飽和の結果、工
程の末期には事実上脱着していた陰性反応赤血
球を移動させるのに十分である。この最終工程
（工程Ｖ）において、前工程で脱着していた赤血
球が急速に集められる。 最終遠心分離工程は、陰性反応の場合、脱着し
た赤血球の百分率が真の陰性反応の割合を示唆す
るようになれば停止できる。本例の場合、最終遠
心分離工程は340秒目に停止させた。 各工程のパラメーター（すなわち遠心分離速度
と持続時間）の値は、前もつて、同一試薬を用い
典型的陰性反応に対する試験で決定できる。最良
の結果を与えた試験から、実際の分析反応に用い
るパラメーターの値を決定する。 別法として、反応中の遠心分離を変化させ、こ
の方法をサンプルの分析反応が行われているカツ
プと陰性対照反応が行われているカツプとで同時
に行い、各遠心回転間にストロボ閃光で照射す
る。 対照反応カツプの底部の拡大像を、たとえば１
秒おきにテレビカメラで撮影し、分析する。生成
した微小沈着像の表面および不透明度を測定し、
微小沈着の生長曲線を対照の陰性反応で得られた
微小沈着の曲線と比較する。ついで、陰性対照反
応における微小沈着の生長曲線が対照の生長曲線
に相当するように遠心分離速度および時間をコン
トロールする。 遠心分離は分析された微小沈着の面が、真の陰
性反応の識別閾値の場合と少なくとも等しい像を
剥離赤血球によつて示すようなつたときである。
この像は以下の方法により決定する。 陰性対照反応に対する前試験の間に、真の陰性
反応について有効な最小サイズ、すなわち識別、
測定、再現が可能な微小沈着中に含まれる赤血球
の百分率を測定した。次に、この陰性反応に対す
る標準偏差σを求めた。陰性反応に対する得られ
た識別閾値は微小沈着中に集められた赤血球の百
分率が上述の陰性反応に対する有効百分率に標準
偏差の２倍を加えた値に等しいときに生じる。同
様に陽性反応の識別閾値は微小沈着中に集められ
た赤血球の百分率が、陰性反応に対する有効百分
率から標準偏差の２倍を差引いた値に等しいとき
に生じる。 たとえば、陰性反応に対する微小沈着中の赤血
球の平均百分率が12％、標示偏差が３％の場合陰
性反応の識別閾値は12％＋２×３％＝18％であ
る。したがつて、分析反応から生じた微小沈着の
表面が、脱着されカツプ頂点に集められた赤血球
の18％またはそれ以上に相当するようになつたと
き、反応は陰性であると考えてよい。陽性反応に
対する識別閾値は12％−２×３％＝６％に等し
い。したがつて、分析の結果生じた微小沈着の表
面が、微小沈着中に赤血球６％またはそれ以下の
場合に相当するならば、反応は陽性であると考え
てよい。微小沈着の表面が赤血球６〜18％に相当
する場合は、反応は疑わしく、再検査が必要であ
る。 以上、ヒト血液サンプル中のHBsウイルス抗原
の存在を検出する場合を例に、本発明の適用第１
例について述べたが、同一方法が、試薬細胞また
は粒子の性質、カツプの底部および前述の細胞ま
たは粒子の固定されるIgXの性質、ならびに抗
IgXI分子の性質を適当に選択することにより、
血液サンプル中の他の任意のウイルス抗原の検出
に使用できることはいうまでもない。 本発明の方法は、血液以外の生物学的メジウム
たとえば睡液または尿にも適用することができ、
また、ウイルス抗原よりもつと一般的に、分子抗
原と呼ばれ、細胞に固定されず、抗原性を有する
遊離分子の抗原にも、包含される各反応が適当に
改変され、すなわち試薬細胞または粒子、細胞ま
たは粒子およびカツプに固定される免疫グロブリ
ン、抗グロブリンおよびその他の各反応パラメー
ターに関し適当な改変が行われれば、適用可能な
ことも当然である。 本発明方法の第２の適用例 次に、ヒト血液サンプルからの赤血球が、Ｄ抗
原活性を有するか否かについて検討する場合の本
発明方法使用例を第１１図ないし第１４ｂ図を参
照しながら説明する。この活性を有する赤血球は
Rh陽性患者に生じ、一方、この活性を持たない
赤血球はRh陰性患者に相当する。 以下は第２例の第１の態様である。 ａ 第１例と同様、第１工程は基質の表面が細胞
の付着または非付着を示すように調整する工程
である（第１１，１２図）。 基質は、たとえばPVC（ポリ塩化ビニル）
製の、Ｖ型底部２２を持つプラスチツクカツプ
２１である。 底部２２は一層の免疫グロブリン２３で被覆
されていて、これは同一動物種からの同一免疫
化学種類に属する、赤血球中の検知すべき抗原
の特異的抗体免疫グロブリンでなければならな
い。たとえば、ヒト赤血球の膜表面に存在する
Ｄ抗原を検出する場合、この抗原の特異的抗体
は抗Ｄ抗体単位を有する、とくにＧ型のヒト免
疫グロブリンである。したがつて、Ｇ型ヒト免
疫グロブリン（ヒトIgG）をカツプの底部に固
定しなければならない。ヒトIgGは白い長方形
２３として示した。 第１例の場合と同じ条件でIgGをプラスチツ
クカツプに固定させる。IgGがカツプ底面に固
定されたのち、９％食塩溶液で洗浄し、固定さ
れていないIgGを完全に除く。 加えるIgGの濃度には限定はない。たとえば
１mg／ml溶液を用い、固定される量よりも過剰
の量を用いるのが好ましい。 少量の生理的溶液を基質の底部に保持させ、
プラスチツク上のIgG層が乾燥するのを防止す
る。 ｂ 本例では、分析される細胞は、ヒト血液サン
プルよりの赤血球で生理的溶液に浸漬されてい
る。これをカツプの外部で、検知すべき抗原に
特異的な試験血清、すなわち公知の（抗Ｄ）抗
体特異性を有し、赤血球によつて運搬されるＤ
抗原基に固定され得るIgG分子を含む血清と数
分ないし数十分、常温で接触させる。実際には
２％または１％希釈血液サンプルから得られる
赤血球の懸濁液を使用する。第１３ａ図の右側
には、分析される赤血球が陽性であり、Ｄ抗原
を有する（赤血球２４の膜上に点で示した）場
合のインキユベーシヨン工程を図解的に示し
た。赤血球の抗原基は試験血清からの抗Ｄ抗体
IgG分子２５を固定する。抗体IgG２５免疫グ
ロブリンは陰影を付した長方形で示してあり、
複合体２６を形成する。 第１３ｂ図は同じ工程で、赤血球２４′が陰
性、すなわちＤ基を持たない場合の同様な図で
ある。この場合、赤血球２４′は抗DIgG２５を
固定しない。 インキユベーシヨンのあとには、インキユベ
ーシヨン容器内での生理的溶液による何回も
（たとえば３回）のすすぎ操作よりなる一連の
洗浄操作を行うのが有利である。各すすぎ操作
は、生理的溶液の添加、懸濁液の形成、遠心分
離、沈降、上澄液の除去よりなる操作のセツト
である。生成物は洗浄され、遊離IgG２５を含
まないメジウム中に浸漬されたインキユベート
赤血球である。 ｃ 次に、インキユベートし、洗浄された赤血球
をカツプ２１中に（その底部はヒトIgG２３で
被覆されている）、抗グロブリンすなわち、ヒ
トIgGに対する抗体基を含む動物免疫グロブリ
ン２７の溶液と同時に加える。抗グロブリン免
疫グロブリンは図中に黒い長方形で示した。 別法として、赤血球の懸濁液をまずカツプに
加え、ついで抗グロブリンを加えてもよい。 本例の場合、用いた抗グロブリンは、ヒト
IgGを注射された、ヤギの免疫血清である。免
疫血清は、ヒトIgGに対してすくなくとも２価
の抗体基を有する免疫グロブリン（ヒト抗IgG
ヤギIgと呼ぶ）を与える。したがつて、ヒト抗
IgGヤギIgはカツプ底部に固定されたヒトIgG
に固定できる１個の抗体基と赤血球に固定され
たヒトIgGに固定できる、他の基をゆうする。 免疫付着反応の感度は抗グロブリンの濃度に
関係するので、この場合は抗グロブリンを高濃
度で使用した。この現象は次のように説明でき
るかもしれない。いかに長時間抗グロブリンイ
ンキユベーシヨンを続けても、赤血球またはカ
ツプに対し固定されるIgGの飽和は、いずれも
100％よりはるかに小である。赤血球の被覆の
形成は多数の異型IgG分子、すなわちカツプま
たは赤血球に固定されたIgGの集合を生ずる。
しかしながら、赤血球が付着によつて固定され
ない限りは、すなわち抗グロブリン分子が赤血
球に固定されたIgGとプラスチツクに固定され
たIgGの間に橋を形成するまでは、赤血球は
IgGで被覆されたカツプの傾斜した底部を移動
しまたはスライドして、任意の２個の異型IgG
分子の接近はきわめて短時間しか続かず、この
時間は赤血球上のIgG表面濃度と反対に変化す
る。すなわち、抗グロブリン分子との二重反応
に距離が好ましい時間はきわめて短い。抗グロ
ブリン分子から最も近い２個の異型IgG分子へ
の平均距離が抗グロブリン分子の平均接近時間
に対して長すぎ、２個の異型IgG分子が好まし
い距離内に接近する有効時間より平均接近時間
が短いと反応は起こらない。平均接近時間は抗
グロブリンの濃度を増大させることにより、明
らかに減少する。 赤血球におけるIgGの表面濃度はあらかじめ
知ることはできないから、赤血球がきわめて低
いIgG表面濃度を示しても、抗IgG分子が赤血
球上のわずかなIgGと反応でき、付着させるよ
うに抗グロブリンは高濃度で用いなければなら
ない。ついでに、反応の感度に対する抗グロブ
リン濃度の影響は、ウイルス抗原たとえばHBs
抗原を検知する場合には小さい。それは、この
場合、試薬赤血球におけるIgG表面濃度が比較
的高レベルに固定されているからである。 たとえば、クームス法において少なくとも力
価128を有するヒト抗IgG抗グロブリンをその
まま、またはわずかに希釈して使用する。実際
には、抗グロブリンは他の公知分析方法、とく
に赤血球凝集を含むクームス反応における感度
について至適になるように希釈される。 すなわち、工程ｂ後に得られた赤血球懸濁液
はカツプ中で抗グロブリンとインキユベートさ
れる。必要に応じて、この間、カツプは振盪さ
れる。 ｄ インキユベーシヨンについで行われる遠心分
離は正確に調整された条件下に実施されねばな
らない。赤血球が陽性か陰性かにより、赤血球
が付着するかまたはそれが妨げられるようにデ
ザインされているからである。 本方法の第１例について前述したように、抗
グロブリンインキユベーシヨンはきわめて短時
間でなければならない。したがつて遠心分離は
反応メジウム（すなわち赤血球の懸濁液と抗グ
ロブリン）をカツプに加えてから数秒ないし数
十秒後、すなわちカツプの底部（IgG２３）ま
たは赤血球（IgG２５）に固定されたきわめて
わずかなIgGが抗グロブリンのヒト抗IgG Ig分
子によつて占拠されたにすぎない。十分短時間
内に開始される。 遠心分離はカツプ２１の回転軸２１ｂに垂直
な軸２１ａの周囲に回転することにより、以下
の２段階に行われる。 第１の段階では、反応メジウムがカツプの底
面２２に対し分布し押しつけられ、赤血球／
IgG複合体が生成していればそのすべて、また
は抗Ｄ試験血清とのインキユベーシヨンによつ
て改変されていない赤血球のすべてが、プラス
チツクに固体されたIgGに対して運ばれる。こ
れは赤血球をカツプの頂点３０に運ぶには不十
分な第１の遠心分離速度V1の適用により行わ
れる。 前述の一般的考慮にしたがい、第１の遠心分
離段階の速度は、その場合の剥離力Ｆd1が、赤
血球をカツプの底部に保持している非特異的結
合力を破壊するには不十分なように選択され
る。赤血球は粘着され、抗グロブリンのヒト抗
IgG分子があれば、プラスチツク底部に固定さ
れたヒトIgGと赤血球によつて運ばれたヒト
IgGの間に橋を形成できるような位置に存在す
る。この被覆工程は、すでに陽性IgG赤血球複
合体に結合されたヒト抗IgG分子が、プラスチ
ツク上のまだ利用できるIgG部位の方向、すな
わちプラスチツクと赤血球の間の分子橋を完成
するのに都合のよい位置移動するためにも用い
られる。 第１の遠心分離速度V1は、プラスチツクと
赤血球の間の分子橋が形成され、完成されるの
に十分な時間維持される。分子橋は以下の結合
鎖よりなるものである。 プラスチツク＋IgG２３／抗グロブリン２
７／IgG２５／陽性赤血球２４ 実際には、この反応は円錐頂角120゜のカツ
プ中において、第１の遠心分離段階は加速約
200ｇ、約１分間の条件で行われる。 ｅ 次に速度V1より大きい速度V2での第２遠心
分離段階が行われる。第２段階は陽性および陰
性反応間の差を明らかにする工程である。速度
V2は生じた遠心力が陰性赤血球をカツプ頂部
３０に移動させ、そこに集める（第１４ｂ図参
照）、陽性赤血球はIgG２３、ヒト抗IgG分子２
７およびIgG２５によりカツプ壁に付着したま
まである（第１４ａ図参照）ように選択され
る。速度V2はすなわち、遠心分離によつて生
ずる剥離力Ｆd2が陰性赤血球をカツプ底部に保
持させる非特異性結合力FNSの合計よりも大
きく、しかしながら陽性赤血球をカツプ底部に
保持させる非特異性結合力および特異性結合力
の和（すなわち、FNS＋FS）より小であるよ
うに選ばれる。 実際には、反応は頂角120゜のカツプ中で行
い、第２の遠心分離操作は、加速約1600ｇにお
いて、数秒ないし数十秒行われる。 分析の結果は反応後直ちに明らかである。 陽性反応の場合、すなわち分析された赤血球
が実際に抗原Ｄ活性を有する場合は、赤血球／
IgG複合体２６はヒト抗IgG分２７（第１４ａ
図）およびヒトIgG２３によりカツプの底部に
粘着されたままである。カツプを軸２１ｂに沿
つて観察した場合（第１４ａ図の右部参照）に
は、カツプの全底面を通じて赤血球の均一な単
層がみられ、すなわち付着が起こつている。 一方、分析された赤血球が抗原Ｄ活性を持た
ない場合は、第２の遠心分離段階でカツプ頂部
３０の方向に移動され、そこに集められる。カ
ツプを軸方向に観察すると、赤血球よりなる微
小沈着３１の形成が認められる（第14b図の右
部）。付着は起こつていない。 使用する試薬量には制限はない。たとえば、
径１ないし７mmのカツプの場合、加える液体量
は15ないし250μである。赤血球懸濁液と抗
グロブリンは等容加えるのが有利である。 以上、赤血球にＤ抗原基があるかどうかの検討
に本発明方法を適用する例を示した。しかしなが
ら、この方法は同一条件で、ヒト血液サンプルの
血清または血漿が特異的抗Ｄ抗体を含むかどうか
を明らかにするにも使用できる。この場合、分析
すべき血清を特異的Ｄ抗原活性を有することが既
知の試験赤血球とインキユベートする。分析され
た血清が特異的抗Ｄ抗体を含む場合は、血清によ
つて供給された特異性抗Ｄ抗体免疫グロブリンが
赤血球上のＤ抗原基に固定される。 次にこうしてインキユベートされた赤血球を洗
浄し、前述のように抗グロブリンと同時に容器中
に加え、ついで前述したように遠心分離工程に付
す。 もし反応が陽性であれば、すなわち分析された
血清が実際に特異性抗Ｄ抗体を含有すれば、プラ
スチツク＋IgG／抗IgG／IgGおよび赤血球の間に
分子橋を生成し、均一な単層の赤血球がカツプの
底表面に形成、粘着される。一方、分析された血
清が特異的抗Ｄ抗体を含まない場合、反応は陰性
で、カツプの底部に粘着し得なかつた赤血球は反
応の末期にはカツプ頂部の微小沈着に集められ
る。 以上本発明の方法を血清または血漿中に特異的
に抗Ｄ抗体または赤血球によつて運搬されるＤ抗
原基の検出について述べたが、本発明の方法は、
血漿中の他の任意の赤血球抗原または他の任意の
抗体の検出に使用することができる。検出が特定
の赤血球抗原に対して行われ、赤血球が現実に抗
原活性を持つかどうかを明らかにすることが所望
される場合、赤血球を、検討される抗原に特異的
であることが既知の抗体を含む試験血清とインキ
ユベートする。逆に、血漿が特定の抗体を含むか
どうかを知りたい場合は、血清を、検討される抗
体に相当する抗原活性を有することが既知の試験
赤血球とインキユベートする。 試験赤血球は、検出すべき抗体に特異的な抗原
基を持たせることができる。また、試験赤血球は
検出すべき抗体に特異的な抗原基が固定された異
種細胞または適当な粒子たとえばプラスチツク粒
子または細胞もしくは粒子で代用することもでき
る。 ついで前述した各種工程を、必要に応じて各操
作パラメーターを改変して実施し、たとえば遠心
分離は付着が起こるか起こらないかを明らかにで
きるように行う。 本発明によるこの第２の例は、任意の細胞抗原
たとえばリンパ球によつて運搬される抗原または
血小板形成抗原の検出に対しても、適当な試薬す
なわち試験血清、カツプの底部に固定される免疫
グロブリンおよび抗グロブリンが選択されれば使
用できる。 本発明のこの第２例は、以下に述べる変法によ
つても実施できる。前例と同様、ヒト血液サンプ
ル中の赤血球がＤ抗原抗体を持つか持たないかを
決定する場合について述べる。 ａ 前述の方法と同様、第１工程はプラスチツク
カツプの円錐状底部をヒトIgGすなわち次工程
に用いられる特異的Ｄ抗原抗体におけると同じ
動物種からの同一免疫化学的種類の免疫グロブ
リンで被覆されるように調製する。 ｂ 次に、前法と同様、分析する赤血球を適当な
生理的溶液に懸濁し、カツプ以外の容器中で、
既知の特異的抗Ｄ抗体を含む試験血清（抗Ｄ試
験血清）とインキユベートする。試験血清とイ
ンキユベートしたのち、赤血球は生理的溶液で
洗浄するのが有利である。 ｃ 次に、上のように処理した赤血球を抗グロブ
リンすなわちヒト抗IgG免疫グロブリンを供給
した動物免疫血清とインキユベートする（カツ
プ外部で前述したように）。このインキユベー
シヨンは常温たとえば20℃において、最高率の
少なくとも高百分率の赤血球固定IgG分子が
（陽性の場合）がそれに付着するヒト抗IgG分
子と反応するのに十分な時間行われる。インキ
ユベーシヨンは20分間続けるのが有利である。 この場合、抗グロブリンは、前述したと同じ
理由で、高濃度において用いるのが有利であ
る。本例の場合、用いた抗グロブリンはクーム
ス法で少なくとも力価128を示し、希釈すると
してもわずかに希釈して用いる（希釈比1/2ま
たは1/4）。 ｄ このインキユベーシヨン期の終わりに、赤血
球懸濁液および抗グロブリンよりなる反応メジ
ウムを、底部をヒトIgGで被覆したカツプに移
す。 ｅ 次に、直ちにカツプをその回転軸に垂直な軸
の回りに回転して第１の遠心分離工程に付す。
遠心分離は赤血球をカツプ底部に押しつけるに
は十分であるが、陰性および陽性赤血球のいず
れをもカツプ壁に対して保持させている非特異
的結合力を破壊しないような速度V1で行われ
る。したがつて、速度V1は、生じる剥離力が
非特異的結合力FNSの合計よりも小であるよ
うに決定される。速度V1はカツプ底部に固定
されたヒトIgG、ヒト抗IgG分子および赤血球
のＤ抗原基に特異的に固定されたヒトIgGより
なる分子鎖が形成されるのに十分な時間適用さ
れる。時間は検出すべき抗原または抗体の性質
にしたがつて選択される。本例の場合、遠心分
離は加速約200ｇで約１分行われる。 ｆ 次に第１の態様と同様、第２の遠心分離操作
が行われる。 遠心分離速度はV2に上昇させる。すでに述
べたように、生じる剥離力は、非特異的力によ
るほかはカツプに結合されていない赤血球すな
わち陰性赤血球をカツプ頂部に移動させるに十
分であるが、Ｄ抗原基をもつた赤血球は移動さ
せない、すなわち陽性赤血球をカツプの傾斜表
面にプラスチツク＋ヒトIgG／ヒト抗IgG／抗
ＤヒトIgG／赤血球のＤ抗原よりなる完全分子
橋によつて保持する特異的結合力FSと非特異
的結合力FNSの和は破壊できないように速度
V2を選ぶ。 認められる結果は前述の場合と同じで、反応
が陽性であれば付着が起こり、カツプ底部に分
布した赤血球の均一な単層がカツプの回転軸に
沿つて観察される。一方、反応が陰性の場合に
は付着が起こらず、カツプ頂部に微小沈着が認
められる。 第２の態様と前述の態様との主たる相違は、抗
グロブリンインキユベーシヨンすなわちあらかじ
め試験血清とインキユベートされた赤血球とヒト
抗IgG分子のインキユベーシヨンを第１の遠心分
離工程の直後にヒトIgGで被覆されたカツプ中で
実施せず、カツプの外部で行い、インキユベーシ
ヨン後に得られた反応メジウムは遠心分離される
までカツプに加えない。本例の場合、プラスチツ
クに固定されたヒトIgG分子と反応するヒト抗
IgG分子の百分率と、赤血球に固定されたヒト
IgG分子と反応するヒト抗IgG分子の百分率の間
に最大の不均斉を得ることを目的とした。理想的
条件では、プラスチツクに固定され、ヒト抗IgG
分子によつて占拠されたヒトIgG分子の百分率は
０％に等しく、赤血球に固定され、ヒト抗IgG分
子によつて占拠されたヒトIgG分子の百分率が最
大になる。もちろん最大値は赤血球をヒト抗IgG
分子を介して互に直接凝集させた場合に得られる
値より小である。 付着反応の最高感度は、各結合末端すなわちプ
ラスチツクに固定されたIgGと、赤血球に固定さ
れたIgGに結合する抗IgG分子の分布の最大の不
均斉がカツプ底面に赤血球がはじめて押しつけら
れたとき、すなわち第１の遠心工程の開始時に達
成されたとき生じるように思われる。不均斉は
IgGの表面濃度が低い結合末端が上より大きい割
合の抗IgG分子を固定するものでなければならな
い。本例では、免疫グロブリンがプラスチツクに
飽和まで結合しているので、プラスチツクはより
高いIgG表面濃度を持つから、IgGの低表面濃度
を持つ結合端は赤血球である。 この種の抗グロブリンインキユベーシヨンは
「不均斉」と呼ばれる。一方、第１の態様におけ
る抗グロブリンインキユベーシヨンは各IgG結合
端が同時に抗グロブリンに接触させられるので
「均斉」と呼ばれる。 赤血球もしくは細胞または抗体抗原が同定され
る場合、不均斉抗グロブリンインキユベーシヨン
がカツプの外部で行われ、ここで免疫付着反応を
生じる場合は、均斉抗グロブリンインキユベーシ
ヨンで得られる感度の200倍もの感度を生じる。 したがつて、不均斉抗グロブリンインキユベー
シヨンを含む等２の態様はとくに、分析すべき血
清中に同定される特定抗体がきわめて少量である
か、または細胞抗原が分析すべき赤血球上できわ
めて低い表面密度しか示さないという理由からき
わめて少数のIg免疫グロブリンたとえばIgGが赤
血球に固定されるにすぎず、反応が困難とされて
いる場合に好ましい。 不均斉抗グロブリンインキユベーシヨンを含む
方法は、分析すべき血清をＤ抗原活性を有するこ
とが既知の試験赤血球とインキユベートし、つい
で上述の操作を行うことにより、この血清が特異
的抗Ｄ抗体を含むかどうかを明らかにするために
使用することもできる。 この方法は、Ｄ抗原以外の赤血球抗原の同定、
また一般に全種類の細胞抗原たとえばリンパ球ま
たは血小板形成抗原の同定にも使用できる。この
場合、遠心分離パラメーターおよび免疫付着反応
に用いられる試薬は、分析すべき血清系に適当に
適合させればよい。同様に、この方法は血漿また
は血清中の任意の種類の抗原を同定するのに使用
できる。 血漿中の赤血球もしくは細胞抗原または抗体を
同定するために用いた本発明方法の上述例では、
付着または非付着を明らかにするのに２工程の遠
心分離工程を用い、第２工程で第１工程より高速
度を用いた。 また、遠心分離は、全小体、たとえば少なくと
も一時的に容器の底壁に粘着させる赤血球に対し
て１回の加速で行う方法もある。加速は、徐々に
累進的に壁から脱着される小体が容器頂部に集め
られるように行う。この小体は、プラスチツクに
固定される免疫グロブリン、抗体グロビリン分子
および小体に固定される免疫グロブリンよりなる
分子鎖を形成し得ず底部壁に付着しなかつたもの
である。この場合、１回の遠心分離工程の間には
加速は陰性および陽性反応上体の両者に関係する
特異的結合力を破壊するための平均に相当する値
よりわずかに大きく保持した。非特異的結合力は
陰性反応小体を保持するのみの力である。加速ま
たは遠心分離速度は低いから、全小体はカツプ底
部に分子橋形成に十分な時間押しつけられ、分子
橋は陰性反応小体の場合より急速に発育し、完成
される。同じ遠心分離速度を十分長時間保持する
と、分子橋を形成できないためカツプ底部に粘着
できなかつた小体はすべてカツプ底部壁から徐々
に剥離され、一方、陽性反応小体は分子橋を形成
できるので、底部壁に粘着したままである。 ヒト血液サンプル中の赤血球のＤ抗原活性を検
知する場合、そして分析は円錐頂角120゜のカツ
プ中で行われる場合、１回の遠心分離工程は加速
約250ｇで約400秒間行われる。 上述の赤血球抗原または抗体を同定するための
反応に用いられる３種の遠心分離計画図を第１６
ないし第１８図に示す。各図とも縦軸はｇで適用
した遠心力を示し、横軸は遠心分離時間を秒で示
す。免疫付着反応は円錐型底部を有し、頂角120
゜のカツプ中で行われた。 第１の遠心分離図（第１６図）は均斉抗グロブ
リンインキユベーシヨンの場合に相当し、カツプ
は０秒でわずかに加速され（すなわち赤血球の懸
濁液および抗グロブリンを含む反応メジウムをカ
ツプ中に加えたのち）、カツプはその回転軸に平
行な軸の回りに回転され、加速は本例の場合４ｇ
である。この相は０秒から15秒まで続け、速度
は赤血球を落下させるのには不十分で、赤血球は
カツプの底部に急速に吸着されるので、抗グロブ
リンインキユベーシヨン工程である。必要に応じ
て、カツプ中の反応メジウムを同時に撹拌するこ
ともできる。 次に、遠心分離加速を非特異的結合力FNSの
みを破壊するための平均レベル以下の値に急速に
上昇させる。この平均レベルが230ｇと評価され
た場合（本例ではヒト血液サンプル中の赤血球上
のＤ抗原活性を検出するのが目的である）、遠心
分離加速は200ｇに上げられる。15秒ないし30秒
の工程の間に、赤血球はカツプの底部方向に移動
し、30秒にはすべて底部に到達する。 遠心分離加速は60秒後まで200ｇに保持され
る。工程すなわち30秒から60秒までの間赤血球
はカツプ底部に押しつけられ、この間、分子橋を
形成できる場合はプラスチツクと赤血球の間に分
子橋が形成され、実際には60秒後までに全分子橋
が完成する。 次に、遠心分離加速は急速に、すべての非特異
的結合力を破壊するに十分な値に増大させる。こ
れはカツプに陰性赤血球を保持するだけの力であ
る。もちろん、加速は陽性反応をプラスチツクに
対し保持させる非特異的結合力と特異的結合力を
合した力を破壊する値より小さい値でなければな
らない。本例の場合、加速は1600ｇに上昇させ
る。したがつて最終工程（工程）の間、非特異
的結合力がプラスチツクに対して赤血球を保持さ
せる唯一の力である場合、これが破壊される。こ
の工程では、剥離された赤血球が急速に集められ
る。遠心分離は84秒後に最終的に停止させる。 この遠心分離図は、わずかな改変はともかく、
不均斉抗グロブリンインキユベーシヨンが行われ
る方法にも適用できる。この場合、工程（すな
わちカツプ中での撹拌および抗グロブリンインキ
ユベーシヨン）は、抗グロブリンインキユベーシ
ヨンがカツプ外部において、抗グロブリンとあら
かじめ試験血清とインキユベートした赤血球（ま
たは分析すべき血清を試験赤血球と）の間で行わ
れるので省略される。不均斉抗グロブリンインキ
ユベーシヨン完了後、反応メジウムをカツプに移
し、直ちに加速200ｇの第１の遠心分離に付す。 赤血球抗原または抗体の同定のための反応に適
用できる第２の種類の遠心分離を第１７図に示し
た。 第１６図の場合のように、15秒目まできわめて
低加速の遠心分離（本例では４ｇ）が適用され
る。工程の均斉抗グロブリンインキユベーシヨ
ンの間は必要に応じてカツプを撹拌する。 15秒後に遠心分離加速を急速に増大させる。本
例の場合、非特異的結合力のみを破壊する平均レ
ベルに相当する値よりもわずかに大きな値に増大
させる。本例の場合、平均レベルは230ｇと推定
され、加速は250ｇに上昇させる。15秒と30秒の
間に、赤血球は下降し（工程）、30秒後にはす
べてがカツプ底部に接触する。遠心分離加速は
250ｇ、すなわち非特異的結合力を破壊するに必
要な平均レベルよりわずかに大きく維持される。
相に続いて直ちに行われる相では非特異的結
合力は徐々に、おだやかに破壊される。非特異的
結合力が赤血球をプラスチツクに保持する唯一の
力であり、赤血球が最も小さい非特異的結合力を
有する陰性反応フラクシヨンに属する場合であ
る。したがつて、この工程は剥離された細胞が
徐々に累進的に集められる工程を伴う。本例では
捕集速度はきわめて低く、赤血球が降下したのち
もカツプ底部に対して十分な時間押しつけられた
ままでいて、分子橋を形成することが可能な場合
はその形成が行われる。細胞が剥離されるよりも
分子橋の形成が急速に行われる。遠心分離加速は
依然として250ｇに保持されているので、分子橋
を形成可能な場合はある時間後にそれが完成さ
れ、一方、カツプ底部に特異的に結合していない
赤血球は徐々に剥離を続ける。相は比較的長時
間続けられ、たとえば410秒後に停止させる。 本例に適用された剥離方法はきわめておだやか
であり、結果は著しく高感度である。これは赤血
球とプラスチツクの間の弱い結合を含む反応に対
してとくに適している。 第１８図は生育反応に呼応して遠心分離をコン
トロールした場合に相当する。この方法は、(a)分
析すべきサンプルの反応を行うカツプ、および(b)
陰性対照反応を行うカツプ中で同時に行われ、遠
心分離の各回転ごとにストロボ閃光で照射され
る。 コントロールの方法はHBs抗原の検出に関連し
て前述した方法とほぼ同じである。陰性対照反応
におけるカツプ底部の拡大像を、たとえば１秒に
１回、テレビカメラにとり分析する。すなわち、
陰性対照反応中に形成した微小沈着像の表面およ
び不透明性を、あらかじめ行われた典型的陰性反
応における微小沈着の表面および不透明性と比較
する。 第１８図は赤血球または細胞抗原または抗体の
同定のための反応で、非特異的結合力のみを破壊
する平均レベルが遠心分離加速450ｇに相当する
場合に適用した遠心分離計画図である。この遠心
分離図は、特性をあらかじめ知り得ない血清系
（とくに非特異的結合力の破壊のための平均レベ
ル）に適用することができる。 前述のように、この方法は均斉抗グロブリンイ
ンキユベーシヨンを包含する。その場合、遠心分
離加速は15秒まで４ｇに保持し、すなわち小体ま
たは細胞をカツプ底部に対して落下させまたは急
速に押しつけるには低すぎる値に保つ。これは抗
グロブリンインキユベーシヨン工程で、この
間、カツプは必要に応じ撹拌する。 15秒後、遠心分離加速を急速に200ｇに上昇さ
せる。15秒と30秒の間に、細胞または小体はカツ
プの急速に落下する（工程）。次に60秒まで工
程が行われる。この間に、細胞または小体の被
覆がカツプの底部に形成され、形成可能な分子橋
はすべて、カツプ底部と細胞または小体間に形成
される。 被覆工程の末期すなわち60秒後には、加速を
100ｇだけ上げ、300ｇで30秒間遠心分離する（工
程）。90秒後、陰性対照反応の微小沈着の表面
および不透明性を測定し、典型的対照陰性反応と
比較する。対照微小沈着の測定された表面および
不透明性が典型的対照陰性反応の場合より小であ
れば、300ｇの加速は非特異的結合力を破壊する
には小さすぎたということになる。 したがつて、遠心分離加速をさらに100ｇだけ
上げ、400ｇで30秒間遠心分離する（工程）。
120秒後に対照微小沈着の表面および不透明性を
測定し、典型的対照陰性反応の場合と比較する。
この場合、非特異的結合力を破壊する平均レベル
は450ｇであつて、400ｇで遠心分離したのちに得
られた陰性対照の微小沈着の表面および不透明性
を測定した結果は依然として典型的対照微小沈着
より低い。陰性対照反応でも、赤血球は非特異的
結合力によつてカツプに結合し、剥離されない。 したがつて、遠心分離加速をさらに100ｇ増加
させて500ｇとした（工程）。30秒後、すなわち
開始から150秒目に、陰性対照反応の微小沈着の
表面および不透明性を再び測定し、典型的対照の
微小沈着の場合と比較する。本例の場合、非特異
的結合力を破壊するための平均レベルを越え、陰
性対照反応で得られた微小沈着は少なくとも典型
的微小沈着の場合に匹敵する表面および不透明性
を有する。すなわち、120秒後から非特異的結合
力が破壊され、赤血球が剥離されると同時に集め
られる工程が始まる。遠心分離加速は500ｇに保
持し、遠心分離は陰性対照反応からの微小沈着の
表面および不透明性が、真の反応を表す剥離赤血
球量に相当するようになつた時点で最終的に遠心
分離を停止する。この場合、遠心分離は330秒後
に停止される。 陽性および陰性反応の間の識別閾値はHBs抗原
の検出方法に関連して前述したと同様にして決定
される。 すなわち、微小沈着に集められ、真の陰性反応
を示す赤血球の百分率が、前述の実験によつて決
定されたように12％であり、標準偏差が３％であ
る場合、真の陰性反応の識別閾値は、前述したよ
うに、微小沈着に集められた18％の赤血球に相当
し、一方、陽性反応の識別閾値は微小沈着に集め
られた６％の赤血球に相当する。 本発明の方法は、検知すべき特定の赤血球抗原
もしくは細胞抗原または特定の抗体の割合を定量
的に測定するのに利用することもできる。得られ
た微小沈着の表面および／または不透明性は、分
析されるメジウム中に存在する抗原または抗体量
に依存するからである。したがつて、陽性反応に
おいて生成した微小沈着の表面および／または不
透明性を測定すれば、単に標準生成物の範囲で得
られた相当する値またはあらかじめ作成した検量
線と比較することにより、メジウム中に存在する
抗原または抗体量を決定できる。 本発明の方法による第２例は、第１例の場合と
同様、同一の遠心分離条件で、各種性質および特
異性を有する赤血球抗原もしくは細胞抗原または
抗体の同定に適用することができる。 理由は前述したように、剥離の可能性はカツプ
底部の傾斜にのみ依存するからである。したがつ
て、問題の各反応ごとに反応に最も適当な傾斜を
有するカツプを選べばよいからである。傾斜は選
ばれた遠心分離速度において陰性反応細胞または
粒子のみが剥離されるように選択される。
第１図ないし第９ｂ図は本発明の方法を血液サ
ンプル中のHBs抗原の検知に用いた場合の各工程
を図解的に示すものであり、第１０図は細胞が遠
心分離に付されている間に受ける力を示す図であ
り、第１１図ないし第１４ｂ図は本発明の方法を
ヒト血液サンプルの赤血球におけるＤ抗原の検知
に用いた場合の各工程を図解的に示すものであ
り、第１５図ないし第１８図は、本発明の方法に
おける遠心分離工程を例示する図である。
ンプル中のHBs抗原の検知に用いた場合の各工程
を図解的に示すものであり、第１０図は細胞が遠
心分離に付されている間に受ける力を示す図であ
り、第１１図ないし第１４ｂ図は本発明の方法を
ヒト血液サンプルの赤血球におけるＤ抗原の検知
に用いた場合の各工程を図解的に示すものであ
り、第１５図ないし第１８図は、本発明の方法に
おける遠心分離工程を例示する図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 生物学的メジウム中のウイルス抗原を検出ま
たは同定するための血漿のような生物学的メジウ
ムの分析方法において、免疫化学種類Ｘに属し、
動物種から得られたIg免疫グロブリン（すなわ
ちIgX免疫グロブリン）を対称軸上に収斂点を
有する容器壁に固定させ；分析すべき生物学的メ
ジウムのサンプルを、検出すべきウイルス抗原に
対する免疫グロブリンの抗体特異性に応じて選択
したのち、IgXをあらかじめ固定させた細胞また
は粒子の懸濁液と容器外でインキユベートし；イ
ンキユベートされた細胞または粒子の懸濁液を含
む反応メジウムと好ましい濃度の抗グロブリン
（すなわち動物種とは別個の動物種から得ら
れ、IgXに対する抗体である分子の溶液（以下
抗IgXと呼ぶ）を上記容器にとり、抗IgX分
子とIgX分子を結合させ、ついでこの抗IgX
分子を介して容器壁と細胞または粒子の間に分子
橋を形成させるような条件下に、上記軸に平行な
遠心力をかけ；遠心分離を、IgXで被覆された
容器の円錐壁にすべての細胞を付着させるための
最初の加速、ついで陰性反応を示す細胞または粒
子があればそれらを解放させるための急速な停
止、その後抗IgX分子によつて形成された分子
橋の破壊により容器壁に付着できなくなつた細胞
または分子を容器の頂点に集めるための第２の加
速を行なうことを特徴とする方法。 ２ 遠心分離は、陰性反応（すなわちウイルス抗
原を含まないサンプルとの反応）の場合、抗IgX
分子により容器壁上および細胞または粒子の対
面表面上に固定されたIgX分子の飽和を達成さ
せるために十分な時間停止させる特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ３ 細胞または粒子の懸濁液は容器外で分析すべ
き生物学的メジウムとインキユベートしたのち生
理的溶液で洗浄する特許請求の範囲第１項または
第２項のいずれか１つに記載の方法。 ４ 用いる抗IgX分子の溶液はクームス法にお
いて少なくとも強度128を有し、そのまま、また
は1/2または1/4の割合に希釈する特許請求の範囲
第１項〜第３項のいずれか一項に記載の方法。 ５ 分析すべき生物学的メジウムとあらかじめイ
ンキユベートした細胞または粒子の懸濁液を抗
IgX分子の溶液と同時に容器に加える特許請求
の範囲第１項〜第４項のいずれか一項に記載の方
法。 ６ 分析すべき生物学的メジウムとあらかじめイ
ンキユベートした細胞または粒子の懸濁液をまず
容器に加え、ついで、抗IgX分子の溶液を加え
る特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか一項
に記載の方法。 ７ 最初の遠心相の前に、反応メジウムの成分す
なわち抗IgX分子の溶液およびサンプルとすで
にインキユベートした細胞または粒子の懸濁液を
細胞もしくは粒子上または容器壁上に固定された
IgX分子の10％が抗IgX分子と反応するのに
少なくとも十分な時間、インキユベートする特許
請求の範囲第１項〜第６項のいずれか一項に記載
の方法。 ８ 反応メジウムをインキユベーシヨン中、撹拌
する特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９ インキユベーシヨンを数秒〜数十秒続ける特
許請求の範囲第７項または第８項のいずれか一つ
に記載の方法。 １０ 各遠心工程すなわち第１工程、続く停止期
および第２工程の加速および持続は、同一試薬お
よび同一条件を用いた予備試験で最良の結果を与
えた時間に合わせまた陰性反応と対照して、すな
わち第１の遠心工程の終わりには実質的に100％
の細胞または粒子が容器壁に付着し、容器壁およ
び細胞または粒子の対面表面に固定されたIgX分
子は停止相の終わりには細胞が容器壁から解放さ
れるように抗IgX分子で十分に飽和され、そし
て細胞が第２の遠心工程で解放され容器の頂点に
集められるように行なう特許請求の範囲第１項〜
第９項のいずれか一項に記載の方法。 １１ 第２の遠心工程は、同時に(a)サンプル分析
反応が行なわれる容器および(b)陰性対照反応が行
なわれる容器において行なわれ、対随容器の底部
の像を第２の遠心工程の間中一定の間隔で記録し
分析して、対照容器の底部が、少なくともほぼ18
％の細胞または粒子が容器頂点に集められたとき
の像に相当した場合に停止できるように自動化す
る特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２ ヒト血液サンプル中のHBsウイルス抗原を
検出または同定する特許請求の範囲第１項〜第１
１項のいずれか一項に記載の方法。 １３ 分析は円錐型底部を有し、頂角120゜の容
器中で行ない、抗IgX分子の溶液を含む反応メ
ジウムとあらかじめ分析すべきサンプルとインキ
ユベートした細胞または粒子の懸濁液とを容器に
加えてから15秒から16秒までの間に第１の遠心工
程を200ｇの加速で行ない、容器へ反応メジウム
を加えてから60秒から300秒までの間遠心を停止
し、最後の遠心工程は加速500ｇで40秒間行なう
特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４ 血液中の細胞抗原（または抗細胞抗体）を
検出また同定するための血液の分析方法におい
て、免疫化学種類Ｘに属し、動物種から得られ
たIg免疫グロブリン（IgX免疫グロブリンと呼
ぶ）を、対称軸上に収斂点を有する容器の壁に固
定させ、分析すべき細胞抗原または抗細胞抗体が
赤血球または血漿中にそれぞれ存在する場合に
は、これらの分析すべき赤血球の懸濁液を試験血
清と（または分析すべき血漿を試験赤血球の懸濁
液と）、IgXを赤血球上に固定させる条件下に
インキユベートし、このインキユベートされた血
球の懸濁液と好ましい濃度の抗グロブリン（すな
わち動物種と別個の動物種から得られ、IgX
に対する抗体である分子の溶液、この分子は抗
IgXと呼ぶ）からなる反応メジウムを容器中、
抗IgX分子がIgXと結合し抗IgX分子を介し
て赤血球と容器の間に分子橋を形成するような条
件下に、容器の対称軸に平行な遠心力をかけ、遠
心分離は、分子橋が形成できるときは赤血球が一
時的に容器壁に粘着し、そして抗IgX分子を介
して分子橋を形成するIgXを有しないことにより
容器壁に粘着できない赤血球だけが容器の頂点に
集められるように行なう方法。 １５ 分析すべき赤血球（または試験赤血球）の
懸濁液を容器外で試験血清（または分析すべき血
漿）とインキユベートしたのち、生理的溶液で洗
浄する特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １６ クームス法において少なくとも強度128を
有する抗IgX分子の溶液を、そのまま、または
1/2もしくは1/4の割合に希釈して用いる特許請求
の範囲第１４項または第１５項のいずれか一つに
記載の方法。 １７ 反応メジウムの両成分すなわち赤血球の懸
濁液と抗IgX分子の溶液とは容器中へ別個に、
同時に加える特許請求の範囲第１４項〜第１６項
のいずれか一項に記載の方法。 １８ あらかじめインキユベートした赤血球の懸
濁液を抗IgX分子溶液に先立つて容器中へ加え
る特許請求の範囲第１４項〜第１６項のいずれか
一項に記載の方法。 １９ 遠心分離前に、反応メジウムの両成分すな
わちあらかじめインキユベートした赤血球の懸濁
液と抗IgX分子の溶液を、赤血球上または容器
壁上に固定されたIgX分子の10％が抗IgX分
子と反応するのに少なくとも十分な時間インキユ
ベートする特許請求の範囲第１７項または第１８
項のいずれか一つに記載の方法。 ２０ 反応メジウムをインキユベーシヨン中撹拌
する特許請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１ インキユベーシヨンは数秒〜数十秒続ける
特許請求の範囲第１９項または第２０項のいずれ
か一つに記載の方法。 ２２ 赤血球の懸濁液を容器外で抗IgX分子の
溶液とインキユベートしたのちに反応メジウムを
容器中に加え、遠心分離し、遠心分離は反応メジ
ウムを容器中に加えたら直ちに行なう特許請求の
範囲第１４項〜第１６項のいずれか一項に記載の
方法。 ２３ 赤血球の懸濁液と抗IgX分子の溶液を約
20分間インキユベートする特許請求の範囲第２２
項記載の方法。 ２４ 遠心分離は、２回の加速が加えられ、すな
わち第１の加速はすべての赤血球を容器壁に押し
つけるように、第２のより強い加速は容器に付着
し得ない赤血球のみを容器頂点に集めるように行
なわれる特許請求の範囲第１４項〜第２３項のい
ずれか一項に記載の方法。 ２５ 遠心分離は、１回の加速が加えられ、少な
くとも一時的に全赤血球を容器壁に付着させ、容
器壁端に粘着できない赤血球のみは徐々に壁から
離れ、容器頂点に集まるように行なわれる特許請
求の範囲第１４項〜第２３項のいずれか一項に記
載の方法。 ２６ 本方法を同一条件において(a)分析すべきサ
ンプルの容器中と(b)陰性対照反応が得られる容器
中とで同時に行ない、陰性対照反応で生成した微
小沈着を一定の間隔で記録し分析して、陰性対照
反応からの微小沈着の分析が約18％の小体が容器
頂部に集められたことを示した時点で遠心分離を
最終的に停止するようにした遠心分離の停止時間
を自動的に決定できる特許請求の範囲第２４項ま
たは第２５項のいずれか一つに記載の方法。 ２７ 本方法を同一条件において、(a)分析すべき
サンプルの容器中と(b)陰性対照反応が得られる容
器中とで同時に行ない、陰性対照反応で生成し
た、微小沈着の像を一定の間隔で記録し分析し
て、微小沈着の増加曲線を陰性対照反応の場合と
比較し、分析すべき微小沈着の増加曲線が対照増
加曲線に対応するように遠心分離のスピードおよ
び時間をコントロールする、反応の進行に応じて
遠心分離を変化させる特許請求の範囲第１４項〜
第２３項のいずれか一項に記載の方法。 ２８ 陰性対照反応からの微小沈着の分析が赤血
球の少なくとも約18％が容器頂点に集められたこ
とを示したときに遠心分離を最終的に停止する特
許請求の範囲第２７項記載の方法。 ２９ 分析反応は円錐型底部を有し、頂角120゜
の容器中で行ない、赤血球の懸濁液を抗IgX分
子の溶液とインキユベートしたのち、反応メジウ
ムを含む容器を錐体軸に垂直な軸の回りに、陰性
反応を示す赤血球が容器の底壁から離脱するより
小さい加速で回転させ、この加速を45秒間続け、
ついで加速を30秒ごとに100gずつ増加させて各
30秒の末期において陰性対照反応中に生成した微
小沈着を分析し、分析結果が容器の頂点に集めら
れた赤血球の百分率が少なくとも陰性対照反応で
得られた値に等しくなつたとき遠心分離を停止す
る特許請求の範囲第２７項または第２８項のいず
れか一つに記載の方法。 ３０ 分析反応は円錐型底部を有し、頂角120゜
の容器中で行ない、赤血球の懸濁液を抗IgX分
子の溶液とインキユベートしたのち、反応容器を
その円錐型底部の軸に垂直な軸の回りに、加速
200ｇで45秒間回転させて遠心分離を行ない、つ
いで遠心分離の加速を急速に1600ｇに上昇させ、
遠心分離は、同一条件下の対照陰性反応において
容器頂部に集められた赤血球の百分率が少なくと
も陰性反応の識別閾値を定める百分率に等しくな
つたとき最終的に停止させる特許請求の範囲第２
４項記載の方法。 ３１ 分析反応は円錐型底部を有し、頂角120゜
の容器中で行ない、赤血球の懸濁液を抗IgX分
子の容液とインキユベートしたのち、反応容器を
その円錐型底部の軸に垂直な軸の回りに、加速
250ｇで回転させて遠心分離を行ない。遠心分離
は、同一条件下の陰性対照反応において容器頂部
に集められた赤血球の百分率が少なくとも陰性反
応の識別閾値を定める百分率に等しくなつたとき
に停止させる特許請求の範囲第２５項記載の方
法。 ３２ 生物学的メジウム中のウイルス抗原を検出
または同定するための血漿のような生物学的メジ
ウムの分析方法において、免疫化学種類Ｘに属
し、動物種から得られたIg免疫グロブリン（す
なわちIgX免疫グロブリン）を対称軸上に収斂
点を有する容器壁に固定させ；分析すべき生物学
的メジウムのサンプルを、検出すべきウイルス抗
原に対する免疫グロブリンの抗体特異性に応じて
選択したのち、IgXをあらかじめ固定させた細胞
または粒子の懸濁液と容器外でインキユベート
し；インキユベートされた細胞または粒子の懸濁
液を含む反応メジウムと好ましい濃度の抗グロブ
リン（すなわち動物種とは別個の動物種から
得られ、IgXに対する抗体である分子の溶液
（以下、抗IgXと呼ぶ）を上記容器にとり、抗
IgX分子とIgX分子を結合させ、ついでこの
抗IgX分子を介して容器壁と細胞または粒子の
間に分子橋を形成させるような条件下に、上記軸
に平行な遠心力をかけ；遠心分離をIgXで被覆
された容器の円錐壁にすべての細胞を付着させる
ための最初の加速、ついで陰性反応を示す細胞ま
たは粒子があればそれらを解放させるための急速
な停止、その後抗IgX分子によつて形成された
分子橋の破壊により容器壁に付着できなくなつた
細胞または分子を容器の頂点に集めるための第２
の加速を行なう方法を実施するための容器セツト
であつて、各種のまた種々の特異性を有するウイ
ルスまたは細胞抗原または抗体の検出を要する多
量のサンプルについて免疫付着反応を行なうため
に、検出すべき抗原または抗体の種類の数に等し
い種類の容器の多数からなり、容器の各種類ごと
に頂角が異なる円錐型底部を有するようにした円
錐型底部を有する容器のセツト。 ３３ １種類または２種類以上の容器からなり、
各種類の容器の頂角は80，90，100，110，120，
130および140゜のいずれかとした特許請求の範囲
第３２項記載のセツト。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR7805758A FR2418463A1 (fr) | 1978-02-28 | 1978-02-28 | Procede pour le depistage ou l'identification, dans un milieu biologique, d'antigenes viraux, d'antigenes erythrocytaires ou cellulaires ou d'anticorps |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS54126596A JPS54126596A (en) | 1979-10-01 |
| JPS6231299B2 true JPS6231299B2 (ja) | 1987-07-07 |
Family
ID=9205177
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2249579A Granted JPS54126596A (en) | 1978-02-28 | 1979-02-27 | Method of detecting or fixing virus antigen or red blood* bacteria antigen or antigen |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JPS54126596A (ja) |
| CA (1) | CA1113858A (ja) |
| CH (1) | CH643068A5 (ja) |
| DE (1) | DE2907198A1 (ja) |
| FR (1) | FR2418463A1 (ja) |
| GB (1) | GB2015156B (ja) |
| IT (1) | IT1114209B (ja) |
| NL (1) | NL7901536A (ja) |
| SE (1) | SE447933B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| IN154925B (ja) * | 1979-10-26 | 1984-12-22 | Guigan Jean | |
| DE3172879D1 (en) * | 1980-05-22 | 1985-12-19 | Pasteur Institut | Coupled product between a lectin and a specific ligand, obtention and use in the biological field |
| DE3048884A1 (de) * | 1980-12-23 | 1982-07-15 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur enzymimmunobestimmung in heterogener phase |
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| DE3175955D1 (en) * | 1981-02-19 | 1987-04-09 | Hoffmann La Roche | Process for the deternination of antigens or antibodies |
| US4360360A (en) * | 1981-04-02 | 1982-11-23 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Centrifugal analyzer |
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| SE8203909L (sv) * | 1982-06-23 | 1983-12-24 | Britta Wahren | Bestemning av virus kenslighet for antivirala medel |
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