JPS62283986A - リン脂質及びリン脂質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 （産業上の利用分野〕 本発明はリン脂質及びリン脂質の製造方法に係り、更に
詳しくはアミノ酸残基で修飾され友リン脂質及びリン脂
質の製造方法に関する。

（従来の技術〕 近年、リポソームやラングミュア・プロジェット（ＬＢ
）膜形成技術により、各種の脂質構造物を容易に形成さ
せることができるようになつ之。官能性の脂質を用いて
脂質構造物上に種々の化合物を共有結合で固定化するこ
とも可能である。

（発明が解決しようとする問題点） しかし、これらの脂質構造物上に直接酵素、抗体のタン
パク質を固定化すると、基板等による立体障害で酵素及
び抗体の活性が著しく阻害されることが本発明者らの研
究により明らかになっ友。

生理活性物質の分離精製手段の一つであるアフィニティ
クロマトグラフィーでは、酵素等の生理活性物質とアガ
ロース等の担体の間に適当な鎖長を持つ分子鎖を導入す
ると分離精製能が著しく向上することが知られている。

これは、担体による立体障害を回避するからでちると言
われている。

アフィニティクロマトグラフィーの例と同様に。

脂質分子に鎖状分子を導入するこ、とにより、脂質構造
物においても前述の立体障害が緩和されるものと推定さ
れる。しかしながら、鎖状分子を導入し之脂質は未だ合
戊例が報告されていない。そこで本発明者はペプチド合
成の技術を足掛りに適当な鎖長を有する分子を導入し九
脂質を合成することを試みた。

ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰ
ＰＥ）のようなアミノ基を有するリン脂質は、ジシクロ
へキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のような縮合剤を用
いてアミノ酸と反応し、適当なアミノ酸残基を導入する
ことができる。この際にアミノ酸のアミノ基を保獲する
必要があるが。

ＤＰＰＥと反応し−ｐＢｏｃアミノ酸は通常の除去条件
では定量的に除去することは困難であり几。すなわち、
ＨＢｒ／酢ｆｉ　＋ＨＦのように強力な除去剤ではＢｏ
ｃ基除去に伴いＤＰＰＨの急速な分解が起き。

一方ギ酸のように弱い除去剤の場合には長時間反応させ
ても全くＢＯＣ基は除去されなかっ九〇本発明は以上の
ような問題点に鑑みなされｔものであり、アミノ酸残基
で修飾されｐ　ＩＪン脂質及びリン脂質の製造方法を提
供することを目的とする。

〔発明の構成〕

（問題点を解決する之めの手段と作用〕まず、窟−の発
明は次式（Ａ） （式中Ｒは炭素数１〜２０の置換基を有してもよいアル
キレン基〕 で表わされるリン脂質である。

式中孔の炭素数１〜２０の置換基を有してもよいアルキ
レン基とは、メチレン、エチリン！プロピレン、イソプ
ロピレン、ブチレン、イソブチレン、ｔ−ブチレン、ヘ
キシレン、ヘプチリン、オクチレン、ノニレン、デシリ
ン、ウンデシレン、ドデシレン、トリデシリン、テトラ
デシレン、ペンレン　　　　　　　　　リン タデシ々、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシリ
ン、ノナデシレン、エイコシレンなどを意味する。

本発明のリン脂質は、ＬＢ映あるいはリポソーム等の脂
質構造物の材料として便用することができる。本発明の
リン脂質により作製し次ＬＢ襖あるいはリポソームでは
、酵素あるいに抗体等のタンパク質を固定化しｔ際、立
体障害により＃素あるいは抗体の活性が損なわｎること
〃Ｓ７！い。

本発明のリン脂質をリポソーム免疫分針用試薬の構造材
料として便粗しｔ列について説明する。

本発明のリン脂質と必要であｎば他の脂質及びコレステ
ロールをフラスコに入れ唇媒を加えて反応させる。反応
後溶媒を留去し、吸引乾燥する。しかる後、壁面に薄膜
が形成され之フラスコ内に所定の傾識物質の水溶液を加
え、密栓をして振とうし、リポソームの懸濁敢を得る。

一方、リポソームに固定化すべき抗原又は抗体に必要で
あれば架ａＳを導入する。以上のようにして得られｔリ
ポソームと抗原又は抗体とを緩衝液中で反応せしめるこ
とにより、リポソーム免疫５）折用試薬が得られる。

窮２の発明は、アミノ基を肩するリン脂′ぼとＢｏｃ基
でアミノ基が保護され九アミノ酸を縮合剤と共に反応さ
せることによりアミノ基を有するリン脂質のアミノ末端
にアミノ酸を導入する第１の工程と、第１の工程で得ら
れ７？：ＢＯＣ−アミノ酸−１３ン脂質と強酸／有機酸
混合系とを反応させることによりＢＯＣ−アミノ酸−リ
ン脂質からＢｏｃ基を除去する第２の工程とを具備する
ことを特徴とするリン脂質の製造方法である。

本発明をさらに説明すると、ジパルミトイルホスファチ
ジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）のようなアミン基を
育するリン脂質とジシクロへキシルカルボジイミド（Ｄ
ＣＣ）のような縮合剤、さらにｔ−ブチルオキシカルボ
ニル（Ｂｏｃ）基でアミノ基が保護されたアミノ酸とを
反応させることにより、アミノ基を有するリン脂質のア
ミノ末端にアミノ酸残基を導入するのが第１の工程であ
る。このようにして得られ−ｐ　Ｂ　ｏ　ｃ−アミノ酸
−リン脂質と強酸と有機酸の混合物とを反応させること
によりＢＯＣ−アミノ酸−りン脂質からＢｏｃ基を除去
し、目的とするアミノ酸で修飾され１ｐ　１３ン脂質を
を得るのが第２の工程である。

本発明で用いられるアミノ酸は格別に限定されるもので
はないが、アミノ基とカルボキシル基が炭素鎖の両端に
位置している奪−アミノ酸であることが好ましい。さら
に、モノアミノモノカルボン酸であることが好ましい。

本発明で用いられる縮合剤としては一般のペプチド合底
に用いられる縮合剤であれば何であって等が挙げられる
。本発明で用いられる強酸と有機酸の混合物は格別に限
定されるものではなく、　ｆた、その混合割合（強酸の
濃度）も用いる強酸あるいは有機酸の種類により適宜決
定される。塩酸とギ酸の混合物あるいは塩酸と酢酸の混
合物の場合には塩酸の濃度が０．０１〜３Ｍが適当であ
る。０，０１Ｍ以下の場合にはＢＯＣ基が除去されず、
３Ｍ以上の場合にはＢＯＣ基の除去に伴いＤＰＰＥの急
速な分解が起きる。

アミノ酸残基を導入する第１の工程とＢＯＣ基をはずす
第２の工程は繰返し行なうことができる。

この場合、希望する長さのペプチド鎖を有するリン脂質
を台底することができる。

また５本発明はリン脂質に限らずアミノ基を有する脂質
すべてに適用することが可能である。

（実施例） 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

実施例１ α、β−ジパルミトイルーｒ−フオスファチジル−（ε
−アミノカプロイル〕エエタールアミン（ＮＨ，−Ｃ，
Ｈ，ｆｆ１−ＤＰＰＥ）の合成（１）試薬 ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰ
ＰＢ）はシグマ社、ＢｏＣ−６−了ミノカプロン酸（Ｂ
ｏｃ−Ｃａｐ）はフルカ社よりそれぞれ購入し念。他の
試薬は市販品（特級）を端整せ伊に使用した。なお、水
は全てイオン交換水を用い念。

（２）合成法 ７０ｍＩＩＤＰＰＢを５０ｍノクロロホルム／メタノー
ル（１０／１）に溶解し、５ＱｒｒｌＢＯｃ−Ｃａｐ、
１５０ｍｊ’ジカルボキシカルボジイミド、１５０ｍｊ
＋ヒドロキシサクシンイミド及び５０μｌトリエチルア
ミンを添加し７を後、室温で２時間攪拌する。ロータリ
ーエバポレータで溶媒を除去し３０ｍＪクロロクロロホ
ルム／メタノー／ｌ／１）に再溶解してＩＱｍ１１０％
クエン酸でトリエチルアミンを抽出する。クロロホルム
層を回収し、溶媒除去後酢酸エチルを加え。

生じた尿素誘導体を口過して除く。溶媒を除去し１ｍｊ
のクロロホルムに溶解し之ものをシリカゲルカラム（φ
ＩＸ３０Ｃｍ）にチャージし、クロロホルム／メタノー
ル（１００１０〜５０のグラディエ／ト）で溶出する。

クロロホルム／メタノール（１０Ｑ／ｓ〜ｌｏ）分画を
回収し、ＢｏＣ−Ｃａｐ−ＤＰＰＥｔ−得た（収率的ｓ
　Ｏ％　）。次いで、Ｂｏｃ−Ｃａｐ−ＤＰＰＥを２ｍ
ｌ　　のＩＭ塩ｒＲ／酢酸に溶解し％室温で３時間放置
後、ロータリーエバポレータ及び真空ポンプを用い塩酸
／酢酸を除去する。１ｍｊのクロロホルムに溶解し、再
びシリカゲルカラムで清製丁製する。薄層クロマトグラ
フィーでニンヒドリン及びリン染色に陽性な分画のみを
回収する（収率二約７０　％　）　、ＮＭＲＫ　より　
Ｃａｐ−ＤＰＰＥであることを７４認し之。ＮＨ，−Ｃ
，Ｈ，、−ＤＰＰＥのＨｌ　−ＮＭＲ。

スペクトルを第１図に示す。

実施例２ （１２−アミノドデカノイル）−ＤＰＰｇ（ＮＨ，−Ｃ
，、Ｈ，、−ＤＰＰＥ）の合成 Ｉｌ）試薬 Ｂｏｃ−ＯＮ（２−（ｔ−ブチロキシカルボニル−オキ
シイミノツー２−フェニルアセトニトリル）はペプチド
研究所、１２−アミノドデカン酸はアルドリッチ社より
購入し友。

ｆ２）Ｂｏｃ−１２−アミノドデカン酸の合成２．２ｇ
１２−アミノドデカン酸を２．１ｍｌのトリエチルアミ
ン及び６ｍｌの水に懸濁させる。これに２．７１　Ｂｏ
ｃ−ＯＮ／１０ｍ１ジオキサンヲ添加し、室呂で３時間
撹拌する。２ｆｆｌ＠度まで濃縮し念後、８０ｍ１の酢
酸エチルを加え、１０％クエン酸で２回洗浄しトリエチ
ルアミノを除去する。

飽和食塩水で２度洗浄し１Ｌ硫酸す）　＋１ウム憔水〕
で脱水する。口過後、酢酸エチルを除去し石油エーテル
を加え結晶化させる（収率：９８％〕。

ｆ３１　ＮＨｌ　−ＣｕすＰＰＥの合成実施ｆ１１１と
同様にしてＢｏｃ−Ｃ，ｆｆ１−ＤＰＰＥを調整した。

これに２ｍ１０．１Ｍ塩酸／酢酸を加えｆ＠解し、室温
で５時間放置する。実施例１と同様にしてシリカゲルカ
ラムを用いてＭ製し九（収率：６０チ）、実施例１と同
様にしてＮＭＲによりＮＨ，−Ｃ，、Ｈ，、−Ｄ　Ｐ　
Ｐ　Ｅであルコトヲ確ＨＬ／　’ｆｔ、、　ｏ　Ｂ　ｏ
Ｃ−ＣＩ！Ｈｔｓ及びＢｏ　ｃ　−Ｃ，、Ｈ，、−Ｄ　
Ｐ　Ｐ　ＥとＮＨｌ　−ＣＩ！Ｈ！４−ＤＰＰＥのＨｌ
−ＮＭＲスペクトルを第２図及び第３図に示す。

比較例１ 実施例１において、０．０５Ｍ塩酸／酢酸を用いた場合
、３０℃２４時間後も殆どＢｏｃ等は除去されなかつｔ
、ま几、３Ｍ塩酸／酢酸を使用すると。

室＠１時間で反応は完了するが、ＤＰＰＥ側のエステル
結合も分断されることが明らかになっ之。

比較例２ 実施ｆｌＪ２で０．０１Ｍ塩酸／酢酸を便用すると、３
０”Ｃ２４時間で２５チ程度Ｂｏａ基が除去された。

１００％酢酸及びギ酸では殆ど除去されなかっｔｏ〔発
明の効果〕 本を明によれば新規なリン脂質及びリン脂質の製造方法
′ｆｃ提供することができる。

【図面の簡単な説明】

π１図に本発明の一実施例であるＮＨ，−Ｃ，Ｈ，−Ｄ
ＰＰＥのＨ’−ＮＭＲスペクトルを表わす図、第２図は
Ｂｏｃ−Ｃ□Ｈ０の）ｌ’−ＮＭＲスペクトル、第３図
はＢＯｃ−Ｃ，、Ｈ，、−ＤＰＰＥと本発明の一実施例
であるＮＨ，−Ｃ□Ｈ，、−ＤＰＰＥのＨｌ−ＮＭＲス
ペクトルを表わす図である。 代理人　弁理士　　　則　近　憲　右 同　　　　　竹　花　喜久男 υ　工

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）次式（Ａ） （Ａ）▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒは炭素数１〜２０の置換基を有してもよいアル
   キレン基） で表わされることを特徴とするリン脂質。
2. （２）アミノ基を有するリン脂質とＢｏｃ基でアミノ基
   が保護されたアミノ酸を縮合剤と共に反応させることに
   よりアミノ基を有するリン脂質のアミノ末端にアミノ酸
   を導入する第１の工程と、第１の工程で得られたＢｏｃ
   −アミノ酸−リン脂質と強酸と有機酸の混合物とを反応
   させることによりＢｏｃ−アミノ酸−リン脂質からＢｏ
   ｃ基を除去する第２の工程とを具備することを特徴とす
   るリン脂質の製造方法。
3. （３）前記強酸と有機酸の混合物が濃度０．０１〜３Ｍ
   の塩酸とギ酸もしくは酢酸の混合系であることを特徴と
   する特許請求の範囲第２項記載のリン脂質の製造方法。