JPS6227663A - 細胞内の物質、微細生物の測定法 - Google Patents
細胞内の物質、微細生物の測定法Info
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- JPS6227663A JPS6227663A JP60166004A JP16600485A JPS6227663A JP S6227663 A JPS6227663 A JP S6227663A JP 60166004 A JP60166004 A JP 60166004A JP 16600485 A JP16600485 A JP 16600485A JP S6227663 A JPS6227663 A JP S6227663A
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- cells
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は細胞内や細胞表面に産生または発現している物
質、微細生物をそのまま迅速に測定するための新規な方
法に関する。
質、微細生物をそのまま迅速に測定するための新規な方
法に関する。
本発明においては、補体結合性抗体と標識補体を用いれ
ば、細胞内や細胞表面に産生または発現している物質や
微細生物をそのまま迅速に測定できることを見出したも
のである。
ば、細胞内や細胞表面に産生または発現している物質や
微細生物をそのまま迅速に測定できることを見出したも
のである。
本発明でいう細胞とは、動物細胞、植物細胞、融合等の
処理細胞、酵母、細菌、原虫等の細胞、これらの遺伝子
操作等の処理細胞等で、あらゆる細胞を包含するもので
ある。
処理細胞、酵母、細菌、原虫等の細胞、これらの遺伝子
操作等の処理細胞等で、あらゆる細胞を包含するもので
ある。
また、本発明における物質としては、細胞の生産する細
胞表面抗原（例えば、アシアロＧＭ１、Ｔ抗原、Ｌｙ抗
原）、細胞内酵素（例えば、ＴｄＴ、ＧＴＰ、ＬＤＨ）
、分泌性物質（例えば、ＣＥＡ、ＡＦＰ、イムノグロブ
リン）などがあり、また、酵母、細菌等の生産する酵素
、ペプチド性物質などがあげられる。
胞表面抗原（例えば、アシアロＧＭ１、Ｔ抗原、Ｌｙ抗
原）、細胞内酵素（例えば、ＴｄＴ、ＧＴＰ、ＬＤＨ）
、分泌性物質（例えば、ＣＥＡ、ＡＦＰ、イムノグロブ
リン）などがあり、また、酵母、細菌等の生産する酵素
、ペプチド性物質などがあげられる。
また、本発明における微細生物としては、培養細胞に感
染するすべてのウィルス、リケッチア−。
染するすべてのウィルス、リケッチア−。
クラミジアなどがある。
また、測定に用いる補体結合性抗体としては、当該物質
、微細生物で免疫し、これから分層した抗血清を用いれ
ばよく、また抗血清からＮ製した抗体、モノクローナル
抗体、自然免疫血清等を用いてもよい。
、微細生物で免疫し、これから分層した抗血清を用いれ
ばよく、また抗血清からＮ製した抗体、モノクローナル
抗体、自然免疫血清等を用いてもよい。
また、標識補体としては、補体Ｃ１ｑ成分の。
免疫グロブリンに対して結合活性を有する部位以外の部
位に各種標識を結合させた結合物であるのが好ましい。
位に各種標識を結合させた結合物であるのが好ましい。
ここでは、補体Ｃ１ｑ分子上の、イムノグロブリンに対
する結合活性を担う部位に全く影響を及ぼさない部位に
Ｓ−８結合が９個存在することに着目される。この部位
のＳ−８結合はＣｌｑ分子を構成するＡ鎖、Ｂ鎖、Ｃ鎖
のＮ末端より４個目のシスティン残基により形成されて
おり、還元剤の攻撃を受けやすく、かつまた物質を結合
し易い位置にある。そこで還元剤によりＳ−８結合を開
裂させ、この部位のＳＨ基を露出させた還元Ｃ１ｑを先
ず作製し、次いで、ＳＲ基と反応する活性基を導入した
物質を作製し、還元Ｃ１ｑと反応させてＣ１ｃｌと物質
の結合物を得るのが好ましい。
する結合活性を担う部位に全く影響を及ぼさない部位に
Ｓ−８結合が９個存在することに着目される。この部位
のＳ−８結合はＣｌｑ分子を構成するＡ鎖、Ｂ鎖、Ｃ鎖
のＮ末端より４個目のシスティン残基により形成されて
おり、還元剤の攻撃を受けやすく、かつまた物質を結合
し易い位置にある。そこで還元剤によりＳ−８結合を開
裂させ、この部位のＳＨ基を露出させた還元Ｃ１ｑを先
ず作製し、次いで、ＳＲ基と反応する活性基を導入した
物質を作製し、還元Ｃ１ｑと反応させてＣ１ｃｌと物質
の結合物を得るのが好ましい。
さらに詳しくは、補体Ｃ１ｑ成分としてはヤギ。
ウサギ、モルモット、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ。
マウス、ヒト等種々の動物由来のもので良く、常法の精
製操作（日本免疫学会；免疫実験操作法Ｂ、ｐ、１３７
６〜１３８０．１９７４）に従ってＣ１（Ｉ成分に富む
画分を採取すれば良い。次にＣ１ｑをＣ１ｑが安定的に
存在し得る緩衝液、例えば１０％庶糖、 １Ｍ食塩、５
ｍＭエチレンジアミン４酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）を
含むトリス緩衝液に溶解し、Ｓ−８結合の還元を行なう
。用いる還元剤としてはメルカプトエチルアミン、ヂチ
オスレイトール、２メルカプトエタノール、システィン
等、通常のもので良く、反応条件もＣ１ｑが変性を起こ
さない適当な条件を選択すれば良い。得られた還元Ｃ１
ｑは透析、塩析、ゲルろ過等で余剰の還元剤を除き、か
つ緩衝液の組成をＰＨ５，５〜６．５でＥＤＴＡを含む
緩衝液に交換して置く。この緩衝液の組成は使用する架
橋剤の性質によって適宜改変するべきものである。一方
、Ｃ１ｑに結合させるべき物質として例えば西洋ワサビ
由来のペルオキシダーゼをとり。
製操作（日本免疫学会；免疫実験操作法Ｂ、ｐ、１３７
６〜１３８０．１９７４）に従ってＣ１（Ｉ成分に富む
画分を採取すれば良い。次にＣ１ｑをＣ１ｑが安定的に
存在し得る緩衝液、例えば１０％庶糖、 １Ｍ食塩、５
ｍＭエチレンジアミン４酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）を
含むトリス緩衝液に溶解し、Ｓ−８結合の還元を行なう
。用いる還元剤としてはメルカプトエチルアミン、ヂチ
オスレイトール、２メルカプトエタノール、システィン
等、通常のもので良く、反応条件もＣ１ｑが変性を起こ
さない適当な条件を選択すれば良い。得られた還元Ｃ１
ｑは透析、塩析、ゲルろ過等で余剰の還元剤を除き、か
つ緩衝液の組成をＰＨ５，５〜６．５でＥＤＴＡを含む
緩衝液に交換して置く。この緩衝液の組成は使用する架
橋剤の性質によって適宜改変するべきものである。一方
、Ｃ１ｑに結合させるべき物質として例えば西洋ワサビ
由来のペルオキシダーゼをとり。
架橋剤としてＮ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチ
ル）マレイミドのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル（ＣＨＭ）をとった場合、この両者をｐＨ６，５〜７
．５でＥＤＴＡを含む緩衝液に溶解し、３０℃で１時間
反応させる。この条件は使用する架橋剤の性質によって
適当な条件を選択する。架橋剤としてはＣＨＭの他にｍ
−マレイミド安息香酸、Ｎ−（４−カルボキシフェニル
メチル）マレイミド、マレイミド酢酸等のＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルを使用し得る。この反応によ
ってマレイミド基を有するペルオキシダーゼが得られる
。
ル）マレイミドのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル（ＣＨＭ）をとった場合、この両者をｐＨ６，５〜７
．５でＥＤＴＡを含む緩衝液に溶解し、３０℃で１時間
反応させる。この条件は使用する架橋剤の性質によって
適当な条件を選択する。架橋剤としてはＣＨＭの他にｍ
−マレイミド安息香酸、Ｎ−（４−カルボキシフェニル
メチル）マレイミド、マレイミド酢酸等のＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルを使用し得る。この反応によ
ってマレイミド基を有するペルオキシダーゼが得られる
。
得られたマレイミド化ペルオキシダーゼと還元Ｃ１ｑを
混合し、ｐＨ５，５〜６．５でＥＤＴＡを含む緩衝液中
、４°Ｃで２０時間保持することによって、補体Ｃ１ｑ
のペルオキシダーゼ結合物が得られる。
混合し、ｐＨ５，５〜６．５でＥＤＴＡを含む緩衝液中
、４°Ｃで２０時間保持することによって、補体Ｃ１ｑ
のペルオキシダーゼ結合物が得られる。
最後にゲルろ過によってペルオキシダーゼとＣｌｑ両方
の活性を持つペルオキシダーゼ標識Ｃ１ｑ画分を採取す
る。このようにして得られたペルオキシダーゼ標識Ｃ１
（Ｉは、Ｃ１ｑが本来有している免疫グロブリンに対す
る結合活性を完全に保持しているものである。
の活性を持つペルオキシダーゼ標識Ｃ１ｑ画分を採取す
る。このようにして得られたペルオキシダーゼ標識Ｃ１
（Ｉは、Ｃ１ｑが本来有している免疫グロブリンに対す
る結合活性を完全に保持しているものである。
測定に際しては、物質、微細生物を産生又は発現してい
る細胞をマイクロプレートにて培養又は固着させ、これ
に補体結合性抗体と標識補体を反応させた後、結合した
標識補体の量を発色等によって測定し、物質、微細生物
の量を知るのである。
る細胞をマイクロプレートにて培養又は固着させ、これ
に補体結合性抗体と標識補体を反応させた後、結合した
標識補体の量を発色等によって測定し、物質、微細生物
の量を知るのである。
次に本発明の製造例及び実施例を示す。
製造例
ヤギ精製Ｃ１ｑ３０■を、０．０５Ｍ トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン、１Ｍ塩化ナトリウム、０．
００５Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ及び１０％スクロースを含
む水溶液（ｐＨ７，４） １０ｍ１に溶解する。これに
０．１Ｍジチオスレイトール溶液０．１ ｍｌを加え、
室温下、１時間放置し１反応させる。次に反応液をセフ
ァデックスＧ−２５カラムに通し、蛋白質画分を回収す
る。
キシメチル）アミノメタン、１Ｍ塩化ナトリウム、０．
００５Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ及び１０％スクロースを含
む水溶液（ｐＨ７，４） １０ｍ１に溶解する。これに
０．１Ｍジチオスレイトール溶液０．１ ｍｌを加え、
室温下、１時間放置し１反応させる。次に反応液をセフ
ァデックスＧ−２５カラムに通し、蛋白質画分を回収す
る。
この蛋白質画分を限外ろ過で約１０ｍ１まで濃縮し、還
元型補体Ｃ１ｑ３０■を得る６次に西洋山葵由来のペル
オキシダーゼ２０■を、燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）６ｍ
ｌに溶解し、ジメチルホルムアミド４ｍｌを加える。更
に、２％４−〔マレイミドメチルコシクロヘキサン１−
カルボキシリック酸すクシンイミドエステル（ＣＨＭ）
のヂメチルホルマミド溶液０．２ｍｌを加え、室温で１
時間静置し、反応させる。この反応液をセファデックス
Ｇ−２５カラムに通し、ＣＨＭ結合ペルオキシダーゼ２
０■を回収する。還元型補体Ｃ１（１３０■とＣＨＭ結
合ペルオキシダーゼ２０■を混合し、４℃で１５時間静
置し、セファロース６Ｂカラムにより１分子量４０万〜
８０万両分を回収し、ペルオキシダーゼ標識補体Ｃ１ｑ
４０■を得た。
元型補体Ｃ１ｑ３０■を得る６次に西洋山葵由来のペル
オキシダーゼ２０■を、燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）６ｍ
ｌに溶解し、ジメチルホルムアミド４ｍｌを加える。更
に、２％４−〔マレイミドメチルコシクロヘキサン１−
カルボキシリック酸すクシンイミドエステル（ＣＨＭ）
のヂメチルホルマミド溶液０．２ｍｌを加え、室温で１
時間静置し、反応させる。この反応液をセファデックス
Ｇ−２５カラムに通し、ＣＨＭ結合ペルオキシダーゼ２
０■を回収する。還元型補体Ｃ１（１３０■とＣＨＭ結
合ペルオキシダーゼ２０■を混合し、４℃で１５時間静
置し、セファロース６Ｂカラムにより１分子量４０万〜
８０万両分を回収し、ペルオキシダーゼ標識補体Ｃ１ｑ
４０■を得た。
実施例１゜
Ｈ５Ｖ （単純性庖疹ウィルス）感染症の病巣部（陰部
又は口唇）より検体を採取し、抗生物質を含む培養液１
ｍｌに懸濁した。その０．１ ｍｌを予めベロー（Ｖｅ
ｒｏ）細胞を培養しておいたマイクロプレートの２つの
ウェルに接種し、３７℃で２２時間培養した。
又は口唇）より検体を採取し、抗生物質を含む培養液１
ｍｌに懸濁した。その０．１ ｍｌを予めベロー（Ｖｅ
ｒｏ）細胞を培養しておいたマイクロプレートの２つの
ウェルに接種し、３７℃で２２時間培養した。
培養後細胞を３％過酸化水素−メタノールで固定し、ゼ
ラチン−ベローナール緩衝液（ｐＨ７，４）で２５倍に
希釈したヒト血清（抗Ｈ３Ｖ補体結合価（ＣＦ価）３２
または４以下）５０μｍを２つのウェルのうち１つずつ
に入れ、更に同緩衝液に溶解した９０゜ｎｇのペルオキ
シダーゼ標１１ｃ１ｑ５０μｍを両ウェルに加えた。室
温で２時間反応させた後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含む燐酸緩衝液で３回洗い。
ラチン−ベローナール緩衝液（ｐＨ７，４）で２５倍に
希釈したヒト血清（抗Ｈ３Ｖ補体結合価（ＣＦ価）３２
または４以下）５０μｍを２つのウェルのうち１つずつ
に入れ、更に同緩衝液に溶解した９０゜ｎｇのペルオキ
シダーゼ標１１ｃ１ｑ５０μｍを両ウェルに加えた。室
温で２時間反応させた後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含む燐酸緩衝液で３回洗い。
過酸化水素−ＡＢＴＳ溶液（ｐＨ４）を０．１ｍｌ／ウ
ェル加え、１時装置いて発色させ、０．０１％アジ化ナ
トリウム溶液０．１ｍｌで反応を停止し４１４ｒ＋ｍに
おける吸光度を測定した。ＣＦ価３２のヒト血清を入れ
たウェルの吸光度は０．２６３、ＣＦ価４以下の血清を
入れたウェルでは０．０８９を示した。この結果より検
体中にはＨ５Ｖピリオンが存在していたことが確認でき
た。
ェル加え、１時装置いて発色させ、０．０１％アジ化ナ
トリウム溶液０．１ｍｌで反応を停止し４１４ｒ＋ｍに
おける吸光度を測定した。ＣＦ価３２のヒト血清を入れ
たウェルの吸光度は０．２６３、ＣＦ価４以下の血清を
入れたウェルでは０．０８９を示した。この結果より検
体中にはＨ５Ｖピリオンが存在していたことが確認でき
た。
実施例２゜
ＣＥＡ （カルシノエンプリョニツク アンチゲン）産
生細胞のクローニングを目的とし、すい癌由来ＣＥＡ産
生細胞Ｔ ３ Ｍ−４を限界希釈（１ｃｅｌｌ／１ｉｅ
ｌｌ） Ｌ、、 、 ９６ウエルマイクロプレートで１
６日間培養を行なった。培養液を除き、トリプシン−Ｅ
ＤＴＡを各ウェル０．１ ｍｌ入れ、細胞を浮遊させた
後に、新鮮な培養液０．２ ｍｌ／ウェルを予め満たし
ておいたプレート２枚に、細胞浮遊液を２０μｍ／ウェ
ルとなるようにレプリカし、さらに４日間培養を行なっ
た。レプリカの一方の培養液を捨て、３％Ｈ２０□−メ
タノールで細胞を固定し、ウサギ抗ＣＥＡ抗血清の１／
４００ＧＶＢ希釈液０．１ ｍｌと１１０ｎｇ１０゜１
ｍ１／νａｌｌのペルオキシダーゼ標識Ｃ１ｑを加え。
生細胞のクローニングを目的とし、すい癌由来ＣＥＡ産
生細胞Ｔ ３ Ｍ−４を限界希釈（１ｃｅｌｌ／１ｉｅ
ｌｌ） Ｌ、、 、 ９６ウエルマイクロプレートで１
６日間培養を行なった。培養液を除き、トリプシン−Ｅ
ＤＴＡを各ウェル０．１ ｍｌ入れ、細胞を浮遊させた
後に、新鮮な培養液０．２ ｍｌ／ウェルを予め満たし
ておいたプレート２枚に、細胞浮遊液を２０μｍ／ウェ
ルとなるようにレプリカし、さらに４日間培養を行なっ
た。レプリカの一方の培養液を捨て、３％Ｈ２０□−メ
タノールで細胞を固定し、ウサギ抗ＣＥＡ抗血清の１／
４００ＧＶＢ希釈液０．１ ｍｌと１１０ｎｇ１０゜１
ｍ１／νａｌｌのペルオキシダーゼ標識Ｃ１ｑを加え。
室温で２時間反応させ、洗浄後、ＡＢＴＳ（（２゜２−
アジ）−ジー〔３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸
〕２アンモニウム塩）基質溶液を加えて発色させた。各
ウェルの０Ｄ４１４は０．１２７〜０．３８６の範囲と
なった。最高の○Ｄ４１４を与えたウェルの細胞を、も
う一方のレプリカより拾い、エキスバンドを行なった。
アジ）−ジー〔３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸
〕２アンモニウム塩）基質溶液を加えて発色させた。各
ウェルの０Ｄ４１４は０．１２７〜０．３８６の範囲と
なった。最高の○Ｄ４１４を与えたウェルの細胞を、も
う一方のレプリカより拾い、エキスバンドを行なった。
実施例３゜
精製α−フェトプロティン１００μｇ（０，１ｍ１）と
フロイント・コンプリート・アジュバント（Ｆｒｅｕｎ
ｄｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ） ０．１ｍｌ
を混合し、７週令のＢａ１ｂ／Ｃマウス腹腔内に投与し
た。投与後２８日目にＡ Ｆ Ｐ （ａ−フェトプロテ
ィン） １００μｇ （０，３ｍ１）を腹腔内に投与し
、さらに３日後に牌細胞をとり出し、Ｎ５−１細胞と融
合させた。細胞を９６ウエルプレートにＩ ＸＩＯ’／
ｍｌの濃度で播き、融合後１日日〜１６日目までＨＡＴ
培地による選択を行い、１７日目に各培養上清の抗体活
性を調べた結果、６４／９４８のウェルで抗体産生が認
められ、２ウエルで抗ＡＦＰ抗体の産生が認められた。
フロイント・コンプリート・アジュバント（Ｆｒｅｕｎ
ｄｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ） ０．１ｍｌ
を混合し、７週令のＢａ１ｂ／Ｃマウス腹腔内に投与し
た。投与後２８日目にＡ Ｆ Ｐ （ａ−フェトプロテ
ィン） １００μｇ （０，３ｍ１）を腹腔内に投与し
、さらに３日後に牌細胞をとり出し、Ｎ５−１細胞と融
合させた。細胞を９６ウエルプレートにＩ ＸＩＯ’／
ｍｌの濃度で播き、融合後１日日〜１６日目までＨＡＴ
培地による選択を行い、１７日目に各培養上清の抗体活
性を調べた結果、６４／９４８のウェルで抗体産生が認
められ、２ウエルで抗ＡＦＰ抗体の産生が認められた。
これらのウェルの細胞を塗抹標本とし３％Ｈ２Ｏ２−メ
タノールで処理して固定し、 ２００倍希釈のヤギ抗マ
ウスＩｇＧ（γ鎖特異的）２０μｍとペルオキシダーゼ
標識Ｃ１ｑ １８ｎｇ／２０μｍを加え、２時間静置し
た。よく洗浄した後にジアミノベンジジン溶液で発色さ
せ、ＩｇＧ産生細胞を数えたところ６２％および９１％
の陽性率が得られた。
タノールで処理して固定し、 ２００倍希釈のヤギ抗マ
ウスＩｇＧ（γ鎖特異的）２０μｍとペルオキシダーゼ
標識Ｃ１ｑ １８ｎｇ／２０μｍを加え、２時間静置し
た。よく洗浄した後にジアミノベンジジン溶液で発色さ
せ、ＩｇＧ産生細胞を数えたところ６２％および９１％
の陽性率が得られた。
Claims (2)
- （１）細胞内や細胞表面に産生または発現している物質
、微細生物を、当該物質、微細生物に対する補体結合性
抗体と標識補体を用いて測定することを特徴とする細胞
内の物質、微細生物の測定法。 - （２）標識補体が補体Ｃ１ｑ成分の、免疫グロブリンに
対して結合活性を有する部位以外の部位に標識物質を結
合した結合物である特許請求の範囲第１項記載の細胞内
の物質、微細生物の測定法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60166004A JPS6227663A (ja) | 1985-07-29 | 1985-07-29 | 細胞内の物質、微細生物の測定法 |
| DK445585A DK445585A (da) | 1984-10-02 | 1985-10-01 | Stof-konjugeret komplementkomponent clq |
| CA000491980A CA1276103C (en) | 1984-10-02 | 1985-10-01 | Substance-conjugated complement component c1q |
| EP85112428A EP0177023A3 (en) | 1984-10-02 | 1985-10-01 | Substance-conjugated complement component c1q |
| KR1019850007264A KR890001538B1 (ko) | 1984-10-02 | 1985-10-02 | 세포기능 조절물질 등을 결합시킨 보체성분 Clq의 제조법 및 이 보체성분 Clq을 사용하는 측정법 |
| US07/032,025 US4882423A (en) | 1984-10-02 | 1987-03-30 | Substance-conjugated complement component C1q |
| US07/355,196 US5035995A (en) | 1984-10-02 | 1989-05-22 | Test method involving substance-conjugated complement component C1q |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60166004A JPS6227663A (ja) | 1985-07-29 | 1985-07-29 | 細胞内の物質、微細生物の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6227663A true JPS6227663A (ja) | 1987-02-05 |
Family
ID=15823096
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60166004A Pending JPS6227663A (ja) | 1984-10-02 | 1985-07-29 | 細胞内の物質、微細生物の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6227663A (ja) |
-
1985
- 1985-07-29 JP JP60166004A patent/JPS6227663A/ja active Pending
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