JPS62272998A - アスパラギン酸アミノトランスフエラ−ゼアイソザイムの分別定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 良匪囚立野 本発明は臨床検査において有用な、血清中のアスパラギ
ン酸アミノトランスフェラーゼ（系統名Ｌ　−ＡＳｐａ
ｒｔａｔｅ：２−ＯＸＯｇｌｕｔ２−０ＸＯａｍｉｎｏ
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＥＣ２，６，１，１，）、同
義語Ｇ　ｌｕｔａｍｉｃＯｘａｌｏａｃｅｔｉｃ　　Ｔ
ｒａｎｓａｍｉｒａｓｅ　　（ＧＯＴ）、以下、ＡＳＴ
と称す）ａ１アイソザイムの分別定量法に関し、さらに
詳しくは、特定の阻害剤の存在下に検体血清を特定の基
質と反応させ、得られた生成物を測定することによりミ
トコンドリア性ＡＳＴを分別定量する方法に関する。

発明の背景 ＡＳＴは、哺乳動物のほとんど全ての臓器に存在してお
り、細胞質に局在する分画である細胞質性ＡＳＴ（以下
、ｓ−Ａ　Ｓ　Ｔと称す）とミトコンドリアに局在する
分画であるミトコンドリア性ＡＳＴ（以下、ｍ−Ａ　Ｓ
　Ｔと称す）の２種類のアイソザイムがあり、検体、特
に血清中の総ＡＳＴＩ、ｓ−Ａ　ＳＴ量、ｍ−ＡＳＴ量
の定量はいずれら臨床診断を行なう上で非常に有用であ
る。

ことに、ｍ−Ａ　Ｓ　Ｔの分別定量は、ミトコンドリア
の機能、肝炎、心筋梗塞、細胞障害の重篤度などの臨床
診断法として有用であり、近年、その簡便かつ特異的な
定量法の必要性が益々高まっている。

従来技術 従来、ＡＳＴアイソザイムの測定は陰イオン交換クロマ
トグラフィー法（臨床化学、５，１６３（１９７９））
、免疫化学的方法（特開昭５０−１９９１８号）および
電気泳動法（ロバート・レイ、クリニカル・ケミストリ
ー（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｒｅｊ、ｃｌｉｎ、ｃｈｅｍ、）。

ｉ先、１９７１（＋９７８））などを用いて行なわれて
いるが、これらは時間のかかる煩雑な操作を要し、充分
な精度が得られないなどの種々の欠点を有している。

さらに、複数の異なるｐＨで活性を測定し、アイソザイ
ムの比を求めろ方法および同様に２つの異なるｐＨで活
性を測定し、さらに、ｓ−Ａ　Ｓ　Ｔ阻害剤の影響をも
調べてアイソザイムの比を計算する方法（ロバート・レ
イ、クリニカル・ケミストリー（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｒｅｊ
、　　Ｃｌ１ｎ、　　Ｃｈｅｍ、）、　　２７．５３５
（１９８１））が報告されているが、いずれも操作が煩
雑であり、迅速性および精度に欠ける。

また、ｓ−Ａ　Ｓ　Ｔ活性を阻害する酵素を用いて前処
理した後、ｍ−ＡＳＴを測定する方法（特開昭６０−１
４９３９９号）も提案されている。しかし、この方法は
、多量の精製酵素を必要とし、経済性に問題があり、ま
た、前処理に比較的長時間を要し、自動分析に適してい
ない。

発明の目的 本発明者らは、このような問題点がなく、迅速で、精度
の高い、かつ、自動分析にも適したｍ−ＡＳＴの分別定
虫法を見出すべく、鋭意研究を重ねた。その結果、ジカ
ルボン酸化合物およびプロテアーゼから選ばれる１種ま
たは２種以上のｓ−Ａ　ＳＴ阻害剤の存在下、従来ＡＳ
Ｔの基質として知られるし一アスパラギン酸と異なる新
たな基質を作用させることにより、ｍ−Ａ　Ｓ　Ｔのみ
を特異的に、迅速、かつ、高精度で分別定量でき、自動
分析にも適用できることを見出し、本発明を完成するに
至った。

２１ヒリ１焚 すなわち、本発明はジカルボン酸化合物およびプロテア
ーゼから選ばれる１種または２種以上のｓ−Ａ、ＳＴ阻
害剤の存在下、検体中のｍ−ＡＳＴにＬ−システイン酸
および２−オキソグルタル酸を基質として作用させ、式
： Ｌ−グルタミン酸　＋　β−スルホニルピルビン酸ＣＩ
） で示される反応に従って生成したＬ−グルタミン酸およ
びβ−スルホニルピルビン酸のいずれかを測定すること
によりｍ−Ａ　Ｓ　Ｔを特異的に定量するＡＳＴアイソ
ザイムの分別定量法を提供するものである。

システィン酸および２−オキソグルタル酸を基質とし、
これらからグルタミン酸およびβ−スルホニルピルビン
酸を誘導する酵素として、従来、システィン酸トランス
アミナーゼが知られているが（ニス・ダーリング、ネイ
チャー（Ｓ、Ｄａｒｌｉｎｇ。

Ｎａｔｕｒｅ）、上７０，７４９〜７５０（１９５２）
）、これはＡＳＴと異なるものであり、ＡＳＴアイソザ
イムの分別定量にシスティン酸と２−オキソグルタル酸
を基質として用いた例は見当らない。

本発明の方法において、５−ＡＳＴ阻害剤として用いる
ジカルボン酸化合物としては、例えば、グルタル酸、ア
ジピン酸、こはく酸、マレイン酸およびそれらの無水物
が挙げられ、入手しやすさ等からグルタル酸が特に好ま
しい。プロテアーゼとしては、アクチナーゼ（科研化学
社製）、パパイン、プロテアーゼ・タイプ■、プロテア
ーゼ・タイプ■、プロテアーゼ・タイプＸ■、プロメラ
イン（いずれもシグマ社製）などが挙げられる。これら
の５−ＡＳＴ阻害剤は単独でも、２種以上併用してもよ
い。

検体は、代表的には血清であるが、これに限定するもの
ではなく、ｍ−Ａ　Ｓ　Ｔの定量が所望される、測定に
供することのできるものいずれでもよい。

基質として用いるし一システィン酸および２−オキソグ
ルタル酸は通常入手しうる定量試薬グレードのものでよ
い。

式（Ｉ）に従って生成したＬ−グルタミン酸またはβ−
スルホニルピルビン酸の測定法は、特に限定するもので
はなく、これらの化合物の定量法として公知のいずれの
方法も採用することができる。

例えば、Ｌ−グルタミン酸は、ＮＡＤの存在下、Ｌ−グ
ルタミン酸脱水素酵素（Ｇ１２ＤＨ）を作用させ、ジア
ホラーゼ（ＤＩ）、フェナジンメトサルフェート（Ｐ　
Ｍ　Ｓ　’）のような電子キャリアと、ニトロテトラゾ
リウムブルー（ＮＴＢ）、３−（４、５−ジメチル−２
−チアゾリル）−２’、５−ジフェニル−２Ｈ−テトラ
ゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）のようなテトラゾリウム
塩を加えて発色させ、可視部の波長で測定するような方
法が好適に採用できる。

意外にも、本発明者らによれば、式： β−スルホ乳酸 （［） で示される反応に従い、ＮＡＤＨの存在下、従来、オキ
ザロ酢酸を基質とすると考えられているＭＤＨをβ−ス
ルホニルピルビン酸に作用させ、ＮＡＤＩ−１の有する
紫外部（３４０ｎｍ）での特異吸収を利用し、そのＮＡ
Ｄ（紫外部で吸収を示さない）への変化、すなわち、ｉ
’Ｊ　Ａ　Ｄ　Ｈの紫外部における光学的密度の減少を
測定してβ−スルホニルピルビン酸を定量することによ
り、ｉ＋−ＡＳＴアイソザイムの分別定量がきわめて高
精度で迅速に行なえることが判明した。したがって、本
発明の方法において、β−スルホニルピルビン酸を測定
する場合は、式ＣＩ）の反応後、式（Ｉ［）の反応を行
なって定量操作を行なうことが好ましく、かくして、本
発明はまた、ジカルボン酸化合物およびプロテアーゼか
らなる群から選ばれる１種または２種以上のｓ−Ａ　Ｓ
　Ｔ阻害剤の存在下、検体中のｍ−ＡＳＴＩ：Ｌ−シス
テイン酸および２−オキソグルタル酸を基質として作用
させ、生成したβ−スルホニルピルビン酸をＮＡＤＨの
存在下、ＭＤＨと作用させることからなるｍ−ＡＳＴア
イソザイムの分別定量法を提供するものである。

なお、本発明においては、式〔Ｉ〕の反応と、式（Ｉｌ
）の反応を含め、生成したＬ−グルタミン酸およびβ−
スルホニルピルビン酸の測定は同一系内で行なうことが
できる。

本発明の方法は、例えば、検体を、要すれば適宜希釈し
、これに、ｓ−Ａ　Ｓ　Ｔ阻害剤、Ｌ−システイン酸、
２−オキソグルタル酸および、Ｌ−グルタミン酸または
β−スルホニルピルビン酸測定用試薬を水性溶液状態で
同時に、または順次添加し、所定の温度で所定時間保持
した後、精製水や盲検を対照として、所定の波長におけ
る光学的密度や。

その単位時間当たりの変化を測定し、ｍ−Ａ　Ｓ　Ｔ標
準を用いた測定値や、それにより作成した検量線から、
検体中のｍ−Ａ　Ｓ　Ｔ量を定量することにより実施で
きる。実施に際しては、ＭＤＨの反応系の場合、ｍ−Ａ
ＳＴの至適ｐＨである叶１６，０〜８．０、好ましくは
、ｐＨ７，０〜７．５に保存することが望ましく、その
ために公知の緩衝剤、例えば、ビス−トリスやトリスが
、通常、ｌＯ〜１００ｍＭ程度の濃度で好適に使用され
る。通常、反応系中には、ｓ−Ａ　Ｓ　Ｔ阻害剤を１０
０〜３００ｍＭ（ジカルボン酸化合物の場合）または１
０００〜３０００チロシン単位／ｘｉ２（アクチナーゼ
の場合）、Ｌ−システイン酸を１００〜２５０ｍＭ、２
−オキソグルタル酸を５〜２０ｍＭ程度の割合で存在さ
せ、反応系を３７℃前後で１〜３０分間程分間時した後
、光学的密度の測定を行なう。また、ＧＩ２ＤＨの反応
系の場合、好ましくは、叶■７．５〜８．５に保持する
ため、同様な緩衝剤１０〜２００ｍＭを使用し、２−オ
キソグルタル酸の濃度を０．５〜５ｍＭとする以外は前
記と同様にして測定を行う。例えば、Ｇ１２ＤＨ，ＮＡ
Ｄ、ＰＭＳおよびＮ’ＴＢを用いてＬ−グルタミン酸を
測定する場合は盲検を対照として５６Ｑｎ＋ａの光学的
密度を測定する。また、ＮＡＤＨおよびＭＤＨを用いて
β−スルホニルピルビン酸を測定する場合は、精製水を
対照とし、３４０ｎｓ＋における光学的密度の単位時間
当たりの変化を測定する。

特に、本発明の方法においては、５−ＡＳＴ阻害剤、Ｌ
−システイン酸およびＬ−グルタミン酸またはβ−スル
ホニルピルビン酸測定用試薬を反応系に添加し、例えば
、３７℃で１−１０分間保持後、２−オキソグルタル酸
を添加し、再度、３７℃で１−１０分間保持することに
より、高精度でｍ−ＡＳＴアイソザイムの分別定量が行
なえることか判明した。

本発明は、また、本発明の方法を簡便、かつ、迅速に行
なうための、ｍ−ＡＳＴアイソザイム分別定量用試薬キ
ットら提供するものである。

かかる試薬キットは、前記のｓ−Ａ　Ｓ　Ｔ阻害剤、Ｌ
−システイン酸、２−オキソグルタル酸およびＬ−グル
タミン酸またはβ−スルホニルピルビン酸測定用試薬か
らなる群から選ばれる少なくとも１種の試薬で構成され
、所望により、ｍ−ＡＳＴ標準品、緩衝剤等の他の薬剤
を組合せてもよい。各試薬は、凍結乾燥品、粉末、顆粒
等の固体状、濃縮液、希釈液状等の液体でよく、通常の
製剤化技術に従い、要すれば所定の割合で適宜混合し、
適宜に包装して製造できる。

前記のごとく、本発明においては、式ＣＩ）および（ｎ
）の反応に従い、β−スルホニルピルビン酸を測定する
ことが好ましく、また、２−オキソグルタル酸を他の試
薬と分けて反応系に添加することが望ましい。したがっ
て、本発明においては、該試薬キットを、ｓ−Ａ　Ｓ　
Ｔ阻害剤、Ｌ−システイン酸、ＮＡＤＨおよびＭＤＩを
含有する第１試薬および２−オキソグルタル酸を含有す
る第２試薬を組合せたものとすることが好ましい。

例えば、第１試薬は、使用時、精製水に溶解して、Ｌ−
システイン酸１００〜３００ｍＭ、好ましくは、約２Ｑ
ＱｍＭ、グルタル酸１００〜４００ｍＭ、ＭＤＨ５〜５
０単位、好ましくは、２０単位／ＲＱ、ＮＡＤＨ０，０
８〜０　、２３　ｊ！９／ｘＱの濃度となるように、各
薬剤を混合した粉末または溶液とすることができる。こ
の第１試薬には、使用時、反応系をｐＨ６、５〜８．０
に保持するため、１０〜１００ｍＭの濃度となる程度の
ビス−トリスやトリスのような緩衝剤を添加することか
できる。

また、第２試薬は、使用時、精製水に溶解して、用手法
の場合は濃度１５０〜６３０ｍＭ、自動分析法の場合は
濃度２０〜１１Ｑ＋ｕＭとなるように２−オキソグルタ
ル酸を含有する粉末または溶液とすることができろ。

このキットを用いて血清中のｍ−Ａ　Ｓ　Ｔアイソザイ
ムを分別定量するには、検体血清に第１試薬を作用させ
、約３７℃で１−１０分間、好ましくは、２〜６分間予
備加温した後、第２試薬を加え、同温度で１−１０分間
、好ましくは、２〜６分間反応させ、精製水を対照にし
て３４０ｎｍにおける吸光度の１分間当たりの減少を測
定し、これらのデータに基づいて下式により検体血清中
のｍ−Ａ　Ｓ　Ｔ活性値（Ｕ／Ｑ）を算出する。

差 ΔＥｓｔｄ：標準ｍ−ＡＳＴの吸光度の１分間当りの差 Ｘ　　　：標準ｍ−ＡＳＴの活性値（Ｕ／ｆ２）このよ
うに、本発明によれば、血清中のｍ−ＡＳＴのみを特異
的に定量でき、しかも何ら特別の装置を要することなく
、極めて簡便かつ迅速に実施できるため、本発明の分別
定量法およびその試薬は、血清中のｍ−ＡＳＴの臨床検
査にきわめて有用である。

つぎに本発明によるｍ−ＡＳＴ分別定量効果を調べるた
めに以下に示す実験を行なった。

なお、以下、β−スルホニルピルビン酸を測定する本発
明の方法を本発明法（１）、Ｌ−グルタミン酸を測定す
る方法を本発明法（２）と称する。

実験 実験ｌ 基質として、Ｌ−アスパラギン酸を用いる従来法および
Ｌ−システイン酸を用いる本発明方法における各種ｓ−
Ａ　Ｓ　Ｔ阻害剤の効果（１）試料の調製 ５−ＡＳＴ試料：免疫沈澱法、電気泳動法等によりｍ−
ＡＳＴを含有しないことを確認したブタ心臓由来のｓ−
Ａ　Ｓ　Ｔ　（ベーリンガー社製）を１巧／村牛血清ア
ルブミン含有ビス−トリス緩衝液（ｐＨ７，５）で希釈
して活性値１３０．６Ｕ／（のｓ−Ａ　Ｓ　Ｔ試料を調
製する。

ｍ−ＡＳＴ試料：免疫沈澱法、電気泳動法等により５−
ＡＳＴを含有しないことを確認したブタ心臓由来の標準
ｍ−ＡＳＴ（栄研化学社製）を前記緩衝液で希釈して活
性値１５４．８Ｕ／１２のｍ−ＡＳＴ試料を調製する。

本発明法（１） （１）試薬の調製 第１試薬；Ｌ−システイン酸（東京化成社製）４゜４０
９、リンゴ酸脱水素酵素（天野製薬社製）２５００単位
、β−Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ（オリエンタル酵母社製）１６、
Ｏｎ、ｓ−Ａ　Ｓ　Ｔ阻害剤（後記第１表および第２表
参照）およびビス・トリス（回し化学社製）０゜５４ｇ
を精製水に溶解し全量をＩｏｏｍ（とする（ｐＨ７，５
）。

第２試薬＝２−オキソグルタル酸（東京化成社製）０．
４６９を精製水に溶解し全景を５０村とする（ｐＨ６，
５）。

（２）方法 前記試料０．０２Ｍに第１試薬０．４０ｍＱを加え、３
７℃で５分間予備加温した後、第２試薬００ＬＯｘ（ｌ
を加え同温度で反応させ、その間精製水を対照にして３
４０ｎｍにおける吸光度の１分間当たりの減少を日立７
０５自動分析装置を用いて測定し、それらのデータから
前記式（Ａ）により、ｍ−ＡＳＴの活性値および泪対活
性を算出した。

従来法 （１）試薬の調製 第１試薬：Ｌ−アスパラギン酸（平井化学社製）３゜４
６ｇ、リンゴ酸脱水素酵素１００単位、β−ＮＡＤＨ１
６，０Ｉ９．５−ＡＳＴ阻害剤（後記第１表および第２
表参照）およびトリス０．３１ｇを精製水に溶解し全量
を１ｏｏｉＱとする（ｐＨ８，０）。

第２試薬：２−オキソグルタル酸０．４６９を精製水に
溶解し全量を５０１とする（ｐＨ６、５）。

（２）方法 前記本発明法（１）の方法と同様にして行なう。

結果を第１表および第２表に示す。

第１表 注コ ＊　ｌ ＊　２ 第２表 注］＊１　前記と同意義 ＊２而記と同意義 第１表および第２表の結果から明らかなように、基質と
してＬ−アスパラギン酸を用いる従来法にジカルボン酸
化合物またはプロテアーゼを添加してら５−ＡＳＴの活
性は阻害されなかったがＬ−システイン酸を用いる本発
明法によればグルタル酸、無水マレイン酸およびアクチ
ナーゼを用いた場合に特に顕著なｓ−Ａ　Ｓ　Ｔ活性阻
害効果が得られた。

実験２ Ｌ−システイン酸基質に対するＡＳＴアイソザイムの活
性 （１）試料の調製 ｓ−Ａ　Ｓ　Ｔ試料：前記実験ｌと同様にして活性値３
５２　Ｕ／＆のｓ−Ａ　Ｓ　Ｔ試料を調製する。

ｍ−Ａ　Ｓ　Ｔ試料：前記実験ｌと同様にして活性値１
５５Ｕ／’！２のｍ−ＡＳＴ試料を調製する。

本発明法（１） （１）試薬の調製 第１試薬：Ｌ−システイン酸３．６３９、リンゴ酸脱水
素酵素（天野製薬社製）２０００単位、β−ＮＡＤＨＬ
３．ＯＢ、グルタル酸２．１３４９およびビス−トリス
０．４５ｇを精製水に溶解し全景を１００村とする（ｐ
［−Ｉ７．５）。

第２試薬；２−オキソグルタル酸２．７４９を精製水に
溶解し全量を５０３１１２とする（ｐＨ６，５）。

（２）方法 前記試料０．１２ｉｅに第１試薬２　、９　ｘＱを加え
、３７℃で５分間予備加温した後、第２試薬０．１０ｘ
Ｑを加え同温度で反応させ、その間精製水を対照にして
３４０ｎｍにおける光学的密度の１分間当たりの減少を
電車ＵＶ２１ＯＡ分光光度計を用いて測定し、それらの
データから前記式（Ａ）により、ｍ−ＡＳＴの活性値お
よび相対活性を算出した。

本発明法（２） （１）試薬の調製 基質検出酵素溶液の調製：Ｌ−システイン酸１゜６９９
．２−オキソグルタル酸７．３巧、Ｌ−グルタミン酸脱
水素酵素（オリ円ンタル酵母社製）１５００単位、ＮＡ
Ｄ＋（オリエンタル酵母社製）０゜＋５９、オキサロ酢
酸デカルボキシラーゼ（東洋醸造社製）５００単位、グ
ルタル酸１．３２ｇ、ｍ−フエナジンメトサルフェート
５　、０　ｍｇ、ニトロテトラゾリウムブルー３０所お
よびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン０．６１
９を精製水に溶解して全量を５０ｘＱとする（ｐＨ７、
８）。

（２）方法 前記試料０．０２ｘ１２に基質検出酵素溶液０　、５　
ｘＱを加え、３７℃で２０分間加温した後０．ＩＮ塩酸
５　、０　皮（ｌを加えて反応を停止させ、精製水から
なる盲検を対照にして５６０ｎｍにおける吸光度を電卓
ＵＶ２１０Ａ分光光度計を用いて測定し、予め作成した
ｍ−ＡＳＴの検量線を用い、ｍ−ＡＳＴの活性値および
相対活性を算出した。

従来法 （１）方法 前記試料を用い、カルメン法によるＡＳＴ活性の測定に
従来一般に使用されている試薬であるネスコー）ＧＯＴ
Ｖｆｆ（ＳＳＣＣ）（日本商事社製）を用いて常法によ
り測定し、各ＡＳＴアイソザイムの活性値および相対活
性を算出した、結果を第３表に示す。

第３表 注］＊相対活性は前記と同意義。

第３表より明らかなように、ｍ−ＡＳＴ活性に関しては
、本発明法（１）および（２）はともに従来法と同様の
値を示し、一方、ｓ−Ａ　Ｓ　Ｔ活性に関しては、本発
明法（１）は相対活性０．６％、本発明法（２）は相対
活性０．０％の値を示し、本発明法によりＡＳＴアイソ
ザイムの分別定蚤が可能なことが判明した。

実験３ ｓ−ＡＳＴ活性に対するグルタル酸の影響（１）試料の
調製 試料Ｉ：免疫沈澱法、電気泳動法等によりｍ−ＡＳＴを
含有しないことを確認したブタ心臓由来の５−ＡＳＴ（
ベーリンガー社製）をｌス９／肩σ牛血清アルブミン含
有ビス−トリス緩衝液（ｐＨ７，５）で希釈して活性値
２５１１Ｊ／Ｑの５−ＡＳＴ試料を調製する。

試料■：前記と同様にして活性値５０７　Ｕ／Ｃのｓ−
Ａ　Ｓ　Ｔ試料を調製する。

試料■：前記と同様にして活性値７６０　Ｕ／Ｑのｓ−
Ａ　Ｓ　Ｔ試料を調製する。

（２）試薬の調製 前記実験１と同様にして調製する。

、　（３）方法 前記実験１および２と同様にしてｓ−Ａ　Ｓ　Ｔの活性
値および相対活性を測定した。結果を第４表に示す。

第４表より明らかなように、グルタル酸を使用する本発
明法（１）および（２）により５−ＡＳＴの活性は完全
に阻害された。

実験４ ｓ−Ａ　Ｓ　Ｔ共存下におけるｍ−ＡＳＴの活性活性値
り月５５Ｕ／ｆ２のｍ−Ａ　Ｓ　Ｔ試料に活性値がそれ
ぞれ０．１５１，３１６および４５６Ｕ／Ｑのｓ−Ａ　
Ｓ　Ｔ試料を添加し、ｓ−Ａ　Ｓ　Ｔおよび実験ｌの本
発明法（１）と同様にしてｍ−Ａ　Ｓ　Ｔの活性値を算
出した、結果を第５表に示す。

第５表 注］＊ 第５表より明らかなように、ｓ−Ａ　Ｓ　Ｔ共存下にお
いてもｍ−Ａ　Ｓ　Ｔ活性値はほとんど影響されない。

したがって、本発明法（１）はｍ−ＡＳＴを特異的に分
別定量できる。

以下に本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。

実施例！ 本発明法（１）による検量線の作成 （１）試薬の調製 第１試薬：Ｌ−システイン酸３．６３ｇ、リンゴ酸脱水
素酵素２０００単位、β−Ｎ、ＡＤＨ１３，Ｏｍｇ、グ
ルタル酸２．８４９およびビス−トリス０．４５ｇを精
製水に溶解し全量を１００３１７！とする（ｐＨ７。

５）。

第２試薬：２−オキソグルタル酸２．７４９を精製水に
溶解し全量を５０肩ＩＪとする（ｐＨ６，５）。

（２）標準血清の調製 ｍ−ＡＳＴ活性活性値３４０　Ｕ／１２の血清を生理食
塩水で１１５．２１５．３１５．４１５．５１５に希釈
して調製する。

（３）測定操作および結果 試験管５本に前記各濃度の標準血清各０．１２５！σを
とり、これに前記第１試薬２　、９　ｘＱを加え、３７
℃で５分間予備加温したのち前記第２試薬０．１ｍＱを
加え、３７℃で反応させ、精製水を対照にして３４０ｎ
ｍにおける吸光度の１分間当たりの減少を測定し、それ
らのデータから前記式（１）により、ｍ−Ａ　Ｓ　Ｔの
活性値を求め検量線を作成した。これを第１図に示す。

図より明らかなように原点を通る直線が得られ、本発明
法（１）の定量性が確認された。

実施例２ （【）試薬の調製 前記実施例１と同様にして調製した。

（２）測定操作および結果 実施例１で用いた第１．第２試薬および標準血清を用い
、１６血清検体につき実施例１と同様の操作を行なって
ｍ−ＡＳＴ活性活性値めた。一方、同じ血清検体につき
、公知の免疫化学的方法によるｍ−ＡＳＴ活性測定に一
般に使用されているｍ−ＡＳＴ試薬「未耕」（未耕化学
社製）を用いて常法によりｍ−Ａ　Ｓ　Ｔ活性値を求め
た。これらより、本発明法（１）と従来法の間の相関図
を作成した。これを第２図に示す。

これから相関係数ｒ＝０．９８９であり、従来法の測定
値をＸ、本発明法（１）による測定値をｙとすると回帰
直線の式はＹ　＝　１．０５８ｘ＋２．１と良好な相関
を示し、本発明法（１）の正確度が確認された。

実施例３ 本発明法（２）による検量線の作成 （１）試薬の調製 基質検出酵素溶液：Ｌ−システイン酸１．６９９．２−
オキソグルタル酸７．３Ｒ９、Ｌ−グルタミン酸脱水素
酵素１５００単位、ＮＡＤ＋０．１５９、オキサロ酢酸
デカルボキシラーゼ５００単位、グルタル酸１．３２ｇ
、ｍ−フェナジンメトサルフェート５．０巧、ニトロテ
トラゾリウムブルー３０ｘｙおよびトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン０゜６１９を精製水に溶解し全量
を５０＋Ｃとする（ｐＨ７，８）。

（２）標準血清の調製 前記実施例１と同様にして調製する。

（３）測定操作および結果 試験管５本に前記各濃度の標準血清各０．０２ｉ１２を
とり、これに前記基質検出酵素溶液０　、５３！７２．
を加え、３７℃で３０分間加温した後０．１Ｎ塩酸５　
、　Ｏｘ１２を加えて反応を停止させ、精製水からなる
盲検を対照にして５６Ｑｎｍにおける吸光度を測定し、
それらのデータから前記式（２）によりｍ−ＡＳＴの活
性値を求め、検量線を作成した。これを第３図に示す。

図より明らかなように原点を通る直線が得られ、本発明
法（２）の定量性か確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明法（１）における検量線を示すグラフ、
第２図は本発明法（１）と免疫化学的方法の間の相関関
係を示すグラフ、第３図は本発明法（２）における検量
線を示すグラフである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ジカルボン酸化合物およびプロテアーゼからなる
   群から選ばれる１種または２種以上の細胞質性アスパラ
   ギン酸アミノトランスフェラーゼ阻害剤の存在下、検体
   中のミトコンドリア性アスパラギン酸アミノトランスフ
   ェラーゼにＬ−システイン酸および２−オキソグルタル
   酸を基質として作用させ、生成したＬ−グルタミン酸お
   よびβ−スルホニルピルビン酸のいずれかを測定するこ
   とによりミトコンドリア性アスパラギン酸アミノトラン
   スフェラーゼを特異的に定量することを特徴とするアス
   パラギン酸アミノトランスフェラーゼアイソザイムの分
   別定量法。
2. （２）該ジカルボン酸化合物がグルタル酸である前記第
   （１）項の分別定量法。
3. （３）ジカルボン酸化合物およびプロテアーゼからなる
   群から選ばれる１種または２種以上の細胞質性アスパラ
   ギン酸アミノトランスフェラーゼ阻害剤の存在下、検体
   中のミトコンドリア性アスパラギン酸アミノトランスフ
   ェラーゼにＬ−システイン酸および２−オキソグルタル
   酸を基質として作用させ、生成したβ−スルホニルピル
   ビン酸をＮＡＤＨの存在下にリンゴ酸脱水素酵素と作用
   させることによりミトコンドリア性アスパラギン酸アミ
   ノトランスフェラーゼを特異的に定量することを特徴と
   するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアイソザ
   イムの分別定量法。
4. （４）ジカルボン酸化合物およびプロテアーゼからなる
   群から選ばれる１種または２種以上の細胞質性アスパラ
   ギン酸アミノトランスフェラーゼ阻害剤、Ｌ−システイ
   ン酸、２−オキソグルタル酸、およびＬ−グルタミン酸
   またはβ−スルホニルピルビン酸測定用試薬からなる群
   から選ばれる少なくとも１種の試薬からなることを特徴
   とするミトコンドリア性アスパラギン酸アミノトランス
   フェラーゼアイソザイムの分別定量用試薬キット。
5. （５）ジカルボン酸化合物およびプロテアーゼから選ば
   れる１種または２種以上の細胞質性アスパラギン酸アミ
   ノトランスフェラーゼ阻害剤、Ｌ−システイン酸、ＮＡ
   ＤＨおよびリンゴ酸脱水素酵素を含有する第１試薬およ
   び２−オキソグルタル酸を含有する第２試薬を組合せて
   なる前記第（４）項のミトコンドリア性アスパラギン酸
   アミノトランスフェラーゼアイソザイムの分別定量用試
   薬キット。