JPS62265984A - アミノ酸変性プロウロキナ−ゼおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野と従来の技術 少なくとも１９４０年代以来、ヒト尿は血しよう中に存
在するたん自分解性チモーゲンであるプラスミノーゲン
を酵素プラスミンに変換する活性を有するものであるこ
とが知られている。このプラスミノーゲン賦活成分はウ
ロキナーゼと呼ばれた。

この尿性プラスミノーゲン賦活成分としては種々異なる
分子形態がこれまでに報告されている。しかしながらこ
れらすべての形態の分子はいずれも実質的に同一の前２
駆体分子であるプロウロキナーゼに由来するものである
と考えられていた。

プロウロキナーゼはそれが発見された時にチモーゲンの
分子型を有するものと考えられたためにその様に命名さ
れたものである。以来これが生物活性を有するものであ
ることが明らかとなった。

（Ｌｉｊｎｓｎ、　Ｈ，Ｒ，、Ｚａｍａｒｒｏｎ、　Ｄ
、、　Ｂｌａｂｅｒ、　Ｍ、。

Ｗｉｎｋｌｅｒ、　Ｍ、Ｅ、およびＣｏ１１ｅｎ、　Ｄ
、　（１９８６年）の［Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、Ｊ　
２６１．１２５３−１２５８゜およびＣｏ１１ｅｎ、　
ＤｌＺａｍａｒｒｏｎ、　Ｄ、、　Ｌｉｊｎｅｎ。

Ｈ，Ｒ，およびＨｏｙｌａｓｒｔｓ、　’ｋｒｌ　（１
９８６年）の「Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、Ｊ　２６
１．１２５９−１２６６゜）その結果、この分子型のよ
り良い命名としてアクロニム　５ＣＵＰＡ　（単鎖尿性
プラスミノーゲン賦活成分）と命名することが提案され
た。プロウロキナーゼは４１１アミノ酸残基を有する単
鎖ｙｄ　＋）　ヘプチドから成るものである。高分子ウ
ロキナーゼ（ＨＭＷ）と呼ばれるその２重鎖型のものは
２つのポリイブチド鎖がジスルフィド結合により結合し
て単一分子を形成して成るものである。プロウロキナー
ゼはリジン１５８とインロイシン１５９との間のはブチ
ド結合のたん自分解切断によってＨＭＷウロキナーゼに
変換される。低分子（ＬＭＷ）ウロキナーゼは単鎖ポリ
にプチドであり、プロウロキナーゼの１５９〜４１１番
のアミノ酸残基から成っている。これら３つの分子型は
いずれもプラスミノーゲンの賦活剤である。

プラスミノーゲン賦活剤は血栓溶解剤として使用可能な
故に非常に注目てれているものである。

前記したウロキナーゼの３種の型の中で、プロウロキナ
ーゼだけが心筋梗塞症、肺動脈塞栓症や深静脈血栓症の
治療用の血栓溶解剤として使用され得ると考えられる。

ＨＭＷウロキナー七やＬＭＷウロキナーゼは何ら特別な
基質特異性を示さない。

故にこれらは顕著な凝血塊溶解作用も示さず又顕著な全
身系のフィブリン溶解活性も有さない。一方、プロウロ
キナーゼはフィズリン選択性を示す。

すなわち、プロウロキナーゼは多くの患者において、凝
血塊溶解作用は示すが面著な全身系のフィブリン溶解活
性は示さない。

しかしながら治療を目的とする場合には、プロウロキナ
ーゼはＨＭＷやＬＭＷのウロキナーゼ等の汚染成分を含
有していないことが望ましい。従って天然源や尿やある
いは試験管内培養したヒト細０の調整培地からプロウロ
キナーゼを単離する際には、尿又は培地中に存在する之
ん自分解酵素による分解によってプロウロキナーゼから
生成した）ＩＭＷおよび（または）　Ｌ　ｒＡ　Ｗウロ
キナーゼを除去することがしばしば行なわれる。組換え
ＤＮＡ技法の結果宿主細胞から生成されるプロウロキナ
ーゼは又、これら宿王の内部やあるいはその外部の培地
中に存在するたん自分解解素の作用の結果生成するＢＭ
Ｗおよび（または）　Ｌ　Ｍ　’Ｔ’／ウロチナーゼを
含有している。又、プロウロキナーゼはこれを治療用に
投与した後に体内でＨＭ　Ｗ　％−よびＬＭＷウロキナ
ーゼに変えられる。そしてこの変換はプロウロキナーゼ
分子が血栓に到達する前に起ってしまうのでちるが、ウ
ロキナーゼの生物学的活性型の中ではこのプロウロキナ
ーゼだけが血栓部位における強力な特異性を有するもの
である。

従って、プロウロキナーゼ製剤中に存在するＨＭＷおよ
び（！たは）ＬＭＷウロキナーゼやあるいは投与された
プロウロキナーゼが血栓部位に到達する前に体内で生成
したこれらＨＭＷおよび（または）ＬＭＷウロキナーゼ
は、プロウロキナーゼ治療における治療特異性を減少さ
せるものである。

この様なわけであるから、プロウロキナーゼ分子のＨＭ
ＷおよびＬＭＷウロキナーゼへの変換を不可能とするか
あるいはそれに対して充分な耐性を与えられたプロウロ
キナーゼ分子が得られるとすれば、それによる治療効果
は非常に改善されるはずである。この様なプロウロキナ
ーゼ分子は、これを治療用に投与した場合に全身系のフ
ィブリン溶解活性をほとんど示さないか又は全く示さな
いと考えられる。

又現在、たん白質の構造および機能の基太的問題点の研
究において、部位特異性の変異誘発因子に関する研究が
注目されている。（す１１えば、Ａｃｋａｒｓ、　Ｇ、
に、およびＳｍ１ｔｈ、　Ｆ、Ｒ，（１９８５年）のｌ
’−Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ　５４
．５９７−６２９、参照。）として遺伝子工学の技術を
使用しである種のたん白質の構造においてその個々のア
ミノ酸残基を所望の位置に変換することが可能であるこ
とが知られている。

本発明の第１の目的は、安定なポリペプチド単鎖を有す
る変性プロウロキナーゼを提供することにある。

本発明の他の目的は、通常は１５８位にあるリジンアミ
ノ酸残基をリジン以外のアミノ酸残基に変換することに
よって、先の目的を満足するポリペプチド単鎖を有する
変性プロウロキナーゼを提供することにある。

本発明の更に池の目的は、先の目的を満足する様にプロ
ウロキナーゼを変性する方法および手段を提供すること
にある。

又本発明の更に他の目的は、発現型において変性プロウ
ロキナーゼをコードする遺伝子配列を有するＤＮＡ発現
ベクターから生物活性を有する全長プロウロキナーゼ分
子を生成する方法および手段を提供することにある。

又本発明の更に他の目的は、先の目的に従って、プロウ
ロキナーゼを生成し得る様に発現ベクターで形質転換し
た生物体を提供することにある。

本発明によるアミノ酸変性プロウロキナーゼは、組換え
ＤＮＡ技術により、リジン１５８−イソロイシン１５９
ベプチビ結合の切断がもはや起ることなく、かつそのホ
ＩＪ　６プチドが本領に分解することなく単鎖状を保つ
様にアミノ酸変性がなされたものである。

本発明は、実質的にそのフィブリン溶解活性を低下させ
ることなく単鎖プロウロキナーゼの治療特異性を改善す
ることを目的として、プロウロキナーゼのアミノ酸配列
の１５８位のリジン残基金置換する方法を提供する。

約５０，０００の分子諺を有する単鎖セＩＪはプチゾ型
のプロウロキナーゼは、これをヒト生体に投与した時に
他の公知のプロウロキナーゼよりも長時間その−ｔ−ｉ
の形で生体中に保持され得る限りにおいて、ヒト生体中
の凝血塊を溶解するために特に効果的に使用できるので
ちり、これは本発明の特徴の１つである。その単鎖型は
高いフィブリン親和性を有し、従って、体内での普通の
出血原因となることはなくむしろ凝血塊の部位に直接局
在することが可能である。

又本発明の更に他の特徴としては、部位特異性変異誘発
等の手段によりプロウロキナーゼのコード配列を変換す
ることによりその単鎖を安定化することが出来るのでこ
れを単鎖ポリペプチド型トして保持することが可能であ
り、従って本発明の単鎖ポリはプチド型プロウロキナー
ゼは天然プロウロキナーゼよりもその治療用途の価値が
高い。

本発明によって変成さｎるプロウロキナーゼは、プラス
ミノーゲン賦活剤であつ′Ｃかつ２本鎖ウロキナーゼ生
成用のアミノ酸切断部位を有する単鎖セ１１はプチド型
である、いかなるプロウロキナ−ゼであっても良い。そ
の切断の起る部位はリジン１５８−インロイシン１５９
　、、？プチド結合部である。

このプロウロキナーゼは約５０，０００の分子量を持っ
ていて良い。その単鎖種は最も高いフィズリン溶解活性
を有することが知られておυ、従って、これをヒト又は
動物の体内に投与した場合に、出血を起すことなくフィ
ズリン塊を溶解する作用を示−す。本発明において使用
する単鎖ポＩＪ　　Ｏプチドプロウロキナーゼは次の様
な構造を有している。

これは公知であり、又英国特許出願 第２，１２１，０５０号（Ｈｅｙｎｅｋｅｒ、　Ｈ，Ｌ
、、　Ｈｏｌｍｅｓ。

Ｗ、Ｅ、およびＶｏｈａｒ、　Ｇ、Ａ、　　による「機
能性ヒトウロキナーゼたん白質の製造」）に記載されて
おり、本明細誓添付の第１図の様な構造を有している。

上記の構造は、水溶液中においてかなり短時間の間に、
あるいは体内においてプラスミノーゲンやあるいは他の
たん自分解酵素の様な物質の存在下に分解することがあ
って２本鎖となり、すなわち、そのリジン１５８−イソ
ロイシン　　Ｒプチト９結合が下記に示すように切断す
る。

しかるに本発明のアミノ酸変成プロウロキナーゼは、上
記において後に示した構造となる様な分解、すなわちリ
シン　　−イソロイシン１５９ベプ、、　　　１５８ チド結合を切断する様な分解に対して安定であり、この
安定性が本発明の第１の特徴である。

プロウロキナーゼは単鎖ポリＲプチビを有するプラスミ
ノーゲン賦活剤として定義されてお９、これはＢｒａｋ
ｍａｎ、　Ｐ、　（１９６７年）による［フィブリン溶
解Ｊ　（Ｓｃｈｓｔｈｅｍａ　Ｈｏｌｋｉｍａ、アムス
テルダム）第１−１２４ページに記載のフィブリン平板
分析法によって定義されたＣＴＡ（血栓溶解剤委員会、
Ｃｏｍｍ１ｔｔｅｅ　Ｏｎ　Ｔｈｒｏｍｂｏｘｙｔｉｃ
　Ａｇｅｎｔｓ）単位で表示されるプラスミノーゲン賦
活剤活性を有するものであり、そして実質的に第１図の
様な構造から成っている。本発明の好ましい態様として
のプロウロキナーゼはヒトプロウロキナーゼであるが、
他の哺乳動物例えばブタ、ウマ、イヌ等のウロキナーゼ
も又使用可能であシ、その定義は、フィブリン溶解活性
を有する単鎖ポリはプチドから成るものであってかつそ
れが切断により２本鎖型になシ得る様なすべてのプラス
ミノーゲン賦活成分を包含するものである。

本発明により変性されるのに好ましいプロウロキナーゼ
としては、組換えＤＮＡ技術を使用して、呻乳類腎細胞
のｍＲＮＡ　　由来のものが挙げられる。

本発明は、組換えＤＮＡ技術を使用して作った、その単
鎖から２本鎖への切断分解が公知のアミノ酸切断部位に
おいて起る様ないかなるプロウロキナーゼに対しても適
用可能である。本発明により変性可能な単鎖プラスミノ
ーゲン賦活剤物質としては、Ｋｏｈｎｏ、　Ｔ、、　Ｈ
ｏｐｐｅｒ、　Ｐ、、　Ｌｉ１−ｇｌｕｓｔ。

Ｊ、　Ｓ、、　５ｕａａ１ｔｈ、　Ｒ，Ｌ、、　Ｇｒｅ
ｅｎｌｅｊ　Ｒ，およびＭｏ１ｒ、　Ｄ、Ｔ、　（１９
８４年）の「Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｊ　２゜６２８−６３
４　；　　Ｈｕｐａｉｎ、　Ｓ、Ｓ、、　Ｇｕｒｅｗｉ
ｃｈ。

■、およびＬｉｐｉｎｓｋｉ、　Ｂ、　（１９８３年）
の「Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ日、Ｊ　　２２０，３１
−３８　：　　スミ。

Ｈｏ、ニスギ、Ｔ、、マツオ、０．およびミハラ、Ｈ０
（１９８２年）の「Ａｃｔａ、　Ｈａｓｍａｔｏｌ、　
Ｊａｐａｎ、Ｊ４５、　１１９−１２８　：　Ｃｏ１１
ｅｎ、　Ｄ、、　５ｔａｓｓｅｎ。

Ｊ、Ｍ、、　Ｂｌａ’ｂｅｒ、　Ｍ、、　Ｗｉｎｋｌｅ
ｒ、　Ｍ、およびＶｓｒｓｔｒａｓｔｅ、　Ｍ、　（１
９８４年）の「Ｔｈｒｏｍｂ。

Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、ｊ　５１．２３１１−２３１４：
およびＷｕｎ、　Ｔ、　−Ｃ，、Ｏａｓｏｗｓｋｉ、　
Ｌ、およびＲｅ１ｃｈ。

Ｅ、（１９８２年）のｌ’−Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｓｍ、
　Ｊ、　２５７゜７２６２−７２６８に記載の物質およ
び米国特許第４．３７０，４１７号および英国特許出願
第２，１２１，０５０号であるＨｅｙｎｅｋｅｒ、　Ｈ
，Ｌ、。

Ｈｏｌｍｅｓ、　Ｗ、Ｅ、およびＶｅｈａｒ、　Ｇ、Ａ
、による「機能性ヒトウロキナーゼたん白質の製造」に
記載の物質を挙げることができる。

本発明の代表的な例としては、プロウロキナーゼをヒト
腎細飽から得ることができる（Ｋｏｈｎｏ等（１９８４
年）の前記文献。この＃ｌ胞を、５チの加熱不活化した
ヌセラム（ＮｕＳｅｒｕｍ；　Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉ
ｖｅＲｅｅｅａｒｃｈ　社（レキシントン、マサチュー
セッツ州）製）を含有するダルベコ変性イーグル培地中
で液体培養する。増殖した細胞を、０２５チドリプシン
で１５分間３５’Ｃで処理した後に、遠心分離により採
取し、そして液体窒素中で凍結する。

これより、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃ
ｈ、　Ｅ、Ｆ。

およびＳａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　（１９８２年）の「
分子クローニングの実験用手引き（Ｍｏｌｅｃｕｘａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　Ｊ（コー
Ａ／ビ　スプリング　ハーバ−研究所、ニューヨーク州
）の第１９１−１９８頁に記載の方法に従ってポ１月勾
ＲＮＡを単離する。これを簡単に説明すると、まず、５
ｇの凍結細胞をＮＰ−４０で溶解しその核を超遠心分離
により除去する。その！ａ＠質両分をたん自分解酵素に
で処理しそしてフェノール／クロロホルム／インアミル
アルコール抽出をくり返してたん白質を除去する。エタ
ノール沈でんにより全、細胞質ＲＮＡを回収し、その収
量は約１６ｍ７である。次いでオリゴ（ａ’ｒ）セルロ
ースクロマトグラフィーによりボ１月ＡｌＲＮＡを単離
し、その収量は約２００■である。単離されたｇ　ＩＪ
　（ＡＩ　ＲＮ　Ａが完全なものであることは、ウサギ
網状赤血球溶解産物系における試峡管内稠訳により確認
される。

ボ１月Ａ）　ｍ　ＲＮ　Ａ　の２本鎖ＣＤＮＡ　への変
換は常法により、逆転写酵素による第１鎖のプライマー
としてオリゴ（ａＴ）を使用し、第２鎖合成用にＤ　Ｎ
　Ａ　ｌ　リメラーゼＩを使用し、末端が２本鎖末端で
あることの確認のためにヌクレアーゼＳ工処理を行いそ
してサイズ選択のためにバイオゲルＡ１５０Ｍによるク
ロマトグラフィーを行なうことにより行なう。（Ｗｉｃ
ｋｅ＝ｓ、　Ｍ、Ｐ、、　　Ｂｕｅ’１１．　Ｇ、Ｎ。

およびＳｃｈｍｉａｋｅ、　Ｒ，Ｔ、　（１９７８年）
の［Ｊ。

Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｍ、Ｊ、　２５３．２４８３−２４
９５参照。）こうしてサイズ選択した２本領ｃＤＮＡを
Ｈｉｎｄ■合成オリゴヌクレオチドリンカー（Ｃｏｌｌ
ａｂｏｒａ−ｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ社製、レキシ
ントン、マサチューセッツ州）とライゲートと、次いで
１重鎖ｆｌファージベクター中に形質転換する（Ｚｉｎ
ｄθｒ。

Ｍ、Ｄ、およびＢｏｅｋｅ、　Ｊ、Ｄ、　（１９８２年
）の「Ｇｅｎｅ　Ｊｌ　１９　）　１−１０　：および
Ｂｏｗ＋ｉｅｎ、　Ｄ、Ｗ、。

Ｍａｏ、　Ｊ、、　Ｇｉｒｌ、　Ｔ、、　Ｈｓｉａｏ、
　Ｋ、、　Ｌｉｌｌｇｕ−１ｓｔ、　Ｊ、Ｓ、、　Ｔｓ
ｓｔａ、　Ｄ、およびＶｏｖｉｓ、　Ｇ、１１’。

（１９８４年）の［ＧｅｎｅＪ、　２７．８７−８９）
。

各１４塩基の長さを有しそしてＰＵＫコード領域領域０
部分回相同５個のオリゴヌクレオチド９プローブを自動
ホスホルアミシト法（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ−
ｔｅｍｓ自動ＤＮＡ合成装置使用）により合成する。

このプローブ（第１〜１５番）を、その遺伝子中におけ
る位ｔｉｉｔ−示して第２図に図式的に示した。

ファージｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのため
に、プローブを混合し、ポリヌクレオチドキナーゼとγ
−３２Ｐ−ＡＴＰとしてよ（、，３２ｐで標識しそして
ポリアクリルアミドゲルにより残シの標識体から単離す
る。こうして標識したプローブを、Ｂｅｎ　ｔｏｎ、　
Ｗ、Ｄ、とＤａｖｉｓ、　Ｒ，’／／、の方法（１−８
ｃｉｅｎｃｅＪ、１９６，１８０−１８２（１９７７年
））によりライブラリーからのニトロセルロース斑リフ
トのプローブ用に使用する。ここでは複数のプローブを
使用するために、例え遺伝子内部に予期し得ない多形現
象が起る場合があったり又、構造又は配列状態における
予期し得ない問題が原因となっである種のプローブによ
る交雑がうまくゆかないことがあっても、それによ＃）
ＰＵＫ含有クローンの同定が妨げられることはない。こ
の様にして、約ｓｏ、ｏｏｏのクローンをプロウロキナ
ーゼ配列用にスクリーニングする。そのコロニーの内の
１つはプローブの１１個と交雑可能である。この後者の
クローンについてジデオキシ法による配列決定および制
限酵素分析によう、このクローンが２，２キロベースの
インサートを含有しておυそのシグナル配列（ＳＳ）の
中間を出発点としていることが明らかとなる。（第１図
参照。）又このシグナル配列の領域と相補性のあるプロ
ーブを使用して更にスクリーニングすると、そのシグナ
ル配列における欠失部を有する第２のクローンが見出さ
れる。

この２つのインサートをその両方に共通のＢｇｌ■制限
部位において発現ベクター中にサブクローニングする。

こうして得られたサブクローンについて制限酵素分析を
行い、後者のｃＤＮＡが全長プロウロキナーゼであるこ
とが明らかとなる。

第３図はマウスＮ工Ｈ３Ｔ３細胞中で複製および発現が
可能彦真核生物発現ベクターｐｓｖ２中への、プロウロ
キナーゼをコードする遺伝子の導入を図示するものであ
る。このプラスミ）’ＤＮＡを制限酵素分析することに
より、これが正しく構築されていることが明らかとなる
。フィブリン平板上での分析（Ｂｒａｋｍａｎ　（１９
６７年）の上記文献）やアミド分解活性の分析（何針等
（１９８４年）の上記文献）によ）マウスＮ工Ｈ３Ｔ３
　糸田胞からＰＶＫが分泌されていることが明らかとな
る。

１５８位にリジン以外のアミノ酸を有するＰＶＫｃＤＮ
Ａを含有するプラスミドの構築を第４図の様にして行う
。これを簡単に説明すると、プラスミ）”　ｐＳＶ２　
ｔ　Ｂｇｅ　ＩＩ　テ次イテＥＣＯＲ■テ切断シテリジ
ン１５８を含有する０２３キロベースのＢｇ／　ＩＩ　
−ＥＣｏＲ■断片と７，１　キロベースのＢｇ　ｌ　１
−ＥＣｏＲｆ断片とにする。この０．２３キロベースの
断片はゲル電気泳動およびゲル溶出により確認できる。

この０．２３　キｏベースのＢｇｅｌ−ｈ：ｃｏＲＩ断
片１Ｄｄｅ）で切断して０．２０キロベースのＢｇｌ　
ＩＩ　−Ｄａｅ　Ｉ断片を得て、これはゲル電気泳動に
よりｉ認される。

この０．２０キロベースのＢｇｌ　［−Ｄｉｅ　ｉ断片
を３分子反応により、７．１　キロベースのＢｇｌＩＩ
　−ＥｃｏＲ■断片および、ｌ個のオリゴヌクレオチド
（これは上記の様にして合成した）の長さであって、リ
ジン１５８−位にアラニンを含有する０、２０キロベー
スのＢｇ／　ｌ　−Ｄａｅ　Ｉ断片の部分と相補性のあ
る合成オリゴマーとライゲートする。（この３分子ライ
ゲーションは、リジン１５８−位にメチオニン又はグル
タミン酸又はバリンのいずれかを有するか又は、リジン
１５８−位にメチオニンを有しそして１６０−位にセリ
ンを有する合成オリゴマーを使用してくシ返し行う。）
この断片を１５℃で５時間ライゲートし次いで細胞の形
質転換を行う。

こうして各断片を正しくライゲーションすることにより
Ｓａｃ　［制限部位ならびに新しいＮｒｕ　７．制限部
位が出来る。１つの形質転換体を制限酵素分析してみる
と、リジン１５８がアラニン残基で置換した新しいＳａ
ｃ　］’［およびＮｒｕ　１部位が出来ていることがわ
かる。ヌクレオチド９領域を通してのジデオキシ配列決
定により、１５８−位のリジンがアラニンで置換してい
ることが確認できる。別の形質転換体をとシ出して、こ
れについて同様の確認実験を行って、１５８−位のリジ
ンがメチオニン、グルタミン酸又はバリンで置換されて
おり、あるいは１５８−位がメチオニンでかつ１６０−
位がセリンで置換されていることが確認できる。

その生化学的な特徴づけや生体内研究の目的として、変
異プロウロキナーゼ遺伝子を持つ前記のプロウロキナー
ゼ誘導体を充分な営において得るために、リジン１５８
変異造伝子を持つ発現プラスミドをカルシウム沈でん法
によって選択マーカーと共に呻乳類細胞、培養物中に共
トランスフエクゾヨ７する（Ａｘｅ’ｌ、　Ｒ，および
Ｗｌｇ、１ｅｒ、　Ｍ、Ｈ，の米国特詐第４，３９９，
２１６号）。２培体ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦ
Ｒ）　　部位の完全に欠失した、ＤＧ４４と命名された
中国産ノ・ムスターの卵巣（ＣＨＯ）　　株（Ｕｒｌａ
ｕｂ、　　Ｇ、、　　Ｋａ日、　　Ｅ、、　　Ｃａｒｏ
ｔｈｅｒｓ。

Ａ、Ｍ、およびＣｈａｓｉｎ、　Ｌ、Ａ、　（１９８３
年）の［ｃｅｌｌ　Ｊｌ　３３＋　４０５−４１２　）
を発現用宿主として匝用する。組換えＤ　Ｎ　Ａ技法に
より作ったマウスＤＨＦ’Ｒミン遺伝子を有する、ｐａ
ｈｆｒ　２．９と命名されたプラスミド（Ｃｒｏｕｓｅ
、　Ｇ、Ｆ、、　ＭｃＥｗａｎ。

Ｒ，Ｎ、　オよびＰｅａｒ日ｏｎ、　Ｍ、Ｌ、　（１９
８３年）の１’−Ｍｏｌ　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、Ｊ、
　　３．　２５７−２６６）と共トランスフエク７ヨン
用の選択ベクターとして使用する。

共トランスフェクションにおいて、クリシン、ヒポキサ
ンチン又はグアニ／を含まない成育培地中での選択によ
りＤＨＦＲ＋コロニーを得る。このコロニーをとり出し
て標準細胞培養用Ｔ−フラスコ中に広げ、そしてその培
養物を調整後にエライザ（ＥＬＩＳＡ）分析法により分
析を行う。エライザ分析において使用するＰＵＫ抗体は
ウサギホリクローナル抗体であり、変異たん白質との交
差反応を行う。こうして、変異たん白質を発現する個々
のコロニーを、エライザ分析における陽性結果として同
定することができる。

生成されるたん白質の生成レベルを増大させるために、
上記の変異株を次いで遺伝子増幅処理に付する（Ｋａｕ
ｆｍａ’ｎ、　Ｒ，Ｊ、および５ｈａｒｐ、　Ｊ。

（１９８２年）の「Ｊ、　Ｍｏｌ　Ｂｌｏｌ、　Ｊ、　
１５９．６０１−６２１；およびＲｌｎｇｏｌｄ、Ｇ、
、　Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ、　Ｂ。

およびＬｅｅ、　Ｆ、　（１９８１年）のｌ’−Ｊ、　
Ｍｏｌ　Ａｐｐ。

Ｇｅｎｅｔｉｃｓ’、　１．　１６５−１７５　）。こ
の遺伝子増幅処理とは、ＤＨＦ’Ｈの特異的抑制剤であ
るメトトレキセート（ＭＴＸ）を高ａ度で細胞に作用さ
せることにより行う。ＭＴＸに応答して、ＤＨＦＲ遺伝
子は増幅しそしてその遺伝子コ♂−数は数百にも又数千
にさえも増加する。共トランスフェクションにより通常
は共挿入（組込み）が成されるので、この変異ＰＶＫ遺
伝子は新たに導入されたＤＨＦ’Ｒ遺伝子と共に共増幅
される。通常使用されるＭＴＸ濃度の連続的増加分布は
１０　ｎ　Ｍ＋　５ｏｎＭ、０．２　μ”＋　　１　μ
ＭＴ　５　ａ　Ｍおよび加μＭから成るものである。し
かしながら実験の途中において、エライザ分析によりそ
の生成レベルが充分となったと判断された時点に３いて
増ａ操作はこれを停止する。５０　ｎ　ＭのＩＡＴ　Ｘ
での処理による段階の後に１ｇにつき約２〜１０ｍ９の
収率が達成される。この増幅操ｆ′Ｆ−’ｔ−完全に行
うと、１ｇにつき少なくとも５０■のレベルの収率が達
成される。

実施例１ プロウロキナーゼの変異型（例えば、１５８−位のリジ
ンがメチオニンに！置換され、そして１６０−位のイン
ロイシンがセリンによって！び喚された変異型）を生成
する、増幅ＣＨＯ細胞からの調整培地（３，９ｌ）　’
ｋ　０．２μＭ　のひだ付きカプセルフィルター（Ｇθ
１ｍａｎ）でろ過して特定の物質を除去する。

このろ過した調整培地を蒸留水で７．４ｊに希釈し次い
で塩酸でｐＨ７，０に調節する。こうして得られた溶液
の伝導度は５．０　ｍ　Ｓ　／譚である。

ＣＭ　−Ｔ　Ｓ　Ｋ　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ
１社製、口ｙクツオード、イリノイ州）カラムの３．２
　ｃｍ　ｘ　１０．８　ｃｍ（８７＋ｘＡり　　のカラ
ムを満たし、これを５０ｍＭりん酸カリウム（ｐＨ７，
０）の５００　ｍｌで平衡化する。先の希釈し、田調節
した調整培地（７，４ｇ　）をこのＣＭ−’Ｉ’　Ｓ　
Ｋカラムに６．５ｎｌ／分の流速で注入する。次いでと
のカラムｆ　５０　ｍ　Ｍりん酸カリウム（ｐＨ７，０
）の４００扉ｅで洗浄し、次にこれを４００罰の５０ｍ
′ｂＡりん酸カリウムと０．１　Ｍ塩化カリウム（ｐｉ
１７．０）で、次いで４００　ｒｒｔｌの５Ｑ　ｍ　Ｍ
りん酸カリウムと０．１５　Ｍ塩化カリウム（ｐＨ７，
０）で溶出する。このカラムの溶出により１０　ＷＬｔ
　　づつの両分を採取し、各両分のたん白質含有當を分
光光度法により２８０　ｎ　ｍ　　の吸光度を測定する
ことにより求める。２８０　ｎ　ｍ　　の光を吸収した
物質を含む、５ＱｍＭｐん酸カリウムおよび０゜１５Ｍ
塩化カリウム（ｐＨ７，０）の溶離液での両分を集め、
−２０’Ｃで凍結して保存する。こうしてろ過したＣＭ
−ＴＳＫ　　による溶出物の体積は約２２０　ｒｔｔｌ
である。

ｐ−アミノベンズアミジンセファロースの１　ｃｍ　Ｘ
６．４　ｃｆｒＬ（５ｍｌりのカラムを満たし、５０　
ｍ　ＩＡ　りん酸ナトリウムおよび１Ｍ塩化ナトリウム
（ｐｔ−ｔ　７．５　）の１００　ｒｎｌで平衡化する
。先のＣＭ−ＴＳＫ溶出物を解凍し、これに５Ｍ塩化ナ
トリウム全３７−加えてその塩濃度を調節する。次いで
このｅｔａ−ＴＳＫ溶出物２２Ｎ塩酸を使って滴定して
ｐＨを２．２として特定の物質を溶かし、そして次にこ
れ１５１Ｎ水酸化ナトリウムで滴定してｐＨを７．５　
とする。このＣＭ−ＴＳＫ溶出物を０．２μフイルター
（Ｍｔｌｌｅｘ　ＧＶ、　Ｍｉ１’１ｉｐｏｒｅ、　ｆ
３ｅｄｆｏｒｄ。

ＭＡ）　　でろ過し次いでｐ−アミノベンズアミジンカ
ラムにｌａｅ／分の流速で注入する。次いでこのカラム
ｆ　５０　ｍ　Ｍりん隈ナトリウムと１Ｍ塩化ナトリウ
ム（ｐＨ７，４）の４０尻！で洗浄し、次に０．１　　
Ｍ酢酸ナトリウムと０．ＩＭｉ化ナトナトリウムｐＨ４
，８）の８０ＷＬｅで溶出する。このカラムの溶出によ
って各２ｒｒｔｌづつの画分を集め、各両分中のたん白
質含量を分光光度法により２８０ｎｍの吸光度を測定す
ることにより求める。２８０　ｎ　ｍ　の吸光度が０．
０２よりも大である両分を集める。こうして集めたｐ−
アミノベンズアミジン溶出画分（４４ｇ／）を−２［１
’Ｃで凍結して保存する。

このｐ−アミノベンズアミジン溶出画分の純度１ｓＤｓ
−ポリアクリルアミドゲルを気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ、
　Ｖ、に、、　１−ＮａｔｕｒｅＪ、　（１９７０）ｔ
２２７．６８０）により測定する。これを簡単に説明す
ると、まず、このｐ−アミノベンズアミジン画分のサン
プルを０．１　％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　　含有の１５チアクリ
ルアミドゲル上に性態しこれを銀着色法により分析する
（Ｈｅｕｋｅａｈｏｖｅｎ、　Ｊ、およびＤｅｒｎｉｃ
ｋ、　Ｒ。

の「電気泳動Ｊ、６，１０３−１１２．（１９８５））
。

ｐ−アミノベンズアミジン画分中のたん白質バンドの分
子量はｓｏ、ｏｏｏダルトンであると考えられる。

又Ｌｏｗｒｙの方Ｑ　（Ｌｏｗｒｙ、　Ｏ，Ｈ，、Ｒｏ
ｇｅｎｂｒｏｕｇｈ。

Ｎ、Ｊ、、　Ｆａｒｒ、　Ａ、Ｌ、およびＲａｎｄｔ、
　Ｒ，Ｊ、の「Ｊ、、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、Ｊ、　
１９３．２６５−２７５゜（１９５１））により測定し
た、ｐ−アミノベンズアミジン画分中のたん白質含量は
０．０２７　ｍ９　／ｒｒｔｌ　　である。このｐ−ア
ミノベンズアミジン画分を遠心分πｔにより濃縮する。

濃縮したｐ−アミノはンズアミジン画分の最終濃度は０
．１９■／罰である。

先の精製した変異プロウロキナーゼのアリクウオット（
部分標本）を触媒量のプラスミンを加えて又はこれを加
えることなく培養して、この変異プロウロキナーゼ分子
のプラスミンによる分解感受性を調べる。まず変異プロ
ウロキナーゼのアリクウオット（すなわち、濃縮ｐ−ア
ミノベンズアミジン画分、１００　Ａｌ　）と、プロウ
ロキナーゼの溶液のアリクウオット（０，２１■／ｒＬ
ｔ溶液を１００μｇ）を０．１％（ｖ／ｖ）の酢酸に対
して２時間透析する。

透析後に、１０μ９のたん白質を含有する各透析液のア
リクウオットを真空遠心分離により乾燥する。

この乾燥した変異プロウロキナーゼおよびウロキナーゼ
のサンプルを次いで５０ｍＭ）ＩＪスーＨＣｅ（ｐＨ７
，４）、０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１％　ト
ウイーン８０００．９　ＷＬｅ中に溶解する。これを使
って次の４種の反応混合物を作る。その反応混合物（１
）はプロウロキナーゼ３０１１ｅｋ含有する。反応混合
物（２）はプロウロキナーゼ３００μｇとプラスミン（
０，０１５ｇ／ｍｌのヒトプラスミン、ミドリ十字（株
）Ｍ）の１１μｇを含有する。反応混合物（３）は変異
プロウロキナーゼ３００μｌｔ−含有する。反応混合物
（４）は変異プロウロキナーゼ３００μｇとプラスミン
（０，０１５９／Ｐｌｔｌ　Ｏヒトプラスミン、ミド’
　＋）　十字（株）製）の１１μｌｔ含有する。これら
の４つの反応混合物を３７℃で３時間培養する。培養後
に、アプロチニンの０．２■／ｄ溶液の７．５μｉｋ反
応混合物（２）と（４）に加える。次いでこの反応混合
物ｋ　Ｏ，１％　（ｖ／ｖ）の酢酸に対して２時間透析
する。透析後に、各透析液を真空遠心分離により乾燥す
る。次いで各サンプルを５０ｍＭ）リス−ＭＣＩ　（ｐ
Ｈ６，８）、２チドデシル硫酸ナトリウム、２０％グリ
セロールおよび１０ｍＭジチオスレイトールの（資）４
ｇ中に溶解し次にＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌ
ｉ、　Ｖ、に、、　「Ｎａｔｕｒｅｊ。

遣ユニ、６８０（１９７０））により電気泳動にかける
。電気泳動後に、ゲル中のたん白質を銀着色により可視
化する（Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ、　Ｊ、およびＤｅｒ
ｎｉｃｋ、　Ｒ，「電気泳動Ｊ、６，１０３−１１２゜
（１９８５））。ゲルの写真を第５図に示す。このゲル
の写真から、この実験条件下において、プロウロキナー
ゼはプラスミンとの培養によって見金に分解するが、変
異プロウロキナーゼはプラスミンとの培養によって分解
しないことがわかる。

実捲例２ プロウロキナーゼの変異型（アミノ酸性１５８−位にお
いて、リジンの代シにグルタミン酸が置換した変異型）
を生成する、増幅ＣＨＯ細胞からの調整培地を０．２μ
Ｍ　のひだ付きカプセルフィルター（Ｇθ１ｍａｎ）で
ろ過して特定の物質を除去する。

このろ過した調整培地をりん酸で滴定してｐＨ７，０と
し、次いで蒸留水１３．０　ｇで希釈する。こうして得
られた溶液の伝導窒は５．２　ｍ　Ｓ　／ｒ：ｒｎであ
る。

ＣＭ−ＴＳＫ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ−社）
カラムの４．４　ｃｍ　ｘ　１５．２　ｃｍ　（２００
ｍｌ　）のカラムを満たし、これを５０ｍＭりん酸ナト
リウム（ｐＨ７，０）の５００　ｍｌで平衡化する。先
の希釈し、…調節した調整培地（１９゜２ｇ）をこのＣ
Ｍ−ＴＳＫカラムに１６ｄ／分の流速で注入する。次い
でこのカラムを５ＱｍＭｐん酸ナトリウム（ｐＨ７，０
）　　の８１０μｇ　で洗浄し、次にこれを６００−の
５０ｍＭりん酸ナトリウムおよび０、Ｉ　Ｍ塩化ナトリ
ウム（ｐＨ７，０’）　　で、次いで６００ｍｇの５Ｑ
ｔｎＭりん酸ナトリウムおよび０．１５　Ｍ塩化ナトリ
ウム（声７．０）で溶出する。このカラムの溶出により
１０ｄづつの画分を採取し、各両分のたん白質含有量を
分光光度法により２８０ｎｍ　　の吸光度を測定するこ
とにより求める。５０ｍＭ　りん酸ナトリウムと０，１
　Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７，０）の溶離液での溶出物
中のたん白質ピークを有する部分の両分を集め、−２０
’Ｃで凍結して保存する。こうしてろ過したＣＭ−ＴＳ
Ｋ　　による溶出物の体積は１３０扉ｅである。

ｐ−アミノベンズアミジンセファロースのＩ　Ｃ２ｎ　
Ｘ１０．２　ｃｒｎ　（８ｒｕｇ　）のカラムを満たし
、５０　ｍ　Ｍりん酸ナトリウムおよび１Ｍ塩化ナトリ
ウム（ｐＨ７，５）　　の１００　ｔｒｔｅで平衡化す
る。先のＣＭ−ＴＳＫ溶出物を解凍し、０．２　ａ　フ
ィルｐ　−（Ｍｌｘｌｅｘ　ＧＶ　、　　１ｖｈ１１−
ｐａｒｅ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）を通してろ過す
る。このろ禍したＣＭ−ＴＳＫ　　溶出物中に塩化ナト
リウム（７，５！Ｊ　’）を溶解する。次いでこの溶出
物をｐ−アミノベンズアミジンカラムにｌｄ／分の流速
で注入する。次いでこのカラムを５ＱＭ５ん酸ナトリウ
ムおよび１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７，４）の２５罰で
洗浄し次に０．１　Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．１　Ｍ
塩化ナトリウム（ｐＨ４，８）の６０　ｔｕｇで溶出す
る。このカラムの溶出によって各２ＷＬｅづつの画分を
集め、各画分中のたん白質含量を分光光度法により２８
０ｎｍの吸光度を測定することにより求める。２８０ｎ
ｍの吸光度が０．０３７よりも犬である両分を集める。

こうして集めたｐ−アミノベンズアミジン溶出画分（３
１ｍｌ　）を−２０℃で凍結して保存する。

このｐ−アミノベンズアミジン溶出画分の純度を＠肥し
たと同様の５ＤＳ−、ｎリアクリルアミドゞゲル電気泳
動により測定する。まず８６μｇのｐ−アミノベンズア
ミジン溶出画分ｔ−０，１％ＳＤＳ含有の１２冬アクリ
ルアミビゲル上に性態しこれを銀着色法により分析する
（Ｈｅｕｋｅｓｓｈｏｖｅｎ、　Ｊ、およびＤｅｒｎｉ
ｃｋ、　Ｒｏの「電気泳動Ｊ、６，１０３−１１２．（
１９８５））。　ｐ−アミノベンズアミジン画分中のた
ん白質バンドの分子量は５０，０００ダルトンであると
考えられる。又Ｌｏｗｒｙの方法「Ｌｏｗｒｙ　。

０、Ｈ，、Ｒｏｓｅｎｂｒｏｕｇｈ、　Ｎ、Ｊ、、　Ｆ
’ａｒｒ、　Ａ、Ｌ、およびＲａｕｄｔ、　Ｒ，Ｊ、の
「Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　Ｊ、　１９３＋２６
５−２７５．（１９５１））により測定した、ｐ−アミ
ノベンズアミジン画分中のたん白質含量は０．０３５１
７１１ｉ’／罰である。

Ｃ０１１ｅｎ等による分析方法（Ｃｏｌｌｅｎ、　Ｄ、
。

Ｚａｍａｒｒｏｎ、　Ｃ，、Ｌｉｊｎｅｎ、　Ｈ，Ｒｏ
およびＨｏｙｌａ−ｅｒｔｓ、　Ｊ、の［Ｊ、　Ｂｔｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ、山２６１゜１２５９−１２６６、（１
９８６））を使用して、先の精製した（Ｊｕ−１５８変
異ＰＶＫのプラスミノーゲンを賦活する活性を調べる。

この分析法では、ＰＶＫ（又は変異ＰＶＫ）を、過剰量
のプラスミンの色素産生基質（Ｄ−Ｗａｇ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−ｐＮＡ）の存在下にプラスミノーゲンと一緒に培
養する。

下記の２つの反応に従って、その色素産生ｊ８質の加水
分解（すなわち、４０５　ｎ　ｍ　の光を吸収する色素
産生基質の加水分解速度をモニターすることにより、反
応により、生成するプラスミン（すなわち、プラスミノ
ーゲン活性化の結果として起る）の量を定量することが
できる。又プラスミノーゲン活性化の割合は、経時的に
吸光度曲線をプロットすることによりモニターすること
ができる。

各成分をあらかじめ３７℃に加温してこれらを下記の様
にして混合して２ｇＸ類の５００μｅ　の反応混合物を
用意する。反応混合物（１）は、５０ｍＭ　トリス−Ｈ
ＣＣ３８ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．１　％　　トウ
ィーン８０　（ｐＨ７，４）の１２９．５　ｔｔ　１３
と、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン（１”ｉ／ｆｆ１Ｊｙ　
Ｋａｋ　ｉ　Ｖ　ｉ　ｔｒ　ｕｍ　）の４４．５　μｍ
３　と、先のｐ−アミノベンズアミド溶出画分の１０゜
５μ！。

５０ｍＭ　　トリ、ｚ、−ＨＣ７１！、３８ｍＭ　　塩
化ナトリウムオよび０．１チ　トウィーン８０　（ｐＨ
７，４）の４８８μｇ　およびＤ−Ｖａ７１！−Ｌｅｕ
−Ｌｙｓ−ｐＮＡ（Ｓ　−２２５１，Ｋａｋｉｖｉ−ｔ
ｒｕｍ）の３．５ｍＭ　　保存溶液Ｑ５０ｍＭ）す、ｘ
、−ＨＣｌ。

３８　ｍ　Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１チ　　トウィ
ーン８０（ｐＨ７，４）中にて５０３μｅ　としたもの
を含有する溶液の３２６μｌ　とを混合することにより
作る。反応混合物（２）は５０ｍＭトリス−ＭＣＩ、３
８ｍＭ塩化ナトリウムおよび１．１チ　トウィーン８０
　（ｐＨ７，４）の１５５μｇと、Ｌｙｓ−プラスミノ
ーゲン（２ｍｇ／鳩Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃａ、　　グリニッチ、コネチカット州）の１９μ
ｌと、先のｐ−アミノベンズアミド溶出画分の１０．５
４ｇ　、　　５０ｍ　Ｍ　トリス−ＭＣＩ、３８ｍ　Ｍ
塩化ナトリウムおよび０．１チトウイーン８０（ｐＨ７
，４’）の４８８　ａ　ｌおよびＤ−Ｖ’ａ／−Ｌｅｕ
−Ｌｙｓ−ｐＮＡ　（Ｓ−２２５１，Ｋａｋｉｖｉｔｒ
ｕｍ、　ストックホルム、スエーデミ）の３５ｍＭ保存
溶液を５０ｍＭ　トリス−ＨＣＬ　３８ｒｎＭ塩化ナト
リウムおよび０．１チ　　トウィーン８０　（ｐＨ７，
４）中にて５０３μｇ　としたもの３ヒ含有する溶液の
３２６μｇ　とを混合することにより作る。

反応混合物（１）および反応混合物（２）を、予め３７
℃に加温しておいたキュベツト中にピペットによりとり
入れる。次いでこれらのキエベッ）ｆ分光分析器（Ｂｅ
ｃｋｍａｎ　ＤＶ−５）にかける。反応混合物の吸光度
と１分間についての吸光度の変化を、加分間の間四秒の
間かくで４０５　ｎ　ｍ　　の波長でモニターする。そ
して反応混合物の吸光度とそれの１分、５分、１０分、
１５分および加分における１分間についての吸光度の変
化を経時的にプロットしこれ全第６図に示す。

実癩例３ ３種類のプロウロキナーゼ誘導体を、生体内血栓溶岬試
験用に精製する。第１の誘導体（Ｍｅｔ／５ｅｒ）は、
通常は１５８−位のアミノ酸であるリジンの代りにその
１５８−位がメチオニンで置換されておりそして通常は
１６〇−位のアミノ酸であるイソロイシンの代りにその
１６０−位がセリンで置換されている構造を有する。第
２の誘導体（Ｇｅｕ）は、通常は１５８位のアミノ酸で
あるリジンの代りにその１５８−位がグルタミン酸で置
換されている溝層を有する。第３のプロウロキナーゼ誘
導体（Ａ４ａ）は、通常は１５８−位のアミノ酸である
リジンの代−りにその１５８−位がアラニンで置換され
ている構造を有する。これらのプロウロキナーゼ誘導体
を実質的に下記の様な方法により精製する。

Ｍｅｔ／Ｓｅｒプロウロキナーゼ誘導体の精製。

Ｍｅｔ／ｓｅｒプロウロキナーゼ誘導体を生成する増幅
ＣＨＯ矧胞からの調整培地（３，９１）を０２μＭ　の
ひだ付きカプセルフィルター（Ｇｅｌｍａｎ）でろ過し
て特定の物質を除去する。このろ過した調整培地を蒸留
水で７．４ｇ　に希釈し次いで塩酸でｐＨ７，０に調節
する。こうして得られた溶液の伝導度は５．０ｍＳ／ｃ
ｍ　　である。この希釈しそしてｐＨ調節した調整培地
（７，４ｇ　）を、５０ｒｎＭ　りん酸カリウム（ｐＨ
７，０）で平衡化したＣ　Ｍ　−Ｔ　Ｓ　Ｋ　（Ｐｉｅ
ｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社）の３．２　ｃｍ　ｘ　１
０．８　ｃｍ　（８７ｒｔｔｌ　）のカラム中に、６．
５ｒｒｔｌ１分の流速で注入する。次いでこのカラム１
５０ｍＭ　りん酸カリウム（ｐＨ７，０）の４００ｄで
洗浄しそして、５Ｑ　ｍ　Ｍりん酸カリウムおよび０．
１　Ｍ　塩化カリウム（ｐ、’（７，０）の４００ばて
次いで５０ｍＭｊｌん酸カリウムおよび０．１５　Ｍ塩
化カリウム（ｐＨ７，０）　（Ｔ）　４００ｔｎｅ　テ
１ｌｆＩ次溶出する。このカラムの溶出により１ｏｒｔ
ｔｔづつの画分を採取し、各画分のたん白質含有量を分
光光度法により２８０　ｎ　ｍの吸光度を測定すること
により求める。２８０ｎｍの光を吸収する物質を含有す
る、関ｍＭりん酸カリウムおよび０．１１４’！　塩化
カリウム（＋）Ｈ７，０）の溶ｌＩ？液での両分を集め
、−９℃で凍結して保存する。このＣＭ−ＴＳＫによる
流出画分（２４０ｍｇ）　ｆ解凍し、２Ｎ塩酸を使って
滴定して…２．２に調節して特定の物質を溶解し、次い
でＩＮ水酸化ナトリウムで滴定してｐＨ全７．５　に調
節する０５Ｎ塩化ナトリウム関μｌをこのＣＭ−ＴＳＫ
溶出画分に加え、次いでこれを０．２　μフィルター（
Ｍｉｌｌｅｘ　ＧＶ、　　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　Ｂｅ
ｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）を通してろ過し、そして５０ｍＭ
５ん酸ナトリウムおよびＩＮ塩化ナトリウム（ｐＨ７，
５）の１００罰で平衡化したｐ−アミノベンズアミジン
セファロースの２．５　ｃｍ　ｘ　５．１　ｃｍ　（２
５ｍＡ　）のカラム（Ｃｏ’１ｌａｂｏｒａｔｉｖｅ。

Ｒｅ５ｅａｒｃｈ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、　Ｍ　Ａ　）に
、１ｒＩｔｇＺ分の流速で江別する。次にこのカラムｆ
　５０　ｍ　Ｍ）ん酸ナトリウムおよび１Ｍ塩化ナトリ
ウム（ｐＨ７，４）で洗浄し、そして０．１　Ｍ　酢酸
ナトリウムおよびＱ、ｌ　Ｍ　塩化ナトリウム（ｐＨ４
，８）で溶出する。

このカラムの溶出により各５ｍＡ’づつの両分を集め、
各両分中のたん白質含有量を分光光ｒｙ法により２８０
　ｎ　ｍ　　の吸光度を測定することにより求める。

２８０　ｎ　ｍ　　の吸光度が０．０７よりも犬である
両分を集める。こうしで集めたｐ−アミノベンズアミジ
ン溶出画分（４０ｄ）　　ｔ−ｍｍ℃で凍結して保存す
る。

Ｌｏｖｒｙの方法（Ｌｏｗｒｙ、　Ｏ，Ｈ，、Ｒａｓｅ
ｎｂｒｏｕｇｈ。

Ｎ、Ｊ、、　Ｆａｒｒ、　Ａ、Ｌ、およびＲａｎｄｔ、
　Ｒ，Ｊ。

（１９５１年）の［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、Ｊ、
　１９３゜２６５−２７５）により測定したこのｐ−ア
ミノベンズアミジン溶出画分中のたん白質含有甘は０．
２６■／プである。

Ｇ４ｕプロウロキナーゼ誘導体の精製。

Ｇ／ｕプロウロキナーゼ誘導体全生成する増１陥ＣＨＯ
ｍ１ｌＶカらの調整培地（３，６６）金０．２μＭ　　
（７）ひだ付きカプセルフィルター（Ｇｅｌｍａｎ）で
ろ過して特定の物質を除去する。このろ過した調整培地
を蒸留水で１０８１に希釈し次いで塩酸でｐｔｌ　７．
０に調節する。こうして得られた溶液の伝４鹿は５．６
ｍｓ／ｍ　　である。この希釈しそしてｐＨ調節した調
整培地（１０，ａ　ｌｌ　）を、５０ｍＭ、９ん酸カリ
ウム（ｐ［（７，Ｑ）で平衡化したＣ　Ｍ−Ｔ　Ｓ　Ｋ
　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社）の４．４　ｃ
ｍ　Ｘ　１０．８　ｃｍ　（１６４ｍｇ）のカラム中に
、７．０　ｍｅ／分の流速で注入する。次いでこのカラ
ムを５０ｍＭりん酸カリウム（ｐＨ７，０）の５００　
ｒｎｌで洗浄しそして、５ＱｍＭＪん酸カリウムおよび
０．１　　Ｍ塩化カリウム（Ｉ）Ｈ７，０）の５００ｍ
Ａ！で次いで５０　ｍ　Ｍりん酸カリウムおよび０．１
５　Ｍ塩化カリウム（ｐＨ７，０）の５００　ｒｕｇで
順次溶出する。このカラムの溶出により１４コづつの両
分を採取し、各両分のたん白質含有せを分光光度法によ
、ｊ＞２８０ｎｍ　　の吸光度を測定することにより求
める。５０　ｍ　Ｍりん酸カリウムおよび０．１　Ｍ　
塩化す）　ＩＪウム（ｐＨ７，０）の溶離液での溶出画
分中の４つのたん白質ピークを集め、−加℃で凍結して
保存する。この４つのピーク画分の合計量は３４０罰で
ある。５ＤＳ−ゲル電気泳動（Ｌａｓｍｍｌｌ。

Ｖ、に、、　「Ｎａｔｕｒθ」）により純度を測定する
。その純度が９０チ　　以下である両分についてはこれ
を更に下記の様にして０４カラムを使用しての逆相ＨＰ
ＬＣにより再精梨する。すなわち、まずこのＣＭ−ＴＳ
Ｋ溶出画分を解凍し、０２μ　フィルター（Ｍｌｌｌｅ
ｘ、　Ｇｖ、　　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　Ｂｅｄｆｏｒ
ｄ、　ＭＡ）でろ過する。各ＣＭ−ＴＳＫ溶出画分を０
．１チ　トリフルオル酢酸で調整し、次いで１５％プロ
ノｑノールおよびｏ、１ｓ　　トリフルオル酢酸で平衡
化したＣ４逆相カラムに、個々に１ｒｔｔｌ１分の流速
で注入する。

Ｇ４ｕ−誘導体はプロパツール傾斜法（１５％−５０チ
、０．１％　トリフルオル酢酸中）により溶出される。

約５分間の保持時間でカラムから溶出する主ピークを集
め、これを０．１　％　（ｖ／ｖ　）酢酸に対して４℃
で１６時間透析する。透析後、サンプルを一加℃で凍結
する。これら２つのＣＭ−ＴＳＫ′ｎｔ製による両分を
解凍し、これらを合わせてそして遠心分離により濃縮す
る。この濃縮Ｇ６ｕ−誘導体（３６ｄ）のたん白質痛度
をＬｏｗｒｙの方法（Ｌｏｗｒｙ、　Ｏ，Ｈ，。

Ｒｏｓｅｎｂｒｏｕｇｈ、　Ｎ、Ｊ、、　ｌ’ａｒｒ、
　Ａ、Ｌ、およびＲａｕｄｔ、　Ｒ，Ｊ、　（１９５１
年）のｌ”’Ｊ、　Ｅｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、Ｊ。

１９３．２６５−２７５）　　により測定したところ０
．２２ＷＩ／ｍであった。

ＡＪａ−プロウロキナーゼ誘導体の精製。

Ａｌａプロウロキナーゼ誘導体を生成する増幅ＣＨＯ細
胞からの調整培地（２，０ｇ　＞を０．２μｇのひだ付
きカプセルフィルター（Ｇｒｌｍａｎ）でろ過して特定
の物質を除去する。このろ過した調整培地を蒸留水で５
．６２　に希釈し次いで塩酸でｐＨ７，０に調節する。

こうして得られた溶液の伝導度は５．４ｍ５Ｚ傭である
。この希釈しそしてｐＨ調節した調整培地（５，６１）
を、５Ｑ　ｍ　Ｍりん酸カリウＡ　（ｐＨ７，０）で平
衡化したＣ　Ｍ　−Ｔ　Ｓ　Ｋ　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａ１社）の３．２　ｃｍ　ｘ　１１．５　ｏｎ
　（９２ｍＪ）のカラム中に、６．０ｍ２１分の流速で
注入する。次いでとのカラム＠　５０　ｍ　Ｍりん酸ナ
トリウム（ｐＨ７，０）の１１で洗浄しそして、５Ｑ　
ｍ　Ｍりん酸ナトリウムおよび０．１５）ｉ（塩化ナト
リウム（ｐＨ７，０）の１ｇで溶出する。このカラムの
溶出によりＳ　ｒｔｔｌづつの両分を採取し、各両分の
たん白質含有量を分光光度法により２８０　ｎ　ｍ　の
吸光度を測定することにより求める。このカラムから溶
出されるたん白質の最終ピークを集め、−加℃で凍結し
て保存する。このＣＭ　−Ｔ　Ｓ　Ｋ　（ｆｃよる溶出
画分（７０ｍＡ’）　を解凍し、固体塩化すｌ−１）ラ
ム３．４７ｇを加えることによってＩＭ塩塩化ナトリウ
ム変度調節し、そして５Ｑ　ｍ　Ｍりん酸ナトリウムお
よび１Ｍ塩化ナトリウム（ｐｉ（７，５）の１００　ｒ
ｎｅで平衡化したｐ−アミノベンズアミジンセファロー
スの１，５ｃｍ　Ｘ　５．Ｏｃｍのカラム（Ｃｏ１１ａ
ｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ社、　　Ｂｅｄｆ
Ｏｒｄ、　ＭＡ　）に、１ｒｒｔｌ／分の流速で性態す
る。次にこのカラムをカラム体積の３倍の量の５０ｍＭ
、９ん酸ナトリウムおよび１Ｍ塩化ナトリウム（１）Ｈ
７，５’）　　で洗浄し、セしてカラム体積の４倍の４
１（３６＋＋ｔ／）の０．１Ｍ酢酸ナトリウムおよび０
．１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ４，８）で溶出する。各５
　ｒｒｔｌづつの両分を集め、各画分中のたん白質含有
ｔｔ”分光光度法により２８０ｎｍ　の吸光度を測定す
ることにより求める。こうして集めたｐ−アミノベンズ
アミジン溶出画分ｔ−２０℃で凍結して保存する。

Ｌｏｗｒｙの方法により測定したこのｐ−アミノベンズ
アミジン溶出画分中のたん白質含有量は０．３１ｐ／だ
ｇである。

こうして精製したプロウロキナーゼのＭｓ　ｔ／５ｅｒ
−１Ｇｌｕ−およびＡＪａ−誘導体を、ウサギ頚静脈血
栓溶解モデル系（Ｃｏｌｌｅｎ等の「Ｊ、　Ｃｈｉｎ。

■ｎｖｅｓｔ、Ｊ、７１，３６８−３７９ｙ　（１９８
３）；Ｃｏ１１ｅｎ、　　Ｄ、、　　５ｔａｓｓｅｎ、
　　ＪｌＭ、、　　Ｗｉｍｋｌｅｒ、　　Ｍ。

およびＶｅｒｓｔｒａｅｔｅ、　Ｍ、の「Ｔｈｒｏｍｂ
、　Ｈａｅｍｏｓ−ｔａｓ、Ｊ、５２．２７−３０．（
１９８４））を使用しての生体内試験により、その凝血
塊溶解能（すなわち血栓溶解能）についてプロウロキナ
ーゼと比較する。プロウロキナーゼはＣｏ１１ａｂｏｒ
ａｔｉｖｅＲｅｓ−ｅａｒｃｈ社（Ｂｅｄｆｏｒａ、　
Ｍ　Ａ　）　から入手した。

この生体実験において、ウサギ（２，５−３Ｋｇ）の頚
静脈中に人工的にフィブリン凝血塊を作っておき、これ
に１■／Ｋｇの投与量のプロウロキナーゼ又は先のプロ
ウロキナーゼ誘導体の１つを４時間以上かけて注射する
。注射終了後加分たってから、血栓溶解の程度全測定す
る。この際、各プロキナーゼ誘導体およびプロウロキナ
ーゼ用に３匹のウサギを使用して実験を行う。実験結果
（すなわち、各プロウロキナーゼ誘導体で処置したそれ
ぞれのウサギについて観察した血栓溶解の程度）を第７
図に示す。

上記した様に、プロウロキナーゼ誘導体の作成において
は、プロウロキナーゼの１５８−位のリジンを除去して
こ扛を１個またはそれ以上のアミノ酸でだけ置換するか
、あるいはさらにこれに組合わせてその１６〇−位のア
ミノ酸ｆ：を換することにより行う。この様なアミノ酸
としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン
、フロリン、フェニルアラニン、ドリフトファンおよび
メチオニンから成る非極性（疎水性）群、グリシン、セ
リン、スレオニン、７ステイン、チロシン、アスパラギ
ンおよびグルタミンから成る物性中性群、アルギニン、
リジンおよびヒスチジンから成る喝性（塩基性）群、お
よびアスパラギン酸およびグルタミン酸から成る陰性（
酸性）群を挙げることができる。同様にして、安定性ｉ
ｖ！強全目的として、１５７−位のイソロイシンを単独
であるいは１５８−位のリジンと一緒に除去しそして１
個又はそれ以上のアミノ酸で置換することができる。

１５８−位　リジンだけを置換すると、アミノ酸変性単
鎖プロウロキナーゼとなりこれは天然の単鎖プロウロキ
ナーゼの場合よりもその２Ｍ重鎖型の変換が起りにくい
。又場合によって：げこの様な変性により、通常の生体
条件下やあるいは凝血塊溶解のための用途に使う条件下
等において先の非置換のリジン部位においては全く分解
が起らなかった程にまでその安定性を増強することもあ
る。しかるに通常のプロウロキナーゼの分解１ｄ生体内
中であるいは保存中に急速におこる。

出発物質としての単鎖プロウロキナーゼおよび生成した
アミノ酸変性プロウロキナーゼは両方とも高いフィブリ
ン選択性を有している。その高いフィブリン選択性につ
いては、Ｚａｍａｒｒｏｎ等（１９８４牟）の前記文献
；スミ、　）１．、　トキ、Ｎ、。

ササキ、に、およびミハラ、Ｈ，（１９８３年）の１−
Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎ　Ｂ’ｉ’ｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ
　Ｊ　　（Ｄａｖｉｄｓｏｎ。

Ｊ：Ｆ、、　Ｂａｃｈｍａｎｎ、　Ｆ、、　′Ｂｏｕｖ
ｉｓｒ、　Ｃ０Ａ、　　およびＫｒｕｉｔｈｏｆ、　Ｅ
、に、Ｏ，ｆ５．　　チャーチヒル、リビングストーン
、エジンバーグ）、　　６．１６５−１６７；およびＣ
ｏ１ｅｎ等（１９８４年）の前記文献に報告されている
。

そのリジンアミノ酸の変性は遺伝子組換え操作により行
うことができる。ｆ９１１えば、所望のアミノ酸変換を
したオリゴマーをＤＮＡ中にスプライシングするか、又
をす、その変換アミノ酸ヲ含有するオリゴマーとＤＮＡ
をハイブリダイズしてプライシングすることにより、Ｄ
ＮＡ＋ｄリメラーゼとの合成とそれに続く合成したＤＮ
Ａのクローニングによってその所望のアミノ酸変換をし
た「変異」ＤＮＡ−１得る様にして行うことができる。

場合によっては、その様な遺伝子変換技術によってリジ
ンを除去し置換するのではなくて、化学的処理によって
も行うことができる。例えば、ｎ−エチルマレイミヒ、
ジントロフルオロベンゼンあるいは２−メトキシ−５−
二トロトロボンの様な反応剤でのアルキル化によりある
いは、ｎ−カルボキシ無水物、ジケテン又はメチルアセ
トイミド酸等によるアシル化により所望のアミノ酸の側
鎖を変換することにより行うこともできる。

単鎖型のりジン−イソロイシン以外の部位での切断によ
って２重鎖型となる様なプラスミノーゲン賦活剤に関し
ては、本発明による切断部位を適当に変更することによ
りこれら賦活剤の安定化を図ることができる。このため
にはし１］え）ブ他の部位のアミノ酸を適当に＠換すれ
ば良い。

【図面の簡単な説明】

第１図はプロウロキナーゼのヌクレオチド°配列および
その演釈されたアミノ配列量水す。アミノ酸には１〜４
１１の番号を付した。矢印は最初に単離したクローンの
出発点を示す。 第２図は本発明において使用するプローブを模式的に図
示したものである。 第３図はマウスＮ　工１−１３　Ｔ　３細胞中でのプロ
ウロキナーゼ発現用に使用したプラスミド’ｐｓＶ、２
　　ｆ、（示す。 第４図は１５８アミノ酸位にアラニンを持つプロウロキ
ナーゼを有するプラスミドの溝築を図示するものである
。 第５図は天然プロウロキナーゼと、１５８−位がメチオ
ニンで蓋換されそして１６〇−位がセリンで蓋換された
プロウロキナーゼ（すなわち、メチオニン１５８−セリ
ン１６０の変異プロウロキナーゼ）とを、ヒトプラスミ
ンでの処理後にゲル電気泳動した結果ｆ示す写真である
。ここでレーン１はプロウロキナーゼ３００μｇ　であ
り、レーン２は１１μｌのプラスミン（０，０１５ｍ９
／ｒｒｔｌ　）　　で予め処理したプロウロキナーゼ３
００μｇであり、レーン３は１５８−位にメチオニンを
そして１６〇−位にセリンを有するプロウロキナーゼ３
００μｇ　であり、レーン４は１１μｌのプラスミン（
０，０１５■／ｄ）で予め処理した、１５８−位にメチ
オニンをそして１６０−位にセリンを有するプロウロキ
ナーゼ３００μｇであり、そしてレーン５は標準分子量
マーカーである。 第６図はｇｌｕ　−１５８プロウロキナーゼによるｇ７
？ｕ−プラスミノーゲン（Ｏ）および８７日−プラスミ
ノーゲン（りの活性化の様子を示す曲線図である。 第７図はプロウロキナーゼ２は変異プロウロキナーゼ遺
伝子を有するプロウロキナーゼ誘導体で処置した３匹の
ウサギのそれぞれについて観察した血栓溶解の程度を示
す表である。 代理人　弁理士（８１０７）　　佐々木　清　隆（ほか
３名）　　、 □、ニー 〜− 図面のｔ７＋書（内容に変更なし）第１ＴＧＴＡＡＴＴ
ｒＴＡＡＡＴＡＡＡＡＧＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＡＡＴＧ
ＴＧＡＴｒＴＴＴＣＴＧ＾第　　３　　図 第５図 ；　（ ＝−１４，２ Ｗ　　＠

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、単鎖ポリペプチド構造を有しかつ高いフィブリン選
   択性を有するアミノ酸変性型プロウロキナーゼであって
   、その２重鎖型への分解抵抗性がそのもとの非変性型よ
   りも高いものである、該アミノ酸変性型プロウロキナー
   ゼ。 ２、そのフィブリン溶解活性を実質的に低下させること
   なく単鎖プロウロキナーゼの分解抵抗性を増加させる方
   法であって、プロウロキナーゼの１５８−位のリジン残
   基を他のアミノ酸で置換することにより変性する様にプ
   ロウロキナーゼを処理することから成る、前記方法。 ３、プロウロキナーゼを遺伝子工学的に処理してそのリ
   ジン＾１＾５＾８を位置特異性変異誘発により置換する
   ことから成る前記第２項に記載の方法。 ４、そのリジン＾１＾５＾８を化学的変性処理によって
   置換することから成る、前記第２項に記載の方法。 ５、そのフィブリン溶解活性を実質的に低下させること
   なく単鎖プラスミノーゲン賦活剤の分解抵抗性を増加さ
   せる方法であって、 該方法が該プラスミノーゲン賦活剤の遺伝子工学的処理
   によりその分解位置を変換させることから成り、 該遺伝子工学的処理が、リジン＾１＾５＾８−イソロイ
   シン＾１＾５＾９切断位置を有する第１のＤＮＡ断片を
   除去し、そしてその第１の除去されたＤＮＡ断片位置に
   変性した切断位置を有する第２の断片を導入することか
   ら成るものである、前記方法。 ６、該第１の除去されたＤＮＡ断片位置を、変性切断位
   置を有する以外はその第１のＤＮＡ断片と同じものであ
   る第２のＤＮＡ断片で置換することから成る、前記第５
   項に記載の方法。 ７、該第２のＤＮＡ断片が、その置換されたアミノ酸が
   リジン以外のアミノ酸である様に１５８−位のアミノ酸
   置換を行ったものであることから成る、前記第６項に記
   載の方法。 ８、該第１のＤＮＡ断片を制限酵素処理により除去する
   ことから成る、前記第７項に記載の方法。 ９、該第２のＤＮＡ断片をＴ＿４ＤＮＡリガーゼでのラ
   イゲーシヨンにより導入することから成る、前記第７項
   に記載の方法。 １０、リジン切断部位を別のアミノ酸で置換することに
   より該切断部位と除去して２重鎖型への変換抵抗性を持
   たせる様にした、構造変性単鎖プラスミノーゲン賦活剤
   。 １１、そのリジン−イソロイシン切断部位を除去して他
   のアミノ酸で置換した、第１図の構造を有する、構造変
   性単鎖プロウロキナーゼ。 １２、該アミノ酸がメチオニンおよびアラニンから成る
   群から選択したものである、前記第１１項に記載の構造
   変性単鎖プロウロキナーゼ。