JPH0847390A - 活性なヒトｔｐａをコードする組換えｄｎａ分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 活性な修飾ヒトＴＰＡをコードする組換えＤ
ＮＡ分子を提供する。 【解決手段】 天然ヒトＴＰＡのＤＮＡ分子のＮ−結合
炭水化物認識配列Ａｓｎ−Ｘ−（ここで、ＸはＳｅｒま
たはＴｈｒを表す）をコードするＡｓｎ、Ｓｅｒまたは
Ｔｈｒコドンの全部ではないが少なくとも一つを、別の
アミノ酸をコードするコドンに置き換えて、ＴＰＡの前
記炭水化物認識配列の該当位置に炭水化物成分が結合す
ることを防止した点で天然のＴＰＡをコードするＤＮＡ
分子と異なることを特徴とする、活性なヒトＴＰＡをコ
ードする組換えＤＮＡ分子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は治療用蛋白質の生産
のための組換えＤＮＡ技術の応用に関し、詳しくは修飾
されたヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｍＴ
ＰＡ）の生産のための組換えＤＮＡ技術の応用に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】リジケン（Ｒｉｊｋｅｎ）ら；Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５８０，１４０
（１９７９）は、ヒト子宮組織からのヒト組織プラスミ
ノーゲンアクチベーター（ｕＴＰＡ）の部分精製を報告
している。このアクチベーターは、単鎖チモーゲン酵素
であり、血液中のプラスミンで活性化されて、フイブリ
ン血栓を溶解する２−鎖型に活性化される。従って、Ｔ
ＰＡは種々の血管病、等に心臓内もしくはその周辺での
血栓の結果として起る心筋梗塞および深部静脈血栓に苦
しむ患者の血栓を溶解する治療用組成物として有用であ
る。

【０００３】癌細胞ライン（Ｂｏｗｅｓ ｍｅｌａｎｏ
ｍａ）細胞からｍＲＮＡをＤＮＡ組換え技術を用いて取
り出し、このｍＲＮＡをｃＤＮＡがコードするＢｏｗｅ
ｓＴＰＡの生産に使用することは、ゴデル（Ｇｏｅｄｄ
ｅｌ）らがヨーロッパ特許出願第００９３６１９号に記
載している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題および課題を解決するた
めの手段】一般に、本発明は活性ヒトＴＰＡをコード
し、天然のＴＰＡ−コードＤＮＡ分子とは、天然ＤＮＡ
分子のＮ−結合炭水化物認識配列Ａｓｎ−Ｘ−（Ｓｅｒ
またはＴｈｒ）をコードするＡｓｎ，ＳｅｒまたはＴｈ
ｒコドンの１つの代りに、別のアミノ酸をコードするコ
ドンに置きかえて、ＴＰＡの炭水化物認識配列の部分で
ＴＰＡに炭水化物部分が結合するのを防止した点で異な
る。

【０００５】好ましい態様においては、炭水化物認識配
列はＴＰＡのカルボキシ末端に最も近い炭水化物認識配
列であるか、またはそのような修飾配列は２ケ所存在
し、すなわち、ＴＰＡのアミノ末端に最も近い配列およ
び中間の配列である。好ましくは、修飾された炭水化物
認識配列において、非Ａｓｎコドン例えばグルタミンコ
ドンでＡｓｎコドンが置き換えられる。

【０００６】本発明の組換えＤＮＡ分子は、複製可能な
発現ベクターにより運ばれ、このベクターは宿主哺乳類
細胞に感染させたとき、活性ヒトＴＰＡをコードするＤ
ＮＡ配列を発現させ、宿主細胞中で発現される前記活性
ヒトＴＰＡは、天然ヒトＴＰＡのＴＰＡ−結合Ｎ−結合
炭水化物部分の１つまたはそれ以上を欠失したものであ
る。本発明の修飾されたＴＰＡは薬学的に受容しうる担
体物質と一緒に混ぜて血栓溶解治療用組成物に製造でき
る。

【０００７】本発明のｍＴＰＡは哺乳動物細胞培養液か
ら、どのＴＰＡにも応用できる方法で、先ず疎水性アフ
イニティークロマトグラフィー、次いでｍＴＰＡを抗Ｔ
ＰＡ抗体に結合させるアフイニティークロマトグラフィ
ーを施す工程で精製できる。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明を好ましい態様に基づき、
以下に詳述する。

【０００９】ヒト子宮ＴＰＡ ｃＤＮＡの合成 本発明のＤＮＡ分子はｕＴＰＡ ｃＤＮＡの部位特異的
突然変異化（ミュータジエネシス）により造成した。そ
のヒト子宮ＴＰＡをコードするｃＤＮＡは、次の工程に
より製造およびクローン化した： １） ヒト子宮組織から全ｍＲＮＡを単離する； ２） この全ｍＲＮＡからｕＴＰＡ ｍＲＮＡを豊富化
する； ３） ＴＰＡ ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、３′ｃ
ＤＮＡ配列および５′ｃＤＮＡ配列を得る； ４） ５′および３′ｃＤＮＡ配列を結合して、中間プ
ラスミドベクター中に完全ｃＤＮＡ配列を得る。

【００１０】ｕＴＰＡ ｍＲＮＡの単離 ヒト子宮組織からのｍＲＮＡは次のようにして単離し
た。約３０ｇのヒト子宮組織を、４Ｍグアニジンチオシ
アネート、１Ｍ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ酢
酸ナトリウム（ｐＨ５．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡを
含有するグアニジンチオシアネート溶液４０ｍｌ中で、
組織ホモジナイザーを用いて破砕した。次にホモジネー
ト１ｍｌ当り１ｇのＣｓＣｌを加え、ホモジネートを３
０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄を、５０ｍ
ｌ遠心管中の５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１．５９２ｇ ＣｓＣｌ／ｍ
ｌ溶媒を含有するＣｓＣｌクッション１５ｍｌ上に重層
し、４５，０００ｒｐｍで２０℃にて２４時間遠心分離
した。ＲＮＡを含有する白色バンドを回収し、このＣｓ
Ｃｌ溶液を水で３倍に希釈し、ＲＮＡを沈澱させるため
に−２０℃で２倍量のエタノールを加えた。沈澱を遠心
で回収した。溶解および沈澱を繰返してＣｓＣｌの混在
を十分に取り除いた。約１１ｍｇの精製ＲＮＡが回収さ
れた。

【００１１】精製ＲＮＡを高塩濃度緩衝液（１０ｍＭ
トリス（ｐＨ８．０）、０．５ＭＮａＣｌおよび０．２
％ドデシル硫酸ナトリウム）中にオリゴーｄＴセルロー
ス１ｍｌを含むアフイニテイーカラムに通してから、エ
タノール沈澱で濃縮して、０．１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．５）３００μｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ドデシル
硫酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドをＳＷ４１チ
ューブ中に得た。チューブを１５℃で３５，０００ｒｐ
ｍ、１６時間遠心分離した。フラクションに別けて回収
し、各フラクションのＲＮＡのサイズを、 ³Ｈ標識した
４Ｓ、１８Ｓおよび２８Ｓの標準マーカーにより決定し
た。

【００１２】ＴＰＡ ｍＲＮＡを含むフラクションを、
ノーザン ブロテイング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ
ｔｉｎｇ）分析で³²Ｐ標識プローブを使って同定し、こ
れらのフラクションをまとめてプールした。ｍＲＮＡを
回収するため、グラジエントに等量の０．４Ｍ ＮａＯ
Ａｃ、ｐＨ５を加えて希釈し、希釈後のグラジエント溶
液に２．５倍量のエタノールを加えて沈殿させた。溶解
と沈澱の操作を繰返して、回収されたＲＮＡ中に少しで
も残存するホルムアミドを除去した。

【００１３】ｕＴＰＡ ｃＤＮＡの３′配列の製造 ｕＴＰＡ ｃＤＮＡの第一ストランドは次のようにし
て、単離されたｍＲＮＡから製造した。ＲＮＡを５０ｍ
ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ₂ 、各々１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２５μｇ／ｍｌオリゴーｄＴ
_12-18 、５０μ／ｍｌアクチノマイシンＤ、３０ｍＭ
２−メルカプトエタノール、０．５ｍＣｉ／ｍｌ（α³²
Ｐ〕ｄＣＴＰ、５０単位のＲＮａｓｉｎおよび４０単位
のＡＭＶ逆転写酵素とともに全量５０μｌ中で３７℃で
１時間インキュベートした。反応は２０ｍＭ ＥＤＴＡ
の添加により終了させた。次に反応混合物を、１０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、お
よび０．１％ドデシル硫酸ナトリウムで平衡化し、そし
て５０μｇ Ｅ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡで予備クロマトグ
ラフィーを行なったセファデックスＧ−１００カラムに
付した。

【００１４】ｍ−ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを含む
フラクションをプールし、エタノールを添加して沈澱さ
せた。回収したハイブリッドを３７℃で数時間０．５Ｎ
ＮａＯＨで処理し、氷酢酸で中和してからエタノール
で沈澱させた。

【００１５】ヌクレオチドトリホスフェートを、次のよ
うにして高塩濃度−エタノール沈澱で除去した。ＤＮＡ
を最初に２０〜５０μｌの水に溶解し、等量の４Ｍ酢酸
アンモニウムを添加した。２倍量のエタノールを加え−
７０℃で一夜放置した。溶液の温度を室温にもどし、遠
心分離でＤＮＡペレットを得た。この操作をさらに２回
繰返し、次いでペレットを７０％エタノールで１回洗う
ことにより、ＴＰＡ遺伝子の３′末端の大部分に相当す
る精製ｃＤＮＡ第１ストランドを得た。

【００１６】ｃＤＮＡ第１ストランドを、５０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
₂ 、２ｍＭ ＤＴＴ、７０ｍＭ ＫＣｌ、各々０．５ｍ
ＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを含有す
る全量１００μｌ中で、ｃＤＮＡ第２ストランドの合成
に使用した。この混合物にＤＮＡポリメラーゼ−クレノ
フラグメント２０単位を１５℃で２０時間加えた。ＤＮ
Ａを、１：１（ｖ／ｖ）のフェノールとクロロホルムの
混合物で抽出し、エタノールで沈澱させた。

【００１７】この二重鎖ｃＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼで
処理してヘアピン構造を除去するため、全量１００μｌ
中に３０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．４）、０．３Ｍ
ＮａＣｌ、４．５ｍＭ ＺｎＣｌ、および５０単位のＳ
１ヌクレアーゼを含む液中で室温に３０分間置いた。反
応を止めるため、ＥＤＴＡおよび１ＭトリスＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）を加え、夫々最終濃度を１０ｍＭおよび０．
１Ｍとした。ＤＮＡを前記のとおりフェノール−クロロ
ホルム抽出および高塩濃度でのエタノール沈澱の繰返し
により精製した。

【００１８】精製した二重鎖ｃＤＮＡ配列を次のように
してクローン化した。先ず二重鎖ｃＤＮＡに、６０ｍＭ
カコジル酸−０．１４Ｍトリス（ｐＨ７．６）、１ｍＭ
ジチオスレイトール、０．１ｍＭ ｄＣＴＰ、および
０．２μＣｉ／μｌの〔 ³Ｈ〕ｄＣＴＰを含む１００μ
ｌ反応液中で、オリゴーｄＣのテールを付けた。１０ｍ
Ｍ ＣｏＣｌ₂ を最終濃度１ｍＭとなるよう加え、５０
単位のターミナルデオキシトランスフェラーゼを１５℃
で１０分間加えた。反応を止めるために、ＥＤＴＡを１
０ｍＭ、ドデシル硫酸ナトリウムを０．１％加え、水で
２倍に希釈した。次に反応混合物をアガロースのゲル電
気泳動に付し、５００ｂｐまたはそれ以上の長さのｃＤ
ＮＡをゲルから回収した。

【００１９】このオリゴーｄＣテールを付したｃＤＮＡ
を、予めＰｓｔＩで直線化しオリゴーｄＧテールを付し
たｐＢＲ３２２ＤＮＡにアニールさせるため、全量０．
５ｍｌ中に１５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５
０ｍＭ ＮａＣｌ、および１ｍＭ ＥＤＴＡを含む液中
で６５℃、１０分間、次に４２℃で２時間処理した。ア
ニールされたＤＮＡは、予めＣａＣｌ₂ で処理して凍結
保存しておいたコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ（ＭＣ１０
６１）細胞を形質転換するために用いた。細胞とＤＮＡ
の混合物を氷上で２０分放置し、３７℃で７分間の熱シ
ョックを与え、続いて２０倍量のＬ−ブロスとともに３
７℃で４５分間インキュベートし、そして１５μｇ／ｍ
ｌのテトラサイクリンを含有するＬ−プレート上にプレ
ーテイングした。

【００２０】組換えクローンをニトロセルロースフィル
ターに移し、一セットのフィルターはテトラサイクリン
プレート上に置いて生存クローンを保存した。レプリカ
組換えクローンを含む二つ目のセットのフィルターは、
クロラムフェニコールプレート上に置いて３７℃で一夜
プラスミドの増幅を行なった。フィルターを処理してＤ
ＮＡを露出させた。フィルターのプレハイブリダイゼー
ションは、５０％ホルムアミド、３ＸＳＳＣ、５Ｘデン
ハート液、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、および１
００μｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡを含む液中
で、４２℃、２時間またはそれ以上の時間行なった。こ
のプレハイブリダイゼーション溶液にＴＰＡ ｃＤＮＡ
配列を有する³²Ｐ−標識プローブを加え、フィルター上
のＤＮＡとハイブリダイズさせた（４２℃、１８時間以
上）。フィルターを次に３ＸＳＳＣで４時間、６５℃の
０．１％ＳＤＳで３０分間洗浄し、そして再度３ＸＳＳ
Ｃで室温で３０分間洗浄した。フィルターを空気乾燥
し、増感スクリーンを使用してコダックＸＡＲ−５Ｘ線
フィルムに−７０℃で１６時間露出した。

【００２１】次に１０個の候補の陽性クローンを単離
し、サブクローン化し、前記の方法で再度スクリーニン
グした。繰返して陽性シグナルを示すクローンのみにつ
き、制限エンドヌクレアーゼ開裂による解析をした。ｐ
ＵＰＡ３２７と命名したクローンは、最も大きいｃＤＮ
Ａ挿入物（２．１５ｋｂ）を含んでいた。

【００２２】ｕＴＰＡ ｃＤＮＡの５′配列の製造 最大長のｃＤＮＡクローンにもｕＴＰＡの全コード配列
は含まれていなかったため、失なわれた５′配列を単離
するために次の方法を用いた。サイズの選択を行なわな
い点を除いては上記同様にｍＲＮＡを単離した。続い
て、次に示すプライマー伸長法によって、第一ｃＤＮＡ
ストランドを合成した。１００μｌ中に８０％ホルムア
ミド、１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．４）、
０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．２５μｇの７２ｂｐフラグメ
ント、および７０μｇのｍＲＮＡを含む反応混合液中
で、ＴＰＡ、ｃＤＮＡ（ヌクレオチド５５２−６２４）
の７２ｂｐ ＰｓｔＩフラグメントを、上記ｍＲＮＡに
アニールさせた。混合液を８５℃、５分間加熱および５
０℃で２０時間インキュベートして、ハイブリッド形成
を行なった。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの回収は、緩
衝液を水で３倍に希釈し、−２０℃で一夜エタノール沈
澱させて行なった。ｍＲＮＡの溶解および沈澱操作を再
度繰返して夾雑成分を除いた。第一ストランドｃＤＮＡ
合成の条件は、オリゴーｄＴを省略した以外は３′配列
に使用した条件と同じである。

【００２３】第二ストランドｃＤＮＡの合成は、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ−クレノウフラグメントのプライマー
（ヌクレオチド１−１５）として合成ペンタデカマー
（ＣＴＧＴＧＡ ＡＧＣ ＡＡＴ ＣＡＴ）を用いて行
なった。１００μｌ中に５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液
（ｐＨ６．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、および７０ｍ
ＭＫＣｌを含む中で、５００ｎｇのペンタデカマーを第
一ストランドｃＤＮＡとアニールさせるため、６５℃で
５分間、６５℃から４３℃で１５分間、４３℃で１５分
間処理し、混合物を使用するまで氷上に保存した。二重
鎖ｃＤＮＡは、３′配列について前記したのと実質上同
様にして合成およびクローン化した。

【００２４】プレートにまいて、スクリーニングおよび
サブクローニングした後、ｐＵＰＡ４３２と命名したク
ローンを同定した。このクローンは失なわれていた５′
コード配列を含み、クローンｐＵＰＡ３７２と６０ｂｐ
の重複部を有していた。

【００２５】全長ｕＴＰＡ ｃＤＮＡの製造 全長のヒト子宮ＴＰＡ遺伝子をコードする。ｃＤＮＡク
ローンを製造するに先立って、遺伝子の５′および３′
部分を配列決定した。このために、クローンｐＵＰＡ４
３２（５′コード配列）およびｐＵＰＡ３７２（３′コ
ード配列）を、マキサム−ギルバート化学デグラデーシ
ョン法およびサンガーのジデオキシヌクレオチド・チエ
インターミネーション法を組合せて分析した。得られた
ヌクレオチド配列を図１〜図３に示す。

【００２６】遺伝子の配列を決定した後、図４および５
に説明するようにして、完全ｃＤＮＡ遺伝子を製造し
た。プラスミドｐＵＰＡ４３２（５′配列）を、先ずＢ
ｇｌＩおよびＢｇｌＩＩの組合せで消化した。ポリアク
リルアミドゲルから４００ｂｐのＢｇｌＩ−ＢｇｌＩＩ
フラグメントを単離し、さらにＨａｅＩＩＩで部分的に
消化した。得られたＢｇｌＩＩ−ＨａｅＩＩＩフラグメ
ント（ヌクレオチド１１７−３８７）をポリアクリルア
ミドゲル上の電気泳動で精製した。フラグメントＰｓｔ
Ｉ−ＮａｒＩ（ヌクレオチド３２１−４４８）はＰｓｔ
ＩおよびＮａｒＩの消化の組合せおよび、続いてのゲル
電気泳動で単離した。このフラグメントをさらにＨａｅ
ＩＩＩで消化して６１ｂｐのＨａｅＩＩＩ−ＮａｒＩフ
ラグメントを生じさせた。ＢｇｌＩＩ−ＨａｅＩＩＩフ
ラグメントおよびＨａｅＩＩＩ−ＮａｒＩフラグメント
の両者を、ＢａｍＨＩおよびＮａｒＩ消化の組合せで直
線化したｐＢＲ３２２中にクローン化した。得られたク
ローン（ｐＵＰＡ−ＢｇｌＩＩ／ＮａｒＩと命名した）
から、ＢｇｌＩＩ−ＮａｒＩフラグメント（ヌクレオチ
ド１１７−４４８）、およびこれより大きいＢｇｌＩＩ
−ＳａｌＩフラグメントが単離された。

【００２７】プラスミドｐＵＰＡ３７２をＢｇｌＩＩで
消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩでブラント末端を形成
し、ＳａｌＩリンカーを加え、次いでＥ．ｃｏｌｉ中に
クローニングしてｐＵＰＡ３７２−ＳａｌＩを生じさせ
ることにより、該プラスミドｐＵＰＡ３７２のヌクレオ
チド２０９１のＢｇｌＩＩ部位をＳａｌＩ部位に変換し
た。続いてｐＵＰＡ３７２−ＳａｌＩをＮａｒＩおよび
ＳａｌＩの二重消化で開裂させて、ＮａｒＩ−ＳａｒＩ
フラグメント（ヌクレオチド４４８−２０９１）を得
た。

【００２８】次に、ｐＵＰＡ４３２からＧ−Ｃテールを
除去してＳａｌＩ部位を導入することにより、子宮ＴＰ
Ａ ｃＤＮＡのリーダー配列に遺伝子工学処理を加え
た。このＳａｌＩ部位の導入は、ＰｓｔＩ消化物からｃ
ＤＮＡを単離し、５′非翻訳領域でＳｆａＮ１で開裂
し、ＤＮＡポリメラーゼＩでブラント末端を形成し、Ｓ
ａｌＩリンカーを加え、ＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩの組
合せで消化し、ＢａｍＨＩとＳａｌＩでの二重消化で直
線化したｐＢＲ３２２ベクター中へクローニングするこ
とにより行なった。

【００２９】この遺伝子工学処理された子宮ＴＰＡリー
ダーを、ＸｈｏＩＩおよびＳａｌＩ消化の組合せで、ベ
クターから切り取った。このＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩフラ
グメント（ヌクレオチド７−１１７）を、ＢｇｌＩＩ−
ＮａｒＩ、ＮａｒＩ−ＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩ−Ｓａ
ｌＩの各フラグメントを上記のように連結して形成され
たＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩフラグメント（ヌクレオチド１
１７−２０９１）にスプライスした。ＳａｌＩ部位を両
端に持つ全長子宮ＴＰＡ遺伝子を、次いでｐＵＣ９ベク
ターのＳａｌＩ部位にクローン化した。図４および５参
照。このｐＵＣ９−ｕＴＰＡプラスミドを、ひき続いて
ｍＴＰＡをコードする組換えＤＮＡの製造に使用した。

【００３０】ｍＴＰＡ ＤＮＡの製造 図９において、天然ヒトｕＴＰＡは、その分子の三つの
アスパラギン残基、１２０，１８７および４５１位置で
Ｎ−グリコシル化されている（これらの位置はリーダー
配列のカルボキシ末端の隣りのアミノ末端グリシン残基
から数えたものであり、図１〜３の１１４，１８１およ
び４４５位置に夫々相当する。図１〜３においては、第
三リーダー開裂部位にすぐ続く位置を１位としてい
る。）。Ｎ−結合グリコシル化の認識配列は、Ａｓｎ−
Ｘ−（ＳｅｒまたはＴｈｒ）である。これらの位置の１
つもしくはそれ以上でのグリコシル化を防止するため、
本発明者らは、ｕＴＰＡ ｃＤＮＡのグリコシル化認識
配列中のアスパラギンをコードするＡＡＣまたはＡＡＴ
コドンをＣＡＡコドン（グルタミンをコードする）に置
き換える方法を採った。後に詳述するとおり、これらの
ミュータント部位（図９のＡ，ＢおよびＣ）は、次のミ
スマッチ・プライマーを用いて、インビトロ部位特異的
ミュータジエネシスにより造成した： （ａ） ミュータント位置Ａに対しては、 ＴＣＧＧＴＧＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＧＴＡＡ ＡＴＧＴＴＧＴ （ｂ） ミュータント位置Ｂに対しては、 ＣＡＡＣＧＣＧＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＧＴＴＧＧＴ ＧＣＡ （ｃ） ミュータント位置Ｃに対しては、 ＧＴＡＧＧＣＴＧＡＣＣＣＴＴＧＣＣＣＡＡＡＧＴ ＡＧＣＡ ミュータントＡ単鎖ＤＮＡをテンプレートとして用い、
ミュータントＡＢ，ＡＣ、およびＡＢＣも夫々製造し
た。最後に、ミュータントＢおよびＣを再結合してミュ
ータントＢＣを得た。こうして可能な７種類の全ての非
もしくは部分グリコシル化ヒトＴＰＡミュータントを製
造した。ミュータントのＡ，Ｂ，Ｃの記号は、ミュータ
ントが記号部位でＡｓｎコドンの代りにＧｌｎコドンを
有することを意味し、他の点では天然のＤＮＡと同一で
ある：従ってミュータントＡＢは部位ＡおよびＢでＧｌ
ｎコドンを有する。Ｇｌｎを用いたのは、単なる便宜上
であり、他の非Ａｓｎコドンを同様に使用できる。ま
た、Ａｓｎコドンを置き代える代りに、このＡｓｎコド
ンから２つ下流のＳｅｒもしくはＴｈｒコドンを他のコ
ドン、例えばＧｌｎで置き代えて同様の結果を得ること
ができる。

【００３１】部位特異的ミュータジエネシス インビトロ部位特異的ミュータジエネシスは、最初にス
ミスら、Ｇｅｎｅ，８，８１−８７，９９−１０６（１
９７９）により報告された方法を変形して次のようにし
て行なった。

【００３２】前記のミスマッチ化オリゴヌクレオチドプ
ライマーを、慣用法により、アプライド・バイオシステ
ムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）自動合
成装置を用いて合成した。

【００３３】図６で説明するとおり、ヒト子宮ＴＰＡを
コードするＤＮＡ（前記）をファージＭ１３ｍｐ１８
〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）またはニューイ
ングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）から入手可能〕中にクローニングし
た。プラスミドｐＵＣ９−ｕＴＰＡをＳａｌＩで消化
し、ｕＴＰＡ遺伝子を含むフラグメントを単離し、Ｓａ
ｌＩで切断しておいたＭ１３−ｍｐ１８ベクターの二−
ストランド体中に挿入した。次にｕＴＰＡの有意ストラ
ンド（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）を含むシングルスト
ランドのファージＤＮＡを単離して、オリゴヌクレオチ
ドにより行なわれるミュータジエネシスのテンプレート
として使用した。各ミスマッチ化オリゴヌクレオチドプ
ライマーを６５℃で１０分間、次いで室温で１０分間、
２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ₂ 、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭジチオスレイトー
ル、０．２ピコモルのシングルストランド化Ｍ１３−ｍ
ｐ１８−ＴＰＡ ＤＮＡ、および２０ピコモルの５′リ
ン酸ミスマッチ化オリゴヌクレオチドを含有する反応液
中で処理して、テンプレートにアニールさせた。次に、
３０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ₂ 、２ｍＭメルカプトエタノール、各１ｍＭのｄ
ＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰおよび１ｍＭの
ＡＴＰを含む等容量の緩衝液ＰＥをアニーリング反応混
合物に添加した。５−１０単位のＤＮＡポリメラーゼ−
クレノウフラグメントおよび３−５単位のＴ４リガーゼ
を添加し、１６℃で一夜インキュベートしてプライマー
の伸長を行なった。

【００３４】反応混合物を希釈し、コンピテントなＪＭ
１０５細胞の形質転換に使用した。ファージのプラック
に関し、その場（ｉｎ ｓｉｔｕ）でのミュータジエニ
ック・オリゴヌクレオチド・プラック・ハイブリダイゼ
ーション法で、³²Ｐ−標識ミスマッチ化プライマーを用
いて、所望のミュータントをスクリーニングした。この
方法は、所望のミュータントはプライマーと完全に相補
性であるが、天然型ＤＮＡは１もしくはそれ以上のミス
マッチ部分を含むことに基づくものである。即ち、適当
なハイブリッド形成条件下では、ミスマッチ化プライマ
ーがミュータントとハイブリッドを形成する程度は、天
然型とハイブリッドを形成するよりも大である。このハ
イブリッド形成能の相違が、所望のミュータントの選択
を可能とする。

【００３５】候補ミュータントを単離し、制限エンドヌ
クレアーゼ消化およびＤＮＡ配列決定により同定する。
所望のミュータントｕＴＰＡ遺伝子を、適当なＭ１３ｍ
ｐ１８−ＴＰＡミュータントの複製型のＳａｌＩ消化に
よって単離した。

【００３６】図８に示すとおり、単離された各ミュータ
ントｕＴＰＡ遺伝子を、プラスミドｐＣＬＨ３ａｘのＸ
ｈｏＩクローニング部位へ挿入した（プラスミドｐＣＬ
Ｈ３ａｘは、ｐＢＲ３２２配列、マウスメタロチオネイ
ン遺伝子の５′調節配列を含む２０００塩基対およびＳ
Ｖ４０の３′調節配列を含む２３７塩基対を伴なうＸｈ
ｏＩクローニング部位を有する）。プラスミドｐＣＬＨ
３ａｘは、プラスミドｐＣＬ２８から図７に示すように
して製造した：出発プラスミドｐＣＬ２８をＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断し、メタロチオネイン遺伝子の方向を変える
ようにして再び連結した；この新たなプラスミドをＢｇ
ｌＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ＳＶ４０の２３７塩
基対ｐｏｌｙＡ領域を挿入した；最後にＢｇｌＩＩ部位
をＸｈｏＩリンカーの付加によってＸｈｏＩ部位に変換
した。得られたプラスミドをＸｈｏＩで切断して、単離
した各ｍＴＰＡ遺伝子を挿入した。各ミュータントＤＮ
Ａを含む各造成物をｐＣＴ〔ミュータント〕と命名す
る。ここで〔ミュータント〕は、夫々のｍＴＰＡがグリ
コシル化の防止のために修飾された部位を示す。例え
ば、部位Ａの修飾を含む造成物はｐＣＴＡと命名され
る。

【００３７】造成の最終工程は、哺乳動物宿主細胞の感
染をひき起すウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）をコー
ドする配列の付加である。プラスミドｐＢ２−２を酵素
ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化して、ＢＰＶゲノムを
含む７．９ｋｂフラグメントを生じさせた。このフラグ
メントを、予め同じ二種の酵素で消化したｐＣＴ〔ミュ
ータント〕中へ連結した。この最終造成物（ｐＣＡＴ
〔ミュータント〕）は、５′メタロチオネイン調節シグ
ナル部分、修飾ｕＴＰＡ遺伝子、ＳＶ４０の３′シグナ
ル部分（ポリＡ付加部位とともに）、および完全ＢＰＶ
ゲノムを含む。これらｐＣＡＴ〔ミュータント〕発現ベ
クターを、次いで哺乳動物宿主細胞に感染させて発現さ
せ、修飾されたｕＴＰＡ蛋白質を単離するために使用し
た。

【００３８】哺乳類細胞の感染（トランスフェクショ
ン） ウイグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら、Ｃｅｌｌ，１１，２２
３（１９７７）の感染技術の変法を用いて、次のように
して、ｐＣＡＴ〔ミュータント〕プラスミドＤＮＡをマ
ウスＣ１２７細胞中に導入した。

【００３９】ｐＣＡＴ〔ミュータント〕ＤＮＡの５−２
０μｇを、１０μｇの担体サケ精子ＤＮＡを含有する２
４０ｍＭ ＣａＣｌ₂ ０．５ｍｌ中へ添加した。この溶
液を、等量の２ＸＨＢＳ（２８０ｍＭ ＮａＣｌ、２０
ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび１．５ｍＭ リン酸ナトリウ
ム；ｐＨ７．１）中へ泡立てながら加えた。室温で３０
分間リン酸カルシウム沈殿を形成させ、５×１０⁵ 個の
Ｃ１２７細胞を感染の２４時間前にプレーテイングし
た。リン酸カルシウム沈澱が生じている間に、細胞増殖
培地を交換した。リン酸カルシウム沈澱を細胞に加え
て、３７℃で６−８時間インキュベートした。ＤＮＡを
除去し、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐ
Ｈ７中の２０％グリセロールに室温で１−２分間暴露し
た。細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％仔牛血清（ＭＡバイ
オロジカルズ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、お
よび１０ｍＭ グルタミン（ＧＩＢＣＯ）を含むダルベ
ッコの修正培地１０ｍｌを添加した。培地を２４時間後
およびその後各３〜４時間毎に交換した。１４〜２１日
後にフォーカスが検出され、２１日後にクローニングリ
ング法（ｃｌｏｎｉｎｇ ｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）で
単離された。このフォーカスを分析のため増殖させた。

【００４０】感染細胞を、慣用手段で培養し、慣用手段
でｍＴＰＡを連続的に培養培地から収穫した。ｐＣＡＴ
〔ミュータント〕を含む形質転換Ｃ１２７細胞は、ｍＴ
ＰＡを高率に生産した。ＢＰＶベクター（これはＤＮＡ
コピー数の増大を果す）中での強力なメタロチオネイン
プロモーターが調節するｍＴＰＡの生産およびＢＰＶに
よる形質転換細胞の連続増殖特性は、相まってｍＴＰＡ
の大量生産の最適系を提供する。

【００４１】培養培地からのｍＴＰＡの抽出および精製 形質転換哺乳類細胞により生産された活性修飾ＴＰＡ
は、宿主細胞培養培地から回収した。細胞抽出物もしく
は培養培地からの活性ｍＴＰＡの精製は、一般に１）疎
水性アフイニテイ−クロマトグラフィー、そして２）抗
体アフイニテイ−クロマトグラフィーの工程を含む。こ
の方法は野生型のＴＰＡや、他の修飾型ＴＰＡにも応用
できる。詳細にはこれらの工程は以下のように行なう。

【００４２】疎水性アフイニテイ−クロマトグラフィー この工程は、宿主細胞培養培地中のｍＴＰＡを、例えば
トリスアクリルブルー（ＬＫＢ）、マクロソルブブル
ー、またはＣＭアフイゲルブルー（ＢｉｏＲａｄ）のよ
うなｍＴＰＡに結合できるが培養培地中の他の何種かの
蛋白質には結合しない染料との複合体にする工程を有す
る。（アフイゲルブルーは、ヒトのノイロブラストーマ
ラインから単離されたプラスミノーゲンアクチベーター
の本発明とは別の精製において、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ 沈
殿およびｐ−アミノベンズアミジン−セファロースクロ
マトグラフィーとの組合わせで使用されている；Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７０４，４５０
−４６０，１９８０。）培地を濾過して澄明化し、次い
で希釈又は濃縮することなく使用した。リン酸緩衝化生
理食塩水、０．０１％ツイーン、ｐＨ７．１で平衡化し
たトリスアクリルブルーマトリックス（ＬＫＢ）を５０
ｍｌ／ｌ加えた。上澄をトリスアクリルブルーマトリッ
クスに加え（２０ｍｌ／ｍｇ ＴＰＡ）（バッチ式結
合）、溶液を４℃で２時間、おだやかに攪拌した。マト
リックスを次に２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４、
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０１％ツイーン８０
で洗った。このＴＰＡ−含有物質を次に負荷率（ｌｏａ
ｄ ｆａｃｔｏｒ）５０％でゲル濾過カラムに注入し、
線速度８５ｃｍ／時間でゲル濾過を行った。トリスアク
リルブルーマトリックスから０．５Ｍアルギニン、０．
０２Ｍリン酸緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１
％ツイーン、ｐＨ７．４で溶出させた。ＴＰＡの回収率
は、一般的に９０−９５％であった。

【００４３】上記のとおり、この工程でトリスアクリル
ブルー以外のマトリックスを使用してもよい。その一例
は、ＣＭアフイゲルブルー（Ｂｉｏ Ｒａｄ）であり、
これはｍＴＰＡを同様に良好に結合し、トリスアクリル
ブルーと同様のパターンでｍＴＰＡを溶出する。

【００４４】アフイニテイークロマトグラフィー 精製を高度に達成する次の工程は、固体支持体カラム上
に固定化した抗ＴＰＡ抗体を使用するアフイニテイーク
ロマトグラフィーである。慣用手段で作られたポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗ＴＰＡ抗体のどちらでも
使用できる。

【００４５】好ましいアフイニテイークロマトグラフィ
ー工程は次のように行なわれる。トリスアクリルブルー
マトリックスから溶出した材料を、該溶出液中に含まれ
る全てのｍＴＰＡ活性を結合できるモノクローナル抗Ｔ
ＰＡセファロースマトリックス中に、４℃で非常にゆっ
くりと通過させる。適当な抗体は、スコットランドのバ
イオスコット社（Ｂｉｏｓｃｏｔｔ，Ｌｔｄ）またはア
メリカン・ダイアグノステイカ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）から市販されている。この抗体
をＣＮＢｒ活性化セファロースに、５ｍｇ抗体／ｍｌ樹
脂の量で結合させる。抗体マトリックスを０．１Ｍトリ
ス、ｐＨ８．０および０．０１％ツイーン８０で予め平
衡化し、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ツイーン８
０、０．１Ｍトリス、ｐＨ８．０で洗浄し、そして３．
０Ｍ ＫＳＣＮ、０．０１％ツイーン８０、０．１Ｍト
リス、ｐＨ８．０で溶出する。溶出は線速度６０ｃｍ／
時間で行ない、７０−８０％より高い回収率が得られ
る。次にこの濃縮されたｍＴＰＡを０．３ＭトリスＨＣ
ｌ、ｐＨ８．０、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０
１％ツイーン８０に対して透析する。

【００４６】抗体／セファロースカラムから回収された
精製ｍＴＰＡはＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動によれば５％
以下の夾雑成分を有する。還元条件で、多少の２−鎖Ｔ
ＰＡ（活性型；単鎖が好ましい型である）が観察され
た。精製工程で使用する緩衝液にアプロチニンを添加す
ることによって、２−鎖型を防止することができる。

【００４７】子宮ＴＰＡ ｃＤＮＡおよび修飾ｕＴＰＡ
の性状決定 上記のとおり、図１〜３には子宮ＴＰＡ ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列を、該ｃＤＮＡによってコードされると
逆算された子宮ＴＰＡのアミノ酸配列とともに示す。暫
定的プレプロ配列（ｔｅｎｔａｔｉｖｅ ｐｒｅｐｒｏ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ）はアミノ酸−３８から−１に相当す
る。図１中でアミノ酸＋１、−３および−６の前の各縦
線は、開裂部位を示す。グリコシル化可能部位は、Ａｓ
ｎ残基のＣＨＯで示されているが；２１５番の部位は実
際はグリコシル化されない。プラスミン開裂部位（単鎖
ｕＴＰＡが２−鎖ｕＴＰＡに変換される部位）は矢印で
示される。セリンプロテアーゼの活性中心の保存された
配列には、下線が施されている。図１〜３はまた、子宮
ＴＰＡ ｃＤＮＡと本発明で種々のアスパラギンコドン
をグルタミンコドンで置き代えた組換えＤＮＡ分子と
の、ヌクレオチド配列の相違を示す。これらの特定のア
スパラギンコドンを除去することにより、コードするＴ
ＰＡ分子のＮ−結合グリコシル化の程度を低めることが
できる。

【００４８】部分的もしくは非−グリコシル化がｍＴＰ
Ａの半減期に及ぼす影響を、半減期の測定及びそれらの
半減期と完全グリコシル化ｕＴＰＡの公知半減期との比
較により調べた。半減期測定は、ウサギを使用し、ＴＰ
Ａ注射後の各種時間に血液サンプルを採取し、存在する
ＴＰＡの活性及び量を夫々フイブリンプレートおよびＥ
ＬＩＳＡ検定で調べることにより行なった。この比較の
例として、以下にミュータントＡおよびＢＣの分析結果
を示す。

【００４９】ミュータントＡ ＴＰＡおよびミュータン
トＢＣ ＴＰＡの分析 インビボにおけるｕＴＰＡの半減期に対して、グリコシ
ル化が影響を及ぼすか否か調べるため、ウサギを動物モ
デルとして試験を行なった〔コレン（Ｃｏｌｌｅｎ）
等、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２３１：１
４６−１５２，１９８４〕。

【００５０】ニュージーランド白色家兎（４−５ポン
ド）に、耳の周辺の静脈から、５０−２００μｇの修飾
ＴＰＡまたは野生型ＴＰＡの５０−２００μｇ量を注入
した。このウサギの大動脈から１ｍｌの血液サンプル
を、直接３．８ｍｌクエン酸ナトリウム中へ、０時間目
および注射後３０秒、１分、２分、３分、４分、５分、
７分、１０分、１５分、２０分の設定時間後に採取し
た。サンプルを遠心分離して細胞を含まないプラズマを
得、これを検定まで凍結保存した。各野生型ＴＰＡおよ
び修飾ＴＰＡ毎に少なくとも３匹のウサギに注射を行な
った。データをプロットすると、試験された各ＴＰＡは
２−３分の同様な半減期を示した。しかしながら、長時
間（２０分）にわたってカーブを分析すると、修飾ＴＰ
Ａのあるものは、野生型ＴＰＡに比べてプラズマ中の濃
度が高いことが判明した。したがって、初期の急速な消
失速度は、試験された全てのＴＰＡについて近似してい
たが、２０分目までの消失速度は修飾ＴＰＡのあるもの
の方が低かった。その例を図１０に示す。表１は、ミュ
ータントＡおよびＢＣが野生型ＴＰＡより有意に遅い消
失速度を持つことを示唆する結果をまとめたものであ
る。

【００５１】

【表１】 これらの結果はＥＬＩＳＡ（ｎｇ／ｍｌ）および ¹²⁵Ｉ
−フイブリン溶解試験（ＭＩＵ／ｍｌ）の両方で測定し
た。

【００５２】⁺ｔＰＡサンプル（注射２０分後）は、フ
イブリン溶解活性の存在（＋）または不存在（−）を示
す。

【００５３】ＮＤ＝測定せず。

【００５４】次の実験は、ＥＬＩＳＡアッセイで検出さ
れた血液中の修飾ＴＰＡが生物学的に活性であることを
確認するために行った。ＴＰＡ活性は、 ¹²⁵Ｉ−フイブ
リンを用いたフイブリンクロット溶解アッセイおよび間
接的アミド基質溶解アッセイ（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ
ａｓｓａｙ）で決定した。結果を表１および図１０に示
すが、それによれば、ミュータントＡおよびＢＣは野生
型子宮ＴＰＡに比べてアッセイ法の如何にかかわらず、
長い消失時間を示した。

【００５５】上記の実験は、修飾ＴＰＡがプラズマ中で
生物学的活性を保持していることを示している。ミュー
タントのフイブリン溶解活性の更に別の試験は生体外お
よび生体中でのクロットの溶解によって行なった。修飾
はＴＰＡは最初に生体外での¹²⁵Ｉ−フイブリンクロッ
トに対する試験を行った。フイブリンクロットは、１０
ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含有する正常ヒトプール血漿０．５
ｍｌ中の１．５μＣｉの ¹²⁵Ｉフイブリン（ＩＢＲＩ
Ｎ，アメルシャム）および１０μｌのトロンボプラスチ
ンの混合物から作った。クロットは実験期間中３ｍｌの
プラズマ中に保持した。放出される放射活性のベースラ
インの安定化のために３７℃３０分間予備インキュベー
ションした後、同量の野生型またはミュータントＴＰＡ
を０．１〜２μｇ蛋白量で、該 ¹²⁵Ｉ−フイブリンクロ
ットに添加し、インキュベーションを３７℃で継続し
た。ＴＰＡ添加後の種々の時間に、サンプル５０μｌを
取り出し、溶液中の放射活性のカウントを行った。時間
ｔにおけるパーセントクロット溶解の計算は、時間ｔに
おける溶液中のカウント量を添加もしくは放出放射活性
カウント総量（１００％ソリュブル）で割って計算し
た。図１１に、野生型ＴＰＡ、ミュータントＡのＴＰ
Ａ、ミュータントＢＣのＴＰＡを比較した、インビトロ
のクロット溶解の結果を示す。図１１のグラフに見られ
るとおり、各特定の量について、修飾ＴＰＡのフイブリ
ン溶解活性は、野生型ＴＰＡの活性と同程度であった。

【００５６】次に修飾ＴＰＡの、インビボにおけるフイ
ブリンクロットに対するフイブリン溶解活性を試験し
た。兎プラズマを使用したとき、インビボのクロット溶
解試験の感度向上が認められたので、インビボのクロッ
ト溶解実験のために同一の０．５又は１ｍｌ ¹²⁵Ｉ−フ
イブリンクロットを作成した。このクロットを、１２ゲ
ージ針を用いて重さ４ポンドのニュージーランド白色兎
の頸静脈に投与した。耳周辺の静脈からＴＰＡを投与
し、頸動脈中のカテーテルを通してプラズマサンプルを
３０秒ないし３時間の間の各時間に抜き取った。ＴＰＡ
注入の各種パラメーターをテストした後、ＴＰＡを４５
μｇの大量投与に引き続いて、０．２５ｍｇ／時間の速
度で１１０分間の連続注入を行なうことが、兎での野生
型およびミュータントＡのフイブリン溶解活性の比較に
最適と判明した。図１２に示す如く、ミュータントＡの
ＴＰＡを注射された三匹の兎のフイブリン溶解活性は、
同量の野生型ＴＰＡを注射した兎よりも大きいことが観
察された。さらに、注入の間において、ミュータントＡ
蛋白質を含むプラズマサンプル中のアミドリシス活性の
方が野生型ＴＰＡの場合より大きいばかりでなく、注入
終了後の４０〜６０分後に血液中に存在するアミドリシ
ス活性もミュータントＡ ＴＰＡの方が野生型ＴＰＡを
投与した兎のプラズマサンプル中のものより大きかった
（図１３）。

【００５７】これらのインビボクロット溶解試験の結果
は、明らかにミュータントＡの長い生物学的半減期を示
しており、連続注入の期間にプラズマ中のＴＰＡの蓄積
の増加につながるものである。ミュータントＢＣについ
ても同様の結果が観察された。インビトロおよびインビ
ボの両方の生物学的アッセイから、二種のＴＰＡミュー
タントＡおよびＢＣは、測定法の如何にかかわらず常に
より長い排出時間を有し、その生物学的活性を保持する
と決論される。上記のとおり、循環血液中からの完全グ
リコシル化ＴＰＡの肝臓による排出は非常に速く、生物
学的半減期は約２分である（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏ
ｓｔａｓ．４６，６５８，１９８１）。従って、ＴＰＡ
は通常は注射では投与されず、大量を３時間かけて注入
することにより投与される。ｍＴＰＡの長い半減期は、
クロット溶解達成に必要な量を少なくするから、注入に
よることなく注射による治療を可能とする。

【００５８】用 途 本発明のｍＴＰＡは血栓治療の必要あるヒト患者、例え
ば術後患者、最近血栓による心筋梗塞をおこした患者お
よび深部静脈血栓症になやむ患者の血栓を溶解する治療
目的に使用される。ｍＴＰＡは薬学的に受容される担体
物質、例えば塩溶液と混合して、経口、静注等で投与し
たり、障害を受けた動脈又は心臓に注射して投与され
る。以下に例示的実施例を示す。

【００５９】

【発明の実施の形態】

実施例１ 大量投与による血栓の緊急的治療のため、５〜１０ｍｇ
の凍結乾燥ｍＴＰＡを生理食塩水と混合し、ｍＴＰＡの
大量を静脈から患者に投与するための注射器の筒内に入
れた。

【００６０】実施例２ 冠状動脈血栓の早急な溶解を目指す注入投与のため、約
１００ｍｇ／時間の凍結乾燥ｍＴＰＡを約１時間かけて
静脈から注入し、その後更に約３時間かけて約５０ｍｇ
／時間の静脈注入を行った。

【００６１】実施例３ 冠状動脈血栓の早急な溶解を目指す注入投与のため、実
施例２の処方によったが、但し、注入の前に生理食塩水
中の約１０ｍｇの大量ｍＴＰＡを静脈注射した。

【００６２】実施例４ 深部静脈血栓症のおだやかな溶解を目指す注入治療のた
め、生理食塩水に溶解した凍結乾燥ｍＴＰＡを約１５ｍ
ｇ／時間の割合で約１２ないし２４時間かけて静脈注入
した。

【００６３】他の態様も特許請求の範囲に含まれる。

【図面の簡単な説明】

【図１】隣接領域を含む、天然ヒト子宮ＴＰＡ遺伝子の
塩基配列を、本発明の組換えＤＮＡ分子中のコドンの置
き代え部分の例とともに示す一連の塩基配列図の最初の
図である。

【図２】図１のつづきを途中迄示す塩基配列図である。

【図３】図１および図２のつづきを最後迄示す塩基配列
図である。

【図４】完全ｕＴＰＡ ｃＤＮＡ配列の製造法を示す一
連の工程図の最初の図である。

【図５】図４のつづきを最後迄示す工程図である。

【図６】ｍＴＰＡをコードする組換えＤＮＡ分子の製造
法を示す工程図である。

【図７】本発明の哺乳類発現ベクターの製造法を示す一
連の工程図の最初の図である。

【図８】図７のつづきを最後迄示す工程図である。

【図９】Ｎ−グリコシル化部位およびジスルフイド結合
部位ならびに本発明におけるグリコシル化ミュータント
の部位を記入したヒト子宮ＴＰＡの模式図である。

【図１０】ｕＴＰＡおよびｍＴＰＡミュータントＡの生
体内における半減期を求めるためのグラフである。

【図１１】ｕＴＰＡおよびｍＴＰＡミュータントＡおよ
びＢＣの生体外における血栓溶解試験データを示すグラ
フである。

【図１２】ｕＴＰＡおよびｍＴＰＡミュータントＡおよ
びＢＣの生体内消失速度を調べるための血栓溶解試験デ
ータを示すグラフである。

【図１３】ｕＴＰＡおよびｍＴＰＡミュータントＡおよ
びＢＣの生体内消失速度を調べるための間接アミド基質
溶解試験データを示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/46 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/09 ＺＮＡ // Ａ６１Ｋ 35/50 7431−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ (72)発明者 ナンシー・シュン アメリカ合衆国マサチューセッツ州02181, ウェルズリー，ワシントン・ストリート 594エイ (72)発明者 ヴァームリ・ビー・レッディ アメリカ合衆国マサチューセッツ州01701, フレイミンガム，トゥー・ジョン・マック ィン・サークル（番地なし) (72)発明者 ジェフリー・エフ・レモント アメリカ合衆国マサチューセッツ州02165, ウェスト・ニュートン，フェアウェイ・ド ライブ 165 (72)発明者 ウィリアム・ダッコウスキ アメリカ合衆国マサチューセッツ州01721, アシュランド，オレゴン・ストリート 73 (72)発明者 リチャード・ダグラス アメリカ合衆国マサチューセッツ州01772, サウスボロ，エッジウッド・ロード 46 (72)発明者 エドワード・エス・コウル アメリカ合衆国マサチューセッツ州01756, メンドン，セミタリー・ストリート 11 (72)発明者 リチャード・ディー・パーセル・ジュニア アメリカ合衆国マサチューセッツ州02158, ニュートン，メイプル・アベニュー 17 (72)発明者 デービッド・タイ−ユイ・ロウ アメリカ合衆国マサチューセッツ州01752, マールボロ，ウェスタービュー・ドライブ 12

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 天然ヒトＴＰＡのＤＮＡ分子のＮ−結合
   炭水化物認識配列Ａｓｎ−Ｘ−（ここで、ＸはＳｅｒま
   たはＴｈｒを表す）をコードするＡｓｎ、Ｓｅｒまたは
   Ｔｈｒコドンの全部ではないが少なくとも一つを、別の
   アミノ酸をコードするコドンに置き換えて、ＴＰＡの前
   記炭水化物認識配列の該当位置に炭水化物成分が結合す
   ることを防止した点で天然のＴＰＡをコードするＤＮＡ
   分子と異なることを特徴とする、活性なヒトＴＰＡをコ
   ードする組換えＤＮＡ分子。
2. 【請求項２】 炭水化物部分の結合が防止された炭水化
   物認識配列が、ＴＰＡのカルボキシ末端に最も近い炭水
   化物認識配列である特許請求の範囲第１項記載の組換え
   ＤＮＡ分子。
3. 【請求項３】 前駆体炭水化物認識配列のＡｓｎコドン
   を非Ａｓｎコドンに置き換えた特許請求の範囲第２項記
   載の組換えＤＮＡ分子。
4. 【請求項４】 ＡｓｎコドンをＧｌｎコドンに置き換え
   た特許請求の範囲第３項記載の組換えＤＮＡ分子。
5. 【請求項５】 炭水化物部分の結合が防止された炭水化
   物認識配列が、ＴＰＡのアミノ末端に最も近い炭水化物
   認識配列である特許請求の範囲第１項記載の組換えＤＮ
   Ａ分子。
6. 【請求項６】 中央付近の炭水化物認識配列のコドンも
   置換された特許請求の範囲第５項記載の組換えＤＮＡ分
   子。
7. 【請求項７】 アミノ末端に最も近い炭水化物認識配列
   および中央付近の炭水化物認識配列におけるＡｓｎコド
   ンを非Ａｓｎコドンに置き換えた特許請求の範囲第６項
   記載の組換えＤＮＡ分子。
8. 【請求項８】 ＡｓｎコドンをＧｌｎコドンに置き換え
   た特許請求の範囲第７項記載の組換えＤＮＡ分子。
9. 【請求項９】 宿主哺乳類細胞中で活性あるヒトＴＰＡ
   をコードするＤＮＡ配列を発現させうる複製可能な発現
   ベクターであって、天然ヒトＴＰＡのＤＮＡ分子のＮ−
   結合炭水化物認識配列Ａｓｎ−Ｘ−（ここで、ＸはＳｅ
   ｒまたはＴｈｒを表す）をコードするＡｓｎ、Ｓｅｒま
   たはＴｈｒコドンの全部ではないが少なくとも一つを、
   別のアミノ酸をコードするコドンに置き換えて、ＴＰＡ
   の前記炭水化物認識配列の該当位置に炭水化物成分が結
   合することを防止した点で天然のＴＰＡをコードするＤ
   ＮＡ分子と異なることを特徴とする、活性なヒトＴＰＡ
   をコードする組換えＤＮＡ分子を含むことを特徴とする
   発現ベクター。
10. 【請求項１０】 宿主哺乳類細胞中で活性あるヒトＴＰ
    ＡをコードするＤＮＡ配列を発現させうる複製可能な発
    現ベクターであって、天然ヒトＴＰＡのＤＮＡ分子のＮ
    −結合炭水化物認識配列Ａｓｎ−Ｘ−（ここで、ＸはＳ
    ｅｒまたはＴｈｒを表す）をコードするＡｓｎ、Ｓｅｒ
    またはＴｈｒコドンの全部ではないが少なくとも一つ
    を、別のアミノ酸をコードするコドンに置き換えて、Ｔ
    ＰＡの前記炭水化物認識配列の該当位置に炭水化物成分
    が結合することを防止した点で天然のＴＰＡをコードす
    るＤＮＡ分子と異なることを特徴とする、活性なヒトＴ
    ＰＡをコードする組換えＤＮＡ分子を含むことを特徴と
    する発現ベクターでトランスフェクションした哺乳類細
    胞。