JPS62257395A - ラツト免疫グロブリンに対するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用±Ｉ 本発明はモノクローナル抗体に関する。更に詳しくいえ
ば、本発明はラット免疫グロブリンに対するモルクロー
ナル抗体、その製造方法およびその利用法に関するもの
である。

従来の技術 近年、主としてマウスの免疫系細胞を使い、その各種表
面抗原に対する抗体を利用して免疫系の働きや免疫疾患
発症の機序を解明する研究が大きく進歩した。

即ち、免疫系細胞はその表面に各種の抗原を持っており
、それらの表面抗原は免疫系細胞の種類、機能、分化の
程度等により変化するので、それらの表面抗原の各々に
対するモノクローナル抗体を用いて各種表面抗原の有１
■を調べることにより、免疫系細胞の同定（タイピング
）を簡単に行なえる様になったことが、免疫学の基礎研
究に大きく貢献している。

マウスの免疫系細胞表面抗原に対する抗体の大部分はマ
ウスの免疫系細胞をラットに免疫して得られたもので、
現在も同様な方法で新しい免疫系細胞表面抗原に対する
抗体の開発が盛んに行なわれている。

これらの抗体を用いて、マウスの免疫系細胞表面抗原を
調べる方法として、従来、これらの抗体にＦＩＴＣ（フ
ルオレセイン・イソチオシアネート）やＰＥ（フィコエ
リスリン）等の螢光色素、ＨＲＰＯ（西洋ワサビペルオ
キシダーゼ）やＡＰ（アルカリ性フォスファターゼ）等
の酵素、もしくはＩ２Ｊ、”Ｃ，３８等の放射性同位元
素のいずれかを標識し、表面抗原に反応した抗体を検出
する免疫測定法が用いられている（「免疫学実験入門」
■、標識抗体法；学会出版センター、　１９８１年）。

発明が解決しようとする問題点 しかしながら、上記のように抗体に螢光色素、酵素ある
いは放射性同位元素を標識する場合には、検出値を最適
とする様に、抗体と標識物質との結合比率を前もって決
定するための試験を行なう必要があり、これは極めて手
間のかかる作業である。

また、免疫系細胞のタイピングを行なう際には複数の抗
体を用いることが多いが、それらの抗体のすべてを標識
し、しかも夫々に対して同程度の検出感度を達成し得る
様にすることは極めて煩雑であると共に困難であるとい
う問題があった。

更に、標識物質を結合することにより抗体の反応性が低
下することもあり、このような場合は、高い検出感度で
精度の良いデータを出すことは困難であった。

前記の様にマウスの免疫系細胞表面抗原に対する抗体の
大部分はラット由来のものである。従って、ラットの抗
体く免疫グロブリン）のすべてに反応し、しかもマウス
の免疫系細胞および免疫グロブリンと交差反応しない抗
ラット免疫グロブリン・モノクローナル抗体があれば、
マウスの免疫系細胞表面抗原の検出は容易かつ正確なも
のとなる。

即ち、」１記のような特性のモノクローナル抗体にＦｒ
ＴＣ，ＰＥ等の螢光色素、ＨＲＰＯｌＡＰ等の酵素もし
くは＋２５１．１４Ｃ１３８等の放射性同位元素のいず
れかを、適当な比率で結合させた標識抗体を用意してお
けば、ラット由来の表面抗原に対する抗体は標識を行な
わずに検体にそのまま反応させ、その後に上記の標識モ
ノクローナル抗体を二次抗体として反応させることによ
り、容易に免疫系細胞の表面抗原を検出できる。この方
法を用いれば、従来の様にすべてのラット由来の抗体の
各々に標識を行なう必要が無くなり、極めて便利になる
。しかもどの抗体を用いても、同じ感度で正確な反応結
果が得られるという利点がある。

これ迄にも同様の目的でラット免疫グロブリンに特異的
に反応するモノクローナル抗体を作り出す試みはなされ
ているが、ラットとマウスは近縁種であるため、マウス
以外のラビット等を免疫感作動物として用いた場合はラ
ット免疫グロブリンとマウスの免疫系細胞表面にあるマ
ウス免疫グロブリンのいずれに対しても交差反応する抗
体しか得られず、上記のような目的には使えなかった。

更に、マウス免疫系細胞への交差反応を無くするために
、マウスを免疫感作動物として用いた例もあるが、その
場合はラット免疫グロブリンに反応するモノクローナル
抗体が出来にくく、うまくラット免疫グロブリンに反応
するモノクローナル抗体が取れても、一部のラット免疫
グロブリンにしか反応しなかったり、反応性が弱〈従来
の方法と比べて検出感度が劣るために、あるいはやはり
マウス免疫グロブリンへの交差反応が見られるために、
実用的なものでなかった。

このような状況の下で、上記の如きラットの抗体（免疫
グロブリン）のすべてと反応し、かつマウスの免疫系細
胞および免疫グロブリンと交差反応しない抗ラット免疫
グロブリン・モノクローナル抗体を得、またこれを１−
業的に生産し得る方法を開発することは意義深いことで
あるが、このようなものは今のところ知られていない。

そこで、本発明の目的は上記のようなラット免疫グロブ
リンに対するモノクロ−ナル抗体を提供することにあり
、更に、該モノクローナル抗体を工業的に生産する方法
を提供すること、並びに該モノクローナル抗体を利用し
た免疫測定法　〈イムノアッセイ法）を提供することも
本発明の重要な目的を構成する。

問題点を解決するための手段 このような状況の下で、本発明者等は上記の如き目的と
する特性のラット免疫グロブリンに対するモノクローナ
ル抗体を得るべく種々検討、研究した結果、ラットの抗
体で感作した特定のマウスの牌細胞と骨髄＠（ミエロー
マ）細胞との融合細胞、即ちハイブリドーマを使用する
ことが有利であることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明のモノクローナル抗体は、ラット免疫グロ
ブリンのアイソタイプＩｇＧ＋　、１ｇＧ２いＩｇＧ２
ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＭのすべてに特異的に反応す
るものであり、特にアイソタイプＩｇＧ、　に属するも
のである。

このようなモノクローナル抗体は本発明によれば以下の
ようにして製造することができる。即ち、ラット免疫グ
ロブリンで免疫感作されたマウスの脾細胞とマウスの骨
髄腫細胞とを融合して、ラット免疫グロブリンに対して
特異的なモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得、
該ハイブリドーマを培養することにより目的のモノクロ
ーナル抗体を量産し得る。

上記本発明の方法においてバイブ＋ｊドーマの形成は、
融合に用いる細胞の調製、ポリエチレングリコールによ
る細胞融合、クローニング（例えば限界希釈法）等の一
連の工程からなる従来公・知の技術に従って得ることが
できる。

上記ハイブリドーマを得るために用いる肝細胞としては
特にラットとはアロタイプの異なるＣ５７ＢＬ／６マウ
スが好ましい。これによってラット免疫グロブリンのす
べてに対して反応し、しかもマウスの免疫系細胞とは交
差反応しないモノクローナル抗体を得ることができる。

一方、脾細胞と融合すべきミエローマ細胞としては従来
公知の各種のものが利用できる。

得られたハイブリドーマの培養はｉｎ　ｖｉｔｒｏ、１
ｎｖｉｖｏのいずれも可能であり、例えばマウスの腹腔
内あるいはＲＰＭ１１６４ｆ）、イーグルＭＥＭ、など
の各種培地中で行うことができ、生成モノクローナル抗
体の精製は塩析法、カラムクロマトグラフィー法、電気
泳動法等の各種方法を適当に組合せることにより行う。

かくして得られる本発明のモノクローナル抗体は既に述
べたようにラット免疫グロブリンのアイソタイプのすべ
てと反応し、しかもマウスの免疫系細胞並びに免疫グロ
ブリンと交差反応しないものであることから、特にマウ
ス免疫系細胞の表面抗原を調べるのに適している。

廊涯 以上述べてきたように、免疫系細胞の同定を行う」１で
、各種表面抗原に対する抗体を使用することが有利であ
り、従来からこのような各種方法が提案されてきた。し
かしながら、従来使用されているこの種の抗体の大部分
はマウスの免疫系細胞をラットに免疫して得られたラッ
ト由来のものであることから、ラット抗体全てに反応し
、かつマウスの免疫系細胞および免疫グロブリンと交差
反応しない抗ラット免疫グロブリン・モノクローナル抗
体の開発が望まれていた。

そこで、このようなモノクローナル抗体を作製する試み
がなされたが、ラットとマウスとが近縁種であることか
ら目的とする抗体は得られなかった。更に、マウスを免
疫感作動物として使用しても、実用的なモノクローナル
抗体は得られなかった。

このような状況の下で、本発明者らは上記の失数例にお
ける原因がマウスへのラット免疫グロブリンの免疫感作
の方法にあると判断し、ラット（アロタイプａ）とは、
アロタイプの全く異なるマウスＣ５７ＢＬ／６（アロタ
イプｂ）をラット免疫グロブリンの免疫感作動物として
用いることにより、即ちマウスの免疫系がラット免疫グ
ロブリンを異物（抗原）として認識しやすい形で免疫感
作を行なうことにより、ラット免疫グロブリンのアイソ
タイプＩｇＧ＋　、ＩｇＧ２ａ、　ＩｇＧ２ｂ、　Ｉｇ
Ｇ、およびＩｇＭのすべてに極めて高い特異的反応を示
し、ラットとは近縁種であるマウスの免疫系細胞表面抗
原およびマウス免疫グロブリンには反応しないモノクロ
ーナル抗体を作り出すことに成功したものである。

かくして得られた本発明のモノクローナル抗体はラット
免疫グロブリンのアイソタイプのすべてに特異的に反応
し、しかもマウスの免疫系細胞および免疫グロブリンと
交差反応しないものであるので、マウスの免疫系細胞表
面抗原を調べる免疫測定法（イムノアッセイ法）におい
て有利に使用てき、その第１の方法は、既に述べたよう
に、本発明のモノクローナル抗体を螢光色素、酵素もし
くは放射性同位元素で標識し、ラット由来の抗体もしく
は抗血清に対する二次抗体として用いる免疫測定法にお
いて使用できる。

本発明のモノクローナル抗体を用いた別の測定法として
は、上記モノクローナル抗体にビオチンを結合させたも
のを用意しておけば、これを同様に二次抗体として用い
、さらに上記の各種標識物質のいずれかとアビジンもし
くはストレプトアビジンの結合物質を加えてビオチンと
反応させることにより、容易に免疫系細胞の表面抗原を
検出できる。この方法を用いれば、上記モノクローナル
抗体にビオチンを結合させておくだけで、免疫測定法が
変わってもそれに適した標識物質とアビジンもしくはス
トレプトアビジンの結合物質を選ぶことにより対応する
ことができ、さらに便利である。

かくして、本発明のモノクローナル抗体は、表面抗原に
反応するラット由来の複数の抗体に標識物質を結合する
手間を省き、安定かつ高検出感度の免疫測定法を実現す
ることを可能とする。

実施例 以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、
本発明の範囲は以下の例により何隻限定されるものでは
ない。

本発明のラット免疫グロブリンに対するモノクローナル
抗体の製造手１頼は次の通りである。

（ａ）　　動物への免疫感作および抗体産生細胞の調製
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに正常ラット血清から精製したラ
ット免疫グロブリンを免疫感作し、感作マウスの脾細胞
を調製して細胞融合に用いた。

ラット免疫グロブリンの精製方法：４５％硫安塩析法お
よびゲル濾過法を用いてラット血清中のアルブミン等の
免疫グロブリン以外の成分を取り除き、さらにプロティ
ンΔアフィニティーカラムを用いて免疫グロブリンを精
製濃縮した。

免疫方法：ＰＢＳ（ＩＪン酸緩衝食塩水）に溶かしたラ
ット免疫グロブリンにコンプリート・フロインド・アジ
ュバントを加えたものを４週令のＣ５７ＢＬ／６マウス
に、ラット免疫グロブリンの量で５０〜１（１０）μｇ
／匹ずつ皮下注射した。さらに１〜２週間の間隔で同一
のマウスに少なくとも２回、同様にして追加免疫を行な
った。この追加免疫はコンプリート・フロイント・アジ
ユバントを加えず静脈注射で行なっても良い。最終免疫
の３〜４日後に免疫感作マウスから部分採血を行ない、
オフクロー工法でマウス血清中にラット免疫グロブリン
に対する抗体ができていることを確認し、抗体濃度の高
いマウスの脾細胞を細胞融合に用いた。

脾細胞の調製方法：マウスから摘出した肺臓をＦｅ２　
（牛胎児血清）を含まないＲＰＭ１１６４０培地中で細
断し、培地中に脾細胞を懸濁させた。

１２０Ｏｒｐｍで５分間遠心分離を行ない上清を取り除
いた後、０．１７　Ｍの塩化アンモニウム溶液を加えて
赤血球を溶解させ、さらにＦｅ２を含まないＲＰＭ１１
６４０培地で２回、遠心分離（１２０Ｏｒｐｍ、　５分
間）により脾細胞の洗浄を行なった。

（ハ）骨髄腫細胞（ミエローマ）の調製ミエローマとし
てマウス由来の８−アザグアニン耐性株（ヒポキサンチ
ングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株）
であるＰ　３−　Ｘ６３−八ｇ８−Ｌｌｌ　　（Ｐ３Ｕ
１）［：カレント　トピックス　イン　マイクロバイオ
ロジー　アンド　イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏ
ｐｉＣ８ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｈｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＩｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ）、　８１．１−７　（１９７Ｂ））
を用いた。他にＰ３−ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１　（ＮＳ
−１）〔ユーロピアン　ジャーナル　オブ　イムノロジ
ー　（Ｂｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ）、６．　５１１−５１９　（１９７６）：］、］Ｐ
３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５．３　（Ｘ６Ｓ、６５３）　
［ニジ′　　ヤーナル　オブ　イムノロジー（Ｊ、Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏ）Ｂｙ　）皿１５４８−１５５０　（１９
７９）　］　、Ｓ　Ｐ　２　／　０−Ａｇ１４（ＳＰ−
２）Ｃネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、　２７６、２６
９−２７０　　（１９７８））等のミエローマを用いて
も良い。

あらかじめ８−アザグアニンを含むｌＯ％ＦＣ３−ＲＰ
Ｍ１１６４０培地で耐性を確認したミエローマを７５ｃ
ｄカルチヤーフラスコでｌＯ％ＦＣ３−ＲＰＭＴ１６４
０培地を用いて培養し、対数増殖期のものをＦｅ２を含
まないＲＰＭ１１６４０培地で２回、遠心分離（１２（
１０）ｒｌ１ｍ、　５分間）により洗浄して、細胞融合
に用いた。

（Ｃ）　　細胞融合 ポリエチレングリコール（分子量１５（１０））Ｉｇに
対しジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）０．３５ｍ１
を加え加熱融解させたものに、等量のＦｅ２を含まない
ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地を加え３７℃に保温したポ
リエチレングリコール溶液（ＰＥＧ溶液）を用いて細胞
融合を行った。

上記の如くして調製した骨髄腫細胞と脾細胞を１＋５−
１：１０の割合でＦｅ２を含まないＲＰＭ　１１６４０
培地中で混合し、１９（１０）ｒｐｍで５分間遠心分離
にかけ、上清を取り除いた。遠心管の底に残った細胞の
ペレットに、０．５ｍｌ　／マウス１匹胛細胞のＰＥＧ
溶液をピペットで少量ずつ、１〜２分かけて加えながら
、同時にピペットの先端でペレットをくずした。さらに
、３７℃に保温したＦｅ２を含まなイＲＰ　Ｍ　１１６
４０培地１０〜２０ｍ１を少量ずつピペットで加えなが
ら、ＰＥＧ溶液を攪拌し、稀釈した。

以上の操作で得られた細胞懸濁液を９０Ｏｒｐｍで５分
間遠心分離にかけ、」１清を取り除いた後、１０〜２０
％ＦＣ３−ＲＰＭ１１６４０培地に１０７個／ｍｌの細
胞濃度となる様に懸濁し、この懸濁液を９６穴マイクロ
プレートに１（１０）μｐ、／穴ず一つ分注した。

融合後の細胞は、温度を３７℃、炭酸ガス濃度を５％に
設定したＣ　０２インキュベーク−内で培養を行い、翌
日、ヒボキサンチン（１（１０）μＭ）、アミノプテリ
ン（０，４μＭ）、チミジン（１６μＭ）を含む１０％
ＦＣ３−ＲＰＭ１１６４０培地（ＨＡＴ培地）を１（１
０）μβ／穴ずつ加えた。

さらに、３７℃にて、５％炭酸ガス雰囲気下で培養を続
け、１〜２日毎に培地の色を調べ、培地のｐ■が低下し
て培地の色が黄色味がかって来たら、その都度、１（１
０）μβ／穴の培養液を抜き取り新鮮なＨΔＴ培地を１
（１０）μβ／穴ずつ加えた。

培養開始後７〜１０日目頃から脾細胞とミニロー７の融
合細胞だけが増殖を始め、コロニーを形成するのが観察
された。１０日目には融合していないミエローマはすべ
て死滅しており、交換用の培養液を、ＨＡＴ培地からア
ミノプテリンを除いたＨＴ培地に代えた。

（ｄ）　　クローニング 融合細胞の」ロニーが透過光により肉眼で観察できる程
度まで大きくなった穴について、培養液交換時の採取上
清を用いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりラッ
ト免疫グロブリンに対する抗体産生の有無を調べ、抗ラ
ット免疫グロブリン抗体の産生が認められた穴の融合細
胞のみ、限界稀釈法によりクローニングを行った。

酵素免疫測定法：ＥＬＩＳＡ用の９６穴マイクロプレー
ト（ダイナチック社）に、免疫感作に用いたラット免疫
グロブリンを濃度５μｇ　／ｍｌに稀釈した溶液を５０
μβ／穴ずつ分注し、１時間静置してコーティングを行
った。次に、０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０
−０．ＯＩＭ燐酸ナトリウム緩衝食塩水（ＰＢＳ　；ｐ
８７．２）で大向をよく洗浄した後、１％牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）−０，０１ＭＰＢＳを２（１０）μｌ／
穴ずつ分注し、３０分間静置してブロッキングを行った
。さらに、上記の洗浄液で大向をよく洗浄し、培養液の
採取」１清を５０μｌ／穴ずつ入れて１時間静置反応さ
せた後、再度上記の洗浄液で大向をよく洗浄し、二次抗
体としてＨＲＰＯ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識
ラビット抗マウス免疫グロブリン抗体〈ダコパッツ社）
を５（１０）倍稀釈した溶液を５０μｌ／穴ずつ分注し
、１時間静置反応させた。なお、ＨＲＰＯ標識ラビット
抗マウス免疫グロブリン抗体はラット免疫グロブリンへ
の交差反応が見られたので、ラット免疫グロブリンを結
合させたアフィニティーカラムを通して、交差反応のあ
る抗体部分を吸収してから用いた。

最後に、上記の洗浄液で大向をよく洗浄してから、オル
トフェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質液（４ｍｇ　　Ｏ
ＰＤ＋４μＡ　　３０％過酸化水素水／１０ｍ１ｐｔ１
５．０　クエン酸緩衝液）を５０μｌ／穴ずつ分注し、
室温下、暗所で３０分間反応させ、２Ｎ硫酸溶液５０μ
ｐ／穴を加えて反応を停止させた。

基質液の発色はエライザ−アナライザー（東洋側型（株
））を用いて、４９０ｎｍの吸光度により測定した。

限界稀釈法：フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウス
の胸腺細胞をＩＯ″個／ｍｎの濃度で懸濁させた１０％
ＦＣ３−ＲＰＭ　１１６４０＠地に融合細胞を加え、９
６穴マイクロプレートに、融合細胞の数が平均５．１お
よび０．５個／穴となる様に３つの区に分けて撒いた。

３７℃、５％炭酸ガス濃度雰囲気下で培養を行い、時々
各穴のコロニー数をカウントし、ｐＨが低下した穴は培
養液（１０％ＦＣ３−ＲＰＭ１１６４０培地）の交換を
行った。

コロニーがある程度の大きさになってから、各穴の培養
液上清を採取し、上述と全く同じ酵素免疫測定を用いて
、各穴の融合細胞の抗ラット免疫グロブリン抗体の産生
の有無と、同抗体が産生されている場合はそのラット免
疫グロブリンに対する反応性の強さを調べた。

ラット免疫グロブリンに対し強い反応を示した穴で、し
かも１つのコロニーだけが観察された穴の融合細胞を用
いて、」二連と同じ要領で、再度限界稀釈法によりクロ
ーニングを行った。

（ｅ）　　反応特性検査 この様にして得られたモノクローナル抗体の培養液上演
を用いて、モノクローナル抗体の反応特性を調べた。

即ち、”　（ｄ）クローニング゛′のところで述べた酵
素免疫測定法と類似の方法で、コーティングする試薬を
ラット免疫グロブリンの代わりにラット免疫グロブリン
の各アイソタイプＩｇＧ１．１ｇＧ２．。

’ｇＧ２ｂＳＩｇＧ２ｃおよびＩｇＭの各々を５μｇ　
／ｍｌに稀釈した溶液を異なる穴にコーティングし、後
は上述と同じ操作を行い、モノクローナル抗体の各アイ
ソタイプに対する反応を調べた。

その結果、ラット免疫グロブリンのすべてのアイソタイ
プに強い反応を示すモノクローナル抗体を産生ずる融合
細胞株（ハイブリドーマ）が１つあり、本発明のハイブ
リドーマ（Ｍ２１　）を得た。

このモノクローナル抗体のアイソタイプはＩｇＧ。

（に鎖）であった。

（ｆ）　　抗体の製作 ハイブリドーマ（Ｍ２１）をヌードマウスの腹腔に注射
し、２０日間該腹腔内で培養した後に腹水を採取し、こ
の腹水から本発明のモノクローナル抗体を精製した。

モノクローナル抗体の精製法：４０％硫安塩析法および
イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製を行い、５
ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法）により精製されたモノクローナル抗体の純度
が高いことを確かめた。

勿論、ハイブリドーマ（Ｍ２１　）をｉｎ　ｖｉｔｒｏ
で培養し、その培養液からモノクローナル抗体を精製し
てもよい。

以上の結果得られたモノクローナル抗体にピオチンおよ
びＦＩＴＣ（フルオレセイン・イソチオシアネート）を
各々標識し、ラット免疫グロブリン、マウス免疫グロブ
リンおよびマウス免疫系細胞への反応の特異性を調べた
。

第１図に酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で調べた、本発
明のモノクローナル抗体のラット免疫グロブリンの各ア
イソタイプに対する反応性を、又、第２図に酵素免疫測
定法で調べた、本発明のモノクローナル抗体のマウス免
疫グロブリンに対する反応性を示す。

’ＥＬＩＳΔの詳細については゛（ｄ）クローニング″
のところで述べた方法に準するものであるので省略する
。但し１、−次抗体としてビオチン化した本発明のモノ
クローナル抗体を用い、二次抗体としてＨＲＰＯ（西洋
ワサビペルオキシダーゼ）−アビジンを用いた。

第１図及び第２図より明らかな様に、本発明のモノクロ
ーナル抗体はラット免疫グロブリンには高い反応性を示
す（第１図参照）が、ラットと近縁種であるマウスの免
疫グロブリンには全く反応せず（第２図参照）、ラット
由来の抗体を用いてマウスの免疫系細胞表面抗原を調べ
る際に、本発明のモノクローナル抗体に各種標識物質を
結合させ二次抗体として用いることが可能であることが
分かる。

ＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体を二次抗体として用い
て、ＢΔＬＢ／ｃマウスのリンパ節細胞および脾細胞の
表面抗原を調べた結果を、第３図ないし第７図に示す。

螢光測定はＦＡＣ３Ｎ　（ベクトンディッキンソン社）
で行った。これらの図において、螢光測定結果は横軸に
明るさを、また縦軸に細胞数をとった光ヒストグラムと
して示した。また、図中の番号は夫々陽性細胞のピーク
（１）、陰性細胞のピーク（２）および−次抗体を反応
させていない細胞のピーク（３）を示すものである。

第３図および第４図は各々、ＢＡＬＢ／ｃ正常マウスの
リンパ節細胞表面のＴｈｙｌ、２抗原およびＧＫＩ、５
抗原を、抗Ｔｈｙｌ、２抗体（ラットＩｇＭ）および抗
ＧＫ１．５抗体（ラッ）ＩｇＧ２ｂ）を用いて測定した
結果である。

第５図、第６図および第７図は各々、ＢＡＬＢ／Ｃ正常
マウスの脾細胞表面のＬｙ−１抗原、Ｌｙ−２抗原及び
ＧＫＩ、５抗原を、抗Ｌｙ−１抗体（ラットＩｇＧ２ａ
）、抗Ｌｙ−２抗体（ラットＩｇＧ２ａ＞および抗ＧＫ
Ｉ、５抗体（ラッ）ＩｇＧｚｂ）を用いて測定した結果
である。

いずれもバックグラウンドの無い綺麗な反応特性が見ら
れ、ラット由来の抗体を用いてマウスの免疫系細胞表面
抗原を調べる際に、二次抗体として極めて有効であるこ
とが′６りかめれらた。第８図に、念のためにＢΔＬＢ
／ｃマウスの脾細胞に直接ＦＩＴＣ標識モノクローナル
抗体を反応させた場合と何も反応させなかった場合とを
比較した螢光測定の結果を示すが、本発明のモノクロー
ナル抗体はマウスの脾細胞と全く反応していないことが
分かる。

勿論、螢光色素としてＰＥ（フィコエリスリン）、ＴＲ
ＩＴＣ（テトラローダミンイソチオリアネート）等の他
の物質を利用してもよいし、螢光色素以外にもＨＲＰＯ
（西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ＡＰ（アルカリ性フ
ォスファターゼ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、乳酸
デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびチロシナー
ゼ等の酵素を標識して酵素免疫測定法の二次抗体として
用いたり、あるいは１２５３１Ｃ，３Ｈ，＋３１　■１
Ｇ２ｐ、３５Ｓ、４ＳＣａ、５１Ｃｒ、等゛の放射性同
位元素を標識して放射性免疫測定法の二次抗体として用
いることも可能である。

あるいは、本発明のモノクローナル抗体にビオチンを結
合させたものを二次抗体として用い、さらに検出用試薬
として上記の標識物質のいずれかにアビジンあるいはス
トレプトアビジンを結合させたものを反応させる測定法
に用いることも可能である。

発明の詳細 な説明した様“に、本発明のモノクローナル抗体はラッ
ト免疫グロブリンのアイソタイプのすべてに対して特異
的に反応し、かつマウスの免疫系細胞および免疫グロブ
リンと交差反応しないので、マウス免疫系細胞の表面抗
原を調べるのに有用である。このようなモノクロ−リー
ル抗体を用いた場合には、表面抗原に反応するラット由
来の複数の抗体に標識物質を結合する手間がいらず、し
かも安定して高い検出感度を達成し得る免疫測定法が提
供できることになる。

さらに、マウスの免疫系細胞以外に、例えばマウスの細
胞中の特定物質をラット由来の抗体や抗血清で調べる場
合にも、本発明のモノクローナル抗体を同様にして使う
ことができる。従って、本発明はマウスを用いた多くの
実験系に対して有効な手段を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のモノクローナル抗体のラット免疫グロ
ブリンに対する反応をＥＬＩＳＡ法で調べた結果を示す
グラフである。 第２図は本発明のモノクローナル抗体のマウス免疫グロ
ブリンに対する反応をＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で調べた結果を
示すグラフである。 第３図および第４図は、ＦＩＴＣを標識した本発明のモ
ノクローナル抗体を用いてＢΔＬＢ／ｃマウスのリンパ
節細胞への抗Ｔｈｙ１．２抗体および抗ＧＫ１．５抗体
の反応性をＦΔＣ３ｌＶで調べた結果を示すグラフであ
る。 第５図、第６図および第７図は、同様にＦＩＴＣを標識
した本発明のモノクローナル抗体を用いて、ＢＡＬＢ／
Ｃマウスの脾細胞への抗Ｌｙ−１抗体、抗Ｌｙ−２抗体
および抗ＧＫ１．５抗体の反応性をＦＡＣ３ＩＶで調べ
た結果を示すグラフである。 第８図はＦＩＴＣを標識した本発明のモノクローナル抗
体のＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞に対する反応性をＦＡ
Ｃ３ＩＶで調べた結果を示すグラフである。 （主な参照番号） １・・陽性細胞のピーク、 ２・・陰性細胞のピーク、

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）ラット免疫グロブリンのアイソタイプＩｇＧ＿１
   、ＩｇＧ＿２＿ａ、ＩｇＧ＿２＿ｂ、ＩｇＧ＿２＿ｃお
   よびＩｇＭのすべてに特異的に反応するモノクローナル
   抗体。
2. （２）アイソタイプＩｇＧ＿１に属する特許請求の範囲
   第１項記載のモノクローナル抗体。
3. （３）ラット免疫グロブリンで免疫感作されたマウスの
   脾細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合して得られたハイ
   ブリドーマを、培養液中もしくはマウスの腹腔内で培養
   することにより、培養液中もしくは腹水中にモノクロー
   ナル抗体を生成蓄積せしめ、これを採取精製することを
   特徴とする、ラット免疫グロブリンのアイソタイプＩｇ
   Ｇ＿１、ＩｇＧ＿２＿ａ、ＩｇＧ＿２＿ｂ、ＩｇＧ＿２
   ＿ｃおよびＩｇＭのすべてに特異的に反応するモノクロ
   ーナル抗体の製造法。
4. （４）上記モノクローナル抗体がアイソタイプＩｇＧ＿
   １に属するものであることを特徴とする特許請求の範囲
   第３項記載のモノクローナル抗体の製造法。
5. （５）上記ラット免疫グロブリンで感作されるマウスが
   Ｃ５７ＢＬ／６であることを特徴とする特許請求の範囲
   第３項または第４項記載のモノクローナル抗体の製造法
   。
6. （６）ラット免疫グロブリンのアイソタイプＩｇＧ＿１
   、ＩｇＧ＿２＿ａ、ＩｇＧ＿２＿ｂ、ＩｇＧ＿２＿ｃお
   よびＩｇＭのすべてに特異的に反応するモノクローナル
   抗体を螢光色素、酵素または放射性同位元素で標識し、
   これをラット由来の抗体もしくは抗血清に対する二次抗
   体として使用することを特徴とする免疫測定法。
7. （７）上記螢光色素がフルオレセイン・イソチオシアネ
   ート、フィコエリスリンおよびテトラローダミンイソチ
   オリアネートからなる群から選ばれる１種であることを
   特徴とする特許請求の範囲第６項記載の免疫測定法。
8. （８）上記酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカ
   リ性フォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グ
   ルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、
   乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびチロシ
   ナーゼからなる群から選ばれる１種であることを特徴と
   する特許請求の範囲第６項記載の免疫測定法。
9. （９）上記放射性同位元素が＾１＾２＾５Ｉ、＾１＾４
   Ｃ、＾３Ｈ、＾３＾２Ｐ、＾３＾５Ｓ、＾４＾５Ｃａ、
   ＾５＾１Ｃｒおよび＾１＾３＾１Ｉからなる群から選ば
   れる１種であることを特徴とする特許請求の範囲第６項
   記載の免疫測定法。
10. （１０）ラット免疫グロブリンのアイソタイプＩｇＧ＿
    １、ＩｇＧ＿２＿ａ、ＩｇＧ＿２＿ｂ、ＩｇＧ＿２＿ｃ
    およびＩｇＭのすべてに特異的に反応するモノクローナ
    ル抗体にまずビオチンを結合させ、得られる結合体をラ
    ット由来の抗体もしくは抗血清に反応させた後、螢光色
    素、酵素または放射性同位元素とアビジンまたはストレ
    プトアビジンとの結合体と反応させることを特徴とする
    免疫測定法。
11. （１１）上記螢光色素がフルオレセイン・イソチオシア
    ネート、フィコエリスリンおよびテトラローダミンイソ
    チオリアネートからなる群から選ばれる１種であること
    を特徴とする特許請求の範囲第１０項記載の免疫測定法
    。
12. （１２）上記酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼ、アル
    カリ性フォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、
    グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ
    、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびチロ
    シナーゼからなる群から選ばれる１種であることを特徴
    とする特許請求の範囲第１０項記載の免疫測定法。
13. （１３）上記放射性同位元素が＾１＾２＾５Ｉ、＾１＾
    ４Ｃ、＾３Ｈ、＾３＾２Ｐ、＾３＾５Ｓ、＾４＾５Ｃａ
    、＾５＾１Ｃｒおよび＾１＾３＾１Ｉからなる群から選
    ばれる１種であることを特徴とする特許請求の範囲第１
    ０項記載の免疫測定法。