JPS62232385A - シアナイドヒトラタ−ゼ酵素の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はシアナイドヒドラターゼの製法に関する。

ある種の真菌類は、シアン１こ物をホルムアミドまで分
解（減収）シうろシアナイドヒドラターゼ酵素ＥＣ，％
４．２．１．６６（このものはホルムアミドヒドロリア
ーゼと称これろこともある）を含む。

これに関係する文献としては、例えば「アーカイブズ・
オブ・バイオケミストリイ・アンド・バイオフィシツク
／Ｃ（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ、ａ
ｎｄＢｉｏｐｈｉｓｉｃｓ）Ｊ　ｊ５１　、４６８〜４
７４（１９７２）　　及び「ファイドパソロシイ（Ｐｈ
ｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇＹ）Ｊ　６７　。

１００１〜１００６（１９７７）がある。そのような真
菌類を、シアン１と物含有排出液の微生物学的処理に使
用でることが提案孕れてきている（例えば欧州特許第６
１２４９号参照）。このように提案きれた処理方法の開
発を今日まで抑制してきた一つ力問題点は、多くのシア
ナイドヒドラターゼ含有真菌類が植物、例えば小麦及び
殊に青色（ｃｙａｎｏｇｅｎｉｃ）植物（例：こうりや
ん）に対し病源となるＣとである。

ＣＭＩ３００５３３の細胞またはそれから誘導された変
異体もしくは突然変異体の細胞を、炭素源及び適切な無
機栄養源を含む水性培地中で好気培養し。

その培地からシアナイドヒドラターゼ含有真菌細胞を回
収することからなるシアナイドヒドラターゼ酵素の製法
が提供される。

また本発明によれば、シアン１ヒ物含有物質をシアナイ
ドヒドラターゼ″！ｔはシアナイドヒドラターゼ含有組
成物で処理してその中のシアン化物を分解することから
なるシアン１ヒ物含有物質の処理方法において、該シア
ナイドヒドラターゼまたはシアナイドヒドラターゼ含有
組成物が前記本発明の方法によって製造これたものであ
ることを特徴とする上記処理方法も提供てれろ。

本発明方法は回分式または好ましくは連続法でありうる
。適当には、本発明方法は、２０〜３４℃の範囲内の温
度、４．５〜Ｚ５の範囲内のｐＨ及び０．２５／時以下
の稀釈率で真菌細胞を連続培養し、そしてシアン１ζ水
素及び／または、シアンイオン源及び／または、培養条
件下でシアンイオン及び／またはシアンｌｌｌ５水素を
発生させる１こ合物、を同時に連続的に供給する、連続
法であるう本発明方法の条件下では、シアンイオンは、
普通、シアン１じ水素の形で培地中に存在するであろう
。

フサリクム・ラテリチワム・ニース株ＣＭ工３００５３
３　Ｖｉ、１９８６年２月６日にイングランド。

ＴＷ９　３ＡＦ、サーリイ、リッチモンド、キュク。

フエリイ・Ｖ−ンの「ザ・コモンウエルス・マイコロジ
カル・インスチテユート」に寄託された。

この株は小麦に対し病源とならず、下記の如き形態学的
性質を有する： 培地（１）ポテト・スクロース寒天（ＰＳＡ）２５０Ｅ
のポテトを洗い、さいの目に切り、１５ｐｓｉの圧力ク
ツカー中に１５分間入れる。次いでこの煮出物を２層の
モスリンを用い絞り出し、２％のグルコース及び２％の
寒天をその濁りＰ液に添加し、そしてこの培地をオート
クレーブ加熱し、分散させる。

培地（２）ンアペク・ドク−Ｘ　（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏ
ｘ　）（変性） 寒天（オキソイド：０ｘｏｉｄＨＣＤＡ）（ｒｏｘｏｉ
ｄＪは商標である）。

生育条件＝２５℃、数週間 生育速度：培地＋１１（ＰＳＡ）及びｆ２＋　（ＣＤＡ
　）でそれぞれ３日間で４．０　ｃｍ及び６日間で３．
０　ｃｍ生育の特性： 白色の上部菌糸を有する羊毛状、拡張するコロニイ。Ｐ
ＳＡでの下層は灰色がかつ定バラ色で深紅色ないし黄色
のいくつかの区画がある。

ＣＤＡではいく分か淡くなる傾向あり。場合により濃赤
色の色素が生成づれろ（殊に時間が経過したとき）。１
〜２週間後に、高所菌糸が褐色となり崩れる傾向がある
。次いで胞子褥が形成づれろにつれてコロニイはむしろ
スリム１じする。色はＰＳＡでは桃色ないし褐色、ＣＤ
Ａではサーモンピンク。浸出物は形成キれず、色素形成
は菌糸の色に従う傾向がある。

分生子： この微生物により小分生子生成芒れず、単−側生フイア
ライドから、ま九は短いフイアライドをもつ多岐１じ分
生胞子から大分生子が生成づれろ。古い培養物では分生
子が凝集して胞子褥を形成する（殊にＣＤＡで）。分生
子は鎌形から彎曲しｔ紡垂形まで種々。背腹性隔膜は３
ないし５０間で変えろが、若い培養物では５゜胞子寸法
は２５〜５０μ×２５〜４．０μ。

基部細胞はしばしば有茎（これに長い５隔膜胞子におい
て特に認められろ。）。膨張細胞は菌糸で生じ、場合に
エリ竿状芽胞は、間をｔ、ｔいて、卑−または釦状に生
じろ。

フサリウム・ラテリチウム・ニーズＣＭＩ３００５３３
　は、シアナイドヒドラターゼ活性に加えて、誘引性の
ニトリラーゼ活性を示−ｆ’、丁なわち、それはニトリ
ル類（有機シアナイド類）が対応する酸へ転１じづれろ
反らに触媒作用を及ぼ丁ように誘導≧れうる。従って二
−スＣＭＩ　３００５３３Ｈニトリラーゼ酵素源として
使用σれうる。フサリウム・ラテリチウム・ニースＣＭ
Ｉ３００５３３またはそれから誘導きれた変異体もしく
は突然賓異体の細胞を、炭素源及び適切な無機栄養源を
含む水性培地で好気培養することによるニトリラーゼ酵
素の産生も１本発明の範囲内である。

真菌類は二つの区別しうる形態で生育孕れうる。

丁なわち球状もしくはペレット状で生育づれろか、ある
いは真菌細胞が生育培地中に分散された拡散フィラメン
ト状ストランドであるときには分散された形で生育嘔れ
る。排出液（廃液）処理での使用のｔめには、真菌類は
、球ないしぺＶット状ではなく、分散され几形態で生育
することが重要である。ぺＶット状での生育はぺＶット
を介しての栄養及び気体の拡散により妨害嘔れろので、
そのような拡散は培養を非効率的にする。本発明方法の
培養段階を実施する条件は、分散てれｔ形態での生育を
促進てるような条件であるのが好ましい。

本発明方法の培養段階において真菌細胞は、炭素寸たは
酸素の制限の条件下で適当に生育しうる。

しかし、条件は、生育が炭素及び酸素の二重の制限の下
で効果的に起こるような条件であるのが好ましい。培地
は定義された培地、丁なわち炭素源以外に鉱物（無機）
塩のみを含み、定義嘔れない有機物質（例えば酵母エキ
ス）を何ら含まないもの、で、ｆＩ−１ろのが好ましい
。

本発明方法では適宜な炭素源を使用できるが、グルコー
スが好ましい。好捷しい窒素諒としては、硫酸アンモニ
９ム及び水酸１ト了ンモニクムがその例であり、ま友好
ましい燐源の例は、燐酸カリウム及び燐酸がある。本発
明方法が連続法である場合に、培地の主要成分は、本発
明方法が定常状態にある間に工程に供給源れる培地中に
下記の範囲内の濃度で存在てろのが好ましい。

Ｈ３ＰＯ４１０〜２０　ｍＭ Ｋ、３０．　　　　　　　　　８００〜１４０［］　ｑ
ＭｇＳ０４・７Ｈ，０７００〜１２００随グルコース（
１分子のＨ，０含む）１０，０００〜４０．０００　ｐ
（ＮＨ，）、Ｓｏ、　　　　　　　５００〜３０００ｐ
ｐｍ微量栄養　　　　　　　　０．１〜２０一定常状態
条件中の連続培養に供給泗れるべき非常に好適な培地は
下記の成分明度である。

１．１　　Ｍ　　Ｈ，ＰＯ４３２０ｍｌ　／　２０　　
ｌ微量金属類／ビオチン　　　１０　ｍｅ　／　２０　
１に、Ｓｏ、　　　　　　　　　　　２０　　ｇ／　２
０　１Ｍｇ５Ｏｎ・７Ｈｚ０　　　　　　１８９　／　
２０　　ｅグルコース／Ｈ，０２２３Ｒ／　　２０　１
（ＮＨ，）、Ｓｏ、　　　　　　　　５０　、！７／　
２０　　ｌ上記の微量金属類／ビオチン溶液は下記の成
分組成を有する（重量は１１当り）： Ｆ　ｅ　Ｃｅｓ　・６ＨｔＯ９，６９ ＣｕＳＯ４Ｈ５Ｈ，ｏ　　　　　　　　　　ろ、６　　
　ｇＭｎＳ（）４−４Ｈ２０３０，０Ｍ Ｚｎ　ＳＯ２・７Ｈ，０３８，０９ ビオチン　　　　　　　０．５２　　ｇシアナイドヒド
ラターゼ活性は、我々の英国特許出願第８６０４０６８
号（対応する日本特許出願は本件と同日に出願）明細書
に記載きれるように培地にシアンイオン源及び／または
シアン比水素源を添加イろことにより誘引できろ。その
ような添加は、細胞の培養の全期間にわｔりその他の栄
養と別個にあるいは一緒に行うことができる。好ましく
はシアン成分は、方法工程へ供給嘔れろ培地に対して、
シアン１じナトリクムまたはシアン１とカリウムのよう
なシアン１こアルカリの形で添加源れろ。連続法におけ
る培養の開始段階中は、最初は低濃度でシアン分を添加
して、培地中の真菌細胞のシアンに対する許容度が増加
するにつれて七の′ｌｌｋ度を次第に増大するのが最良
である。最後に、定常状態培養中は、一定の濃度で供給
することができろ。そのような一定濃度は、培地へ供給
でれる全媒質（丁なわち培地へ供給嘔れるてべての液体
供給物の合計）中で、少なくとも１５ｍＭであるのが適
当であり、好ましくは乾燥細胞型ｔ１ｇ当り２〜１０ｍ
モル、特に４〜６ｍモルである。我々は、定常状態中に
培地に供給嘔れる培質中のシアンイオンの濃度が高くな
ると、細胞中のシアナイドヒドラターゼ酵素の増大しｔ
活性をもｔら丁こと、及びその酵素活性の大きさはシア
ンイオン濃度の増加と共に線型的（正比例的）に増大て
ること。

を発見した。例えば、低濃度（５ｍＭ）のシアナイド（
シアンイオン）添加における培地１１ＩＩｌ当り毎分生
５３！埒れろホルムアミドμモルのｊｆＬ位での酵素活
性は５５であるが、高濃度（２０ｍＭ）の添加における
酵素活性は２２０阜位である。

本発明方法の培養段階について好ましい条件は下記の如
くである。

稀釈率：　０．０５〜０．１１／時 ｐＨ：　　５．０　〜６．０殊に５．５この工うな条件
は我々の英国特許出願第８６０４０６８号明細書に記載
嘔れている。

連続法におけろ培養段階中に、培地を培養槽から連続的
に取り出し、シアナイドヒドラターゼ含有細胞を適宜な
手段（濾過法が好ましい）によって、取り出し培地から
分離する。吹入ハで、この分離づれ几細胞を乾燥し、そ
して例えば押出法によす、ツらに処理して適宜な形態（
例えば凝集体ま九は粉体）の７アナイドヒドラターゼ含
有細胞剤を作ることができる。酵素を細胞から分離して
。

細胞から別７″Ｌ７を形で使用てろＯとができるが、普
通はこのようなことは必要とてれず、酵素は１通常はそ
れを含む細胞から分離づれずに使用てれる。

シアナイドヒドラターゼ含有真菌の菌糸は、我々の欧州
特許第６１２４９号明細書に記載きれている工うに固定
することができろが、このような改作も普通は実施され
ない。

本発明の方法で作られるシアナイドヒドラターゼ剤は、
シアン［し物含有水性排水の処理（例えば我々の欧州特
許第６１２４９号の方法による処理）の定めに非常に適
している。この酵素剤は高い貯蔵安定性（例えば１６０
日に及ぶ半減寿命）及び高い活性を有する。殊に高い活
性な有てろ酵素含有剤は１本発明方法の培養段階を酵素
″または炭素の制限条件下、または酸素及び炭素の両者
の二重制限条件下で実施する場合に作られる。活性は２
８〜３４℃、特に３０〜６２℃の範囲内の温度で生育し
た細胞で高い。

本発明方法の重要な利点は、小麦のような耕作植物を含
むほとんどの一般植物に対し病原とならない細胞中にシ
アナイドヒドラターゼ酵素が産生されることである。従
って、その酵素は従来よりも広い応用範囲で使用てろこ
とができろ。

本発明を以下の実施例にエリ説明する。

実施例１ この実施例は、真菌株フ廿すウム・ラテリチクム・二−
スＣＭＩ３００５３３が環境中で非病原性であることを
確認てろ几めに実施した。これを行う定めに、０の菌株
、フサリウム・グラミネアルム（Ｆ、　ｇｒａｍｉｎｅ
ａｒｕｍ）の二つの菌株及びフサリウム・グルモルム（
Ｆ、　ｃｕｌｍｏｒｕｍ）の一つの菌株の冬小麦栽培種
に対する病原性の調査研究を実施しｔ０フサリウム菌株
ＣＭＩ３００５３３が嘴てろ属の天然型菌株の多くのも
のの宿主は、小づい穀粒栽培作物であるので、高度に感
受性の小麦種を選定し、発病のために理想的な条件を与
えろことに決定しｔｏもしこのような条件下で発病づせ
ろことができないならば、これはその真菌が無発病力性
であることを示すであろう。ここで用いた小麦穐はフサ
リウム・クルモルムに対して感受性であるために選択さ
れたｏ 材料及び方法 被試験フサリウムの各単離菌株について、ｉｏｏｇの乾
燥小麦種子を、１ｍｌ当り２Ｘ１０　個１での分生子を
含む水性懸濁液で接種した。Ｃれをガラスジャーに入れ
て１５分間ローラーミル上で転勤（タンプリング）≧せ
、ペーパータオルまたは土壌に播種した。

１、　ペーパータオル試験 １００個の種子を、水に浸した特殊タイプのペーパータ
オル２枚の間に播き、２０℃においてポリエチレン袋中
に配置した。５〜６日後、苗の茎に褐色病変が存在てろ
か否かを検査しｔｏそのような病変が存在した場合には
、それを切開し、寒天に移した。寒天平板を２５℃で７
日間までづンキュペートし、フ廿すウム・ラテリチウム
菌株ＣＭＩ３００５３３及びその他の菌株の発育を記録
した。

２、土壌試験 １００個の種子を、２枚のシード・トレイ（２２Ｘ１６
Ｘ５ＣＭＬ）　　のレピントン・ユニバーサル・コンポ
スト（Ｌｅｖｉｎｇｔｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｃｏ
ｍｐｏｓｔ）中に播い九〇そして水を充分に与えｔ０各
ポットの上にアルミニウムの蓋を置いた。これらヲ１０
℃において８〜１０日間、子葉鞘の先端が丁度量るまで
インキュベー）Ｌ７ｔ、試験を１８〜２５℃の温室に４
〜６日間移して実施し之。苗に褐色病変が見られたとき
には、それを切開し、寒天平板に移しｔ０寒天平板を２
５℃で７日間までインキュベートし、フサリウム・ラテ
リチクム菌株ＣＭＩ３００５３３　及びその他の菌株の
発育を記録した。

結　　果 フサリウム・ラテリチウム菌株ＣＭＩ３００５３３馨含
む四つのフサリウム種単離菌株による三種の冬小麦栽培
種の接種に対でろ応答を下記表に示す。

Ｆ、クルモルム：ペーパータオル試験及び土壌試験の両
方で三種の栽培角のすべての菌を感染泗せた。

Ｆ、タラミネアルムの単離菌株に５７及びに１３８４　
：土壌試験でラピアー（Ｒａｐｉｅｒ）種を感染嘔せ。

Ｋ１３８４１ｄペーパータオル試験でアルマダ（Ａｒｍ
ａｄａ）種も感染させた。

Ｆ、ラテリチウム菌株Ｃ〜ｌｌ３００５３ろば、三稲丁
なわちラビアー、アルマダ及びブロック（Ｂｒｏｃｋ）
種のいずれの小麦に対しても病原とならないことが明ら
かである。

結　　　論 １、　この試験は、高感受性の小麦棟に対するフサリウ
ム・クルモルム及びフサリウム・グラミネアルムの単離
菌株の病原性を示すことができた。

２、同一条件下でフサリウム・ラテリチワム菌株ＣＭＩ
３００５３３は病原性でなかつ九〇実施例２ 炭素源としてグルコースを含む定義の培地を用いて６０
００１容積の容器でフサリクム・ラテリチウム菌株ＣＭ
Ｉ３０５３３’ｒ連続的に培養し元。そのグルコース濃
度は生育制限濃度であつｔ。ｐｉ−Ｈ−！５．０〜５．
８であり、稀釈率は０．０８〜０．１　ｈｒ　　であり
。

温度は３０〜３２′Ｃであった。シアンＩｔｓナトリワ
ムを栄養供給物に６１．５〜７３．５ｒｎＭの濃度で添
加し九０１４０時間にわたり、Ｉ１１！当り０．８１ｇ
以下のエタノールの生Ｆｙ：、をもたらす空気吹込量の
低減による酸素ストレスに培養物を付した。バイオマス
が１２．２〜１４３９／ｌ　　で生成づれ、そのシアナ
イドヒドラターゼ活性は、乾燥型ｆｔ１ｍ、！９　当り
毎分８１〜１２２．４μモルのホルムアミド生成に相当
するものであった（シアン化物の１２０ｍＭの溶液をｐ
Ｈ８，５及び２０℃で用いて検定した）。

実施例６ グルコースを炭素源及び制限栄養として含む定義の培地
を用いて６ｇの培地容積中でフサリ９ム菌株ＣＭＩ３０
０５３３を連続的に培養した。ｐｕは５．５〜６．０で
あり、稀釈率は０．０９〜０．１０　ｈｒ　−’であり
。

温間に３０℃であった。７２時間にわたり、シアンＩｔ
ｓナトリウム溶液を栄養に対して１２．５〜１３．５ｍ
Ｍの濃度（液体供給物合計中の濃度）で添加し几ところ
、１９５〜２５．５μモル／分／乾燥細胞ｍｇのシアナ
イドヒドラターゼ活性が得らｉ＊（１００ｍＭシアン１
ヒナトリウム溶液中でｐＨ８，５及び２０℃で検定）。

まｔその期間中にプロピオニトリルの溶液を栄養に対し
て１．７〜８．６ｍＭ　　（液体供給物合計中の濃度）
で添加し几。培養液をこの期間中に３回サンプリングし
、上澄液をプロピオニトリルについて分析し友が、いず
れも検出きれなかった（検出限度ｎ１ｍＭであつ７ｔ）
。そのような速度（量）でのプロピオニトリルの添加ハ
、最後のサンプリングの時点ででに、培養液中の８．６
　ｍＭの水準となるべきものであるから、ごのＣとはプ
ロピオニトリルを分解しつるニトリラーゼ酵素活性の存
在を示すものである、

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）真菌株￥フサリウム・ラテリチウム￥・ニースＣ
   ＭＩ３００５３３の細胞またはそれから誘導された変異
   体もしくは突然変異体の細胞を、炭素源及び適切な無機
   栄養源を含む水性培地中で好気培養し、その培地からシ
   アナイドヒドラターゼ含有真菌細胞を回収することから
   なるシアナイドヒドラターゼ酵素の製法。
2. （２）培養を、炭素または酸素の制限条件下もしくは炭
   素及び酸素両者の制限条件下で連続的に実施することを
   特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）培養中に、培地に対して、シアンイオン源及び／
   またはシアン化水素源を少なくとも１５ｍＭに相当する
   濃度（培地に供給される全培質中のシアンイオン及び／
   またはシアン化水素）で供給することを特徴とする特許
   請求の範囲第１または２項に記載の方法。
4. （４）炭素源がグルコースである特許請求の範囲第１〜
   ３項のいずれかに記載の方法。
5. （５）シアンイオン源及び／またはシアン化水素源を、
   乾燥細胞重量１ｇ当り２〜１０ｍＭに相当する全培質中
   濃度で培地に供給することを特徴とする特許請求の範囲
   第２項に記載の方法。
6. （６）シアンイオン源及び／またはシアン化水素源を、
   乾燥細胞重量１ｇ当り４〜６ｍＭに相当する全培質中濃
   度で培地に供給することを特徴とする特許請求の範囲第
   ５項に記載の方法。
7. （７）培養を４．５〜７．５の範囲内のｐＨで実施する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１〜６項のいずれか
   に記載の方法。
8. （８）培養を２８〜３４℃の範囲内の温度で実施するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１〜７項のいずれかに
   記載の方法。
9. （９）シアン化物含有物質をシアナイドヒドラターゼま
   たはシアナイドヒドラターゼ含有組成物で処理してその
   中のシアン化物を分解することからなるシアン化物含有
   物質の処理方法において、該シアナイドヒドラターゼま
   たはシアナイドヒドラターゼ含有組成物が特許請求の範
   囲第１〜８項のいずれかに記載の方法により製造された
   ものであることを特徴とする上記処理方法。
10. （１０）真菌株￥フサリウム・ラテリチウム￥・ニース
    ＣＭＩ３００５３３の細胞またはそれから誘導された変
    異体もしくは突然変異体の細胞を、炭素源及び適切な無
    機栄養を含む水性培地中で好気培養し、その培地からニ
    トリラーゼ酵素及びシアナイドヒドラターゼを含有する
    真菌細胞を回収することからなるニトリラーゼ酵素の製
    法。