JPS62224288A - シアナイドヒドラタ−ゼ酵素の製法 - Google Patents
シアナイドヒドラタ−ゼ酵素の製法Info
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- JPS62224288A JPS62224288A JP62035455A JP3545587A JPS62224288A JP S62224288 A JPS62224288 A JP S62224288A JP 62035455 A JP62035455 A JP 62035455A JP 3545587 A JP3545587 A JP 3545587A JP S62224288 A JPS62224288 A JP S62224288A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はシアナイドヒドラターゼの製法に関する。
ある種の真菌類は、シアン化物をホルムアミドまで分解
(減成)しうるシアナイドヒドラターゼ酵素E CNo
、11 、2 、1.68(このものはホルムアミドヒ
ドロリアーゼと称されることらある)を含む。
(減成)しうるシアナイドヒドラターゼ酵素E CNo
、11 、2 、1.68(このものはホルムアミドヒ
ドロリアーゼと称されることらある)を含む。
これに関係する文献としては1例えば「アーカイブズ
オブ バイオケミストリイ・アンド・バイオフィジック
ス(A rcl+1ves of B iocbemi
、 andn 1opl+1sics)」151.4
68〜474(1972)、「ファイトパンロジイ(P
byLopatl+o1ogy)」87.1(101
〜1006(1977)及び下記の「ザ・ジャパニーズ
・ジャーナル・オブ・ファーメンテ−ジョン・テクノロ
ジー(t、heJapanese J 、 Ferne
nt、 Tecl+nol」がある:Vol、 45.
No、 7 、p、 630−636(1967)Vo
l、 46.No、 10.p、 807−81
3(1968)Vol、 47.No、 10.p、
639−643(1969)及びVol、 48.N
o、 5 、p、 277−282;253−
290(1970)。
オブ バイオケミストリイ・アンド・バイオフィジック
ス(A rcl+1ves of B iocbemi
、 andn 1opl+1sics)」151.4
68〜474(1972)、「ファイトパンロジイ(P
byLopatl+o1ogy)」87.1(101
〜1006(1977)及び下記の「ザ・ジャパニーズ
・ジャーナル・オブ・ファーメンテ−ジョン・テクノロ
ジー(t、heJapanese J 、 Ferne
nt、 Tecl+nol」がある:Vol、 45.
No、 7 、p、 630−636(1967)Vo
l、 46.No、 10.p、 807−81
3(1968)Vol、 47.No、 10.p、
639−643(1969)及びVol、 48.N
o、 5 、p、 277−282;253−
290(1970)。
そのような真菌類を、シアン化物含有排出液の微生物学
的処理に使用することが提案されてきている(例えば欧
州特許第61249号参照)、このような目的のために
適当であるためには、真菌は、可成りの期間にわたり安
定かつ高活性のシアナイドヒドラターゼ酵素を含むのが
望ましい。
的処理に使用することが提案されてきている(例えば欧
州特許第61249号参照)、このような目的のために
適当であるためには、真菌は、可成りの期間にわたり安
定かつ高活性のシアナイドヒドラターゼ酵素を含むのが
望ましい。
本発明によれば、(A)炭素源及び適当な無機栄養物を
含む水性培地中で28〜34℃の温度、4.5〜7.5
のl) H及び0.11/時以下の稀駅率で微生物菌株
を連続的に培養すると同時にシアンイオン、及び/また
はシアン1ヒ水素、及び/または培養条件下でシアンイ
オン及び/またはシアン化水素を発生する化合物を、培
地に対して少なくとも15mMに相当する濃度(培地に
供給される媒質の合計中のシアンイオン及びまたはシア
ン〔ヒ水素)で連続的に供給し、そして(B)培地から
シアナイドヒドラターゼ含有細胞を回収する、各工程か
らなるシアナイドヒドラターゼ酵素の製法が提供される
。
含む水性培地中で28〜34℃の温度、4.5〜7.5
のl) H及び0.11/時以下の稀駅率で微生物菌株
を連続的に培養すると同時にシアンイオン、及び/また
はシアン1ヒ水素、及び/または培養条件下でシアンイ
オン及び/またはシアン化水素を発生する化合物を、培
地に対して少なくとも15mMに相当する濃度(培地に
供給される媒質の合計中のシアンイオン及びまたはシア
ン〔ヒ水素)で連続的に供給し、そして(B)培地から
シアナイドヒドラターゼ含有細胞を回収する、各工程か
らなるシアナイドヒドラターゼ酵素の製法が提供される
。
シアン化物含有物質をシアナイドヒドラターゼまたはシ
アナイドヒドラターゼ含有物質で処理してその中のシア
ン化物を分解することからなるシアン化物含有mWの処
理方法において、該シアナイドヒドラターゼが特許請求
の範囲第1〜9項のいずれかに記載の方法により製造さ
れたものであることを特徴とする上記処理方法も本発明
の範囲内である。
アナイドヒドラターゼ含有物質で処理してその中のシア
ン化物を分解することからなるシアン化物含有mWの処
理方法において、該シアナイドヒドラターゼが特許請求
の範囲第1〜9項のいずれかに記載の方法により製造さ
れたものであることを特徴とする上記処理方法も本発明
の範囲内である。
培地に添加されたシアンイオンは、培養の条件下でシア
ン1ヒ水素になる。
ン1ヒ水素になる。
微生物菌株は真菌類菌株であるのが好ましいが、適当な
細ai類菌株も使用しつる。本発明方法で1史用しうる
真菌類としては、ステムフィリウム・ロチ(S Lem
pl+yliun 1aLi)種、(例えばATCC1
1718) 、マイコレプトディスクス・テレストリス
(Mycoleptodiscus Lerrestr
is)種く例えばCB5231.53ン:フサリウム・
モニリフォルメ(F usariu*IIonilir
orme)種(例えば、オタワのカナダ農林省カルチャ
ー・コレクションから入手できるNo、3104゜SA
、49a、このものはCBS 161.82としても
寄託されている);ヘルミントホスボリウム・ソルグヒ
コラ()[e1mintl+osporium sor
gl+1cola)種、このらのはドレチスレラ・ソル
グヒコラ(D rechslernsorghicol
a)[とも称される(f3’lえばC[lS 249.
49):ベリコニア・キルキナタ(Periconia
circinata)種・(例えばCB S 263
.37);及びグロメレラ・ツカマオ・ンシス(G I
oserel Ia tucamancnsis)種<
rsえばCB S 132.37)がある。
細ai類菌株も使用しつる。本発明方法で1史用しうる
真菌類としては、ステムフィリウム・ロチ(S Lem
pl+yliun 1aLi)種、(例えばATCC1
1718) 、マイコレプトディスクス・テレストリス
(Mycoleptodiscus Lerrestr
is)種く例えばCB5231.53ン:フサリウム・
モニリフォルメ(F usariu*IIonilir
orme)種(例えば、オタワのカナダ農林省カルチャ
ー・コレクションから入手できるNo、3104゜SA
、49a、このものはCBS 161.82としても
寄託されている);ヘルミントホスボリウム・ソルグヒ
コラ()[e1mintl+osporium sor
gl+1cola)種、このらのはドレチスレラ・ソル
グヒコラ(D rechslernsorghicol
a)[とも称される(f3’lえばC[lS 249.
49):ベリコニア・キルキナタ(Periconia
circinata)種・(例えばCB S 263
.37);及びグロメレラ・ツカマオ・ンシス(G I
oserel Ia tucamancnsis)種<
rsえばCB S 132.37)がある。
上記のATCC番号は、米国メリーランド州(2085
2>ロックビレ、パーク・ローン・ドライブff 23
01のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
によって指定された番号であり、またCBS番号は、オ
ランダ国バアルンのザ・七ントラル、ビュウロウ・ヴア
・シュインメルカルチャーズによって指定された番号で
ある0本発明に使用することができ、文献に該酵素を産
生すると記載されているその池の真菌類としては、コレ
2)・トリチウム・グラミニコラ(Cof lecLo
trichumHraminicola)種、グロエオ
ケルコスボラ・ソルグヒ(G Ioeocercosp
ora 5orHbi)種、ヘルミントホスホリウlト
ツルキクム(1−[e1mintbospborium
Lurcicu+n)種、ヘルミントホスホリウム・マ
イディス(f(1mayd+s)!、ヘルミントホスポ
リウム・カルボヌl、(H、carbonum)種及び
ヘルミンl−ホスホリウム フォムナ(H、phonn
a)種がある。
2>ロックビレ、パーク・ローン・ドライブff 23
01のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
によって指定された番号であり、またCBS番号は、オ
ランダ国バアルンのザ・七ントラル、ビュウロウ・ヴア
・シュインメルカルチャーズによって指定された番号で
ある0本発明に使用することができ、文献に該酵素を産
生すると記載されているその池の真菌類としては、コレ
2)・トリチウム・グラミニコラ(Cof lecLo
trichumHraminicola)種、グロエオ
ケルコスボラ・ソルグヒ(G Ioeocercosp
ora 5orHbi)種、ヘルミントホスホリウlト
ツルキクム(1−[e1mintbospborium
Lurcicu+n)種、ヘルミントホスホリウム・マ
イディス(f(1mayd+s)!、ヘルミントホスポ
リウム・カルボヌl、(H、carbonum)種及び
ヘルミンl−ホスホリウム フォムナ(H、phonn
a)種がある。
好ましい真菌類菌株はフサリウム属閑株、殊に7サリウ
ム・ラテリヂウム(F usarium lateri
tium)のニース(Nees)株CM I 300
533である。
ム・ラテリヂウム(F usarium lateri
tium)のニース(Nees)株CM I 300
533である。
フ リウム・ラテリチウム・ニース株CM1.111)
0533は、1986年2月3日にイングランド、TW
9 3AF、サーリイ、リッチモンド、キュウ、フエリ
イ・レーンの「ザ・コモンウェルス・マイコロジカル
インスチチュート」に寄託された。この株は小麦に対し
病源とならず、下記の如き形態学的特質を有する: 培地(1)ポテト スクロース寒天(PSAン2509
のポテトを洗い、さいの目に切り、15psiの圧力ク
ツカー中に15分間入れる。
0533は、1986年2月3日にイングランド、TW
9 3AF、サーリイ、リッチモンド、キュウ、フエリ
イ・レーンの「ザ・コモンウェルス・マイコロジカル
インスチチュート」に寄託された。この株は小麦に対し
病源とならず、下記の如き形態学的特質を有する: 培地(1)ポテト スクロース寒天(PSAン2509
のポテトを洗い、さいの目に切り、15psiの圧力ク
ツカー中に15分間入れる。
次いでこの煮出物を2層のモスリンを用い絞り出し、2
%のグルコース及び2?6の寒天をその濁りP液に添加
し、そしてこの培地をオートクレーブ加熱し、分散させ
る。
%のグルコース及び2?6の寒天をその濁りP液に添加
し、そしてこの培地をオートクレーブ加熱し、分散させ
る。
培地(2) ツアペク・ドクス(Czal+ek −D
ox)(変性) 寒天(オキソイド:0xoid)(CD A)(’0x
oid」は商漂である)。
ox)(変性) 寒天(オキソイド:0xoid)(CD A)(’0x
oid」は商漂である)。
成育条件:25°C1数週間、
成育速度: 培地(1)(PSA)及び<2)(CDA
)でそれぞれ3日間で4.0cz及び3日間で3.0c
x 成育の特性; 白色の上部国光を有する羊毛状、拡張す
るコロニイ、PSAでの下層は灰色がかったバラ色で深
紅色ないし黄色のいくつかの区画がある。CDAではい
く分か淡くなる傾向あり、場合により濃赤色の色素が生
成される(殊に時間が経過したとき)、1〜2週間後に
、高所菌糸が褐色となり崩れる傾向がある0次いで胞子
褥が形成されるにつれてコロニイはむしろスリムCヒす
る0色はPSAでは桃色ないし褐色、ODAではサーモ
ンピンク。浸出物は形成されず、色素形成は菌糸の色に
従う傾向がある。
)でそれぞれ3日間で4.0cz及び3日間で3.0c
x 成育の特性; 白色の上部国光を有する羊毛状、拡張す
るコロニイ、PSAでの下層は灰色がかったバラ色で深
紅色ないし黄色のいくつかの区画がある。CDAではい
く分か淡くなる傾向あり、場合により濃赤色の色素が生
成される(殊に時間が経過したとき)、1〜2週間後に
、高所菌糸が褐色となり崩れる傾向がある0次いで胞子
褥が形成されるにつれてコロニイはむしろスリムCヒす
る0色はPSAでは桃色ないし褐色、ODAではサーモ
ンピンク。浸出物は形成されず、色素形成は菌糸の色に
従う傾向がある。
分生子、 この微生物により小分生子生成されず。
11を一側生フイアラドから、または思いフイアラドを
もつ多岐rヒ分生胞子から大分生子が生成される。古い
培養物では分生子が凝集して胞子前を形成する(殊にC
DAて)。分生子は鎌形から湾曲した紡錘形まで種々、
背腹性隔膜は3ないし5の間で変るが、若い培養物では
5゜胞子寸法は25〜50μ×2.5〜4.0μ。
もつ多岐rヒ分生胞子から大分生子が生成される。古い
培養物では分生子が凝集して胞子前を形成する(殊にC
DAて)。分生子は鎌形から湾曲した紡錘形まで種々、
背腹性隔膜は3ないし5の間で変るが、若い培養物では
5゜胞子寸法は25〜50μ×2.5〜4.0μ。
基部Mi胞はしばしば有茎(これは長い5隔膜胞子にお
いて特に認められる〉。
いて特に認められる〉。
1ffj張細胞は菌糸で生じ、場合により芽状芽胞は、
間を置いて、単一または鎖状に生じる。
間を置いて、単一または鎖状に生じる。
フサリウ14・ラテリチウム・二−スCM130053
3の4(1111aを好気培養することによりシアナイ
ドヒドラターゼ酵素を製造する方法は、我々の出願中の
英国特許第8604069号及び同第8607595号
の明細書(対応する日本特許出願は本件と同日に出願)
に記載され、特許請求されている。
3の4(1111aを好気培養することによりシアナイ
ドヒドラターゼ酵素を製造する方法は、我々の出願中の
英国特許第8604069号及び同第8607595号
の明細書(対応する日本特許出願は本件と同日に出願)
に記載され、特許請求されている。
真菌類は二つの区別しうる形態で生育されうる。
すなわち球状もしくはペレット状で生育されるが、ある
いはX菌細胞が生育培地中に分散された拡散フィラメン
ト状ストランドであるときには分散された形で生育され
る。排出液(廃液)処理での使用のためには、真菌類は
球ないしベレット状ではなく、分散された形態で生育す
ることが重要である。
いはX菌細胞が生育培地中に分散された拡散フィラメン
ト状ストランドであるときには分散された形で生育され
る。排出液(廃液)処理での使用のためには、真菌類は
球ないしベレット状ではなく、分散された形態で生育す
ることが重要である。
ベレット状での生育はベレットを介しての栄π及び気体
の拡散により妨害されるので、そのような拡散は培養を
非効率的にする6本発明方法の培養工程(A)を実施す
る条件は、分散された形層での生育を促進するような条
件であるのが好ましい。
の拡散により妨害されるので、そのような拡散は培養を
非効率的にする6本発明方法の培養工程(A)を実施す
る条件は、分散された形層での生育を促進するような条
件であるのが好ましい。
本発明方法の培養工程(A)において真菌細胞は、炭素
または酸素の制限の条件下で適当に生育しうる。しかし
、条件は、生育が炭素及び酸素の二重の制服の下で効果
的に起こるような条件であるのが好ましい、培地は定義
された培地、すなわち炭素源以外に鉱物(無機)塩のみ
を含み、定義されない有機物fT(例えば酵母エキス)
を何ら含まないもの、であるのが好ましい。
または酸素の制限の条件下で適当に生育しうる。しかし
、条件は、生育が炭素及び酸素の二重の制服の下で効果
的に起こるような条件であるのが好ましい、培地は定義
された培地、すなわち炭素源以外に鉱物(無機)塩のみ
を含み、定義されない有機物fT(例えば酵母エキス)
を何ら含まないもの、であるのが好ましい。
本発明方法では適宜な炭素源を使用できるが、グルコー
スが好ましい、好ましい窒素源としては、6HFaアン
モニウム及び水酸化アンモニウムがその例であり、また
好ましい清潔の例は、燐酸カリウム及び燐酸がある0本
発明方法が連続法である場6に、培地の主要成分は、本
発明方法が定常状態にある間に工程に供給される培地中
に下記の範囲内の濃度で存在するのが好ましい。
スが好ましい、好ましい窒素源としては、6HFaアン
モニウム及び水酸化アンモニウムがその例であり、また
好ましい清潔の例は、燐酸カリウム及び燐酸がある0本
発明方法が連続法である場6に、培地の主要成分は、本
発明方法が定常状態にある間に工程に供給される培地中
に下記の範囲内の濃度で存在するのが好ましい。
Hs P O−10〜20 aM
KISO4800〜 1.4001)l)IIIMg
so、・ 7H,0700〜 1,200pp瞬グルコ
ース(1分子のLO含む)io、ooo〜40,00O
pp鋼(N I[、)2S O4500〜 3.OOO
ppm微1栄養 0.1〜209
1)m定電状態条件中の連続培養に供給されるべき非常
に好適な培地は下記の成分組成である。
so、・ 7H,0700〜 1,200pp瞬グルコ
ース(1分子のLO含む)io、ooo〜40,00O
pp鋼(N I[、)2S O4500〜 3.OOO
ppm微1栄養 0.1〜209
1)m定電状態条件中の連続培養に供給されるべき非常
に好適な培地は下記の成分組成である。
1.mM H,Po、 32011/2
01v11量金属頚/ビオ+ ン10zN/ 20fK
t S O4201F/ 20m M g S O+・7 H2018y/ 201グルコ
ース/ H2023h/ 201(N H、L S O
450y/ 201上記の微量金m M /ビオチン溶
液は下記の成分組成を有する(重量は11当り): F eCL ・61(to 9.62C
uS O4・58 zo 3.69Mn
5 O4・4 [12030,0yZnS○4 ’ 7
H2O38,OIFビオチン
0.52g培地に対するシアンイオン源及び/またはシ
アン化水素源の添加は、細胞の培養の全期間にわたりそ
の他の栄養と別個にあるいは一緒に行なうことができる
。好ましくはシアン成分は、方法工程l\供給される培
地に対して、シアンfヒナトリウムまたはシアン化カリ
ウムのようなシアン化アルカリの形で添加される。連続
法における培養の開始段階中は、最初は低濃度でシアン
分を添加して、培地中の真菌細胞のシアンに対する許容
度が増加するにつれてその濃度を次第に増大するのが最
良である。最後に、定常状態培養中は、一定の濃度で供
給することができる。そのような一定濃度は、培地へ供
給される全媒質(すなわち培地へ供給されるすべての液
体供給物の合計)中で、少なくとも15+*Mであるの
が適当であり、好ましくは乾燥細胞重11g当り2〜1
0sモル、特に4〜6輪モルである。我々は、定常状態
中に培地に供給される培買中のシアンイオンの濃度が高
くなると、細胞中のシアナイドヒドラターゼ酵素の増大
した活性をもたらすこと、及びその酵素活性の大きさは
シアンイオン濃度の増加と共に線型的(正比例的)に増
大すること、を発見した。13’lえば、低濃度(5m
M)のシアナイド(シアンイオン)添加における培地1
11当り毎分生成されるホルムアミドパモルの単位での
酵素活性は55であるが、高濃度(20mM>の添加に
おける酵素活性は220単位である。
01v11量金属頚/ビオ+ ン10zN/ 20fK
t S O4201F/ 20m M g S O+・7 H2018y/ 201グルコ
ース/ H2023h/ 201(N H、L S O
450y/ 201上記の微量金m M /ビオチン溶
液は下記の成分組成を有する(重量は11当り): F eCL ・61(to 9.62C
uS O4・58 zo 3.69Mn
5 O4・4 [12030,0yZnS○4 ’ 7
H2O38,OIFビオチン
0.52g培地に対するシアンイオン源及び/またはシ
アン化水素源の添加は、細胞の培養の全期間にわたりそ
の他の栄養と別個にあるいは一緒に行なうことができる
。好ましくはシアン成分は、方法工程l\供給される培
地に対して、シアンfヒナトリウムまたはシアン化カリ
ウムのようなシアン化アルカリの形で添加される。連続
法における培養の開始段階中は、最初は低濃度でシアン
分を添加して、培地中の真菌細胞のシアンに対する許容
度が増加するにつれてその濃度を次第に増大するのが最
良である。最後に、定常状態培養中は、一定の濃度で供
給することができる。そのような一定濃度は、培地へ供
給される全媒質(すなわち培地へ供給されるすべての液
体供給物の合計)中で、少なくとも15+*Mであるの
が適当であり、好ましくは乾燥細胞重11g当り2〜1
0sモル、特に4〜6輪モルである。我々は、定常状態
中に培地に供給される培買中のシアンイオンの濃度が高
くなると、細胞中のシアナイドヒドラターゼ酵素の増大
した活性をもたらすこと、及びその酵素活性の大きさは
シアンイオン濃度の増加と共に線型的(正比例的)に増
大すること、を発見した。13’lえば、低濃度(5m
M)のシアナイド(シアンイオン)添加における培地1
11当り毎分生成されるホルムアミドパモルの単位での
酵素活性は55であるが、高濃度(20mM>の添加に
おける酵素活性は220単位である。
本発明方法の培養段階について好ましい条件は下記の如
くである。
くである。
稀釈率:0.05〜0.11/時
pt[:5.O〜6.0、殊に5.5
温度 :28〜34℃(最も高い酵素活性のためには特
に30〜32℃) 連続法における培養段階中に、培地を培養槽から連続的
に取り出し、シアナイドヒドラターゼ含有細胞を適宜な
手段(i濾過法が好ましい)によって、取り出し培地か
ら分離する0次いでこの分離された細胞を乾燥し、そし
て例えば押出法により、さらに処理して適宜な形n(例
えばit2集体または粉体)のシアナイドヒドラターゼ
含有細胞剤を作ることができる。酵素を細胞から分離し
て、細胞から別れた形で使用することができるが、普通
はこのようなことは必要とされず、酵素は、3m常はそ
れを含む細胞から分離されずに使用される。シアナイド
ヒドラターゼ含有真菌の菌糸は、我々の欧州特許第61
249号明細書に記載されているように固定することが
できるが、このような改作も廿通は実施されない。
に30〜32℃) 連続法における培養段階中に、培地を培養槽から連続的
に取り出し、シアナイドヒドラターゼ含有細胞を適宜な
手段(i濾過法が好ましい)によって、取り出し培地か
ら分離する0次いでこの分離された細胞を乾燥し、そし
て例えば押出法により、さらに処理して適宜な形n(例
えばit2集体または粉体)のシアナイドヒドラターゼ
含有細胞剤を作ることができる。酵素を細胞から分離し
て、細胞から別れた形で使用することができるが、普通
はこのようなことは必要とされず、酵素は、3m常はそ
れを含む細胞から分離されずに使用される。シアナイド
ヒドラターゼ含有真菌の菌糸は、我々の欧州特許第61
249号明細書に記載されているように固定することが
できるが、このような改作も廿通は実施されない。
本発明の方法で削られるシアナイドヒドラターゼ剤はシ
アン化物含有水性排水の処FW(r!Aえば我々の欧州
特許第61249号の方法による処T!Iりのために非
常に適している。この酵素剤は高い貯蔵安定性(例えば
130日に及ぶ半減寿命)及び高い活性を有する。殊に
高い活性を有する酵素含有剤は、本発明方法の培養段階
を酸素または炭素の制限条件下、または酸素及び炭素の
両者の二重制限条件下で実施する場合に作られる。特に
高活性の酵素含有剤は、本発明方法の培養工程を30〜
32℃の範囲の温度で実施したときにCヤられる。
アン化物含有水性排水の処FW(r!Aえば我々の欧州
特許第61249号の方法による処T!Iりのために非
常に適している。この酵素剤は高い貯蔵安定性(例えば
130日に及ぶ半減寿命)及び高い活性を有する。殊に
高い活性を有する酵素含有剤は、本発明方法の培養段階
を酸素または炭素の制限条件下、または酸素及び炭素の
両者の二重制限条件下で実施する場合に作られる。特に
高活性の酵素含有剤は、本発明方法の培養工程を30〜
32℃の範囲の温度で実施したときにCヤられる。
本発明を以下実施例により説明する。
丸1匠L
フサリウム菌株CMI 300533を、グルコース
が生育制限因子である定義培地での連続培養においてH
CNの存在下に生育させて、シアナイドヒFう9−セ活
性ヲZA引Lり、pH5,5及ヒo、05b−’の稀釈
率(稀釈速度〉において種々の温度で定常状態を設定し
た。この結果を表1に示す。これは。
が生育制限因子である定義培地での連続培養においてH
CNの存在下に生育させて、シアナイドヒFう9−セ活
性ヲZA引Lり、pH5,5及ヒo、05b−’の稀釈
率(稀釈速度〉において種々の温度で定常状態を設定し
た。この結果を表1に示す。これは。
最高の酵素活性が30〜32℃において誘引されたこと
、及びこの温度以下での生育が誘引活性を半減させるこ
とを示している。34℃での生育は、培地の疲労をもた
らす、酵素活性単位は、pt18.5において100+
aMのシアン化ナトリウムから1分間に生成されるホル
ムアミドのμモル数である。
、及びこの温度以下での生育が誘引活性を半減させるこ
とを示している。34℃での生育は、培地の疲労をもた
らす、酵素活性単位は、pt18.5において100+
aMのシアン化ナトリウムから1分間に生成されるホル
ムアミドのμモル数である。
1:・′ −に る晶 のン
フサリウム菌株CM I 300533を、グルコー
スが生育制限因子である定義培地での連続培養において
HCNの存在下に生育させて、シアナイドヒドラターゼ
の濃度を誘引した。 pH5,5、温度30℃及び稀釈
速度0.10h−1を一定にt、!持して種々の酸素供
給量で定常状態を設定した。誘引酵素を凍結乾燥し、シ
リカゲル上で4℃において貯蔵し、その酵素製剤の一部
分の試料を時間間隔を霞いて検定することにより酵素製
剤の安定性を監視した。
スが生育制限因子である定義培地での連続培養において
HCNの存在下に生育させて、シアナイドヒドラターゼ
の濃度を誘引した。 pH5,5、温度30℃及び稀釈
速度0.10h−1を一定にt、!持して種々の酸素供
給量で定常状態を設定した。誘引酵素を凍結乾燥し、シ
リカゲル上で4℃において貯蔵し、その酵素製剤の一部
分の試料を時間間隔を霞いて検定することにより酵素製
剤の安定性を監視した。
この結果を表2に示す、これは、培養物が酸素/炭素の
二重の制限の下に生育されたときに酵素の貯蔵安定性が
増すことを示している。
二重の制限の下に生育されたときに酵素の貯蔵安定性が
増すことを示している。
グルコースが生育制限因子である定義培地での連続培養
においてフサリウム菌株CMI 300533を生育
することにより、シアナイドヒドラターゼの誘引プロフ
ィルを測定した。pH5,5、温度30℃及び稀釈速度
0.10h−’を一定に維持して、種々の流入)I C
N濃度において定常状態を設定した。
においてフサリウム菌株CMI 300533を生育
することにより、シアナイドヒドラターゼの誘引プロフ
ィルを測定した。pH5,5、温度30℃及び稀釈速度
0.10h−’を一定に維持して、種々の流入)I C
N濃度において定常状態を設定した。
添f寸図は、誘引活性の大きさと、流入媒体中の少なく
とも24−Mまでのシアンイオン濃度との間の線型応答
を示すグラフである。このグラフにおいては、縦軸のミ
リモル単位の公称シアンイオンl農度に対して、横軸の
全活性(前記定義の通り)がプロットされている。
とも24−Mまでのシアンイオン濃度との間の線型応答
を示すグラフである。このグラフにおいては、縦軸のミ
リモル単位の公称シアンイオンl農度に対して、横軸の
全活性(前記定義の通り)がプロットされている。
人並1」−
炭素源としてグルコースを含む定義培地を用いて600
01!容の容器中でフサリウム菌株CM1300533
を連続的に生育した。そのグルコース濃度は、生育制限
濃度であった。p!−1は5.0〜5.8であり、稀釈
速度は0.08〜0.1h−’であり、温度は30〜3
2°Cであった。シアン化ナトリウムを61.5〜73
.5IIMcr)′a度で栄養供給流に添加した。培養
物を、通気(酸素供給)速度の低減によって酸素ストレ
スにけしたところ、0.81gエタノール/rの生成が
もたらされた。140時間にわたり、乾燥重量1jIg
当たり毎分81.0〜122.4μモルの生成ホルムア
ミドのシアナイドヒドラターゼ活性をもつバイオマスが
12.2〜14.3g/’fで生じた。
01!容の容器中でフサリウム菌株CM1300533
を連続的に生育した。そのグルコース濃度は、生育制限
濃度であった。p!−1は5.0〜5.8であり、稀釈
速度は0.08〜0.1h−’であり、温度は30〜3
2°Cであった。シアン化ナトリウムを61.5〜73
.5IIMcr)′a度で栄養供給流に添加した。培養
物を、通気(酸素供給)速度の低減によって酸素ストレ
スにけしたところ、0.81gエタノール/rの生成が
もたらされた。140時間にわたり、乾燥重量1jIg
当たり毎分81.0〜122.4μモルの生成ホルムア
ミドのシアナイドヒドラターゼ活性をもつバイオマスが
12.2〜14.3g/’fで生じた。
図面は実施例3の結果を示すグラフであり、縦軸はシア
ンイオン濃度(ミリモル)であり、横軸は酵素活性(屯
位/肩g)である。
ンイオン濃度(ミリモル)であり、横軸は酵素活性(屯
位/肩g)である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)(A)炭素源及び適当な無機栄養物を含む水性培
地中で28〜34℃の温度、4.5〜7.5のpH及び
0.11/時以下の稀釈率で微生物菌株を連続的に培養
すると同時にシアンイオン、及び/またはシアン化水素
、及び/または培養条件下でシアンイオン及び/または
シアン化水素を発生する化合物を、培地に対して少なく
とも15mMに相当する濃度(培地に供給される媒質の
合計中のシアンイオン及びまたはシアン化水素)で連続
的に供給し、そして(B)培地からシアナイドヒドラタ
ーゼ含有細胞を回収する、各工程からなるシアナイドヒ
ドラターゼ酵素の製法。 (2)微生物菌株は¥フサリウム¥(Fusarium
)属の菌株である特許請求の範囲第1項に記載の方法(
3)菌株は¥フサリウム・ラテリチウム¥(Fusar
ium lateritium)ニース(Nees)菌
株CM1300533またはそれから誘導された変異体
もしくは突然変異体である特許請求の範囲第2項に記載
の方法。 (4)培養工程(A)において微生物菌株を炭素または
酸素の制限条件下、あるいは炭素及び酸素の二重制限条
件下で培養する特許請求の範囲第1〜3項のいずれかに
記載の方法。 (5)炭素源がグリコールである特許請求の範囲第1〜
4項のいずれかに記載の方法。 (6)シアンイオン源及び/またはシアン化水素源を、
培地に対して、乾燥細胞重量1g当り2〜10ミリモル
に相当する範囲内の全媒質中濃度で供給する特許請求の
範囲第1〜5項のいずれかに記載の方法。 (7)シアンイオン源及び/またはシアン化水素源を培
地に対して、乾燥細胞重量1g当り4〜6ミリモルに相
当する範囲内の全媒質中濃度で供給する特許請求の範囲
第6項に記載の方法。 (8)pHは5.0〜6.0である特許請求の範囲第1
〜7項のいずれかに記載の方法。 (9)培養温度は30〜32℃である特許請求の範囲第
1〜8項のいずれかに記載の方法。 (10)シアン化物含有物質をシアナイドヒドラターゼ
またはシアナイドヒドラターゼ含有物質で処理してその
中のシアン化物を分解することからなるシアン化物含有
物質の処理方法において、該シアナイドヒドラターゼが
特許請求の範囲第1〜9項のいずれかに記載の方法によ
り製造されたものであることを特徴とする上記処理方法
。
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