JPS62198390A - 固定化プロテア−ゼの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はたんは（質を加水分解する際に触媒として用い
られる固定化プロテアーゼの製造法に関する。

〔従来の技術〕

酵素の固定化の方法としては、１）共有結合、イオン結
合、物理的吸着、生化学的親和力などにより不溶性の担
体に固定化する担体結合法、２）酵素どうしをグルタル
アルデヒドのような二（多）官能性試薬で架橋する架橋
法、３）低分子化合物を重合あるいは会合させるか、あ
るいは高分子化合物を可溶の状態から不溶の状態に移す
ことによって生ずる高分子ゲル（格子型）、マイクロカ
プセル、リポソームに包み込んだり、中空繊維（ホロー
ファイバー）、限外濾過膜に酵素を閉じ込める包括法、
４）これらを適当に組合わせた複合法、がある。これら
の固定化法はそれぞれ長所と短所をあわせもっており、
目的や酵素のａ類に応じて使い分ける必要がめる。

固定化プロテアーゼによるたんばく質の加水分解の研究
は、例えばチーズのカード調製またはビールの混濁防止
等を目的として広い範囲で行なわれている。この際、た
んばく質が表面荷電を有することから、プロテアーゼの
固定化方法としてはプロテアーゼが脱離しにくい共有結
合法が一般的に用いられている。

従来の共有結合法によるプロテアーゼを固定化する方法
として、共有結合可能な官能基（たとえばアミノ基また
はカルボキシル基）を有する担体（例えばシラン化アル
ミナ等）を多官能性架橋剤（例えばグルタルアルデヒド
）の溶液に接触させて共有結合させた後、洗浄して遊離
の多官能１呆僑剤を除去し、しかる後に該担体をプロテ
アーゼ浴液と接触させ活性化された官能基にプロテアー
ゼを共有結付させ、さらに塩溶欣（例えば塩化す）　Ｉ
Ｊウムの溶液等）にて未吸着のプロテアーゼを除いて固
定化プロテアーゼを得るという方法が行なわれている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら上記の従来の固定化方法では分解対象物が
表面荷電を有する高分子のたんばく質であるため、分解
中に固定化担体よりプロテアーゼが脱離し易く、固定化
プロテアーゼとしての活性が低下してゆくという問題点
があった。

〔問題点を解決するための手段〕 そこで、本発明者らは鋭意研究の結果、たんばく質の加
水分解中のプロテアーゼの脱離をなくシ、安定した固定
イヒプロテア７−ｔ！！を得る方法を見出したのである
。

すなわち本発明は順次、 ａ）共有結合可能な官能基を有する担体に架橋剤を共有
結合させ、 ｂ）上記結合した架橋剤にプロテアーゼを共有結合させ
、そして Ｃ）上記固定化されたプロテアーゼに再度架橋剤処理を
施すこと を特徴とする固定化プロテアーゼの製法である。

即ち、本発明によれば前記した従来の方法により得られ
た固定化プロテアーゼにさらに架橋剤処理を施すため、
固定化されたプロテアーゼ同士の間に新たな架橋結合が
生じる。このプロテアーゼ間の新たな架橋結合により、
たんは（質の加水分解時のプロテアーゼの脱離が防止さ
れるのである。

本発明で使用される担体は共有結合可能な官能基を有す
る有機または無機の担体が使用される。共有結合可能な
官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒ
ドリル基、水酸基等が挙げられるが、とりわけアミノ基
を有する担体が好ましい。こ扛らの官能基な有する担体
の具体ψ１」を挙げるとアミン基を有する無機担体とし
ては多孔質ガラスのアミノシラン誘導体（例えばｒ−ア
ミツブａピルトリエトキシシランにて表面処理された多
孔性ビーズ等）またはアルミナのアミノシラン誘導体が
あり好１しくけアルミナのアミノシラン誘導体が用いら
れる。ま九アミノ基を有する有機担体の具体例としては
キト−サン、多糖類誘導体（Ｄ−アミノベンジルセルロ
ース等）、ポリアクリルアミド誘導体、スチレン系樹脂
（ポリアミノポリスチレン等）またはポリビニルアルコ
ール誘導体等があり、とりわけキト−サンアミノエチル
セルロース、アミノエチルポリアクリルアミド、セファ
ロースのアミン誘導体、またはポリビニルアルコールの
誘導体が好ましい。また、カルボキシル基を有する担体
としてはアンパルライトＸＥ−６４、アンバーライトＩ
ＲＣ−５０などの無機担体があり、スルフヒドリル基を
有する担体としてはエンザクリルポリチオールなどの有
機担体があり、水酸基を有する担体としてはポリビニル
アルコールなどの何機担体がある。

本発明の固定化プロテアーゼの製法の実施に使用できる
多官能性架橋剤としては、グリオキザール、マロンアル
デヒド、スクシニルアルデヒド、グルタルアルデヒド、
ジアルデヒド殿粉などのポリアルデヒド類、ジエチルマ
ロンイミドまたはジエチルアジピンイミド等のイミドエ
ステル類、ジイソシアナート類または８−）リアジン類
等があり、好ましくはグルタルアルデヒドが挙げられる
。

本発明の固定化プロテアーゼの製法の実施に使用できる
プロテアーゼとしては、ペプシン、トリプシン、Φモト
リプシン、カテプシン等の動物起源のプロテアーゼ、パ
パイン、ブロメリン、フィシン等の植物起源のプロテア
ーゼ、担子菌プロテアーゼ、Ａ、　ｎｉｇｅｒ　＠性プ
ロテアーゼ、ん隷１ｔｏｉ酸性プロテアーゼ、んｏｒｙ
ｚａｅ中性プロテアーゼ、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉａ中性
プロテアーゼ、Ｂ、　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｇアル
カリプロテアーゼ、Ｓ。

ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼ等の微生物起源のプロテア
ーゼが使用されるが、好ましくはペプシンが使用される
。

本発明の固定ｊヒブロテアーゼの製法の実施にあっては
、前記した従来方法によりあらかじめ固定化プロテアー
ゼを得た後、次に再度多官能性架橋剤処理することによ
ケ固定されたプロテアーゼ間の架橋処理を行なう。プロ
テアーゼ間の架橋処理は、酸性プロテアーゼでは田４．
０付近、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼでは
ｐＨ７，５付近の緩衝液中で行なうのが好ましく、この
緩衝液中に適当な濃度になるように前記多官能性架橋剤
を存在させる（例えばグルタルアルデヒドの場合は１０
′ｓ程度〜）。次いで従来方法により調製された固定化
プロテアーゼの湿潤重量に対して３倍から１０倍の量の
多官能性架橋剤を含む緩衝液を固定化プロテアーゼに接
触させるかま九は固定化プロテアーゼを充填したカラム
に通塔させる。反応時間（接触時間）は４℃では約１時
間程度でよい。その後前記した緩衝液により、未反応の
多官能性架橋剤を除去し、より安定化した本発明の固定
化プロテアーゼを得る。

以下、実施例に従って本発明の固定化プロテアーゼの製
法を詳述するが、これに限定すべき主旨のものではない
。

実施例　１ １）　アミノシラン化アルミナ（粒子径５Ｂ；住友アル
ミ社製）に２．５−のグルタルアルデヒドをｐＨ７〜８
、室温の条件下で約１時間接触させ・た後、蒸留水で過
剰のグルタルアルデヒドを洗浄除去した。次に、ｐｉ（
４，Ｑに調整した０、０５Ｎ酢酸ナトリウム・塩酸緩衝
液１ｄにペプシン（アメリカ、シグマ社製）を５１９の
割合で溶解し、この液を前記の架橋剤処理したアミノシ
ラン化アルミナの湿潤重量１ｔに対して２−添加して４
℃で２４時間靜装した。次いで、ｐＨ４，Ｑに調整した
１Ｍ塩化ナトリウム溶液で未固定のペプシンを洗浄除去
した後、前記の０．０５Ｎ酢酸ナトリウム・塩酸緩衝液
で塩化ナトリウムを洗浄除去して、固定化ペプシンを得
た。

１１）前記により調製された固定化ペプシンを重量比６
倍〜１０倍の１０％グルタルアルデヒド（０，０５Ｎ酢
酸ナトリウム・塩酸緩衝液中、ｐｉ４４．０に調製）に
４℃にて１時間浸漬した。固定化ペプシンを分別し、０
０５Ｎ酢酸ナトリウム・塩酸緩衝液（Ｉｉ４４．０）で
洗浄して未反応のグルタルアルデヒドを除去した。この
ようにして本発明の固定化にプシンを得た。

実施例　２ １１１）実施例１と同様にしてアミノシラン化アルミナ
にグルタルアルデヒドを共有結合させ九。

次に１１１ｉ４７．５に調整した０、０５Ｎリン酸緩衝
液１−にサブチリシンＡ（デンマーク、ノボ社Ｈ）を５
９の割合で溶解し、この液を前記のグルタルアルデヒド
を共有結合させたアミノシラン化アルミナの湿潤重錘１
？に対して２−添加して、４℃で２４時間静置した。次
いで、声７．５Ｋａｌｌ整した１Ｍ塩化ナトリウム溶液
で未固定のサブチリシンＡを洗浄除去した後、前記の０
０５Ｎ！／ン酸緩衝液で塩化ナトリウムを洗浄除去して
、固定化サブチリシンＡを得た。

＋Ｖ）　　前記により調製された固定化サブチリシンＡ
を重量比３倍〜１０倍の１０チグルタルアルデヒド（０
，０５Ｎ　＋７ン酸緩衝液中、μｍ　７．５に調製）に
４℃にて１時間浸漬した６固定化にプシンを分別し、０
．０５ＮＩＪン酸緩衝液（ｍ７．５）で洗浄して余分の
グルタルアルデヒドを除去し、本発明の固定化サブチリ
シンＡを得た。

固定化プロテアーゼ活性の評価 実施例１の１）の工程のみに工り調製された従来の固定
化ペプシンおよび［）　＋　ＩＩ）の工程によりｉｍｓ
された本発明の固定化ペプシンを一定量とり、それぞれ
を１チカゼイン溶液（ｕｉ　３．０に調製）に添加し、
６０℃にて６０分間振とうしたのち、ろ過してろ液を採
増した。このろ液から一定量をサンプリングしくこの液
をｘｇと称する）、残りのろ液をさらに６０℃にて６０
分間振とうして一定量をサンプリングした（Ｙｇとする
）。

Ｘ液およびＹ液にトリクロロ酢酸ｍ液を加え可溶たんぽ
（質を７オーリン法にて比色定量し、ペプシンの経時的
相対活性としてとらえた。結果を表１に示す。

また実施例２の１１１）の工程のみにより調製された従
来の固定化サブチリシンＡおよび１ｉｌ）　＋　ｉｖ）
の工程により調製された本発明の固定化サブチリシンＡ
を一定量とり、前記した固定化ペプシンと同様の方法に
より経時的相対活性を測定した。

結果を表２に示す。

表　　１ 従来の（Ｍ定化ペプシンを　　　、。ｏ　　　　　　１
１６用いた場合 表　　２ を用いた場合 表１および表２から明らかなように従来の方法でｙ４製
した固定化プロテアーゼに比べ本発明による固定化プロ
テアーゼはろ過後のプロテアーゼの相対活性値の増加が
少ないか全（ない。

これにより、本発明の固定化プロテアーゼは担体からの
プロテアーゼの脱離が抑制されていることがわかる。

〔発明の効果〕

以上詳述したように本発明の固定化プロテア−ゼは従来
方法のものと比較すると、プロテアーゼの担体からの脱
離が有効に抑制されており安定性が向上しているという
有利な効果を奏するものである。

外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 共有結合法による固定化プロテアーゼの製法において、
   順次、 ａ）共有結合可能な官能基を有する担体に架橋剤を共有
   結合させ、 ｂ）上記結合した架橋剤にプロテアーゼを共有結合させ
   、そして ｃ）上記固定化されたプロテアーゼに再度架橋剤処理を
   施すこと よりなることを特徴とする固定化プロテアーゼの製法。