JPS6219759A - 疎水性の充填剤を使用するカラムクロマトグラフイ−の溶離液の循環使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、疎水性の充填剤を充填したクロマトグラフィ
ー用カラムを用い、極性溶媒またはこれに非極性溶媒を
飽和量までの範囲の量添加したもので槽底される溶離液
でカラムクロマトグラフィーを行なう場合の溶離液の効
果的な循環使用方法に関するものである。

〔従来の技術〕

従来、疎水性の充填剤を充填したクロマトグラフィー用
カラムを用いて行なうカラムクロマトグラフィーでは、
水、メタノール、エタノール、グロパノール、アセトン
、アセトニトリル、テトラヒト０ロフラン、ジオキサン
などの極性溶媒のうちの１種類の溶媒か、またはコ種類
以上の混合溶媒が溶離液として使用されており、水を含
む溶離液を使用するのが一般的である（　ＰＨＡＲＭ　
ＴＥＣＨＪＡＰＡＮＶｏｌ、　／　＃　Ｎｏ−’＃　　
コｊ（１９１１ｒ！］〕。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし、疎水性の充填剤を充填したクロマトグラフィー
用カラムを用いてカラムクロマトグラフイーを行なう場
合、上記のような極性の高い溶離液を溶質を得る目的で
蒸留、濃縮するためには。

一般的に高い熱量と長時間を要し、また溶離液が２種類
以上の混合溶媒である場合、蒸留、濃縮して回収した溶
離液は一蒸留以前の溶質を含まない溶離液ど比較して組
成が変わってしまう場合が多ζ、このため蒸留、濃縮し
て回収した溶離液を再びこの溶離液を流出させたカラム
の上部に注ぎカラムクロマトグラフィーの溶離液として
使用するためには１回収した溶離液を構成する溶媒の組
成をガスクロマトグラフィーなどによって分析し。

その上で溶離液の組成を回収する以前の組成と同じにす
るために１例えば精留してそれぞれ単一の溶媒にした後
、あらためて混合するか、または新たに溶媒を添加して
混合するなどしなければならなかった。かぐして、蒸留
、濃縮して回収した溶離液を、上記のような操作を行な
わず再び溶離液として使用することは難しかった。

本発明はこの問題を解決し、疎水性の充填剤を充填した
クロマトグラフィー用カラムを用いてカラムクロマトグ
ラフィーを行なう場合の溶離液の効果的な循環使用方性
を提供するものである。

〔問題点を解決するだめの手段〕

上記の問題点を解決するための本発明は、疎水性の充填
剤を充填したクロマトグラフィー用カラムを用い、７種
類または一種類以上の極性溶媒、あるいはこれに非極性
溶媒を飽和量までの範囲の量添加したものを溶離液とし
て用いるカラムクロマトグラフィーにおいて、上記カラ
ムの下部から流出する溶質を含んだ溶離液に、これと二
相に分離する状態となるように非極性溶媒を添加、接触
させることにより溶離液中の溶質を非極性溶媒に移行、
抽出させた後、この非極性溶媒と溶離液とを分離し、溶
質が抽出された後の溶質を含まない溶離液を再び上記カ
ラムの上部に注ぎ、このカラム中の溶質を溶離させるこ
とを特徴とする。疎水性の充填剤を使用するカラムクロ
マトグラフィーの溶離液の循環使用方法である〇 本発明において、疎水性の充填剤としては、アルキル基
をシリカゲルに化学結合させた充填剤、スチレンとジコ
兎ベンゼンの共重合物を素材とした吸着樹脂−メタクリ
ル酸エステルやアクリル酸エステルを母体とする吸着樹
脂、またはシリカゲルにシリコンオイルや炭化水素類を
含浸させた充填剤などを使用することができる。そして
これらの充填剤のクロマトグラフィー用カラムＣ以下、
することができる。

充填剤が充填されたカラムには溶離液を通液し。

充填層中の気泡を取り除ζなどして、いわゆるカラムの
コンディショニングを行なって分離精製の目的の成分を
含む原料の負荷に備える〇本発明で使用する溶離液とし
ては、１種類の極性溶媒、または２種類以上の極性溶媒
の混合物。

あるいはこれらに非極性溶媒を飽和量までの範囲の量添
加したものが用いられる。

本発明ではカラムの下部から溶質を含んで流出するこれ
らの溶離液は、これと二相に分離する状態となるように
非極性溶媒を接触させることに−よって、溶質を非極性
５媒で抽出した後、溶離液を溶質を含む非極性溶媒と分
離し、この溶質を含まない溶離液を、クロマトグラフィ
ー用溶離液として再びカラムの上部にもどして循環して
使用するものであるので、溶離液は、循環使用している
間に組成の変化が少ないことが好ましく、また溶質の抽
出に使用する非極性溶媒と二相に分離するのがよ（１両
液、すなわち溶離液と溶質の抽出に使用する非極性溶媒
を等量ずつ分液ロートに入れて分配した場合、溶離液側
の容１が全く変わらないか、または増す・ものが好まし
い。これは、例えば分配した際、溶離液側の容量が減る
場合には、溶離液幇構成している溶媒が溶質の抽出に使
用する非極性溶媒によって抽出されていることを示して
おり、この溶離液を循環使用すれば溶質の抽出を行なう
ごとに溶離液の組成が変化してしまうためであり、一方
１分配した後に溶離液の容量が増す場合には、抽出に使
用した非極性溶媒が溶離液に飽和した場合であるため、
さらに循環便用しても溶離液の溶媒組成は変わらないか
らである。

溶離液として、７種類の極性溶媒または２種類以上の極
性溶媒の混合物に非極性溶媒を飽和量までの範囲の量添
卯したものを使用するのは、非極性溶媒を添加すること
によって１分離する目的の取分の分離効果を高めるため
であるが、溶離液に添加する非極性溶媒と、溶質の抽出
に使用する非極性溶媒の種類が異なる場合は、溶離液と
溶質の抽出に使用する非極性溶媒とを分配した際に、溶
離液に添加する非極性溶媒が、抽出のための非極性溶媒
によって抽出される場合があり、このような溶媒系で溶
離液を循環使用した場合には、溶離液から溶質の抽出を
行なうごとに溶離液の組成が変化してしまう恐れがある
ため、溶離液に添加する非極性溶媒としては、溶質の抽
出に使用する非極性溶媒と同じものを使用することが好
ましい。

このことから、本発明で使用する溶離液としては、循環
使用している間の組成の変化が少ないことが好ましいた
め、７種類の極性溶媒または２種類以上の極性溶媒の混
合物に溶質の抽出に使用する非極性溶媒と同じ非極性溶
媒を飽和量までの範囲の量添加したものを用いることが
好ましい０本発明で溶離液として用いる極性溶媒の具体
例としては１例えば水、メタノール、エタノール。

プロパツール、インプロパツール、ブタノール、アセト
ン、メチルエチルケトン、アセトニトリル。

ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸などの酸の水溶
液、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基の水
浴液を挙げることができ、これらのうちの７種類の溶媒
かコ種類以上の混合溶媒を。

分離する目的の物質に応じて適宜選択し、使用すること
ができる。

また、溶離液に添加する非極性溶媒、または溶質の抽出
に使用する非極性溶媒の具体例としては。

例工Ｉｄ　ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−へブタン
、ｎ−オクタン、イソオクタン、シクロヘキサン、ベン
ゼン、トルエン、クロロホルム、ジクロルメタンなどを
挙げることができる。

↑ 極性溶媒に非極性溶媒を添加した溶離液の調梨には１例
えば選定した１種類または２種類以上の極性溶媒と、非
極性溶媒を分液ロートに入れ、振トウすることにより溶
離液を得ることができる０その際の液温はカラムクロマ
トグラフィーを行なう際のカラムの充填剤の充填層の温
度と同じであることが好ましい０ に分離精製の目的の成分を含む原料を負荷し、上記のよ
うにして調製した溶離液をカラムに通液して溶離を開始
する。そしてカラムの下部から流出する溶質を含む溶離
液は一定量ずつ分画し、それぞれ分液ロートな用いて分
画した溶離液景の／／１０〜１倍量程度の非極性溶媒を
７〜１回分はどに分けて添加し溶離液から溶出を行なう
か、または連続抽出装置などを使用してカラムの下部か
ら流出する溶離液から連続的に溶質を非極性溶媒で抽出
する。この場合、抽出に使用する非極性溶媒の量や１分
液ロートを用いる場合の抽出回数、また連続抽出装置を
使用する場合の抽出用非極性溶媒と溶離液の流量比など
は、抽出用非極性溶媒にょる溶離液からの溶質の抽出率
などによって決定し。

溶離液からの溶質の抽出は完全に行なわれることが好ま
しい。

非極性溶媒で溶質を抽出した後１分液ロートを用いて抽
出した場合には、それぞれ分画された溶離液からの抽出
分ごとに、非極性溶媒を蒸留、ａ縮して各分画分の溶質
を得、また、連続抽出装置などにより溶質を抽出した場
合には、連続抽出装置から溶質を抽出して流出する非極
性溶媒を一定量ずつ分画し、この非極性溶媒を蒸留、濃
縮して溶質を得１分画された溶質は、ガスクロマトグラ
フィー（ＧＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー〔ＨＰ
ＬＣ）などによって分析することによって目的の成分を
得ることができる。

そして非極性溶媒によって溶質が抽出された後の溶離液
は、再びカラム中の取分を溶離するべ（。

カラムの上部から注ぎ入れ、カラムクロマトグラフィー
の溶離液として循環使用する。

〔発明の効果〕

本発明によれば、疎水性の充填剤を充填したカラ′ムを
用いるカラムクロマトグラフィーで使用する極性の毘い
溶離液を直接蒸留、濃縮することな（容易に目的とする
成分を得ることができ、しかも使用する溶離液の組成を
変化させることなく効果的に循環して使用することがで
きる０〔実施例〕 以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれにより制
限されるものではない口 実施例　１ スチレンとジビニルベンゼンの共重合物を母体とする三
菱化成（株）製の非極性吸着樹脂セパビーズ５Ｐ−２０
７を、直径３ｃｍ、高さ５０ｍのガラス製カラムにｊ　
ＯＣｍの高さまで充填した。

メタノールな浴離敵として上記非極性吸着樹脂充填層に
流し込み、充填層の気泡を取り除き、充填層最上部がわ
ずかに露出するまで、このカラム下部から溶離液を流し
て止め、目的とするエイコサペンタエン酸エチルｔ４ｔ
２．６係含有する脂肪酸エチル混合物コ、／ノを負荷し
た。このものはガスクロマトグラフィーＣ以下、ＧＬＣ
という】による分析の結果、エイコサペンタエン酸エチ
ルの他に２０種類はどの脂肪酸エチルが含まれていたＯ カラム下部から溶離液を流出させ、脂肪酸エチル混合物
を完全に樹脂層にしみ込ませて溶離液の流出を止めた。

カラムの充填層上部の空間に溶離液を流し込みながら溶
離液をこのカラム下部から毎分／、♂Ｕの流速で流出さ
せ、初めのｊＯ酩を三角フラスコに取り、続けて流出し
て（る溶離液を別の三角フラスコに取った。そして初め
の夕０虹の溶離液を分液ロートに入れ、溶離夜景の約４
の量であるｌ≦ａのｎ−ヘキサンで３回１合計４ｔ♂ｒ
ｎ６のｎ−ヘキサンで溶質の抽出を行ない、このｇｒｍ
Ａのｎ−ヘキサンを蒸留、濃縮して第１画分の溶質を得
た。一方、溶質が抽出された後の溶離液は再びカラム上
部に流し込み、カラムクロマトグラフィーを続け、この
ようにして第１画分までの溶！画分と第６画分に分画さ
れており、それぞれの含有率は？２．３係および♂グ、
２係、また収景は０．２３ｇ−および０．２θ）であっ
た０なお、上記実施例中のＧＬＣの分析は下記の条件で
行ない１面積百分率で含有率を表示した０ＧＬＣ分析条
件 充填剤：液相ＤＥＯ８−８ＴＣガスクロ工業Ｃ株】製〕
０ｑｂ 担体Ｕｎｉｐｏｒｔ　ＨＰ　（ガスクロ工業（株）製］
≦０〜♂０メツシュ カラム：３１Ｒ１ＩＬφ×−ｍ　ガラスカラムカラム温
度＝２００℃ キャリアガス：窒素 検出器：水素炎イオン化検出器（Ｆ、１．Ｄ、　）実施
例　２ 直径ｊｃｍ％高さｊ　Ｏｃｍのガラス製カラムにｊ　Ｏ
Ｃｍの高さまでスチレンとジビニルベンゼンの共重合物
である三菱化成ｃ株）製の非極性吸着樹脂ダイヤイオン
ＨＰ−コθを充填し、た。

♂！係メタノール水／　０００−と１ｏｏｒＩｖ８のｎ
−ヘキサンをコ！の分液ロートに入れ、振どう。

分配したところ、ｎ−へキサン飽和のｔタ係メタノール
水１０！Ｊ’ｔｎｌが得られた。

このｎ−へキサン飽和の♂タ係メタノール水を溶離液と
して上記非極性吸着樹脂層に流し込み、充填層の気泡を
取り除き、充填層最上部がわずかに露出するまで上記カ
ラムの下部から溶離液を流して止め、目的とするエイコ
サペンタエン酸エチルを４ｔＯ％含有する脂肪酸エチル
混合物に、４ｔｆを負荷した。このものは、ＧＬＣによ
る分析の結果、エイコサペンタエン醗エチルタ０％ノ他
に。

２０種類はどの脂肪酸エチルを合計３０係含んでいた０
カラムの下部から溶離液を流出させ、脂肪酸エチル混合
物を完全に樹脂層にしみ込ませて溶離液の流出を止めた
。ついでカラムの充填層上部の空間に溶離液を流し込み
ながら溶離液をこのカラムの下部から毎分／♂祷の流速
で流出させ、初めのｊ　００　ｍｌを三角フラスコに取
った。続けて流出して（る溶離液を別の三角フラスコに
取った。

そして、初めのｓｏｏｍｔの溶離液を／！の分液ロート
に入れ、溶離液量の／／１０の量である夕Ｏｍ８のｎ−
ヘキサンで３回、合計／ｊＯｒｌＬｌのｎ−へキサンで
溶質の抽出を行ない、この／！０ｒｆＬｌのｎ−ヘキサ
ンを蒸留、ａ縮して第１画分の溶質を得た〇一方、溶質
が抽出された後の溶離液は、再びカラムの上部に流し込
みカラムクロマトグラフィーを続け、上記と同様にして
第７２画分までの溶質を得た。このようにして得られた
両分をそれぞれＧＬＣによって分析した結果、目的とす
るエイコサペンタエン酸エチルは、第１１と７２画分に
分画されており、それぞれの含有率は９６．３％および
ワ！、／係、また収量は／、３ノおよび０．♂ノであっ
た。

なお、上記実施例中のＧＬＣ分析は実施例１と同じ条件
で行なった。

実施例　３ アセトニトリル／♂ＯｍＢ　、メタノール？０α。

水３０廐を分液ロートに入れ、振とり、混合した後、こ
れにｎ−ペンタン３０ｒｆＬｌを加えて分配したところ
、ｎ−ペンタン飽和のアセトニトリル、メタノール、水
の混合溶媒約３１０ｒｌｄ；が得られ、これを溶離液と
した。

直径コ、コＣｍ、にさｊ　Ｏｃｌｌｌの中圧液体クロマ
トグラフィー用ガラスカラムにオクタデシル基を化学結
合により保持したシリカゲル系のカラムクロマトグラフ
ィー用充填剤であるＭＥＲＣＫ社製のＬｉ　Ｃｈｒｏｐ
ｒｅｐ　ＲＰ　−／　／　ｒ　／ｒ　〜２ｒ　μｍ　】
ｉｑ。

１を上記の溶離液とともに湿式充填した。

目的とするエイコサペンタエン酸エチルを４ノｇ、、＜
係、ドコサヘキサエン酸エチルを２グ、／係含有し、そ
の他に２０種類程度の脂肪酸エチルを合計３／％含有す
ることがＧＬＣ分析によって確認された脂肪酸エチル混
合物３　、ｒｆを、上記カラムの充填層最上部に負荷し
、定電ポンプで３．！にｌ／　Ｃａはどの定圧で溶離液
を送り込みながら、カラムの下部から毎分１．♂彪の流
速で溶離液を流出させ、これを直径２ａｍ　、高さ／　
Ｊ−Ｏｃｍの液々向流抽出装置のカラムの上部から下部
に向かって流し、抽出のための溶媒であるｎ−ペンタン
を上　　ｉ記の液々向流抽出装置のカラムの下部から上
部に向かって毎分θ、乙祷の流速で流して溶離液から浴
′質の抽出を行なった。

溶質がｎ−ペンタンによって抽出され液々向流抽出装置
のカラムの下部から流出した溶離液は。

再び上記のカラムクロマトグラフィーの溶離液として使
用し、溶質を抽出して液々向流抽出装置のカラムの上部
から流出するｎ−ペンタンは、／！ｎずつでフラクショ
ンｌ〜１０まで分画シ、それぞれ蒸留し、溶媒を留去し
た後、ＧＬＣ分析を行なった。ＧＬＣ分析の結果−フラ
クション７を蒸留、濃縮して得られた画分は１．θ２ノ
でエイコサペンタエン酸エチルの含仔率９３．乙係であ
り。

またフラクション９を蒸留、濃縮して得られた画分は０
．４ｔ♂ノで、ト１コサヘキサエン酸エチルの含有率は
９乙、コ％であった。　　　−なお、上記実施例中のＧ
ＬＣ分析は実施例１と同じ条件で行なった。

実施例　４ りＯ％エタノール水グθＯｍＢとシクロヘキサン２００
ｒｎｌを分液ロートに入れ、振とう１分配したところ、
シクロヘキサン飽和のエタノール水約夕ｌコＭが得られ
、これを溶離液とした。

Ｙで使用したものと同じカラムクロマトグラフィー用充
填剤／９０ｍ１を上記溶離液とともに湿式充填して、コ
ンディショニングを行なった。

α−トコフエロルを３０．！％、γ−トコフェロールを
４ｔ／、３％、δ−トコフェロールなコ♂、２係含有す
ることをＧＬＣ分析によって確認したトコフェロール混
合物Ｊ−１７ｇ−を上記カラムの充填層最上部に負荷し
、定量ポンプでｕ、ｊにｌＺｃ肩はどの定圧でカラムへ
溶離液を送り込みながら、カラムの下部から毎分／、θ
ｍｂの流速で溶離液を流出させｊＯｒｆＬｂで／分画と
した。分画した溶離液は。

１分画分ずつ分液ロートに入れ、！虹ずつのシクロヘキ
サンで３回、溶質の抽出を行ない、溶質が抽出された後
の溶離液は、再びカラムクロマトグラフィーの溶離液と
して使用した。溶質を抽出したシクロヘキサンは、蒸留
、濃縮して溶質を得た。

以上のようにして／〜コθまでの溶質画分、すなわちト
コフェロール画分を得、それぞれＧＬＣ分析を行なった
ところ、第２画分ではα−トコフ二〇−ル含有率９３．
９％のものが／、３ｆ、１ｇ／／画分−’Ｑはγ−トコ
フェロール含ＫＮ　９　！　−３％のものが／−９９，
第１グ画分ではδ−トコフェロール含有率９′３．グ係
のものが／、２９得られた。

上記実施例中のＧＬＣ分析は、下記の条件で行ない、面
積百分率で含有率を表示した。

ＧＬＣ分析条件 充填剤：液相５ｉｌｉｃｏｎｅ　ＧＥ　５Ｅ−Ｊθ［：
宿料化工（株）製］１．！％ 担体Ｓｈｉｍａｌｉｔｅ　Ｗ　（宿料化工Ｃ株］製〕♂
０〜ｌθ０メツシュ カラム：ｊｍ、φ×２−／ｍ　　ガラスカラムカラム温
度二２乙θ℃ キャリアガス：窒素 検出器：水素炎イオン化検出器（Ｆ、Ｉ、Ｄ−）実施例
　５ ♂０％ｎ−グロバノール水ざ！とイソオクタン２ｋを分
配したところ、５’、２７のイソオクタン飽和のｎ−グ
ロパノール水が得られ、これを溶離液とした。

直径ｔ　ａｍ　、　　高さ７ｍのガラス製カラムに、ス
チレンとジビニルベンゼンの共重合物を母体とした三菱
化成〔株〕製の非極性吸着樹脂セパビーズ５Ｐ−２０７
を！　ｊ　ｃｍの高さまで充填し、上記の溶離液をこの
カラムに流し込み、セパビーズ５Ｐ−２０２の充填層を
溶離液で満たし、充填層中の気泡を取り除いた後、充填
層の最上部がわずかに露出するまでカラムの下部から溶
離液を流出させた０ ブラシ力ステロールタ、２％、カンペステｏ　−ル２／
、３係、スチグマステロール／３．２％。

β−シトステロールゲタ、３％を含有することがＧＬＣ
分析によって確かめられた植物ステロール混合物からβ
−シトステロールを分離することを目的としてこの植物
ステロール混合物９　、　ｒｇ−を１１０１１ｇのｎ−
プロパツールに溶解し、カラムの内壁を伝わらせながら
ゆるやかに上記充填層上に注ぎ入れた０カラムの下部か
ら溶離液を毎分１０ａ′の速度で流出させ、上記の植物
ステロール混合物のれ一グロパノール溶液が、充填層に
完全に浸透したところで、溶離液の流出を止めた。この
充填層上に溶離液を注ぎ入れカラムの下部から毎分ｊＯ
ｍｌずっ溶離液を流出させ、／分画分を一！とじて、初
めのコＬを三角フラスコに取った。続け”ＣＩＸ　出シ
て（る溶離液を別の三角フラスコに取った。そして初め
の２！を分液ロートに入れ、−〇〇ａずつのイソオクタ
ンで３回１合計ｔｏｏｍｚのイソオクタンで溶質の抽出
を行なった。

溶質の抽出が終了した溶離液は、再びカラムの上部に注
ぎ入れ、カラムの溶離液として使用し。

このようにして第１〜２３番目までの分画な行なった。

これらは蒸留、濃縮してイソオクタンを留去した後、そ
れぞれＧＬＣ分析を行なった。ＧＬＣ分析の結果、第２
θ番目の画分はβ−シトステロール含有率が９２．２％
であることがわかった。

このものの収量は２−ｒ９であった。

上記実施例中のＧＬＣ分析は、下記の条件で行ない１面
積百分率で含有率を表示した。

ＧＬＣ分析条件 充填剤：液相５ｉｌｉｃｏｎｅ　ＯＶ　−／　７　［西
尾工業Ｃ株）製〕２％ 担体Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ　Ｗ−ＨＰ　（西尾工業Ｃ株
）製〕１００〜ｌコθメツシュ カラム：ｊａ＋ｉφｘｘ、７ｍ　ガラスカラムカラム温
度：２２０℃ キャリアガス：窒素

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 疎水性の充填剤を充填したクロマトグラフィー用カラム
   を用い、１種類または２種類以上の極性溶媒、あるいは
   これに非極性溶媒を飽和量までの範囲の量添加したもの
   を溶離液として用いるカラムクロマトグラフィーにおい
   て、上記カラムの下部から流出する溶質を含んだ溶離液
   に、これと二相に分離する状態となるように非極性溶媒
   を添加、接触させることにより溶離液中の溶質を非極性
   溶媒に移行、抽出させた後、この非極性溶媒と溶離液と
   を分離し、溶質が抽出された後の溶質を含まない溶離液
   を再び上記カラムの上部に注ぎ、このカラム中の溶質を
   溶離させることを特徴とする、疎水性の充填剤を使用す
   るカラムクロマトグラフィーの溶離液の循環使用方法。