JPH0260361B2

JPH0260361B2 -

Info

Publication number: JPH0260361B2
Application number: JP59053896A
Authority: JP
Inventors: Akio Kawahara; Hiroto Sugano; Shuji Ishii; Hiroshi Saito
Original assignee: Soken Kagaku KK
Current assignee: Soken Kagaku KK
Priority date: 1984-03-21
Filing date: 1984-03-21
Publication date: 1990-12-17
Also published as: JPS60197209A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、液体クロマトグラフイーによる工業
的分離法およびその装置に関するものである。移動相に液体を用いる液体クロマトグラフイー
法は、主に送液部、試料注入部、分離部及び検出
部からなり、微量試料を簡便かつ高精度で再現性
よく分析できることから、今日一般的な分析手段
として広く使用されている。最近では、これら利
点を有する液体クロマトグラフイー手法を単なる
分析から分取へ、更には工業的分離・精製への応
用に関心が持たれてきている。しかしながら、従来の分取装置の多くは分析装
置の単なるスケールアツプにすぎないため、工業
化装置の際には溶媒使用量、操作圧力、負荷量等
が問題となり、精製コストが著しく高価なものと
なる。つまり分析用では高理論段数の単カラムで
迅速かつ高精度に分離するために高価な微粒子充
填剤（5μm）を用い、低負荷、高圧下で操作す
るようになつている。これに対し、工業用分取で
は低圧下で大量処理するために安価な大粒径充填
剤を用い、大量負荷の操作を行なう。工業用分取
装置で重要なことはいかに安価に精製するかであ
る。両者に於ては、展開溶媒、充填法、試料注入
法等もおのずと異なるので、その差異を表−１に
示す。

【表】表−１から判るように、粒径、充填法、試料過
負荷の違いによつてH.E.T.P.（Height
Equivalent of theoreical plate）も工業用では
分析用と比較して大きな数値となる。従つて、こ
うした点を補う工夫が要求されるため、単なる分
析装置のスケールアツプでは工業用としては実用
に耐えない。溶質及び溶媒を同一カラムに循環さ
せて分離をよくするリサイクル手法が国内外で研
究されており、この手法は長いカラムを使用する
場合に問題となる圧力降下が解消されて有利では
あるが、単カラムでのリサイクルである点で工業
規模にはそのままでは有効に利用できなかつた。本発明者らは、すでに工業用液クロプラントの
設計、建設の経験から従来の分取装置による分
離・精製方法では工業化の際に精製コストが非常
に高くなり、工業化対象物質が極く限られるとい
う問題に気が付いていた。こうしたことから、精製コストを重視した工業
規模あるいは工業化のための各種データの取れる
工業装置類似フローでしかも分取用液体クロマト
グラフイーの種々の利点を発揮しえる混合物の分
離・精製法が切望されていた。本発明の目的は、分離に必要な理論段数を確保
し、大きな負荷量がとれ、かつ効率良く分離・精
製しえる液体クロマトグラフイーによる工業的分
離・精製法を提供することにある。而して本発明
者らは、分析用の単なるスケールアツプという思
想から脱却し、工業用レベルで問題となる種々の
関係因子について検討を行つて本発明を完成し
た。即ち、本発明の液体クロマトグラフイーによる
分離方法は、大量の混合試料を展開溶媒と共に、
粒径10〜80μmの充填剤を充填した第一のカラム
に送液し、第一カラムからの溶離液より分離すべ
き目的成分を含むメインフラクシヨンを取り出
し、粒径10〜80μmの充填剤を充填した第二のカ
ラムを備える閉鎖ループ内を循環させて目的成分
を他の成分と分離することを特徴とするものであ
る。本発明の分離法に使用することのできる装置
は、第１図に例示するように、大量の混合試料から液体クロマトグラフイによ
つて目的成分を分離する分離装置であつて、大粒
径の第１充填剤が充填された少なくとも１本の第
１カラム６と、流路を介して第１カラム６の上流
側に設けられた溶離液槽（溶媒貯槽）４と、第１
カラム６と溶離液４との間の流路に設けられた試
料注入用バルブ３と、試料注入用バルブ３に連通
した試料槽１と、流路を介して第１カラム６の下
流側に設けられた第１フラクシヨンコレクター８
と、第１カラム６と第１フラクシヨンコレクター
８との間の流路に設けられた第１検出器７と、流
路に設けられた送液装置５と、第１カラムと第１
フラクシヨンコレクター８との間の流路に設けら
れかつ目的成分を含むメインフラクシヨンを取り
出すプレカツトバルブ９と、から成る粗分画ライ
ン；およびメインフラクシヨン取出し時に前記粗
分画ラインのプレカツトバルブ９と流路を介して
連通しかつ大粒径の第２充填剤が充填された第２
カラム１０と、流路を介して第２カラム１０の下
流側に設けられた第２フラクシヨンコレクター１
５と、第２カラム１０と第２フラクシヨンコレク
ター１０との間の流路に設けられた第２検出器１
２と、リサイクル時に第２検出器１２からの溶出
液を第２カラム入口に戻し分離完了後に目的成分
を第２フラクシヨンコレクター１５に流すリサイ
クルバルブ１３と、リサイクルバルブ１３と第２
カラム入口との間の流路に設けられた送液装置１
１と、から成るリサイクルラインとを含むことを
特徴とするものである。さらに、本発明の分離法に使用することのでき
る別の装置は、第４図に示すように、大量の混合
物試料から液体クロマトグラフイによつて目的成
分を分離する分離装置であつて、大粒径の第１充
填剤が充填された少なくとも１本の第１カラム２
９と、大粒径の第２充填剤が充填された少なくと
も１本の第２カラム３２と、各々流路を介して第
１カラム２９と第２カラム３２との上流側に設け
られたカラム切替え用バルブ２８と、各々流路を
介し第１カラム２９と第２カラム３２との下流側
に設けられかつ目的成分を含むメインフラクシヨ
ンの取り出し時に第１カラム出口を第２カラム入
口に連通させるプレカツトバルブ３１と、流路を
介してカラム切替えバルブ２８の上流側に設けら
れた溶離液タンク２４と、カラム切替えバルブ２
８と溶離液タンク２４との間の流路に設けられた
試料注入用バルブ２３と、試料注入用バルブ２３
に連通する試料タンク２１と、流路を介してプレ
カツトバルブ３１の下流側に設けられ、フラクシ
ヨンコレクター３４と、第１カラム２９と第２カ
ラム３２との下流側に設けられた検出器３０と、
プレカツトバルブ３１とフラクシヨンコレクター
３４との間の流路が溶離液タンク２４と試料注入
用バルブ２３との間の流路と交差する箇所に設け
られかつリサイクル時にカラムからの流路をその
カラムへの流路に連通するリサイクルバルブ２５
と、流路に設けられた送液装置２６と、プレカツ
トバルブ３１とカラム切替えバルブ２８とを直接
に結ぶ中心流路とからなることを特徴とする。第１図は本発明の一例を示すフロー図であり、
第２図は第１図における各カラムでの分離状況の
一例を示したものである。まず第１図及び第２図
により、被処理液（試料）がα，β，γ，δ，の
４成分からなり、α成分が分取目的成分である場
合を例にとつて説明する。試料貯槽１にある試料
を試料注入ポンプ２により一定容量のループに貯
えてポンプ２を停止後、直ちにバルブ３を切替
え、溶媒貯槽４からポンプ５を介して送液される
展開溶媒とともに第一カラム６に一定量の試料を
チヤージする。検出器７での各成分の分離状況は
第２図ａに示す如く大きな二個のピーク（Ａと
Ｂ）に分離する。分取目的のα成分がＢピークに
含まれているとすれば、Ａピーク（δ成分）をフ
ラクシヨンコレクター８で分取する一方、Ｂピー
ク（α，β，γ.成分）のみをバルブ９を切換えて
第二カラム１０に送り込む。続いてバルブ９は元
の状態に戻るので展開溶媒はポンプ１１により第
二カラム１０に送液される。この状態では、ポン
プ１１―バルブ９―第二カラム１０―検出器１２
―バルブ１３―バルブ１４―フラクシヨンコレク
ター１５の系列（ループ１）とポンプ２―バルブ
１６―バルブ３―第一カラム６―バルブ９―検出
器７―フラクシヨンコレクター８の系列（ループ
２）が独立に運転できる。第二カラム１０から流出し検出器１２でＢピー
ク中のα成分が分取できる位に分離していれば、
そのままフラクシヨンコレクター１５で分取す
る。第２図ｂのように未分離の場合には、バルブ
１３を切換えてループ１で、第２図ｃのようにな
るまでリサイクルを行つて分取する。リサイクル
回数は、第二カラム１０に注入される成分数が少
なくても各成分の保持比k′の値が近い物質ほど、
またカラム容積が大きいほどその回数は多くな
る。本発明は、複数カラムを用いたリサイクルシ
ステムを採用しているため、長いカラムを使用し
なくても次式の関係よりカラムの分離度R_sを高
めることができる。 R_s＝Ｃ√ Ｃ：常数ｎ：リサイクル回数前述したように、リサイクルシステム自体につ
いては従来より知られてはいるが、いずれも単カ
ラムを用いたもので、工業規模にはそのままでは
有効に利用できない。その理由を第３図により説
明する。単カラム使用では試料中成分（α，β，
γ，δ）の全ての成分が同時にリサイクルするた
め、保持比の差が大きな成分が含まれていると、
第１回リサイクルでα成分とβ成分が重なり始ま
り、第２回リサイクルではα成分とβ成分並びに
γ成分とδ成分のピークの重なりが生ずる。従つ
て１〜２回位のリサイクルしか行えず、またリサ
イクルを行つても実効を高めることが困難であつ
た。本発明では、第一カラムで主溜以外を予備カ
ツトし、保持係数の近い値を持つた主溜のみを第
二カラムにチヤージすることができるため、第二
カラムの負荷量が低減され、高純度・高回収率で
目的成分が得られ、しかも少ない溶媒使用量で実
施できる。２塔カラムにおいては、第１カラム、第２カラ
ムそれぞれ独立して送液ポンプが備わつているの
で、第１カラムと第２カラムに異なつた種類の充
填剤を用いて分離することができる。つまり各充
填剤の種類に応じて溶離液をそれぞれのカラムに
流すことによつて異なつた分離モードを連続して
行なうことができる。これに対して、従来はある
充填剤の詰つたカラムで分離、分取し、目的成分
を含んだ分取液を濃縮して試料溶度を調整した
後、異なる充填剤の詰つたカラムで分離調整を行
ない目的成分のみを取り出していた。したがつ
て、従来法は非常に多くの工程を必要として時間
が非常にかかる欠点があつた。さらに２塔カラム
を用いて連続的に行なう本発明の方法では、第１
塔からの目的成分を含む流出成分を正確に第２塔
に注入し、それと同時に第２塔カラムの溶融液送
液ポンプが作動出来るようにコンピユータによる
自動制御が可能となる。異なる分離モードを連続して行なえることによ
つて単カラムの単一分離モードと比べて分離性能
が飛躍的に向上するだけでなく、全自動制御によ
り容易に短時間で出来るようになる。例えば、生
体高分子の分離精製の分野では第１カラムでゲル
口過、第２塔でイオン交換が用いられることが多
いが、その他の分離モード、吸着、分配イオンペ
ア、アフイニテイーなども用いることが出来る。第４図も本発明の一例を示すフロー図である
が、第１図と異なり、ポンプ及び検出器を夫々１
台ずつで操作し第一カラム、第二カラムともにリ
サイクル機能を有するユニークなものである。試
料貯槽２１にある試料を試料注入ポンプ２２によ
りループに注入した後、バルブ２３を切換え、溶
媒貯槽２４からバルブ２５及びポンプ２６を介し
て送液される展開溶媒とともに、試料はバルブ２
７及び２８を介して第一カラム２９にチヤージさ
れる。第一カラム２９の中で展開した試料は、検
出器３０とバルブ３１の切変えによつて、主溜の
みがバルブ３１及び２８を介して第二カラム３２
にチヤージされる。試料の成分によつては第一カ
ラムでリサイクルさせて分取する。第一カラムの
前溜及び後溜はバルブ２５及び３３を介してフラ
クシヨンセパレーター３４で分取する。第二カラム３２にチヤージされた主溜部分は、
ポンプ２６―バルブ２８―第二カラム３２―バル
ブ３１―バルブ２５のループを用いて溶媒に展開
される。第二カラム３２を出た各成分が検出器で
十分に分離していることが確認されたならば、バ
ルブ２５，３３を介して分取される。第二カラム
３２を出た各成分が十分に分離していない場合
は、上記ループを用いて分離するまでリサイクル
を行つてその後分取する。この第４図に示した例は、いずれのカラムにも
リサイクル機能を持たせたものであるが、ポンプ
１台のため第一カラムと第二カラムとを独立して
同時に運転はできない。そこで次の方法を採用し
て処理量を高めることが望ましい。即ち、同程度
の大きさのカラムを二本用いて主溜を第二カラム
３２に注入し、リサイクルの有無にかかわらず第
二カラム３２を出た時点で分取ができる程度に第
二カラム３２で分離を進め、その溶質成分が該当
カラムの半分位進んだ時点で新たにサンプルルー
ブにチヤージした試料をバルブ２３を切換えて第
二カラム３２にチヤージする。第二カラム３２で
は主溜の分離と新たにチヤージされた試料の分離
とが同時に進行する。そして、第二カラム３２か
らの主溜（前記主溜を更に分離したもの）はバル
ブ２５，３３を介して分取し、新たにチヤージさ
れた試料に対しては該試料の主溜のみをバルブ２
５，２８を介して第一カラム２９にチヤージす
る。以下同様に第一カラム２９において上記主溜
と新たな試料との分離を同時進行させる。なお、これまで本発明を２本のカラムを用いた
場合を例に説明したが、本発明は22本のカラムに
限定されず、複数本、望ましくは２〜４本のカラ
ムで実施できる。３塔目以降は更に純度を上げる
ためのカラムとして使用される。本発明では、内径１〜100cm程度のカラムを使
用する。充填剤は、粒径10〜500μmであることが
必要であるが、シリカ、ODS（疎水性表面処理）、
各種ポーラスポリマー担体等公知のものが使用で
きる。また、検出器についても紫外吸光光度計
（UV）、示差屈折計（RI）等公知のものが使用で
きる。溶媒としては、ヘキサン、ベンゼン、酢酸
エチル、酢酸メチル、クロロホルム、テトラヒド
ロフラン、水、ホルムアミド、アセトニトリル、
メタノール、エタノール等が挙げられ、溶剤回
収、処理液成分や検出器との適合性等を考慮して
選定する。本発明の被処理液は、分析装置で分離
できる物質であればすべて本分離・精製方法の対
象である。２塔カラムの代表的な第１図、第４図のフロー
図を用いた装置では第１塔で粗分画するためその
保持時間が長い不要成分が含まれている場合、そ
の不要成分を第１塔で除去するので第１塔プラス
第２塔のカラム長さと同じ長さの単カラムで分離
するより時間が短くなり、それだけ溶離液の使用
量が少なくなる。また２塔カラムでは同じ長さの
単カラムよりも試料を大きく取れる。これは第１
塔で粗分画することにより、第２塔の試料負荷量
が軽減されるからである。つまり、２塔カラムと
単一カラムと比較すると溶離液使用量も少なく１
回当りの試料負荷量も多くのせることが出来る。本発明は、複数本のカラムを用いた回分的処理
であつて複雑なバルブ切換えを連続的にスムース
に操作するために、シーケンサー及びコンピユー
ターによる制御で通常実施される。以上の説明から明らかなように、本発明は複数
本のカラムを用いた各カラムで適正な分離を行
い、かつリサイクル機能を有することから、大き
な負荷量（数mg／cm²〜数ｇ／cm²程度）で効率良く
分離・精製ができ、またカラムの理論段数が飛躍
的に増大され、溶媒使用量も著しく低減できる。
それゆえ、本発明は液体クロマトグラフイーの工
業化への問題点を一気に解決したものである。な
お、従来、カラムを非常に汚す試料物質の場合に
充填剤の短期劣化を防止する目的で予備カラム
（一般にガードカラムと呼ばれる）を設けること
が知られているが、予備カラムと本発明にかかわ
るカラムとは全く異質のものである。以下、実施例により本発明の効果を具体的に示
す。実施例１第１図のフローを持つ装置において、標準サン
プルを用いたリサイクル実験を下記条件で行つ
た。＜実験条件＞試料：ベンゼン(B)＋ナフタレン（Ｎ）サンプルサイズ：２ml 溶媒：メタノール（95％）＋水（５％）カラム：第一塔 30〓×300^lmm 第二塔 30〓×500^lmm 充填剤：第一塔オクタデシルシラン
（ODS）10〜20μm 第二塔ODS40〜64μCm 流速：2.3cm／mm 検出法：UV検出器（λ＝254nm）実験手順は前述の通りに従い、第一カラムで一
部カツトした後、第二カラムでリサイクルした。リサイクル結果を第５図に示した。図中、Ｂ―
１〜Ｎ―１はリサイクル前の流出曲線、Ｂ―２〜
Ｎ―２は１回リサイクルの流出曲線、Ｂ―３〜Ｎ
―３は２回リサイクル、Ｂ―４〜Ｎ―４は３回リ
サイクル、Ｂ―５〜Ｎ―５は４回リサイクルの流
出曲線を示している。この結果から、保持係数の
近い物質だけをリサイクルすることで、その回数
を増やすことができることが判る。理論段数は表
−２に示す通りであつた。

【表】表−２よりリサイクルをかけるに従つて理論段
数も増加していることが判る。また、溶剤使用量
はリサイクルを使わない場合に比べ約1/4であつ
た。実施例２分取目的の一例としてエイコサペンタエン酸
（EAP）からのアラキドン酸（AA）の分離を、
第１図のフローを持つ装置において下記条件で行
つた。＜実験条件＞試料：蒸留いわし油サンプルサイズ：2.5ml 溶媒：メタノール（100％）（その他は実施例１と同様）第６図及び第７図に結果を示した。第６図は、
過負荷量のサンプルを第一カラムにかけ第一カラ
ム流出時の分離状況を示している。ピーク中の
AA部分と考えられるところ（図中斜線部分）だ
けを第二カラムにかけた。第７図ａが第二カラム
流出時の分離状況を示している。この時点では、
まだ純度よく分取できるほどではないため第二カ
ラムでリサイクルをかけたのが第７図ｂである。
AAの純度と回収率は表−３に示す通りであつ
た。

【表】また、原料（蒸留いわし油）及び分取AAの
HPLCの分析結果を第８図に示した。第８―１図
は原料、第８―２図は第７図ａ斜線部分、第８―
３図は第７図ｂ斜線部分の分析結果を示す。図
中、RTはランニングタイムを示し、（）内の
値はAA又はEPAの純度を示す。これよりAAとEPAとが容易に分離されること
が判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一例を示すフロー図であり、
第２図は各カラムでの分離状状況の一例を示した
ものである。第３図は単カラムにリサイクルさせ
た場合の分離状況の一例を示したものである。第
４図は本発明の他の一例を示すフロー図である。
第５図は実施例１のリサイクル結果を示したもの
であり、第６図及び第７図は実施例２のエイコサ
ペンタエン酸（EPA）からのアラキドン酸
（AA）の分離結果を示したものである。第８図
は原料（蒸留いわし油）及び分取AAのHPLCの
分析結果を示したものである。１，２１……試料貯槽、４，２４……溶媒貯
槽、６，２９……第一カラム、７，１２，３０…
…検出器、１０，３２……第二カラム、５．１
１，２６……ポンプ。

Claims

【特許請求の範囲】１大量の混合試料を展開溶媒と共に、粒径10〜
80μmの充填剤を充填した第一のカラムに送液し、
第一カラムからの溶離液より分離すべき目的成分
を含むメインフラクシヨンを取り出し、粒径10〜
80μmの充填剤を充填した第二のカラムを備える
閉鎖ループ内を循環させて目的成分を他の成分と
分離する液体クロマトグラフイーによる分離方
法。２大量の混合試料から液体クロマトグラフイに
よつて目的成分を分離する分離装置であつて、大
粒径の第１充填剤が充填された少なくとも１本の
第１カラムと、流路を介して第１カラムの上流側
に設けられた溶離液槽と、第１カラムと溶離液槽
との間の流路に設けられた試料注入用バルブと、
試料注入用バルブに連通した試料槽と、流路を介
して第１カラムの下流側に設けられた第１フラク
シヨンコレクターと、第１カラムと第１フラクシ
ヨンコレクターとの間の流路に設けられた第１検
出器と、流路に設けられた送液装置と、第１カラ
ムと第１フラクシヨンコレクターとの間の流路に
設けられかつ目的成分を含むメインフラクシヨン
を取り出すプレカツトバルブと、から成る粗分画
ライン；およびメインフラクヨン取出し時に前記
粗分画ラインのプレカツトバルブと流路を介して
連通しかつ大粒径の第２充填剤が充填された第２
カラムと、流路を介して第２カラムの下流側に設
けられた第２フラクシヨンコレクターと、第２カ
ラムと第２フラクシヨンコレクターとの間の流路
に設けられた第２検出器と、リサイクル時に第２
検出器からの溶出液を第２カラム入口に戻し分離
完了後に目的成分を第２フラクシヨンコレクター
に流すリサイクルバルブと、リサイクルバルブと
第２カラム入口との間の流路に設けられた送液装
置と、から成るリサイクルラインとを含む、分離
装置。３大量の混合物試料から液体クロマトグラフイ
によつて目的成分を分離する分離装置であつて、
大粒径の第１充填剤が充填された少なくとも１本
の第１カラムと、大粒径の第２充填剤が充填され
た少なくとも１本の第２カラムと、各々流路を介
して第１カラムと第２カラムとの上流側に設けら
れたカラム切替え用バルブと、各々流路を介し第
１カラムと第２カラムとの下流側に設けられかつ
目的成分を含むメインフラクシヨンの取り出し時
に第１カラム出口を第２カラム入口に連通させる
プレカツトバルブと、流路路を介してカラム切替
えバルブの上流側に設けられた溶離液タンクと、
カラム切替えバルブと溶離液タンクとの間の流路
に設けられた試料注入用バルブと、試料注入用バ
ルブに連通する試料タンクと、流路を介してプレ
カツトバルブの下流側に設けられ、フラクシヨン
コレクターへと、第１カラムと第２カラムとの下
流側に設けられた検出器と、プレカツトバルブと
フラクシヨンコレクターとの間の流路と交差する
箇所に設けられかつリサイクル時にカラムからの
流路をそのカラムへの流路に連通するリサイクル
バルブと、流路に設けられた送液装置と、プレカ
ツトバルブとカラム切替えバルブとを直接に結ぶ
中心流路とからなる分離装置。