JPS62181792A - リボフラビンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は醗酵法によるリボフラビンの製造法に関するも
のである。更に詳しくはサツカロ・ミセス属に属するリ
ボフラビン生産菌から誘導したアンモニウムイオンに耐
性を有する変異株を培地中で培養して生成・蓄積したリ
ボフラビンを採取するリボフラビンの製造法に関するも
のである。

この方法により醗酵法によるリボフラビン製造方法を工
業的に改善することに成功した。

リボフラビンは医薬、飼、料添加剤、食品用の着色剤な
どとして有用な物質である。

〔従来の技術〕

醗酵法によるリボフラビンの製造法として、エレモテシ
ウム・アシビイ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕａ　ａｓｈｂ
ｙｉｉ）、アシビア・ゴッシビイ（Ａｓｈｂｙａ　ｇｏ
ｓｓｙｐｉｉ）　、キャンディダ・フラレリイ（Ｃａｎ
ｄｉｄａ　ｆｌａｒｅｒｉ）、又はクロストリジウＬ・
アセトブチリカム（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕｓ　ａｃｅｔ
ｏｂｕｔｙｌｉｃｕｓ＋）等を糖質培地中で培養して培
養液中にリボフラビンを生成・蓄積せしめる方法が知ら
れている（プログレス・インダストリアル・ミクロバイ
オロジー１巻１３９頁、１９５９）　。

本発明者の一部は酢酸を炭素源とする醗酵法によるリボ
フラビンの製造法を報告している〔アグリ力ルチャル・
アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒ、　Ｂ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　ｖｏｌ、　２８＋　９゜５５
９、ρ、５６６、　ｐ、７６５（１９６４）　）　。

又、変異株を用いる方法としては、本発明者らによるサ
ツカロミセス属に属するプリン要求性変異株を用いる方
法（特願昭５９−９９０９６号）、サツカロミセス属に
属する３−アミノ−１，２，４−トリアゾールに耐性を
有する変異株を用いる方法（特願昭５９−９９０９７号
）、サツカロミセス属に属するプリン要求性復帰変異株
を用いる方法（特願昭６０−１２０１１９号）が知られ
ている。

尚、上記文献においては微生物の名称としてキャンディ
ダ・ロブスタ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｒｏｂｕｓｔａ）が用
いられているが、その後キャンディダ・ロブスタの標準
株（タイプストレイン）において胞子が見出されている
ため、ロダー著［ザ・イーストＪ　１９７０年版におい
ては、キャンディダ・ロブスタはサツカロミセス・セレ
ビシェ（Ｓａｃｃｈａ−ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）に再分類されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記のような菌が知られているものの、醗酵法によるリ
ボフラビンの製造を工業的に実施するために解決すべき
課題はまだ多く、リボフラビンの蓄積濃度及び生産速度
の高い菌を得ることは勿論のこと、従来知られているサ
ツカロミセス属に屈するリボフラビン生産菌を用いての
醗酵法によるリボフラビンの製造法では、窒素源として
培地中でアンモニウムイオンを生じる物質を用いた場合
、生産菌がアンモニウムイオンに対し感受性を有し、例
えばアンモニウムイオン濃度が２０００ｐｐｍ以上では
リボフラビンの蓄積■と生育が極端に低下するという問
題点があった。

本発明はこのような視点のもとに、培地中のアンモニウ
ムイオン濃度を２０００ｐｐｍ以上に高めてもリボフラ
ビン蓄積量が殆ど低下しない菌株を得て、これを用いた
工業的に改善されたリボフラビンの新製造法を提供する
ことを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは醗酵法によるリボフラビンの製造法を改良
すべく鋭意検討した結果、サツカロミセス属に属するリ
ボフラビン生産菌のアンモニウムイオン、耐性変異株を
誘導したところ、培地中のアンモニウムイオン濃度を高
めてもリボフラビンの蓄積量が殆ど低下しないことを認
め、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ）属に属し、アンモニウムイオンに耐性を有する
リボフラビン生産菌を培地中で培養して、リボフラビン
を生成・蓄積せしめこれを採取することを特徴とするリ
ボフラビンの製造方法である。

ここで云うアンモニウムイオン耐性とは、培地中でアン
モニウムイオンを生じる物質に対する耐性を意味し、ア
ンモニウムイオンを生じる物質としては、例えば塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢
酸アンモニウム、フマル酸アンモニウム等のアンモニウ
ム塩類、アンモニア水、尿素等を挙げることができる。

（使用する微生物〕 本発明で使用する微生物はサツカロミセス属に属するリ
ボフラビン生産菌から誘導したアンモニウムイオン耐性
変異株であれば何れも用いることができる。

好適な具体例としてサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｓｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｎｌ
ｌ−２６８（Ｆｌ！ＲＭ　ＢＰ−９６５）が挙げられる
。この変異株は３−アミノ−１，２，４−トリアゾール
耐性、プリン要求性復帰変異株ＴＲ−２９（ＰＩ！ＲＭ
　ＢＰ−７８２）を親株としてＮ−メチル−Ｎ’−二ト
ローＮ−二トロソグアニジン処理によって常法により誘
導されたアンモニウムイオン耐性、３−アミノ−１，２
，４−）リアゾール耐性変異株であり、アンモニウムイ
オン耐性が付与されている点で親株であるＴＲ−２９と
は明らかに区別することができる。

（菌株の取得法） 本発明で使用する菌株はサツカロミセス属に属し、プリ
ン要求性を有するリボフラビン生産菌を親株として通常
の変異誘導処理法を適用することによって比較的容易に
取１；ｌできる。

例えば親株として３−アミノ−１，２，４−トリアゾー
ル耐性、プリン要求性復帰変異株であるサツカロミセス
・セレビシェＴＲ−２９を用い、紫外線照射或いはＮ−
メチル＝Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジン等の薬
剤で処理後、第１表に示す高濃度のアンモニウムイオン
を含む寒天培地に塗抹し、生育してきたコロニーをアン
モニウムイオン耐性株として選択する。

第１表　　選択培地組成 得られた変異株のアンモニウムイオン耐性を確認するた
め、生育度実験を以下の如く行った。

親株のサツカロミセス・セレビシェＴト２９とこれから
誘導したアンモニウムイオン耐性変異株Ｎｉｌ−２６８
をグルコース２％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス
０．３％、麦芽エキス０．３％を含む液体培地１００ａ
＃に接種し、３０℃で４０時間振盪培養する。この培養
液を第２表の培地に１２％の植菌攪で接種し、３０℃で
５日間振盪培養した。

第２表 生育は６１０ｎｍの吸光度で測定した。アンモニウムイ
オン濃度１３５０ｐｐ−での生育を１００として各々の
アンモニウムイオン濃度における相対生育度を測定し、
その結果を第３表に示した。第３表に示すようにサツカ
ロミセス・セレビシェＮ１ｌ−２６８は明らかにアンモ
ニウムイオンに対して耐性を有していた。

第３表　　相対生育度 （培養方法） 本発明で使用する微生物を培養する方法を説明する。炭
素源としては酢酸、グルコン酸等の有機酸、グルコース
、シュークロース、キシロース等の糖質、エタノール、
グリセリン等のアルコール類その他が使用できる。

窒素源としては種々の形態の窒素化合物が使用でき、例
えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、炭酸アンモ
ニウム、尿素、アミノ酸、ポリペプトン等を用いること
ができる。

また炭素源、窒素源の他にリン酸第１カリウム、硫酸マ
グネシウム等の無機塩類を使用することが好ましい。ま
た必要に応じビオチン等のビタミン類、アミノ酸、核酸
塩基などの微量栄養素を添加すればリボフラビンの蓄積
量を増す場合が多い。本発明者が先に発明した亜鉛イオ
ンを添加してリボフラビン生産性を向上させ鉄イオンに
よる阻害を防ぐ改良製法（特願昭５８−１６５２４５号
）を適用することも出来る。

培養には好気的条件が好ましい。培地のｐ）は２乃至１
０とするが、６乃至９に調節すれば最も好ましい結果が
得られる。温度は２０℃乃至３７℃の範囲のうち使用菌
株の生育及びリボフラビン生産性に適した温度を用いる
ことができる。

このようにして得られる培養液からのリボフラビンの採
取には公知の手法が適用できる。

即ち培養液を６０℃〜１２０℃に加熱しリボフラビンを
溶解させたのち、遠心分離により酵母菌体と濾液に分離
し、濾液を必要に応じ濃縮したのちハイドロサルファイ
ド或いは三塩化チタンにより還元しリボフラビンを沈降
させる。このようにして得られたリボフラビンを空気中
で酸化させたのち、水、酢酸水溶液等の溶媒を用いて再
結晶を行い、精製することが可能である。

さらには本発明者らによるリボフラビンの取得法（特願
昭５９−１４３９５３号）を用いて高純度のリボフラビ
ン結晶を採取することが可能である。

〔実　施　例〕

以下実施例により本発明方法を更に説明する。

実施例１ サツカロミセス・セレビシェＮ１１−２６８及びその親
株であるサツカロミセス・セレビシェＴＲ−２９をグル
コース２％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３
％、麦芽エキス０．３％を含む液体培地１００ｍｊに接
種し、３０℃で４０時間振盪培養する。

この前培養液を第４表の醗酵培地に１６％の植菌量で接
種し、３０℃で１１日間振盪培養した。培養液中に蓄積
したリボフラビンの量は、親株であるサツカロミセス・
セレビシェＴＲ−２９を用いた場合には３．１０ｇ／ｌ
であったのに対し、サツカロミセス・セレビシェＮ１１
−２６８を用いた場合は３．４０ｇｅｌに向上した。

第４表　リボフラビン生産醗酵培地組成実施例２ 前記第３表に示す醗酵培地組成のうち、硫酸７ンモニウ
ムの濃度を第５表に示すように変え、他は同じ組成の培
地で実施例１と同様の方法で１０日間壇培養行った。第
５表に示すように、親株であるサツカロミセス・セレビ
シェＴＲ−２９を用いた場合に比べ、サツカロミセス・
セレビシェＮ１ｌ−２６８を用いた場合は、アンモニウ
ムイオン濃度を高めても培養液中に蓄積されるリボフラ
ビン覆は殆ど減少しなかった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属
   し、アンモニウムイオンに耐性を有するリボフラビン生
   産菌を培地中で培養して、リボフラビンを生成・蓄積せ
   しめこれを採取することを特徴とするリボフラビンの製
   造方法。