JPS62104596A - 体液中のグアナ−ゼ活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、体液、例えば血清中のグアナーゼ（以下、Ｇ
ＵＡと略称する。）の活性測定法に関する。

「発明の背景」 ＧＵＡは核酸代謝にあずかシ、グアニンを脱アミノ化し
てキサンチンとアンモニア全生成させる酵素であって、
肝臓、腎臓、脳などに於て強い活性が認められるもので
ある。臨床的には、正常血清、赤血球、白血球に於ては
ほとんど活性が認められないことから、体液中のＧＵＡ
を測定することは肝細胞障害の櫃めて敏感な指標になる
といわれている。

ＧＵＡの活性測定法として、これまで種々の方法が発表
されているが、実用的なものとしては、ＧＵＡ グアニン＋Ｈ２０キサンチン＋ＮＨ。

の反応で生成したキサンチンを測定する方法（特開昭６
０−１０２１９９号公報；特開昭５９−６６８９９号公
報：　Ｓｕｇｉｕｒａ　ａｔ　ａｌ、　Ｃｈｅｍ、　Ｐ
ｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌす２９　ｅ４　２　６〜４　２９
　　（１９８１）　　：Ｎ１５ｈｉｋａｖａ　　ａｔ　
　ａＬｃｌｌｎ、ｃｈｓｍ、。

２７．５６０〜５６］（１９８１）等）とＮＨ，を測定
する方法（伊東ら、臨床病理、２３巻、７３３〜７３６
゜１９７５年等）とがある。

ＮＨ３’を測定する方法としては、インドフェノール反
応を利用したものが主流であるが、血清タンパクが類似
の発色をするため、検体ブランク測定を実施しなければ
ならず、しかもその値が高いため測定結果に誤差を生じ
やすいなどの欠点も有する。

一方、ＧＵＡによってグアニンから生成したキサンチン
（以下、ＸＡと略称する。〕を測定する方法としては、
例えば、これにキサンチンオキシダーゼ（以下、ＸＯＤ
と略称する。）ｔ−作用させて生成するスーパーオキジ
ドアニオ／（０□７）全測定する方法（第２４回日本臨
床化学会年会抄録、１０４頁。

１９８４年）或いは０″を経由して生成するＨ２０□を
測定する方法、生成したＸＡにＸＯＤとウリガーゼを作
用させ、ｎから生成した尿酸からもＨ２０□を生成させ
て、ＸＡからのＨ２Ｏ２と尿酸からのＨ２０□の合計量
を測定する方法などがある。しかしながら、０２′を測
定する方法は感度が低いため血清量を多く必要とし、ま
た試薬盲検が必要であるなどの欠点があり、Ｈ２０□を
測定する方法ではＸＡ　−ＸＯＤの反応によシ同時に生
成する０□”ｔ−Ｈ２Ｏ□へ変換する必要があるため、
スーパーオキシドジスムターゼ（以下、ＳＯＤと略称す
る。）を共存させたシ、クエン酸を加えて酸性にしたシ
しなければならず、ステップ数が多く操作が繁雑である
。即ち、いずれにしても、未だ充分満足し得るグアナー
ゼ活性測定法は見出されていない。

「発明の目的」 本発明は上記した如き状況に鑑みなされたもので、キサ
ンチンを測定することによりＧＵＡ活性を測定する方法
に於て、従来よシ改善が求められていた測定感度の問題
、検体盲検の問題、共存物質による誤差の問題等をすべ
て解決したＧＵＡ活性の新規で且つ精度の高い定量法を
提供することを目的とする。

「発明の構成」 本発明は、グアニンを基質とし、体液中のグアナーゼ（
ＧＵＡ）の作用によシ生成したキサンチン（ＸＡ）に、
キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）　、ウリガーゼ、還
元型補酵素、ペルオキシダーゼ、フェノール類（又はナ
フトール類）又はアミン類、及び被還元性呈色試薬を作
用させて、生成する色素を比色定量することによシその
活性値を求めることを特徴とする、グアナーゼ活性測定
法である。

本発明の方法は、以下の（１）〜（３）の反応式で示さ
れる。

グアニン　　　　　　　　キサンチン ホルマデン又ハジホルマデン十ＮＡＤ（Ｐ）　　・曲曲
（３）尚、（２）式は、詳しくは下記の２つの式から成
る。

（キサンチン） このように、本発明は、ＧＵＡ　Ｋよジグアニンから生
成したキサンチンにＸＯＤとウリガーゼを作用させ、生
成した尿酸を更Ｋ、ウリガーゼによシ）ｆ、０２とアラ
ントイン及び炭酸ガスに分解させ、キサンチンからＸＯ
Ｄにより生成したＨ２０□と、尿酸からウリガーゼによ
り生成したＨ２Ｏ２との総量を、還元型補酵素、ベルオ
キシメーゼ、フェノール類（す７トール類）又はアミン
類の存在下、被還元性呈色試薬を用いて測定しているの
で、従来法に比べ感度が２倍に向上する。

酵素反応により生成したＨ２０□は、本発明者らが先に
特許出願した方法（特願昭６０−０７１６３２号）。

即ち還元型補酵素、ＰＯＤ、フェノール類（又はナフト
ール類）又はアミン類、及び被還元性呈色試薬を用いる
Ｈ２０□の定量法を適用することによシ、測定が可能で
、これによシ共存物質の影響の少ない測定値を得ること
ができる。

また、本発明を行なうにあたり、検体（血清）中に存在
する尿酸、キサンチンなどによる誤差は、予メＸＯＤ、
ウリガーゼ、イルオキシダーゼ、及びアミン類又はフェ
ノール類（又はナフトール類）を検体中に存在させ、一
定時間反応させることＫより消去できるので、検体盲検
の測定が不必要である。

また、本発明の方法では、０□′をＨ２Ｏ２Ｖｃ完全に
変換するために反応停止剤を用いて、酵素反応を一旦停
止させなければならないというようなことも准い。

即ち、（２ａ）式に於ける反応では、０２″：を経由し
てＨ２０□に変換されるが、この反応を完全に行なわせ
るには、通常、液性を酸性にしたり、或はスーパーオキ
シドジスムターゼ（Ｓ（］））令磨咄横Ｈ←−４＝Ｆ＋
を添加する必要があるが、本発明の方法では、このよう
な処理は全く必要ない。更に、グアニン−ＧＵＡの酵素
反応と同時に呈色反応が行なえるので、レイト法による
測定も可能である。また。

エンド法で測定を行なう場合、反応停止剤としては従来
から用いられている塩酸、クエン酸等の酸類を用いても
よいが、中性のドデシル硫酸塩を用いれば、自動分析装
置の材質をいためる恐れもなく、よシ好ましい。

本発明に用いる還元型補酵素としては、例えば、還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）や
、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（ＮＡＤＰＨ）等が挙げられるが、これらに限定される
ものではない。

また、ペルオキシダーゼは、植物由来、動物由来、微生
物由来のペルオキシダーゼがいずれも使用できるが、通
常は西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが好ましく用い
られる。

本発明に用いる被還元性呈色試薬としては、既存のもの
未知のものを問わず、還元されて呈色する化合物は全て
挙げられる。既存のもので一般によく用いられるものと
しては、例えば、ニトロテトラゾリウムブルー（以下、
ＮＴＢと略称する。）２−（４−ヨードフェニル）−３
−（４−二トロフェニル）−５−７エニルテトラゾリウ
ム　クロリド（以下、ｒＮＴと略称する。）、３−　（
４，５−ジメチルチアゾリル−２）　−２，５−ジフェ
ニルテトラゾリウム　プロミド（以下、ＭＴＴと略称す
る。Ｘ２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（２−カル
ボキシフェニル）−５−（４−（ヒドロキシポリ（オキ
シ−１，２−エタンジイル）〕フェニル）−２Ｈテトラ
ゾリウム　クロリド（以下、　ＢＣＲＴと略称する。）
等のテトラゾリウム塩が挙げられる。

本発明に用いるフェノール類としては、フェノールその
ものの他、例えば、メチル、エチル、ゾロぜル等アルキ
ル置換フェノール、例、ｔば、メトキシ、エトキシ、プ
ロポキシ等アルコキシ置換ｈノール、塩素、臭素、弗素
、沃素等ハロｒン置換フェノール等各種誘導体が使用で
きる。また、ナフトール類としては、ナフトールそのも
のの他、例えは、ナフトールスルホン酸類、ナフトール
カルボン酸類等のナフトール誘導体が使用できる。

アミン類としては、通常の有機アミンがいずれも使用で
き、−級、二級、三級を問わない。また、一般に脂肪族
アミンに比べ芳香族アミンの方が、少ない使用量で効果
がある。これらのアミン類の具体例としては、例えば、
アニリン、Ｎ−メチルアニリン、Ｎ−エチルアニリン、
Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、　Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリ
ン、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−
Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−）ルイジン、３＃
５−ゾメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−ソジウムスルホプロビル）アニリン、Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロビル）−ｍ−）
ルイジンナトリウム等が挙げられるが、これらに限定さ
れるものでないことは勿論である。

これらアミン類、フェノール類及びナフトール類は夫々
巣独で用いても、任意に二種以上組み合せて用いてもか
まわない。また例えば］−］Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノー
４−ナフトール４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノサリチル酸
のように、１つの化合物がフェノール類でもあり、アミ
ン類でもある化合物を使用することもできる。

本発明の方法は、通常エンド法では３ステツプ、レイト
法では２ステツプになる。即ち、第１ステツプでは、試
料中に共存するキサンチン、ヒＩキサンチン、尿酸、及
び必要であればアスコルビン酸やビリルビン等の分解処
理を行ない、第２ステツプでは基質のグアニン金倉む試
液が用いられ、ＧＵＡの酵素反応と呈色反応が同時に行
なわれる。

レイト法では、この呈色反応の単位時間当りの呈色の増
加を測定する。エンド法では、第２ステツプでのＧＵＡ
酵素反応を一定時間行なわせた後に反応停止剤を加えて
酵素反応を止め、吸光度を測定する。Ｈ２０□と被還元
性呈色試薬との反応は、還元型補酵素、ＰＯＤ　、及び
フェノール類（又はナフトール類）又はアミン類の共存
下で進行するので、第１ステツプの試薬（以下、第１試
液と略称する。）中に被還元性呈色試薬又は還元型補酵
素のいずれか一方を存在させることは何等差支えない。

アスコルビン酸を含む試料の場合は、第１試液との反応
で生成したＨ２Ｏ。が、ＰＯＤの存在下でアスコルビン
１！！ヲ始め、その他の還元性物質を競合的に分解する
ので通常はほとんど問題はないが、その量が異常に多い
ときは、この第１試液中に銅イオンを共存させれば、本
発明者らが先に開示した特開昭５９−２３０１６１号又
は特願昭５９−１１８６０１号の発明に示される如く、
アスコルビン酸は分解除去できるし、ビリルビンの影響
も低減できる。

また、アスコルビン酸オキシダーゼを第１試液中に共存
させてもよい。更に、ビリルビンはビリルビンオキシダ
ーゼを第１試液に共存させることにより分解除去できる
。

第１試液に含まれるＸＯＤ、ウリガーゼ、ＰＯＤ、フェ
ノール類（又はナフトール類）又はアミン類の量は、試
料中のヒデキサンチン、キサンチン、及び尿酸を分解で
きる量であれば特に限定されないが、第２ステツプの反
応に支障のない量が望ましいことはいうまでもない。ま
た、第２ステツプの試薬（以下、第２試液と略称する。

）中に、更にＸＯＤ　、ウリガーゼ、ＰＯＤ、フェノー
ル類（又はナフトール類）又はアミン類、のいずれか又
は全てを存在させることは何等差支えない。

第１試液の液性は、ＸＯＤ、ウリガーゼ、ＰＯＤが作用
する範囲であれば特に限定されないが、通常はｐＨ５〜
９の範囲が好ましく用いられる。

第２試液の液性は、第１試液と混合してＧＵＡの酵素反
応をさせるときの液性がｐＨ５〜９になるように調製す
る。第２試液中のクアニンケの濃度は、第１試液と混合
して第２ステップ反応を行なうとき、０．０５〜５　ｍ
　ｎｏνｌの範囲になるように調製する。

ＸＯＤは第２ステツプの反応液中１〜１００Ｕ／Ｊ、ウ
リガーゼは１〜３００Ｕ／ｉ　ＰＯＤは１００〜１０，
０００Ｕ／／、フェノール類（又はナフトール類）又は
アミン類は０．１〜５００　ｍ　ｍｏｌ／ｌ　、　ＮＡ
Ｄ（Ｐ）　Ｈは０．０１〜２０　ｍ　ｍｏｌ／ｌの範囲
が好ましく用いられるが、これらに限定されるものでは
ない。

第１試液、第２試液の液性の調整に用いる緩衝剤は、通
常用いられている緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、トリ
ス塩酸緩衝液、グツド緩衝液などが使用できるが、これ
に限定されるものではない。

酵素反応又は呈色反応を円滑に行なわせるため、界面活
性剤を第１試液又は／及び第２試液に加えることは何等
差支えない。

反応停止剤としてドデシル硫酸塩を用いる場合は、最終
呈色液中、］　ｍ　ｍａｌｌ１以上の濃度になるように
する。反応停止剤として塩酸、クエン酸等の酸類を用い
る場合は、最終呈色液の液性がｐｉ−１３以下になるよ
うにする。

以下に実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

「実施例」 実施例　１゜ 〔試液の調製〕 ■　第１試液 ０、１　Ｍリン酸塩緩衝ｆｉ（ｐＨ７，０）中に、ＸＯ
Ｄ　１＆：６０　Ｕ／ｌ、ウリガーゼ’ｋｌｏＯＵ／ｉ
　ＰＯＤを３．０００Ｕ／ｌ及びフェノール′ｆ！：ｏ
、０１％の濃度になるように溶解した。

■　第２試液 ０、１　Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）中に、グアニ
ン’ｋ　Ｏ，８ｍ　ｍｏｌ／ｌ　、　ＮＡＤＰＨｔ”　
１．２５　ｍ　ｍｏｌ／ｌ、ＮＴＢを０．０４％及びト
リトンＸ−１００ｔ−０，１係の濃度になるように溶解
した。

■　反応停止液 ドデシル硫酸ナトリウムの０．２チ水溶液を調製した。

〔試　料〕

ゾール血清に、Ｓ　ｉ　ｇｍａ社製グアナーゼ（Ｆｒｏ
ｍＲａｂｂｉｔ　Ｌｉｖｅｒ　）を夫々１０．２０，３
０，４０．５０Ｕ／７！になるように添加し、これを試
料とした。

〔測定方法〕

試料５０μｌｔ−とり、第１試液１．０Ｗｌｌｆｔ加え
、３７℃で５分間加温後、第２試液１．０−を加えて、
３７℃で正確に３０分間加温した。反応停止液１．０４
を加え混和した後、試薬ブランクを対照として。

波長５６０　ｎｍの吸光度を測定した。

第１図にグアナーゼ（ＧＵＡ）濃度と吸光度との関係を
示す。第１図より明らかな如く、各ＧＵＡ活性値（Ｕ／
ｌ）に対してプロットした吸光度を結ぶ検量線は良好な
定量性を示している。

実施例　２゜ 〔試液の調製〕 ■　第１試液 実施例１．に同じ。

■　第２試液 実施例１．に同じ。

■　反応停止液 実施例１．に同じ。

〔試　料〕

血清、及び血清°に尿酸、キサンチン、ヒポキサンチン
を夫々加えたものを試料とした。

〔測定方法〕

実施例１．に同じ。

測定結果を表１に示す。

表　　１ 表１から明らかなように、本発明の方法では、血清中の
尿酸、キサンチン、ヒポキサンチンの影響を全く受けな
かった。

実施例　３゜ 〔試液の調製〕 ■　第１試液 実施例１．に同じ。

■　第２試液 実施例１．に同じ。

■　反応停止液 実施例１．に同じ。

〔試　料〕

血清１０検体、及びグアナーゼ（ＧＵＡ）　２０Ｕ／ｌ
を含む標準液を試料とした。

〔測定方法〕

実施例１．に同じ。

測定結果を表２及び表３に示す。

参考例　１ 〔試液の調製〕 ■　基質液 ０、１　Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６，５）中に、グアニ
ンを０．８　ｍ　ｍｏｌ／ｌの濃度になるように溶解し
た。

■　発色試液 ０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐ）１６゜５）中に、キサン
チンオキシダーゼｔ−６０Ｕ／１．　ＮＴＢ’ｔ”０．
０４％、　　］−メトキシフェナジンメトサルフェート
をＯ，ＯＯＳ優、β−シクロデキストリン’ｉ　０．４
　％及びトリトンＸ−１００ｔ０．２％の濃度になるよ
うに溶解した。

■　反応停止液 ０．１チドリトンＸ−１００を含む０．　Ｉ　Ｎ塩酸を
調製した。

〔試　料〕

実施例３．に同じ。

〔測定方法〕

基質液０．５１７と発色試液０．５　ｍを混和し、３７
℃で３分間加温した。これに試料（血清）５０μｌを加
えて、３７℃で３０分間加温後、反応停止液２．０ｍ１
−加えて、水を対照として波長５６０　ｎｍの吸光度を
測定した（ＰＩ：　ｔ＞。

基質液の代シに０．１　Ｍリン酸塩緩衝ｆｉ　（ｐＨ６
，５）を用いて同様に操作し、血清ブランクの吸光度を
測定した（”ｔｌ）。

基質ｔ　０．５　ｄ、発色試液０．５１を用い、血清５
０μｌの代シに蒸留水を用いて、血清と同様に操作し、
試薬ブランクを測定した（ＦＢＩ）。

ＧＵＡ　２０　Ｕ／／を含む標準液を試料として用い、
血清と同様に操作して吸光度を測定した（”５ｔｄ）。

測定結果を表２及び表３に示す。

（１）本発明（実施例３）と従来法（参考例１）の感度
を比較したものｔ−表２に示す。

表　　　２ 表２から明らかなように、本発明の方法は、０２″：を
測定する参考例１．に比べて、約２倍の感度を有する。

（ｉＤ　　血清］０検体を用いて、実施例３．と参考例
１６で測定した結果を表３に示す。

表３の結果についてｔ検定を行なった結果、有意水準５
憾で実施例３．と参考例１．の間には差が認められなか
っ九。

表　　　　　３ Ｙ　＝　０．９４９Ｘ十０．３　（ｒ＝０．９９９　）
「発明の効果」 以上述べた如く、本発明は、ＧＵＡの新規で且つ有用な
定量法を提供するものであり、 ■　従来法に比べ感度が高い点。

■　ニトロテトラゾリウムブルー等のテトラゾリウム塩
を発色試薬として用いて還元系で測定するため、アスコ
ルビン酸等還元性を有する共存物質の影響の少ない測定
値が得られる点。

■　検体中に共存する、キサンチン、ヒポキサンチン、
尿酸等による影響は、予め検体中にＸＯＤ、ウリガーゼ
、ペルオキシダーゼ、及びアミン類又はフェノール類（
又はナフトール類）を添加して一定時間反応させること
により消去できるので、検体盲検の測定が不必要となっ
た点。

等に顕著な効果を奏する発明でちゃ、斯業に貢献すると
ころ大なるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１．に於て得られた検量線を表わし、
横軸の各グアナーゼ活性値（Ｕ／ｌ　）について得られ
た吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだもので
ある。 特許出願人　　　和光純薬工業株式会社葛　ｔ　田 グ°アナー仁゛殉・ａ７１Ｌ　（切倹）昭和６１年７　
月３０Ｈ 昭和６０年　　特許願　第２４３２００号２、発明の名
称 体液中のグアナーセ活性測定法 ３、補正をする者 ゛財ノ１との関係　　特許出願人 郵便番号　５４１ 住所　大阪ｔｔＳ大阪市東区道修町３丁目１０番地連絡
先　特許課（東京）　　ＴＥｌ、　０：ｌ−２７０〜８
５７１名称　和光純薬工業株式会社 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６、補正の内容 ｆｉ＋　　明細、！Ｆ　４　ｙ７３行目に記載の「或い
は」を「或は」と補正する。 「　　　　０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　キサンチン　　　」キリンチン　　　」 「０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　キサンチン　　　」キサンチン　　　」 以上

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）グアニンを基質とし、体液中のグアナーゼ（ＧＵ
   Ａ）の作用により生成したキサンチン（ＸＡ）に、キサ
   ンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）、ウリガーゼ、還元型補
   酵素、ペルオキシダーゼ、フェノール類（又はナフトー
   ル類）又はアミン類、及び被還元性呈色試薬を作用させ
   て、生成する色素を比色定量することによりその活性値
   を求めることを特徴とする、グアナーゼ活性測定法。
2. （２）体液中に存在するキサンチン、ヒポキサンチン、
   尿酸を、キサンチンオキシダーゼ、ウリガーゼ、ペルオ
   キシダーゼ、フェノール類（又はナフトール類）又はア
   ミン類を用いて分解後、体液中のグアナーゼ活性の測定
   を行なう、特許請求の範囲第１項に記載の測定法。
3. （３）還元型補酵素が、還元型ニコチンアミドアデニン
   ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）又は還元型ニコチンアミド
   アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）である、
   特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の測定法。
4. （４）被還元性呈色試薬がテトラゾリウム塩である、特
   許請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の測定法
   。