JPS6182165A - 発光特異結合検定に於いて外部光を抑制する減衰剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 又里鬼！見 本発明は、一般に発光検定法に関し、より特別には発光
特異結合検定に於ける外部光の抑制に関する。

特異結合検定は、試料中に小濃度で存在する被検物質ま
たはリガンドの経済的な検出および測定方法を提供する
。特異結合検定は、一方が被検物質であり、他方が特異
結合性パートナ−であって互いに特異的に認識する２種
の結合性物質の相互作用に基づいている。その相互作用
が特異結合検定の基礎として働くことができる特異結合
性パートナ−の例には、抗原−抗体、ビオチン−アビジ
ン、ＤＡＮプローブ、酵素−基質、酵素−阻害剤、酵素
−コファクター、細胞表面レセプタ一対が含まれる。他
の特異的結合性物質を含む検定も知られており、これら
の検定も本発明の範囲内にある。

多くの変化が提案されているが、１つのかかる検定は、
直接測定可能な標識反応の１成分と前取て接合されてい
る特異結合性パートナ−と試料中の被検物質を結合させ
ることを含む。標識反応を測定して被検物質と接合特異
結合性パートナ−との間の結合の程度を決定するが、こ
の結合の程度は検定方法の特殊性に依存しかつ試料中の
被検物質の量を反映することができる。特異結合検定は
、生物学的、医学的、環境的および工業的用途に於ける
種々のりガントの定量に多大の有用性があることが知ら
れている。

特異結合検定には、放射能法、クロモゲン法、ルミノゲ
ン法を含む種々の標識反応が提案されている。放射能標
識法では、特異結合性パートナ−と接合される成分が放
射能を放射する原子または分子である。゛クロモゲン標
識反応およびルミノゲン標識反応は、数種の反応が含ま
れる可能性がある点で化学的により複雑である。クロモ
ゲン型またはルミノゲン型の１つの反応では、接触反応
に於て分子は変色するかあるいは発光する。従って特異
結合性パートナ−に接合される成分は、基質と呼ばれる
反応体または触媒のうちのいずれか１つであることがで
きる。反応の残りの成分すなわち結合性パートナ−に接
合されない成分はクロモゲンまたはルミノゲン試薬媒質
中へ供給され、標識接合物と試薬媒質との結合によって
それぞれ変色または発光が生じるようになっている。

特異結合法の原理を用いる種々の検定が知られており、
幾つかの検定は重要な診断用具となっている。かかる特
異結合検定の１つの型すなわち免疫検定に於ては、被検
物質は抗体または抗原またはハブテンであり、この被検
物質をこの群のもう１つの成員と反応させる。以下の背
景議論はかかる免疫検定に焦点を合わせるが、この焦点
は提示を明らかにするために選んだものであり、本発明
を限定するためのものではなく、本発明は発光標識特異
結合検定に広く応用することが可能である。

体内に於ける反応性成分の存在を検知することは、特異
結合検定を用いるのに特に好適な医学的に重要な診断技
術である。１つの重要な例である免疫反応に於ては、人
体は単独で抗原と呼ばれるある種の異種分子に応答して
抗原に対して特異的な抗体を産生じ、侵入抗原を中和す
るのを助ける。

幾人かのヒトはある種の抗原の少量にさえも過大な反応
を生じる。重篤となりあるいは死に到ることすらあり得
る過大の反応はアレルギー反応と呼ばれている。従って
、あるヒトがアレルギーを有するかどうか、またもしそ
うならばどんなアレルゲンに対してアレルギーを有する
かを決定することができ、その結果、抗原への暴露を避
けることができあるいはそのヒトをその抗原に対して脱
感作することができるようにすることは極めて望ましい
。

過去に於て、アレルギー感受性は、抗原性の可能性のあ
る刺激物質を一定期間ヒト皮膚に接触させておき、ヒト
反応を観察して感受性を判断する生体内での貼付試験ま
たはストラッチ（ｓ　ｔｒａ　ｔｃｈ）試験で測定され
た。かかる生体内試験は、不確かでかつ定量化が困難で
あると共に、医師にとっても患者にとっても不経済で不
便でありかつ時間を浪費することになる。

生体外免疫検定は、患者の体内から排出される液体試料
中に存在する、ある種の抗原に対して特異的な抗体の量
を測定することによってその患者のアレルギー状態を示
すことができる。特別な抗原に対する抗体が人体に存在
することを検出する１つの特異結合免疫検定に於ては、
測定のために主旨定された固体表面に抗原を付けた後、
該抗原に対して特異的な抗体を含んでいるか否かがわか
らない患者からとったヒト血清に暴露させる。血清中に
抗体があれば、抗体は抗原と反応して、該抗体も固体表
面に固定される。血清を除去し、もし抗原−抗体対が存
在するならば、液封を幾つかの方法のうちの１つの方法
で標識する。例えば、抗原−抗体対を抗ヒト抗体に接合
された放射性原子で標識し、それによって血清中に抗体
被検物質が存在していたときのみ、放射性原子は表面に
固定され（抗原−抗体対を通して）、その後で測定する
ことができる。ラジオイムノアッセイと呼ばれるこの方
法は有効であるが、後で投棄しなければならない放射性
試薬の使用が必要であることおよび低い量の被検物質に
対して感度が制限されることなどの幾つかの欠点がある
。

表面に付いている抗原−抗体対をルミノゲン反応系の１
つの成分と接合させた抗ヒト抗体で標識する発光免疫検
定またはＬＩＡと呼ばれる方法も提案されている。発光
反応系の残りの成分は茨に導入される試薬媒質中に与え
られていて、固定化標識接合物へ試薬媒質が接触すると
発光するようになっている。この発光検定の光源は性格
が化学的であっても生物学的であってもよいので発光検
定は、それぞれ化学発光および生物発光と呼ばれる。発
光検定に於ける発光は、蛍光から生じることも燐光から
生じることもあり得る。これらの検定のいずれかで放射
される光は、例えば倍増型光電管または写真フィルムの
ような適当な手段による測定で検出することができる。

発光特異結合検定を用いる場合、幾つかの問題が生じる
。特に関心があるものは、測定のために１旨定された光
放射以外の表面または容積からの光の放射である。外部
光といわれるかかる光は指定表面から放射される光の測
定を妨害する。今述べたばかりの検定方法では、標識抗
原−抗体対が固定される固体表面付近で望ましくない外
部光が生成され、発光中この指定表面の周りに“ハロー
”効果を生じる。この外部光は表面の見掛は像を広げ、
その鮮明度を低下させる。指定表面から放射される光の
見掛けの相対強度はこの外部光の結果変化される。すな
わち、比較的弱く放射する固体表面領域は、それが実際
に外部光によるよりも背景に対して幾らかより明るく見
える可能性があり、その像が明らかに相対的に強くかつ
広くなる。この場合、不正確な測定が得られる。

関連する問題が非特異結合から生じる。上記特異結合検
定は一般に高度に特異的であるが、対応する特異結合パ
ートナ−が存在しな（でも発光反応成分が表面に固定さ
れるようになる非特異結合があるかも知れない。かかる
非特異結合が起こると、非特異発光が放射され、試料中
に対応する被検物質が無くても反応性の偽陽性指示を生
じる可能性がある。

発光特異結合検定のもう１つの型に於て、被検物質また
は被検物質類似物は、好ましくは透明管壁の底部のよう
な指定測定表面に濃縮される。被検物質を含む第１溶液
を、発光反応の１つの成分と接合させた、該被検物質に
対する特異結合性パートナ−より前またはと同時に添加
して、溶液中および指定測定表面に特異結合対を生成さ
せる。

次に、発光反応の残りの成分を第２溶液で添加する。し
かし、他の表面および管容積全体にわたって見られる反
応対は外部光放射を生じ、指定測定表面にある特異結合
対からの光強度の測定を妨害する可能性がある。かかる
外部光を減少させる１つの方法は、第２溶液を添加する
前に管から試料および第２溶液を物理的に除去する方法
であるが、この方法は別個の工程を必要とする。かくし
て検定は１工程法でなく多工程法を必要とし、従って検
定の実施費用が増す。かかる環境下で、外部光の妨害を
避け、特に多（のかかる試験をルーチンに行いかつ別個
の工程がかなりの費用を計上する場合に、検定を均質的
に行い得るようにすることは極めて望ましいことである
。

従って、発光検定に於ける望ましくない外部光を抑制す
る方法が要望されている。本発明はこの要望を達成する
ものでありかつ関連した利益をも与えるものである。

衾貝■叉■ 本発明は、発光によって監視される検定に於ける望まし
くない外部光を抑制する技術に関する。

１つのかかる検定に於て、試験溶液中のりガントまたは
被検物質を発光反応系の成分の１つに接合された特異結
合性パートナ−に結合させる。発光反応系の残りの成分
を、次に添加する試薬媒質中で導入する。特に、この技
術は、指定された測定表面に固定された反応体から光が
放射される検定に関して用いることが好ましい。表面か
らの像の鮮明度は増加され、その結果、像から行われる
定性的比較および定量的測定の両方あるいはその他の測
定の精度を向上させることができる。その上、偽陽性指
示の起こることが少なくなる。また、非指定表面または
容積からの外部光も抑制される。

本発明によれば、特異結合性パートナ−に接合されてい
ない発光反応系の最終的な残りの成分を供給する試薬媒
質中に、放射される発光の波長を含む波長の光を吸収す
る減衰剤を与える。減衰剤は、指定された測定表面また
は容積以外の表面または容積からの減衰剤が無ければ見
える望ましくない外部光を抑制するのに十分な量で存在
する。

１つの実施態様に於て、発光反応によって生成される光
を測定するとき、指定表面を発光性試薬媒質と接触させ
る。試薬媒質は外部光を抑制する減衰剤を含んでいる。

好ましくは、減衰剤は、少なくとも発光分子が放射する
光の波長の光を吸収する染料である。外部光を抑制する
とき、減衰剤は非特異発光をも減少または除去する。

試薬媒質へ添加される減衰剤は、少なくとも発光反応で
放射される光の波長を含むある波長スペクトルにわたる
光を吸収する染料として都合よく選ぶことができる。減
衰剤は、随意に他の波長の光を吸収し、減衰剤が発光の
波長の光だけを吸収するという制限はない。如何なる点
に於ても本発明を限定するためと考えるべきでない１例
として、発光性分子ルミノールは、酸化されるとき約４
５０ｎｍの波長を中心とする狭いスペクトルにわたる放
射線を放射する。減衰剤は、この波長の光を吸収せねば
ならずかつ付加的にルミノール放射の全スペクトルから
の光を吸収するため波長約４５０ｎｍの十分広い範囲の
光を吸収せねばならない。この場合のために好ましい減
衰剤は、約４５０ｎｍに於て最大であるルミノール放射
スペクトルの吸収を確実にするため３５０ｎｍ〜５７５
ｎｍの光を吸収する染料混合物である。かかる減衰剤を
用いると、用いない場合に指定測定表面付近で見られる
望ましくない外部光を抑制する。

今や、減衰剤の使用が発光特異結合検定の分野に於ける
顕著な進歩を示すことは明らかであろう。

減衰剤は試薬媒質中に含まれていて、望ましくない外部
光を抑制しかつ指定測定表面からのより鮮明な像とより
正確な強度測定とをもたらす。発光が放射される指定測
定表面が、放射光強度が記録されつつあるとき液体試薬
媒質中に浸漬されている場合、減衰剤は、便宜上、試薬
媒質中に含まれる染料または染料混合物として選ぶこと
ができる。

本発明の他の特徴および利益は、例として本発明の原理
を示す添付図面に関して述べる以下のより詳細な説明か
ら明らかになるであろう。

好ましい　　と、の−細なｉ′日 本発明の第１の好ましい実施態様に於ては、発光免疫検
定法に関して減衰剤を使用するが、この場合、各糸に単
一型の抗原が結合している複数の固体系を試験チャンバ
ー１０に取り付け、種々の抗原の幾つかに対する抗体を
含む可能性のある血清に暴露する。特別な糸上の抗原に
対して特異的に結合する抗体が血清中に存在すると、そ
の抗体は抗原と結合し、次いで観察のために標識される
。

発光分子は任意の適当な型のものでよいが、ルミノール
のような化学発光性分子が好ましい。

より詳細には、第１図および第２図が好ましい発光検定
法に使用するために適当な試験チャンバーの形状を示す
。試験チャンバー１０は、ポリスチレンのような任意の
適当な不反応性材料製の細長い剛性中空ピペットである
。試験チャンバー１０の本体１２は、別の平坦な表面（
図には示してない）に平接触するために適した平坦面１
４を有する。平坦面１４付近の試験チャンバー１０の容
積の一部分は中空であり、従って細長い平底キャビティ
１６ができている。試験チャンバー１０の両端には、第
１中空管状突出部１８と第２中空管状突出部２０が設け
られている。管状突出部１８．２０のおのおのは、それ
ぞれの突出部付近の点でキャビティ１６と連通していて
、第１突出部１８に部分的真空を印加することによって
第２突出部２０中を通ってキャビティ１６中へ液体が吸
い込まれるようになっている。典型的な試験チャンバー
は、長さが約１７ｃｍ、幅が約１．４　ｃｍ、高さが約
０．８　ｃｍである。キャビティ１６は、長さ約１１ｃ
ｍ、幅約０．９　ｃｍ、深さ約０．１１の真直ぐな側面
の平底凹部で、本体１２の１７ｃｍＸ１．４ｃｍ平坦面
１４に開口している。キャビティ１６は、容積が約１ｍ
６である。

複数、好ましくは３８本の隔置された抗原被覆木綿糸２
２をキャビティ１６にわたって交差して張り、両端をキ
ャビティ１６の両側面の本体１２に固定する。各木綿糸
は、その血清との反応性を測定しようとする抗原の既知
量で一定長の木綿糸を被覆することによって調製される
。代表的な抗原としては、ぶたくさの花粉、バミューダ
草（Ｂｅｒｍｕｄａ　ｇｒａｓｓ）のようなある種の草
、西洋とねりこのようなある種の木、猫の毛のような動
物の成分が含まれ、これらの抗原は、当業者に公知の多
数の適当な方法のどれかで糸に付けることができる。糸
２２の幾本かは反応性の既知の特異的反応体で被覆され
ていてもよ（、あるいは未被覆のままであってもよい。

いずれの場合にも、対照または標準として試験結果の較
正に用いられる。本実施態様では糸２２を抗原で被覆さ
れたものとして述べたが、試験チャンバー１０および以
下に示す試験方法は一般に特異結合検定に関して用いら
れ得ることが認められるだろう。特に、本発明の減衰剤
は、抗体の免疫検定での使用に限定されるものではなく
、前述のように他の特異結合検定のために広（用いるこ
とができる。

キャビティ１６は、キャビティ１６の開放面上および糸
２２上に置かれた光透明性窓２４で密閉されていて、糸
が密閉キャビティ１６内にあるようになっている。窓２
４は、接着剤または溶剤接着または超音波接着のような
任意の適当な方法で本体１２の平坦面１４に付けられて
いる。発光強度測定を得るために以下に説明する方法に
於て、糸２２の指定測定表面２８から放、射される光に
関してのみ強度を測定することが望ましく、この場合、
指定測定表面は窓２４の内面２６に接触もしくは近接し
ている糸２２表面部分である。他の糸２２表面部分また
はキャビティ１６の他の部分から放射される光の測定は
望ましくなく、指定表面２８以外の表面または容積から
放射されるかかる光は外部光である。上記の好ましい実
施Ｂ様に於ては、糸２２は、窓の内面２６との接触によ
って指定表面２８の部分に沿って僅かに平坦化されてい
るが、かかる平坦化は偶発的であり、本発明の実施可能
性にとって臨界的なものではない。

試験チャンバー１０は、ヒト患者の血液中のような種々
の抗原に対する抗体の存在を決定するための免疫検定に
用いることができる。血液試料を患者からとり、この血
液を遠心分離して約１　ｍ　ｌ容量の血清試−料を調製
する。第１管状突出部１８に部分真空を印加することに
よって第２管状突出部２０を通してキャビティ１６中へ
血清を吸い込む。突出部１８．２０に栓をし、血清を糸
２２と接触させて十分な時間インキュベートして血清中
の抗体を糸２２に結合している抗原と反応させる。

インキュベーション時間は、典型的には約７〜約２４時
間である。血清中に存在しかつ特別な糸２２に付いてい
る抗原と反応性の抗体があれはこの抗体は抗原に結合す
るので、糸２２に固定される。特別な糸２２に結合して
いる抗原に対する抗体が血清中に無い場合には、該抗原
で被覆された糸には特異結合反応は起こらない。かくし
て、特異的抗原に対する抗体が血清中に存在すると、抗
原−抗体対が糸２２に固定される。特異抗原に対する抗
体が、血清中に無い場合には、糸２２に付いている抗原
に対して特異的に結合する抗体は無い。

種々の糸２２には数多くの異なる抗原を付けることがで
きるので、試験血清中に存在する種々の抗体によって、
ある糸は結合対を有するが他の糸は有しないことがあり
得る。糸２２に結合した抗原−抗体対２９の存在は、第
３図に毛髪状突出物として略示しである。

次に、血清をキャビティ１６から重力で排液させ、管状
突出部１８を通してキャビティ１６中へ緩衝洗浄液をフ
ラッシュすることによってキャビテイ１６内部を洗浄す
る。洗浄液は、好ましくはｐｉ（約７の燐酸塩緩衝０．
１％食塩水である。洗浄液を第２管状突出部２０を通し
てキャビティ１６から排液する。この洗浄操作を、次に
少なくとも２回繰返し、毎回新しい洗浄液でフラッシュ
し、キャビティ１６から試験血清を完全に除去する。

結合抗原−抗体対２９の存在は、対を発光標識すること
によって決定されるので、結合抗原−抗体対の存在は液
封の部位からの光の放射によって見ることができる。糸
２２の部分からの光放射量を次に測定して、各糸の抗原
−抗体対２９の反応性のレベルを決定する。望ましくは
、指定測定表面２８からのみの光を測定する。しかし、
本発明を用いない場合、他の表面および容積から放射さ
れる外部光が望ましくないのに測定される。本発明を用
いると、かかる指定測定表面２８から放射される光だけ
が測定される。

検定法の工程を説明する前に、好ましい実施態様の反応
体のための発光反応系の化学を簡単に説明する。有機分
子ルミノール（５−アミノ−２゜３−ヒドロ−１，４−
フタラジンジオン）は、過酸化水素のような酸化剤との
反応中に約４５０ｎｍの波長の光を発する。このルミノ
ール反応は西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のよ
うな酵素で触媒される。実際上測定可能な光強度を得る
ためには、３つの反応成分ルミノール、ＨＲＰ、酸化剤
を一緒にしなければならない。（本明細書中で用いる場
合、“成分”とは発光反応系の反応体のいずれか１つあ
るいはその触媒である。触媒はそれ自体反応に直接入ら
ないことが知られているが、触媒は“成分”という用語
の範囲内にあるものとする） ルミノール反応系は、成分のいずれか１つルミノールま
たはＨＲＰまたは酸化剤を抗ヒト抗体へ接合し、この接
合抗ヒト抗体を糸２２に付いている固定化抗原−抗体対
と反応させ、かつ別個に残りの成分を試薬媒質で与える
ことによって、糸２−２に付いている抗原−抗体対の存
在および量を測定するために用いることができる。抗原
−抗体対が存在しかつ固定されている場合には、ルミノ
ール反応の３成分全部が糸の所に存在し、光を発する。

逆に、特別な抗原に対する抗体が血清中に存在しない場
合には、試薬媒質中に含まれていない接合された成分が
無いので、発光しない。（後者の陳述の１つの例外は非
特異的結合によるものであり、この例外については後で
詳しく述べる）ルミノール反応系の化学を詳しく述べた
が、本発明は、その応用がこの反応系に限定されるもの
ではない。一般に、発光反応系は内部励起または外部励
起の結果として約１１００ｎ〜約１５００ｎｍの放射線
を放射する。本発明を用いることができる他の発光系は
、例えば下記の発光様物質：ルミノール以外のジアシル
ヒドラジド、アクリジニウム塩、シュウ酸ジアリール；
ルシフェリンおよびフラボンモノヌクレオチドのような
生物発光性系を含む。他の代表的な系は米国特許第４，
３９６．５７９号に記載されており、この記載は参照文
として本明細書に含まれるべきものとする。本発明は、
光源がどんなものであってもすべてのかかる発光標識系
に適用可能であり、系の制限は現在の所知られていない
。

上記の好ましい実施態様に於て、ルミノール反応系の触
媒はＨＲＰを抗ヒトＩｇＨに接合させることによって反
応系へ与えられ、かくしてＨＲＰが標識となる。この標
識接合物は、ナカネ（Ｎａｋａｎｅ）Ｖｏｌ、　１４．
９２９ページ（１９６７）に記載されている方法のよう
な標準的方法で調製される。

再び現在の所好ましい実施態様について説明すると、血
清を除去しかつキャビティ１６を洗浄した後、抗ヒトｒ
ｇＥに接合させたＨＲＰの溶液を第２管状突出部２０を
通してキャビティ１６中へ吸い込む。この溶液を十分な
時間、典型的には約２４時間までの時間キャビティ１６
内に保持させ、溶液中の抗ヒＩ−１ｇｇを糸２２の所で
固定されている抗原−抗体対２９のヒト抗体と特異的に
結合させる。その結果、抗原−抗体対が存在する場合、
ＨＲＰは抗原−抗体対によって固定される。しかし、幾
らかの糸上に抗原−抗体対が無い場合でも、少量の接合
ＨＲＰはそれらの糸に非特異的に結合する可能性がある
。

インギュヘーション後、抗ヒトＩｇＥに接合している残
留未反応ＨＲＰを含む媒質を第２管状突出部２０を通し
てキャビティ１６から排液する。キャビティ１６を、好
ましくは、新しい燐酸塩緩衝食塩水で、前述の方法で、
少なくとも３回洗浄して未結合ＨＲＰの痕跡を除去する
。

次に、キャビティ１６をルミノールと過酸化水素、好ま
しくはｐＨ約９の１００ｍＭ硼素塩緩衝液中に５ミリモ
ル（ｍＭ）のルミノールと１ｍＭの過酸化水素とを含む
試薬媒質で満たしてルミノール反応系の残りの成分を供
給する。前工程でＨＲＰがそこに固定されている糸２２
上の反応部位に於てルミノール反応系の３成分全部が存
在し、ルミノール反応が起こり、その部位から光が放射
される。

ＨＲＰが結合されない場合には、ルミノール反応は触媒
されず、ルミノールと過酸化水素が液中に存在しても光
は実質的に放射されない。

発光分子自体が糸２２に結合されている必要はなく、そ
の代わりに試薬媒質中で自由であってもよい。本明細書
中で用いる“表面から放射”および“局在化”反応とい
う用語は表面に固定された発光性成分を意味するが、表
面に結合した成分を発光性成分を含む反応に入らせるか
または反応を触媒させるために表面に十分近接している
溶液中の自由な未結合発光性成分をも意味すると解決す
べきである。本明細書中で用いられる“標識”という用
語は発光反応のために所要な成分の１つを表面に付いて
いる抗原−抗体対のような測定されるべき被検物質に直
接または間接に接合させる方法を意味する。従って、“
標識”は、発光性分子のりガントへの物理的付着に限定
されない。

発光光を生成させかつ記録するため、キャビティ１６中
の適所に試薬媒質を入れ、試験チャンバーの管状突出部
１８．２０を密閉する。暗室中で、試験チャンバー１０
を１枚のフィルム３０に接触させ、平坦面１４をフィル
ム３０に押しつける。

フィルムは、好ましくは米国マサチューセッツ州、ケン
ブリッジのポラロイドコーポレーションから発売されて
いるポラロイド５７型インスタントフイルムである。フ
ィルムを十分な時間、通常約１秒〜約２時間、好ましく
は約５分〜約４０分間露出してルミノール反応から放射
される光を記録する。フィルムを処理し、像を解析して
各糸２２に結合していた抗原−抗体対の程度を決定する
。別法では、光を、眼または増倍型光電管または他の光
検出器のような他の適当な手段で測定することができる
。

第４図は上記の方法で得た典型的な像を示す。

白い線は糸２２の像であり、糸に結合している抗原−抗
体対の存在を示す。強度が強い程、その特別な糸上に存
在する抗原に対する患者の反応は大きくなる。第４図に
見られるように、多くの糸の像の周りは外部光のために
か、なりぼやけており、このぼやけは、時に“ハロー”
として知られている。第６図は、同じ血清の対応する像
であるが、ラジオイムノアッセイ法で標識された像を示
す。

発光標識法では、ラジオイムノア・ノセイで生成される
フィルム中には存在しない幾つかの線が出現する。発光
法は感度が高くかつ従ってラジオイムノアッセイ法では
見られない幾つかの線を生じるが、第４図の発光法で観
察される（が第６図のラジオイムノアッセイ法では見ら
れない）幾つかのラインは偽陽性指示であり、非特異的
結合から生じるものである。かくして、上記発光法には
、外部光と偽陽性像の存在の可能性があるための不確か
さという欠点がある。

本発明によれば、少なくとも発光反応系が放射する光の
波長の光を吸収する減衰剤が試薬媒質中に含まれていて
、放射光の記録中存在するようになっている。減衰剤は
、該減衰剤が無い場合に多（の糸２２の付近に存在する
望ましくない外部光を抑制するのに十分な量で存在する
。好ましくは、ルミノール反応に用いる場合、減衰剤は
、ルミノール反応で放射される光の波長４５Ｏｎｍ付近
の波長の光を吸収する市販染料の混合物である。染料は
、外部光を抑制するために十分な量で試薬媒質中へ入れ
られる。減衰剤は、偽陽性指示の観察を減少し、その結
果、この方法の信頬性を同上することも見いだされた。

多数の染料の吸収スペクトルを測定して、ルミノール反
応で放射される光の波長を含む吸収スペクトルを有する
受容できる染料または染料混合物を決定する。染料は、
米国メリーランド州ハルチモアのマコーミソクコーポレ
ーション（ＭｃＣｏｒｍｉｃＣｏｒｐｏｒａ　ｔ　１ｏ
ｎ）からシリング（Ｓｃｈ　ｉ　１１　ｉｎｇ）の商標
をもつＦＤ＆Ｃ（食品、医薬品および化粧品用）食品染
料として得られた。シリング黄色染料は約４２０ｎｍに
吸収ピークがあり、シリング赤色染料は約５２０ｎｍに
吸収ピークがあることが観察された。シリング黄色染料
は、タートラジンとしても知られているＦＤ＆Ｃ黄色染
料＃５とアラル（Ａｌｌｕｒａ”）　　レッドＡＣとし
ても知られているＦＤ＆Ｃ赤色染料＃４０との混合物を
含む。タートラジンとアルラレッドＡＣとは、それぞれ
メイクインデックスの第９版中エントリー１に８８４７
と２７６であり、これらのエントリーは参照文として本
明細書中に含まれるものとする。シリング赤色染料は、
エリスロシンとしても知られているＦＤ＆Ｃ赤色染料＃
３とアラルレッドＡＣとしても知られているＦＤ＆Ｃ赤
色染料＃４ｏとの混合物である。エリスロシンおよびア
ルラレソドＡＣは、それぞれメルクインデックスの第９
版中のエントリー１１ｈ３６１５および隘２７６であり
、これらのエントリーは参照文として本明細書に含まれ
るものとする。しかし、これらの特殊な染料の使用が本
発明の実施にとって臨界的ではないことを強調しておく
。その代わりに、染料が検定法自体に悪影響を与えない
限り、発光反応によって生じる光の波長付近の光を吸収
するどんな染料または染料の組み合わせも受容できる。

吸収スペクトルに基づいて、ルミノール反応系に対して
好ましい減衰剤を、試験した黄色染料と赤色染料との等
容量混合物として選んだ。この混合物の吸収スペクトル
はルミノールによって放射される光の波長公称４５０ｎ
ｍを含む約３５０ｎｍ〜約５７５ｎｍのスペクトル範囲
にわたる光吸収を示す。選択される減衰剤は少なくとも
発光反応系が放射する波長の光を吸収しなければならな
い。他の波長のスペクトルにわたる吸収は許容でき、か
つ本発明の使用を妨げない。

試薬媒質中の減衰側染料の濃度は外部光を抑制するのに
十分な濃度でなければならない。本出願人はこの可能な
説明に束縛されたくはなく、また本発明の実施可能性が
この可能な説明によって制限されることはないが、現在
わかっている、第１図の実施態様に於ける外部光の原因
は第３図に示されている。フィルム３０に達する光の主
強度は、矢印３４で示されるように、試薬媒質３２およ
び窓２４を通して指定測定表面２８からフィルム３０へ
最短距離を走行する光の強度である。減衰剤が無いと、
矢印３６が示すように、試薬媒質と窓２４とのより長い
距離を過って走行する幾つかの光がフィルム３０に達す
る。このより長い距離を走行する光（矢印３６）は主と
して指定測定表面２８以外の表面または容積から放射さ
れるものであって、糸２２の周りの外部光またはハロー
をひき起こすものと思われる。減衰側染料は、試薬媒質
３２中を通る光の走行距離に比例する量だけ光を吸収す
る。

従って、減衰剤の濃度は、外部光（矢印３６）を抑制す
るのに十分な光の量を吸収するが指定測定表面２８から
放射される光（矢印３６）には小さな影響しか与えない
ように選ぶことができる。

従って、減衰剤の濃度の選択は、外部光を抑制するのに
十分な光吸収と写真露出時間を過度に長（するようなあ
まりにも多すぎる直射光の吸収との均衡を含む。従って
減衰剤の機能は、放射光の吸収に関するものであって、
発光反応の選択的阻止に関するものではないと考えてい
る。減衰剤は発光反応系の成分ではないので、各反応系
のための減衰剤の選択および最適化は、ここに説明した
物理的原理に基づいている。

ルミノール反応系のために添加されるべき減衰側染料の
好ましい量を決定するために、一連の測定を行った。上
述のようにして、ただし染料濃度を変えて行われる５つ
の発光検定を、単一染料がらとった血清部分について行
った。結果はフィルムに記録され、かつ指定測定表面２
８に固定された光度計の電圧信号を測定することによっ
て、５つの試験のおのおのに対して同一の対照糸の指定
測定表面から放射される光の強度を測定した。比較のた
め、糸の像のすぐ近くの光度計信号を外部光信号として
測定した。下記第１表に結果を示す。

第−一」−一一表 ０　　　　　　　４．４４　　　２．８４　　　　　１
，５６０．５　　　　　４，４２　　　０．１４５　　
　　３０．５１．０　　　　　４．３６　　　０．１１
０　　　　３９．６２．０　　　　　３．７８　　　０
．１０５　　　　３６５．０　　　　　２．３８　　　
０．０９０　　　　２６．４染料減衰剤を用いない（濃
度比Ｏの）場合、信号対外部光比は１より僅かしか大き
くないので、指定測定表面２日の像は背景外部光に対し
て目立たない。染料濃度を増すと、第２欄に見られるよ
うに指定測定表面２８からの信号が減少する。第１表の
第３欄かられかるように、すべての減衰側添加は外部光
を顕著に減少させる。信号対外部光比（第４欄）は、試
薬媒質中の染料の相対濃度比が約１．０のときに最大と
なる。写真像の質および鮮明度は、研究したすべての減
衰側染料添加に対して改良されるが、相対濃度比が１の
場合に最大の相対的改良が見られる。この染料濃度に於
て、波長４５０ｎｍの光の吸光度は約８．４である。上
記と同じこの最適化方法は、他の発光反応系に関して用
いられる減衰剤の最適濃度決定のために適用することが
できる。

これらの結果に基づいて、１：１赤色および黄色染料減
衰剤の好ましい相対濃度比は約０．５〜約２．０であり
、最も好ましい比はｌであって吸光度８．４に相当する
と判断された。かくして、本明細書中で外部光に対して
適用される“抑制”とは外部光の完全な除去を要求する
ものではなくて、その代わりに、測定しよとする光の強
度に対する外部光強度の減少を意味する。他の発光反応
系では他の染料および濃度および比が好ましいかも知れ
ないが、これらは、上述した方法で容易に決定すること
ができる。

第４図および第６図に示したと同じ検定で、しかし減衰
側染料の最も好ましい相対濃度比を試薬媒質中に含む検
定の写真像を第５図に示す。減衰剤の存在によって外部
光は実質的に抑制されているので、像上の線はぼけずに
鮮明である。糸の指定測定表面から発する光だけがフィ
ルムに記録されている。逆に、個々の糸の像の強度よ、
ぼやけのために像の幅および強度に関して不確かになっ
ている第４図の対応する線よりも血清中に存在する抗体
の量をより真実に示している。第４図中に存在する幾つ
かの線が第５図中には存在しないという予想外のことが
観察される。第４図には存在して第５図には存在しない
線は、おそらく糸２２に非特異的に結合することによる
偽陽性指示を示すものと思われる。すなわち非特異的結
合は、実際に存在しない場合に陽性指示を生じる。この
仮定は、第４図には線３８．４０の像が存在するが第５
図には対応する線が無いことによって支持される。線３
８．４０は意図的陰性試験較正線であり、無反応および
無像強度を示す。第５図の像は線３８．４０に対応する
線を示さない。従って、本発明の減衰剤の使用を示す第
５図の結果は、正しい検定結果をより真実に示すもので
ある。

好ましい染料は、検定法に悪影響を与えないＦＤ＆Ｃ用
の市販染料を混合して、ルミノールまたはルミノール以
外の発光剤に関して用いるために適当な減衰剤を得るな
どによって容易に選択することができる。他の発光反応
系に用いるためのかかる減衰剤を調製するためには、そ
の反応系の放射光の波長を測した後、その波長に吸収が
ある染料を選ぶか、あるいは前述の方法で放射光の波長
に於て一緒に吸収する染料の混合物を調製しさえすれば
よい。選択された減衰剤の最適濃度は、第１表に関する
方法などで決定される。

本発明の減衰剤は、使用が経済的である。比較的安い減
衰剤のほんの少量を試薬媒質に与えればよい。血清、洗
浄液、ＨＲＰ接合抗ヒ目ｇＥ含有媒質には減衰剤を添加
する必要はない。発光反応系の参加成分を一連の媒質に
加えた後、減衰剤を光が記録される適所の媒質に添加す
る。

本発明の減衰剤の使用は、所望でない外部光を遮蔽する
ために窓２４上に置くことができるマスクの使用よりも
経済的でありより有効である。または、マスクは、抗原
−抗体対がそれに固定されている固体が自由に動き回る
多くの検定法では使用できない。例えば、第７図は、ビ
ーカー４２中にガラスまたはプラスチックビーズ４０が
入っていて、測定されるリガンド４４の固体付着物とし
てビーズ４０を用いて検定法を実施する第２の実施態様
を示す。かかる検定は、前記の好ましい実施態様のため
に説明した方法と同様な方法に従ってもよく、あるいは
技術上公知の他の検定法に従ってもよい。ビーズ４０は
自由に動き回ることができるか、あるいは検定操作中に
導入または生成されるものであってもよい。これらの場
合には、マスクは外部光を減少するために無効である。

一方、本発明の減衰剤は、前述したように、試薬媒質に
添加して外部光を抑制することができる。

本発明の減衰剤の使用は、不均質型でなくて均質型であ
る種の特異結合検定を行わせることもできる。通常、指
定測定容積中または指定測定表面で発光反応系の成分が
放射する光は、本質的に試験装置の遠隔容積中で放射さ
れる光と区別できないので、遠隔部数射光からの妨害無
しに指定容積または表面からの光を完全に検定するため
には、遠隔容積内の発光成分から指定測定容積または表
面を物理的に隔離しなければならない。この型の検定は
“不均質”と呼ばれる。指定容積または指定表面から放
射される光が遠隔容積から放射される光と区別できる場
合には、物理的隔離は不要である。後者は“均質”検定
と呼ばれ、隔離工程が不要だという点で不均質検定より
も典型的に安価である。

例えば、第８図に示すように、試験試料からの反応済み
被検物質を含む対５０を透明管５４の内面５２に固定さ
せることができる。発光反応系の１成分と接合された、
被検物質に対する結合性パートナ−を含む溶液を管５４
中へ導入し、インキュベートして被検物質と標識抗被検
物質接合物とを反応させる。慣例では、残留未反応特異
結合性パートナ−を含む溶液を、次に、管５４から除去
し、管５４内部を洗浄する。かかる先行技術の実施方法
では、標識接合物を含む溶液が管中に残留している間ま
たは遠隔容積５８または遠隔表面６０が存在している間
は発光反応系の残りの参加成分を直接管５４へ添加する
ことができない。というのは、発光反応系の該成分が容
積全体にわたって混合することになるので、発光反応が
指定測定表面５６で進行すると共に、遠隔容積５８また
は遠隔表面６０でも進行するからである。遠隔容積５８
または遠隔表面６０から放射される外部光からの妨害の
ために指定表面５６に於ける反応の度合を別個に測定す
ることができない。

逆に、染料のような減衰剤を、接合標識以外の発光反応
に於ける残りの参加成分を含む試薬媒質の部分として管
５４に添加する場合には、遠隔容積５８および遠隔表面
から放射される外部光は吸収されるので、指定測定表面
５６から放射される光の測定を妨害しない。試験試料お
よび標識接合物含有溶液は、遠隔容積５８（または遠隔
表面６０）で発生する外部光が１枚のフィルムのような
測定手段に達する前に吸収されるので、減衰側含有試薬
媒質の導入前に除去される必要がない。

従って、２つの物理的隔離を必要とする不均質検定は、
本発明の減衰剤の使用によって均質法に変えられる。

本発明の減衰剤が発光特異結合検定法に顕著な改良を与
えることは明らかであろう。本発明の減衰剤は、指定表
面または指定容積から放射される光の測定を妨害する外
部光を優先的に減少させるために経済的でありかつ有効
である。当業者は、本明細書中に記載した方法の変化が
本発明の精神および範囲内でなされ得ることを認めるで
あろう。

特に、他の発光反応系および検定方法を本発明に関して
用いることができる。従って、本発明は、本発明の特許
請求の範囲による以外には限定されるものではない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の第の実施態様に関して発光検定に用
いられる試験チャンバーの斜視図であり、第２図は、第
１図の試験チャンバーの、線２−２についての部分的拡
大断面図であり、第３図は、第２図の一部分のさらに拡
大した詳細口であり、 第４図は、減衰剤を加えない場合の、第１図の試験チャ
ンバーを用いる試験血清の発光検定の結果の写真像であ
り、 第５図は、第１図の試験チャンバーを用い、かつ本発明
の減衰剤を添加した場合の、第４図に示した試験結果を
得るために用いたと同じ試験血清の発光免疫検定の結果
の写真像であり、第６図は、第１図の試験チャンバーを
用いる、第４図に示した試験結果を得るために用いたと
同じ試験血清のラジオイムノアッセイの結果の写真像で
あり、 第７図は、本発明の第２の実施態様に関して用いられる
、一般に球形の固体表面がその中に浸漬されたビーカー
の断面立面図であり、 第８図は、本発明の第３の実施態様に関して用いられる
、内壁表面上に反応性成分が塗布しである管の断面立面
図である。 図面番号の説明 １０・・・試験チャンバー、１４・・・平坦面、１６・
・・平底キャビティ、２２・・・抗原被覆木綿糸、２８
・・・指定測定表面、２９・・・糸に結合した抗原−抗
体対、３０・・・フィルム、３２・・・試薬媒質。 図面の浄書（内容に変更なし） 手続補正書（方式） ２、発明の名称　　　　発光特異結合検定に於いて外部
光を抑制する減衰剤 ３、補正をする者 事件との関係　　出願人 名　称　　　マスト　イミュノシステムズインコーポレ
ーテッド ４、代理人 ５、補正命令の日付　　昭和６０年９月２４日６、補正
の対象　　　　全図面

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）発光反応系の成分の反応によって放射される光を
   ２つの反応性物質間の反応の尺度として利用しかつ外部
   光を生成する特異結合検定に用いるための試薬媒質であ
   って、発光反応系が放射する光の波長の光を吸収しかつ
   外部光を抑制するのに十分な濃度で存在する減衰剤を含
   む試薬媒質。
2. （２）発光反応系の少なくとも１つの成分をも含む特許
   請求の範囲第（１）項記載の試薬媒質。
3. （３）反応性物質が固体表面に固定される特許請求の範
   囲第（１）項記載の試薬媒質。
4. （４）上記特異結合検定が免疫検定である特許請求の範
   囲第（１）項記載の試薬媒質。
5. （５）上記試薬媒質が液体である特許請求の範囲第（１
   ）項記載の試薬媒質。
6. （６）放射光が化学発光によって生成される特許請求の
   範囲第（１）項記載の試薬媒質。
7. （７）光がルミノールによって放射される特許請求の範
   囲第（１）項記載の試薬媒質。
8. （８）上記減衰剤が染料である特許請求の範囲第（１）
   項記載の試薬媒質。
9. （９）上記減衰剤が赤色染料と黄色染料との混合物であ
   る特許請求の範囲第（１）項記載の試薬媒質。
10. （１０）発光特異結合検定を行うための手段であって、
    発光反応系の成分の少なくとも１つも含む手段と、 発光反応系が放射する光の波長の光を吸収する減衰剤を
    含む試薬媒質と を有してなる試験キット。
11. （１１）上記手段が試験チャンバーをも含む特許請求の
    範囲第（１０）項記載の試験キット。
12. （１２）上記手段が少なくとも１種の反応性リガンドを
    も含む特許請求の範囲第（１０）項記載の試験キット。
13. （１３）上記減衰剤が発光反応系の少なくとも１つの成
    分との混合物で与えられる特許請求の範囲第（１０）項
    記載の試験キット。
14. （１４）上記減衰剤が染料である特許請求の範囲第（１
    ０）項記載の試験キット。
15. （１５）少なくとも２つの成分が所要である発光反応系
    で放射される光を被検物質の存在の尺度として用いて試
    験溶液中に於ける被検物質の存在のための特異結合検定
    を行う方法であって、 光に対して透明な少なくとも１つの面を有しかつその内
    部の該透明表面付近に被検物質と反応性の物質が付いて
    いる試験表面を有する試験チャンバーを用意する工程と
    、 試験溶液を該試験チャンバー中へ導入して試験表面へ接
    触させ、それによってもし試験溶液中に被検物質がある
    ならば、該被検物質が試験表面に付いている反応性物質
    と反応して固定された被検物質を生成するようにする工
    程と、試験溶液を試験チャンバーから除去しかつ試験チ
    ャンバー内を洗浄する工程と、 被検物質に対する特異結合性パートナーであって発光反
    応系の１つの成分と接合している特異結合性パートナー
    を試験チャンバー中へ導入する工程と、 未反応の接合結合性パートナーを試験チャンバーから除
    去しかつチャンバー内を洗浄する工程と、 発光反応系の残りの成分と発光反応系が放射する光の波
    長の光を吸収する減衰剤とを含む試薬媒質を試験チャン
    バー中へ導入する工程と、放射された光の強度を記録す
    る工程と を有してなる方法。
16. （１６）減衰剤が染料である特許請求の範囲第（１５）
    項記載の方法。
17. （１７）発光反応系が放射する光を用いかつ測定手段に
    よって記録される、試験溶液中の被検物質の検定のため
    に試験チャンバー内で発光特異結合検定を行う方法であ
    って、 試験チャンバー内の指定測定部位に被検物質を固定させ
    る工程と、 被検物質に対する特異結合性パートナーであって、発光
    反応系の成分の１つに接合されている特異結合性パート
    ナーを被検物質へ導入する工程と、 発光反応系の残りの成分と指定測定部位以外の部位で生
    成される光を抑制するための減衰剤とを含む試薬媒質を
    試験チャンバー中へ導入する行程と を有してなる方法。
18. （１８）被検物質が試験チャンバー内の固体表面に固定
    される特許請求の範囲第（１７）項記載の方法。
19. （１９）減衰剤が染料である特許請求の範囲第（１７）
    項記載の方法。
20. （２０）被検物質へ導入する該工程後でかつ試験チャン
    バー中へ導入する該工程前に接合結合性パートナーを試
    験チャンバーから除去する工程をも含む特許請求の範囲
    第（１７）項記載の方法。