JPS6178391A - Ｌ−リンゴ酸のバイオテクノロジ−による製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は高濃度の水性溶液の形で中和されたフマール酸
から水性相中で及び１−リンゴ醐が塩の形で存在する発
酵液体１ｌあたり１７０〜４００１が得ら力、る時点で
のＬ−リンゴ酸濃度でバイオテクノロジーによる変換を
行ってリンゴ酸の純粋なＬ−異性体１を製造する方法に
関するものである。

Ｌ　＋　＋７ンゴ酸に食料品工業及び医薬品工業に於て
緩衝物質、錯体形放剤、酸味料及び水分保持剤として使
用される。Ｌ−リンゴ酸は天然物質としてこの使用領域
に適する、化学的に、たとえばマレイン酸無水物の水付
加によって入手できるリンゴ酸のり、Ｌ−異性体混合物
の形で存在する。リンゴ酸のＤ−異性体は天然に存在し
ない。千り、故化学的に合成されたり、ＩＩ−ＩＪリン
ゴ酸使用に食料品−及び医薬品領域で危険である。

本発明の目的は純粋な形でＬ−ＩＪリンゴ酸バイオテク
ノロジーによる製造の経済性？改良することである。

Ｌ−リンゴ酸のバイオテクノロジーによる製造に数種の
方法が知られている。この方法の一部（たとえばドイツ
特許出願公告第２５６’５２８５号明細Ｖ）　）はフマ
ール酸を水付加によって１−リンゴ酸に変える特別な微
生物？用いて処理される。米国特許第３．９２２．１９
５号明細書中にバクテリア細胞を固定化することが提案
されている。ドイツ特許出願公告第２．５６１２８５号
明細書によれば遊離したバクテリア細胞を用いて及びド
イツ特許出願公告第２４１５３１０号明細書によればバ
クテリア細胞から単離された酵素フマラーゼ？用いて処
理する。

更にカビとバクテリアとの組合せによってＬ−リンゴ酸
へのグルコースの変換が記載されている（　、Ｔ、　Ｆ
’ｅｒｍｅｎｔ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、、第５４巻、へ４
（１９７／１）、第１９７〜２０４頁）。この場合カビ
はグルコースから７−１ｒ−ル酸を形成する。

次いでこれをバクテリアによってｆ、−リンゴ酸に変え
る。

フマール酸の１−リンゴ酸への変換を生じせしめる酵素
、フマラーゼは微生物、たとえばバクテリア又はカビの
菌体から特別な方法で単離することができ、次いで一遊
離さｔ−した又は固定化された形で−フマール酸からＬ
−リンゴ酸を得るために使用することができる（ドイツ
特許出願公告用２．４１５．３１０号；スイス特許１７
１．９９０号明細り。

２−３の方法に於て発酵調製物に多量のカルシウム化合
物を加える。そねによって形成されｆｃＬ−リンゴ酸ニ
殆んど発酵の間にＯａ−マレートとして沈殿する（ドイ
ツ特許出粕公開第１，４１７、０３３号明細書）。

カビ音用いるＬ−リンゴ酸のバイオテクノロジーによる
製造方法は同様に公知である。この方法に於てＬ　−リ
ンゴ酸は実際にこのカビに与えられる炭素源（たとえば
糖蜜、糖類、エタノール、酢ｌ！！りの生化学的分解又
汀変成によって得られる（　Ｊ、　Ｆｅｒｍｅｎｔ、　
Ｔｅｃｈｎｏｌ、　　第５５巻、ル２（１９７７）、第
１９６頁〜第１９９頁）。

この方法に直接フマール酸から出発しない。

米国特許第五〇Ａ＆９１０号明細、日中に記載された方
法は発酵調製物が１０〜１５％の糖類の他に更に１〜１
０％の有機酸、たとえばピルビン酸又はフマール酸？含
有することができる。

しかしこのカビ処理法に於て添加される有機酸けＬ−リ
ンゴ酸の合成に対する基質としてではなく、Ｌ−１７ン
ゴ酸への添加さｆｌ、た糖類の生化学的分解又は変成の
反応促進剤として使用される。

Ｅｌ　Ｋ　ｎ−パラフィンＯＬ−リンゴ酸への発酵によ
る変化１ｄ２Ｎ類のイーストの組合せ罠よって可能でち
る。この際一方のイーストはパラフィンをフマールｉ！
＆に変え、他方のイーストハ生じたフマール酸をＬ−リ
ンゴ酸に変える（　Ａｇｒ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、第３４巻（１９７０）、第１
８３３頁〜第１８３８頁）。

米国特許第４．０１　＆　５０８号明細書中に中間段階
として炭化水素からフマール酸アンモニウムを用いるＬ
−アスパラギン酸のバイオテクノロジーによる製造が記
載されている。この際カビと組合されたバクテリアを使
用する。７７−ル酸アンモニウムは実質的に完全にＬ−
アスパラギン酸に変化する。この際最後にＬ−アスパラ
ギン酸の形成に灼する及びフマール酸アンモニウムから
Ｌ−リンゴ酸の形成ＶＣ附する熱力学的理由が述べられ
ている。

フマール酸アンモニウムのＬ−アスパラギン酸へのバイ
オテクノロジーによる変換に関するその他の記載はドイ
ツ特許＠２．３４５．２７１号及びベルギー特許第８１
３，４８０号明細書に認められる。

公知のＬ−リンゴ酸のバイオテクノロジーによる製造方
法は殊に次に記載する特性を有するニーバクテリアを使
用する場合、バイオテクノロジーによる方法はカビを使
用する場合に比して取扱いが困難である。バクテリアが
少量のためにたとえばその分離問題が生じる。更にバク
テリアは副生成物−その中には毒性の副生成物が入るが
−を形成する傾向がある。

特に医薬領域に於けるＬ−リンゴ酸の使用に対する妨害
はバクテリアによって形成されたＬＰＢ−毒（リボボリ
サ力うイドー毒）であり、発熱性物質が生じ、これから
Ｌ−リンゴ酸を経費のかかる処理工程、たとえば限外デ
過によってしか精製することができない。米国製許第３
．９２２．１９５号明細書に記載芒れたバクテリア−処
理法は副生成物として少量のコハク醗を生じる。これを
リンゴ酸から分離するのけ困難である。

一酵素フマラーゼを使用する場合、フマラーゼ源として
第一に微生物の菌体が挙げられる。

Ｌ　−ＩＪンゴ醗の製造開始前に微生物の菌体を培養し
、多大な費用をもってフマラーゼにしなければならない
。

一生細胞又は細胞から単離された＃素フマラーゼの固定
化は付加的な処理工程である。

−高濃度でＯａ−イオンの存在下発酵する場合、形成さ
れたＬ−リンゴ酸は殆んど発酵の間にＯａ−マレートと
して沈殿する。これは発酵液体の攪拌及び通気に際して
問題となる。

−米国特許＆９２２．１９ｓ号明細’ＩＦ（固定化され
たバクテリア）及びドイツ特許出願第１，４１１０３５
号明細書（高いカルシウム濃度）に記載された反応を度
外視すれば、Ｉ、　＋　ＩＪンゴ酸の得られる濃度は一
般に比較的小さく、明らかに培養液１ｌあたり１００ｆ
以下である。

一発酵は３日より長くかかる。この僅かな生産性のため
に必要な生物反応器の大きい容量は装置上の多大な費用
の原因となる。特にこれが汚染されない処理工程を可能
にする、経費をかけて構成寧れた反応器だからである。

文献中の”発酵”の概念が従来比較的大きい意味範囲を
有するにもかかわらず、これに関連しで発酵″　とにフ
マラーゼの作用下フマール酸の７．　＋　ＩＪンゴ酸へ
の生化学的変換のことである。

栄養素の消費下植菌から生物体の増殖を”培養“と呼ぶ
。

特願昭５９−５５６６５号に中和されたフマール酸から
遊離する微生物を用いて水性相中で及び培養溶液１ｌあ
たり１００〜１７０ｆが得られる時点でのＬ＋　１７ン
ゴ酸濃度で微生物による発ｉ！＃’ｉ行ってリンゴ酸の
純粋なＬ−異性体を製造することが記載されている。こ
の方法は多大な生産性の点で優れている。収率は理論的
収率７７％よりも多い。これはＤ−リンゴ酸を生じない
。Ｌ＋　１７ンゴ酸が溶液の形で得られ、これは食品及
び医薬品に適する品質へのその後処理に極めて有利であ
る。この方法の場合フマール酸の主なｉｔそのナトリウ
ム−及び（又は）カリウム−塩の形で使用する。

この方法が従来技術に比して著しく優れているにもかか
わらず、これをより改良する課題が生じる。

この課題は本発明によれば次の特徴的な特色ケ有する方
法によって解消されるニ ー子め存在するフマール酸のＭは調製物１ｌあたり１７
０〜４００ｖである。

一フマール酸を少なくとも半分まで水酸化アンモニウム
用いて中和する。

したがって製造されるＬ−リンゴ酸は発酵液体中で対応
する塩の形で存在する。好ましい実施形態に於てはフマ
ール酸の中和のために１４Ｈ４０Ｈのみを使用する。そ
の他の実施形態に於ては中和のためにＮＨ２ＯＨ及び水
酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）′ｌｔ２：１のモル割合で
使用する。予め存在する中和されたフマール酸のｎは飽
和濃度に相当する量よりも大きい。この場合フマール酸
は先ず一部不溶性の形で存在する。フフール酸を発酵が
進行している間一部づつ発酵容器中に加えることもでき
る。次いで一時生じる不溶性フマラートの不在下Ｌ−Ｉ
Ｊンゴ酸の高濃度を得ることができる。

バイオテクノロジーによる変換は微生物全周いて、好ま
しくはカビに用いて又は酵素を用いて実施することがで
きる。微生物は遊駆又は固定されていてよい。酵素は固
定してもしなくてもよい。

カビはＡａｐｅｒＢｉ’１ｌｕｅ−、Ｐｅｎｉａｉｌｌ
ｉｕｍ−。

Ｐａｅｃｉ’ｌｏｍｙｃｅｓ−、Ｔａｐｈｒｉｎａ−、
Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏ−ｒｉｕｍ−、Ｐｙｔｈｉｕ
ｍ−、ＩＰｕｓａｒｉｕｍ−、Ｂｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ
−属のうちの１つから、特にＡａｐｅｒｇｉｌｌｕｓｗ
ｅｎｔｉｉ　−、Ｐｅｎ１ｃｉｌ〕ｉｕｍ　ｎａｌｇｉ
ｖｅｎｓｉｓ−。

Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｉｕｍ−、Ｈｙｐｈ
ｏｐｉｃｈｉａ　ｂｕｒｔｏｎｉ一種から由来するのが
好ましい。酵素としてはフマラーゼを使用することがで
きる。この酵素Ｖｉ７マラートのＬ−マレートへの変換
に適する微生物がら得られる。

この方法全実施するために中和されたフマール酸の水性
溶液又は懸濁液を製造し、こねに別個に培養されかつ培
養液体から分離さ′ｉ′Ｌｆｅ菌体を加える。菌体の濃
度−乾燥体として計）すして−は７マラ一ト含有発酵液
体１ｌｔりたり０．５〜５０Ｆである。フマラートを６
〜４８時間、２０〜６０℃で非無菌条件下に発酵する。

菌体及びＬ−ＩＪンゴ酸を公知の方法に従って発酵液体
から分離する。

新たに培養されかつ培養液体から分離さｎ、た菌体を斂
回−３回まで、好ましくは２回−夫々新たに調製された
フマラート溶液又は−懸濁液中で発酵に使用することが
できる。

特定微生物の能力のゆえにあるいはまた極めて好ましく
は高いＮＨ，−濃度の存在下フラール酸をＬ−リンゴ酸
に変える光めに、フマール酸−濃度を発酵の開始時に及
び対応してＬ−リンゴ酸−濃度を収得時点で従来公知の
方法に比して著しく高めることができる。というのσＮ
Ｕ４−フマラートは水中でナトリウム−又はカリウムー
フマラートよりも著しく良好に溶解するからである。

Ｌ−リンゴ酸の製造に対する基質としてＮＨ。

−７マラートを使用することは驚くべきことである。と
いうのは次のことが予期さね、なかったからであるニ ーこの様に高いＮＨ４−櫃度一これはたきえげ１．８規
定２１Ｂ、−フマラート溶液に相当する−を消費するカ
ビが存在する。

一本発明による方法に於てＮＨ，−フマラー）を直接方
法（ＩＪＨ３ｋフマール酸に付加）でもなく又は間接方
法（物質代謝でフマール酸からＬ−リンコ噴ケ経て生じ
るオキザル酢酸のアミノ化）でもなくＬ−アスパラギン
酸に変換する。

−ＩＪ１（、−イオンが７マラートのＬ−マレートへの
バイオテクノロジーによる変換’１−ｆｆｌ進する。

一特定のカビ−こレバナトリウム−及び（又は）カワウ
ムーフマラートを対応するＬ−マレートに全く変換しな
いか又は比較的体々に変換するーはこれにフマール酸ｅ
ＮＨ４−ｔｕとして提供した時に良好７ｉＬ−マレート
産出−ニング法？用いて見い出すことができる。

寒天−寒天によって固められる水性栄養培地−こｆｉは
炭素源、たとえば糖類及び増殖に必要なその他の栄養素
の他にＮＨ４−７マラート？）ＩＨ，−フマラートの溶
解積以上にある濃度で含有し、それによって栄養培地が
不溶性フマラートのために濁る一上に６植菌するか又汀
試料培地を浮遊させたもので調製する。この栄誉培地上
で為いフマラートー濃度を消費する２Ｎのみが増殖する
。Ｌ−マレ−）ｆｌフマラート留 ）＝５−Ｌ−マレートに変える　　がそのコロニーの周
囲の澄明な輪で認めることができる。

他方、適するカビ灯菌株群から導が？Ｌ　、６６例とし
ては次のものが挙げられる。

−ｌ＋ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　　ｗｅｎｔｉｉ　　ＯＢＳ
　　１２１．３２−　Ａｓｐｅｒｇｉ’１１ｕｓ　ｐｈ
ｏｅｎｉｃｉｓ　ＤＳＭ　６２０６Ｂ−ｌ＋ｐｅｒｑｉ
ｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ　ＤＳＭ　６３２７２−　Ｐｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｎａｌｇｉＱｖｅｎｓｉｅ　ＯＢ
Ｓ　３５２．４８−　Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ　ｂｕｒ
ｔｏｎＩＤＳＭ　７０６６５本発明による方法は非連続
的にも、連続的にも実施することかできる。発酵液体を
連続的に除去し、Ｌ−リンゴ酸にＰＡ製する間珈体倉り
とえば発酵容器中に残留することができる。あるいけ菌
体を発酵液体と共に連続的に除去し、液体の分離後容器
に戻す。

ＮＨ４−フマラートのバイオテクノロジーによる変換は
た七えげナトリウム（Ｎａ）−７マラートの変換よりも
急速に進行する。それ故に同じ長い発酵期間に於てＬ−
リンゴ酸のより高い濃度を収得時点で得ることができる
。

ＮＨ４−７マラート及びＮａ−７マラートを使用する場
合フマール酸のＬ　＋　ＩＪンゴ酸へのバイオテクノロ
ジーによる変換速度を振盪フラスコ中で次の条件下測定
する： １１　Ｈ，ＯＲ又はＮａＯＨで中和されたフマール酸１
２５ｆ／ｌ：温度２７℃；ｐＢ−値ａｏ；培舎時間２４
時間：Ｍ体１り／ｌＣ乾燥体として計算して）；１ｌあ
たり１１０ｆｔ類及び１ｌあたＦ）　５　ｆ　Ｎａ−７
マラートを有する前培養液（カビ１に馴致させる目的で
）から得られる菌体。

’ｌ、ｌソーゴ酸の濃度（収得時点での２／ｌ）はたと
えば次のものである。

したがってＮＨ４−７マラートのＬ−マレートへＯ変換
速ＲＩｒｓ　Ｎ　ａ−７マラートのＬ−マレートへの変
換速度に比して一般に大きくかつ２〜３の菌株を用いた
場合更により大きい。

変換速度がＷＥ４−フマラートの場合その他の７マラー
トの場合に比してより大きいだけではなく、収得時点で
得ることができるＬ−リンゴ酸の最大最終濃度も大きい
。Ｎａ０Ｅｌで中和した場合溶液中フマール酸が俵高約
１７０４／ｌ、これに豹してＮＨ４ＯＨで中和した場合
最高２１０１７１溶解する。収得時点でのＬ−リンゴ酸
の濃度がいくらかフマール酸の予め存在する濃度に対応
するので、ＮａＯＨで中和した場＠’ｖｆ、　−リンゴ
酸約１７０　ｆ／　／　Ｌ　ＫＮしてＮＨ４ＯＨで中Ｍ
Ｉ　した場合ｆｌＴ、、−リンゴ酸約２１０ｆ／Ｌを得
ることができる。

混合塩の場合、溶解すべきフマール酸量及びそれによる
収得時点でのＬ−リンゴ酸量を史に増加することができ
る。フマールＬ￥２ｔモル割合２：１で１１）１４０１
（及び′Ｎａ０Ｆｌ　ｆ用いて中和した場合、１ｌあた
りフマール酸約２４０ｆが溶解する。その際収得時点で
約２４０　？／ｌのＬ−ＩＪンゴ酸＃度が得られる。

高い１１Ｈ４−濃度でのフマラートの大きい変換速度ゆ
えに、予め存在するフマラート殖は葡換の開始以前に全
く完全に溶液中に導入される必要はない。それ故し−マ
レートの飽和挨塵付近で行うことができる。

たとえば１ｌあたリフマール酸３００ｒ１に予め存在さ
せ、懸濁液のｐＨ−値’（ＮＨ４ＯＨで８に調整した時
、ＮＨ４−フマラートの一部は溶解されずＶＣＣ編製物
中存在する。溶解さね、たフマラートＯＬ−マレートへ
の変換が進む七先ず溶解していないフマラート（、’Ｒ
３ＷＥ　Ｌ、、Ｌ−−ｒ　レ−）　ヘの変換が容易に行
われる。収得時点で約３００ｖ　／　ｔのＬ−マレート
−濃度が得らｒる（Ｌ−リンゴ酸として計算して）。

本発明によるフマール酸からＬ−リンゴ酸のバイオテク
ノロジーによる製造は２段階工程である。

第一段階で無菌条件下栄養素の消費下で菌体を公知方法
で培養する。この培養液体は中和されたフマール酸不含
又は少量しか含有しない。

フマール酸を加えた場合、これｆ′ｉ微生物を馴致させ
るために使用する。

培養の間フマール酸不在又はほとんど不在の場合、カビ
はペレット状に増殖するが好ましく、容易に分離するこ
とができる。フマール酸含有培養液体中でカビを培養す
る場合、カビは糸状に増殖するのが好ましく、分離は困
難である。

第一段階での不可欠な培養液体の殺菌のゆえに場合によ
り添加さハ、たフマール酸をこの段階で好ましくはＮａ
ＯＨ又は水酸化カリウム（Ｋ）で中和する。ＮＨ４−７
マラートは加熱状態ですでに一部費化する。化学的殺菌
又ｄ濾過による殺菌の場合、フマール酸を第一段階でＮ
Ｈ４ＯＨで中和することもできる。

第二段階で７マラートを第一段階で培養されかつ培養液
体から分離された菌体によってＬ−マレートへバイオテ
クノロジーによって変換する。第二段階で無角条件は不
必要である。発酵液体は変換の開始時にフマラートを極
めて一１１ＡＩワな形で含有する。

第一段階で菌体の増殖はたとえば次の様に進行する： 栄養溶液は１６あたり次の栄養素を含有する。

３０９　　　　ショ糖 ２Ｆ　　　リン酸水素ジアンモニウム（ＷＥ４）２ＨＰ
Ｏ４３Ｐ　　　桃酸アンモニウム（ＷＥ４）鵞８０４０
．９ｆ　　　リン酸マグネシウムｌｌ１ｇ日０４・７馬
０２ｔ　　　塩化カリウムＫＯ１ ３０■　　　塩化鉄Ｑｌｌ）　　ＦｅＣ１５−６１１，
０微生物の馴致のためにフマラート１に３０ｆ／ｌまで
、好ましくは５　’Ｉ／ｌまで加えることができる。微
生物が増殖のためにまだ有効物質（７’（とえげビタミ
ン）１に必要とする場合、栄養溶液に更にこの有効物質
を加える。

栄養溶液を２〜９、好ましくｔｉ３〜６のｐＨ−値に調
整し、殺菌する。カビの増殖に必要な炭素化合物を無機
の栄養素と共に殺菌するか又は−たとえば枦４日のカラ
メル化現象の回避のために一夫々を別個に殺菌する。カ
ビ増殖にショ糖の他にトウモロコシ粉、クルコース、グ
リーｃｌＪｙ、ｎ−パラフィン、エタノール及びその他
の炭素含有化合物が適する。

殺菌さ１．た栄養溶液にフマール師のＬ−リンゴ酸への
変換て適するカビの植苗率、すなわち１〜２０％、好オ
しくＦｉ、３〜１０％の量で植菌する。菌体は温度１通
気及びｐＨ−値に関してフントロールされた条件下１〜
６日間添加された炭素化合物の消費下増殖する。増殖温
度は２０〜５０℃、好捷しくけ２５〜３５℃である。

ｐＲ−値は増殖の間苛性アルカリ溶沿の供給によって保
たれる。

第一段階での増殖の終了後、培養液体？濾過又はその他
公知の液体／固体−分離操作によって培養ｐ液と菌体と
に分離する。菌体勿第二段階でバイオテクノロジーによ
る変換に使用する。

第二段階に於てフマラートのＬ−マレートへのバイオテ
クノロジーによる変換はたとえば次の様に進行する： 第一段階から（又は先に行われた第二段階から）得られ
た菌体を７マラートの溶液又は腎匂；１液に移す。菌体
の景（乾燥物質として計算して）は調製物の［１５〜５
０　？／ｌである。フマラートは完全に又は主にＮＨ４
−７マラートとして存在し、場合により先ず一部不溶性
の形で存在する。発酵液体を容器中で弱く攪拌し、通気
する。

この際カビ−菌体が７マラート（Ｉ−Ｌ−マレートに変
換する。温度は２０〜６０℃、好１しくけ３０〜４５℃
であり、ｐＨ−値は６〜１０、好ましくは７〜９である
。６〜４８時間俵、変換は高いフマラート濃度でも終了
する。Ｌ−リンゴ酸の量はフマール酸のもとの量とほぼ
同じである。

第二段階で使用された容器は極めて簡単に構成すること
ができる。というのは殺菌のための又は高い酸オー転換
率ケ生じるための装置を必要としないからである。攪拌
及び通気のための装置？有する簡単に洗浄場れうる温度
調節可能な容器で十分である。菌体の沈殿を防ぐために
弱い授拌が好ましい。菌体に呼吸維持に必観な酸素を供
給するために弱い通気が好捷しい。

本発明による方法に次の利点を有するニー１［４−７マ
ラートはその他の７マラートに比してより急速に変換す
る。それによって空時収量は改良される。

一収得時点でのＬ　＋　１７ンゴ酸の濃度はその他の公
知の方法に於けるよりも高い。このことは経済的な処理
を可能にする。

一発酵に於て極めて濃厚ｆｘＬ　−ＩＪンゴ醒はその１
１Ｈ４−塩の形でこのＢＩＴ（４−マレートの他に実質
上まだ未反応のＮＨ４−フマラートの残り及び菌体のみ
を含有する液体中に生じる。このことは処理を著しく簡
易化する。

一７マラートｅ高収率でＬ−マレートへ変換する。産出
されたＬ−リンゴ酸の量に予め存在するフマール酸の量
とほげ同一である。

−バイオテクノロジーによる変換は簡単に構成さｒＬ７
’ｈ容器中で行われる。こｎは無菌条件の達成及び維持
のための及び高い酸オー転換率を得るための装置は必要
上せず、そｎ、によって経済的に製造及び販売すると２
ができる。

−Ｄ−リンゴ酸ｒ生じない。

−Ｌ−１ンゴ酸が液体の形で得ら力、る。これけ食品及
び医薬品に適する品質へのその後処守に極めて有利であ
る。たとえばこれｉｊ　ＬＰ８−毒及びコハク酸が存在
しないことにある。

−分離された菌体を数回使用するこ表ができる。

−フマール酸を専ら最適な発酵条件下にＬ　−ＩＪンゴ
酸に変換する。その際カビに対して最適な増殖条件は顧
慮されない。

本発明を次の例によって説明するが、本発明はこれによ
って限定されるものではない。

菌体の培養 例Ａ 第一段階で菌体の培養のために飲料水１ｌｔりたり ショ糖　　　　　　　３０２ （ＮＨ４）、８０４ｓ　ｙ （ＮＨ４）２ＨＰ０４　　　　　　　　　２　　ｆＭ　
ｇ、　Ｓ　０４・７Ｈ鵞０　　　　　　　　　　０．　
９　　ｆＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２　９’ＩＰｅＣｔ３−６Ｈ２０３０ｍｙ Ｈａ−フマラート　　　　　　　１０２を含有する栄養
溶液をｉｉＭＩ製する。処理容ｆ＝ｒｌＢｔを有する生
物反応器をこの栄′４浴液７．２　ｔで充填し、殺菌し
、カビ植菌α８ｔでＡｅｐｅｒｇｉｌｕｓｗｅｎｔｔｉ
　　を植菌する。培養条件は次の通りである： 通気：ｃＬ５を空気／ｌ　反応容廿・分（α５ｖｖｍ　
） 攪拌回転数＝５００回転数／分（導入管を組合せた別型
攪拌器） 温度：３０℃ ｐ）ｉ−値：　７．０　（ＮＨ４０Ｆｌ溶液の供給によ
ってｐＨ−電極を介する装ｆｅ７ｊ−用いて一定に保つ
。） ４８時間後、培養液体１ｌあたり菌体１１．２２（乾燥
体として計算して）が生じる。こｒ＋、　１Ｐ増し、洗
滌する。

例Ｂ カビＡｓｐｅｒｇｉ’１１ｕｓ　ａｗａｍｏｒｉの菌体
を例Ａと同様に次の点を変えて培養するニ ー栄養溶液はフマラート不含である。

−ｐＨ−値を６０に調整し、一定に保つ。

例Ｃ カビＰｅｎｉｃｌｌｉｕｍ　ｎａｌｇｉｏｖｅｎｅｉｓ
　　の菌体を例Ａと同様に培養する。

例Ｄ カビＨｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ　ｂｕｒｔｏｎｉの菌体’
ｉｊＡと同様に培養する。この場合栄養溶液けＮａ−フ
マラート１０ｆ／ｌの代りにＨａ−フマラート３ｏり／
１１に含有する。

例Ｅ カビ？ｕａａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｉｕｍの菌体を
例Ａと同様に培養する。

一ル酸（２１０９／ｌ）−溶液（ｎＴ３４ｏｎで中和：
ｐＲｗａＯ）１６を甲で懸濁し、弱く攪拌されかつ通気
された容器中で３２℃で非無菌条件下で培養する。２４
時間の培養後、発酵液体１ｌあたりＬ−リンゴ酸２１３
ｆが生じる。

（２４０Ｓ’　／　ｌ　’Ｉ−溶液（モル割合２：１で
ＮＨ４ＯＨとＮａＯＨｆ用いて中和）１６を中で懸濁す
る。２４時間の培養後、発酵液体１ｌあたりＬ−リンゴ
酸２３５？が生じる。

例３ 例Ａによって培養された菌体をフマール酸（３２０ｆ／
／ｌ　）−溶ｉ／懸濁液（ＮＨ，０１１テ中和）１６を
中で懸濁する。３６時間の培養後、発酵液体１ｌあたり
１．−ＩＪンゴ酸３２８ｆが生じる。

例４ 例ＡＫよって培養された菌体をフマール酸（２４０ｆ／
ｌ）−溶液（モル割合２：１でＮＨ４ＯＨ及びＮａ０Ｅ
を用いて中和）８を中で懸濁する。１２時間の培養後、
発酵液体１ｌあたりＬ−リンゴ酸２３７ｖが生じる。

例５ 例１の発酵液体から分離され九菌体を新たにフマールｆ
＠　（２１０ｆ　／　Ｌ　）−溶液（ＮＨ４ＯＨで中和
：ｐＲｗａＯ）１６４中で懸濁する。すなわちこの菌体
ｔ２回フマラートのＬ−マレートへのバイオテクノロジ
ーによる変換に使用する。

３６時間の培養後、発酵液体１ｌあたりＩ、−１ンゴ酸
１９８ｆが生じる。

例６ 例Ｂにより培養された菌体を処理容量３００ｔの容器で
フマール酸（２１０り／ｌ）−溶液（ＮＨ４ＯＨで中和
’、ｐＨ＝ＥＬＯ）中で懸濁する。

フマール酸−溶液中の菌体濃度け５０ｆ／ｌである（乾
燥体として計算して）。２４時間の培養後、発酵液体１
ｌあたりＬ−リンゴＮｉ、２０５ｔが生じる。

例７ 例Ｅにより培養された菌体を処理容量３００ｔの容器で
フマール酸（２１０ｔ　／　ｌ　）−溶液（ＮＨ，ＯＨ
で中和：ｐ）１＝＆０）中で懸濁する。

フマール酸−溶液中の菌体濃度は３０　ｔ／ｌである（
乾燥体として計算して）。３６時間の培養後、発酵液体
１ｌあたりＬ−リンゴ酸２０７２が生じる。

例８ 例Ｃにより培養された菌体をフマール酸（２４０ｆ　／
　ｌ　）−溶液（モル割合２：１でＮ　Ｈ４０Ｈ及びＮ
ａＯＨｆ用いて中和）１６を中で懸濁する。フマール酸
−溶液中の菌体濃度Ｆｉ６り／ｌである（乾燥体として
計算して）。２４時間の培養後、発酵液体１ｌあたＣ　
Ｌ−Ｉ）ン酸２３４ｆが生じる。

例９ 例りにより培養された菌体をフマール酸（２１ｏｒ／ｚ
）−溶液（１４）１４０Ｈで中和；ｐＨ＝ａ５）１６を
中で懸濁する。フマール酸−溶液中の菌体温度け７２／
ｌである（乾燥体きして計算して）。３６時間の培養部
・、発ｆ＃液体１ｌあたりＬ−リンゴ酸２１２２が生じ
る。

例１０ 容器中にＮ１（４−フマラートー練濁液（４００ｙ／ｌ
：フマール酸として計算して）を予め存在させ、ｐＨＥ
Ｌｏに調整する。フマラートは先ず一部不溶性の形で存
在する。この液体中で菌体５５　ｆ／ｌ　（乾燥体とし
て計算して）−例Ａにより培養−を懸！すする、３２℃
で３６時間の培養後、発酵液体１ｌあたりＩ、　＋　１
７ンゴ酸３７８２が生じる。

例１１ 容器中にＨＥ、−フマラート溶液（１９０２／ｌ：フマ
ール酸として計算して）？予め存在させ、ｐｌ’１ＥＬ
Ｏに調整する。この液体中で菌体２　ｑ　ｔ　／　ｔ　
（乾燥体として計算して）−％ｌ　Ａにより培養−を懸
濁する。３４℃で６時間の培養後、発酵液体１ｌちたり
Ｌ　−ＩＪ　：ｙゴ酸１７１２が生じる。

すべての例に於て発酵の終了時に菌体及びＬ−マレート
を公知の方法で分離する。１体ケ場合により次の発酵に
使用し、Ｌ−マレートを公知の方法で処理してＬ−リン
ゴ酸となす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）高濃度の水性溶液の形で中和されたフマール酸から
   水性相中で及びＬ−リンゴ酸が塩の形で存在する発酵液
   体１ｌあたり１７０〜４００ｇが得られる時点でのＬ−
   リンゴ酸濃度でバイオテクノロジーによる変換を行つて
   リンゴ酸の純粋なＬ−異性体を製造するに際して、予め
   存在するフマール酸の量が調製物１ｌあたり１７０〜４
   ００ｇであり、フマール酸の中和を少なくとも半分まで
   水酸化アンモニウムを用いて行うことを特徴とする前記
   化合物の製造方法。 ２）フマール酸の中和を水酸化アンモニウムだけで行う
   ことよりなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）フマール酸の中和を水酸化アンモニウム及び水酸化
   ナトリウムを用いてモル割合２：１で行うことよりなる
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４）予め存在する中和されたフマール酸の量は飽和濃度
   に相当する量より多く、先ず一部溶解せずに存在するこ
   とよりなる特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれ
   かに記載した方法。 ５）発酵が進行している間発酵容器中に固体のフマール
   酸を一部づつ添加することよりなる特許請求の範囲第１
   項ないし第４項のいずれかに記載した方法。 ６）微生物を用いてバイオテクノロジーによる変換を行
   うことよりなる特許請求の範囲第１項ないし第５項のい
   ずれかに記載した方法。 ７）カビを用いてバイオテクノロジーによる変換を行う
   ことよりなる特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ−、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
   ｍ−、Ｐａｅｃｉｌｏ−ｍｙｃｅｓ−、Ｔａｐｈｒｉｎ
   ａ−、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ−、Ｐｈｔｈ
   ｉｕｍ−、Ｆｕｓａｒｉｕｍ−、Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉ
   ａ−属のうちの１つからなるカビを用いてバイオテクノ
   ロジーによる変換を行うことよりなる特許請求の範囲第
   ７項記載の方法。 ９）Ａｓｐｅｒｉｇｉｌｌｕｓ　ｗｅｎｔｉ−、Ａｓｐ
   ｅｒｉｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ−、Ｐｅｎｉｃｉ
   ｌｌｉｕｍ　ｎａｌｇｉｏｖｅｎｓｉｓ−、Ｆｕｓａｒ
   ｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｉｕｍ−、Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈ
   ｉａ　ｂｕｒｔｏｎｉ−、Ａｓｐｅｒｉｇｉｌｌｕｓ　
   ｎｉｇｅｒ−、Ａｓｐｅｒｉｇｉｌｌｕｓ　ｐｈｏｅｎ
   ｉｃｉｓ−種のうちの１つからなるカビを用いてバイオ
   テクノロジーによる変換を行うことよりなる特許請求の
   範囲第８項記載の方法。 １０）酵素を用いてバイオテクノロジーによる変換を行
   うことよりなる特許請求の範囲第１項ないし第５項のい
   ずれかに記載した方法。 １１）フマラーゼを用いてバイオテクノロジーによる変
   換を行うことよりなる特許請求の範囲第１０項記載の方
   法。 １２）中和されたフマール酸の水性溶液又は懸濁液を製
   造し、菌体の培養から又は先だつて行われた発酵から分
   離された菌体をフマール酸−溶液又は−懸濁液に加え、
   菌体濃度はフマール酸含有発酵液体中で０．５〜５０ｇ
   ／ｌ（乾燥体として計算して）であり、６〜４８時間２
   ０〜６０℃でバイオテクノロジーによる変換を行い、発
   酵液体から菌体及びＬ−リンゴ酸を分離することよりな
   る特許請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかに記載
   した方法。 １３）分離された菌体を夫々新たに調製されたフマラー
   ト−溶液又は−懸濁液中で３回まで使用することよりな
   る特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４）非無菌条件下でバイオテクノロジーによる変換を
   行うことよりなる特許請求の範囲第１２項及び第１３項
   記載の方法。