JPS6152678B2

JPS6152678B2 -

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Publication number: JPS6152678B2
Application number: JP7853483A
Authority: JP
Inventors: Sawao Murao; Eiko Matsumura; Takashi Shin
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1983-05-04
Filing date: 1983-05-04
Publication date: 1986-11-14
Also published as: JPS59203492A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は公知のアミノアシラーゼとは種々な性
質において異なる新規な酵素Ｎ〓−カルボベンゾ
キシアミノ酸アミドヒドロラーゼおよびその製造
法に関する。アミノアシラーゼはアミノ酸のα−アミノ基が
アシル化されたＮ〓−アシルアミノ酸の酸アミド
結合に作用しアミノ酸とアシル基に相当する脂肪
酸を生成する反応を触媒する酵素である。またヒ
プレートヒドロラーゼ、あるいはヒプリカーゼと
呼称される酵素はアミノアシラーゼの一種であ
り、ヒプリン酸、即ち安息香酸とグリシンが酸ア
ミド結合で脱水縮合した化合物に作用し、安息香
酸とグリシンを生成する反応を触媒する酵素であ
る。一般的に、これら酵素をＮ〓−アシル−DL−
アミノ酸混合物に作用せしめＮ〓−アシル−Ｌ−
アミノ酸のみを選択的に加水分解し、光学純度の
高いＬ−アミノ酸の製造工程に実用化されてい
る。微生物により生産されるアミノアシラーゼは
既にいくつか発見され実用化されているが、これ
ら既知のアシラーゼとは異なる新規なアミノアシ
ラーゼを提供することは、アミノ酸、ペプチド、
医薬品原料、試薬等の製造において重要な課題の
一つであり、また酵素化学或いは分析化学等の見
地からも重要視される課題である。従来、Ｌ−アミノ酸のα−アミノ基がアシル化
されたＮ〓−アシルアミノ酸を加水分解する酵素
は哺乳動物の各組識、カビ、細菌、各種の植物種
子などに存在することが知られており、特に豚腎
皮質由来のアミノアシラーゼ〔J.Biol.Chem，
194，455（1952）〕は著名である。微生物起源で
はアスペルギルス（Aspergillus）またはリゾプ
ス（Rhizopus）属〔Bull.Agr.Chem.Soc.Jpn.，
21，291，296，300，304（1957）〕、コリネバクテ
リウム（Corynebacterium）属〔特公昭49−
13989号〕、シユードモナス（Pseudomonas）属
〔特公昭56−43353号〕、ラクトバシラス
（Lactobacillus）属〔J.Biol.Chem.，235，3193
（1960）〕、ストレプトミセス（Streptomyces）属
〔特開昭53−59092号〕等が知られている。これら
既知のアミノアシラーゼ類は種々なアシルアミノ
酸に分解作用を有するが、アミノ酸のα−アミノ
基がカルボベンゾキシ基で保護された化合物、即
ちＮ〓−カルボベンゾキシアミノ酸には全く作用
しない。そこで本発明者は、Ｎ〓−カルボベンゾキシア
ミノ酸に作用する酵素の検索を目的として広く微
生物の培養物を検討した結果、乳酸菌に属する細
菌にＮ〓−カルボベンキシアミノ酸あるいはＮ〓
−ベンゾイルアミノ酸に作用するＮ〓−カルボベ
ンゾキシアミノ酸アミドヒドロラーゼを発見し
た。本発明はこの発見に基づいて完成されたもの
である。即ち、本発明は一般式：〔式中、R₁はカルボベンゾキシ基またはベン
ゾイル基およびR₂は水素またはメチル基を表わ
す〕で示される化合物に作用し（但し、R₂がヒドロ
キシメチル基である化合物には作用しない）、グ
リシンまたはアラニンとベンジルアルコールまた
は安息香酸とに分解する、以下の特性を有するＮ
〓−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒドロラー
ゼおよびその製造法に関する：基質特異性：グリシンまたはＬ−アラニンのα−アミノ基が
カルボベンゾキシ基、ベンゾイル基（これらの基
は核置換基を有していてもよい）で保護された化
合物およびＮ〓−ベンゾイルグリシルグリシンに
特異的に活性を示す至適PH：５〜７作用適温：30〜45℃ 分子量：約220000 活性化：Coイオンで活性化される等電点：4.48 本発明酵素はストレプトコツカス属に属する菌
株から生産されることが見出された。菌株は限定
的ではなく、新規なＮ〓−カルボベンゾキシアミ
ノ酸アミドヒドロラーゼ生産能を有する細菌であ
ればいかなる菌株でもよく、またこれ等の菌株の
変種もしくは変異株でもよい。そしてストレプト
コツカス属に属する上記菌株の具体例としては、
ストレプトコツカス・フアエカリス
（Streptococcus faecalis）が挙げられる。なお、
本菌株はアメリカン・タイプ・カルチユアー・コ
レクシヨン（American Type Culture
Collection）に寄託されているものであり、スト
レプトコツカス・フアエカリス（Streptococcus
faecalis）ATCC8043である。本発明において、Ｎ〓−カルボベンゾキシアミ
ノ酸アミドヒドロラーゼ生産菌を使用しＮ〓−カ
ルボベンゾキシアミノ酸アミドヒドロラーゼを製
造するにあたつて用いられる培地は、通常の乳酸
菌の培養に用いられる培地が挙げられる。即ち、
Ｎ〓−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒドロラ
ーゼ生産菌が資化しうる炭素源、窒素源および無
機塩、更に必要ならば微量栄養素を含有するもの
であればよい。炭素源としては、例えばグルコース、フラクト
ース、ラクトース、シユークロース、デキストリ
ン、澱粉加水分解物、麦芽エキス、廃糖蜜等の炭
水化物、クエン酸、コハク酸、フマール酸、酢酸
等の有機酸類およびマンニトール、グリセリン等
のアルコール類が用いられる。培地の窒素源とし
ては資化しうる窒素化合物またはそれを含有する
ものであればよく、例えばポリペプトン、肉エキ
ス、大豆等の蛋白質の加水分解物、各種アミノ酸
類、アンモニウム塩、硝酸塩等が用いられる。そ
の他、無機塩としては、例えばマンガン、リン
酸、カリウム、マグネシウム等の無機塩類が適宜
用いられ、または有機微量栄養素としてアミノ
酸、ビタミン、プリン塩基およびこれらを含有す
るペプトン、酵母エキス等が適宜用いることがで
きる。菌の培養は静置培養で行なう。大量培養などの
工業的生産には撹拌深部培養が好適であるが、通
気撹拌培養、浸透培養等の好気的条件下に培養す
ることもできる。培養温度は30〜40℃、好ましく
は37℃付近であり、培地PHは８〜５、好ましくは
7.0付近である。培養時間は培養形態によつても
異なるが、通常14〜18時間である。本発明のＮ〓−カルボベンゾキシアミノ酸アミ
ドヒドロラーゼはＮ〓−カルボベンゾキシアミノ
酸アミドヒドロラーゼ生産菌の培養液中および菌
体内に存在するが、その大部分は菌体内中に存在
する。培養時間を長くすることにより自己消化を
引起しＮ〓−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒ
ドロラーゼを培養液中に遊離させることもでき
る。本発明のＮ〓−カルボベンゾキシアミノ酸アミ
ドヒドロラーゼを培養物から抽出、精製するには
通常の酵素蛋白質抽出、精製法を適用することが
できる。例えば、遠心分離法などの適当な操作により培
養物から菌体を集めた後、その菌体をガラスビー
ズなどの適当な摩耗剤とともに機械的に破砕する
方法、超音波照射によつて破砕する方法、フレン
チプレスを用いて破砕する方法、リゾチーム等の
溶菌酵素を用いる方法、またはオスモテイツクシ
ヨツクを起用する方法等により菌体を破砕する
か、または水あるいは生理食塩水もとくは緩衝液
中に菌体を懸濁し、トルエン等の存在下で放置も
しくは浸透して抽出した後、該溶液を遠心分離法
などの適当な操作により不溶物を除去し、これを
そのまま粗酵素液として得る。また通常の蛋白質
濃縮方法、例えば粗酵素液を凍結乾燥する方法、
あるいはエタノール、アセトン、イソプロパノー
ル等の有機溶媒を用いる分別沈澱による方法、も
しくは硫酸アンモニウム等の塩類を用いる塩析を
行なつた後限外濾過膜あるいは中空糸膜もしくは
コロジオン膜等を用いる透析操作を行なう方法、
等を適宜選択して実施することにより粗酵素粉末
を得ることができる。上記の粗酵素液もしくは粗酵素粉末より精製酵
素を分取するには、イオン交換、ゲル濾過、吸
着、電気泳動、アフイニテイクロマトグラフイー
等を適宜組合せて行なう。例えば、ジエチルアミノエチル−セフアデツク
スなどのイオン交換体を用いるイオン交換クロマ
トグラフイー法、アミノヘキシル−セフアロース
もしくはヒドロキシアパタイト等の吸着体を用い
る吸着クロマトグラフイー法、セフアデツクスあ
るいはセフアロースもしくはセフアクリルなどの
親水性担体を用いるゲル濾過法、ポリアクリルア
ミドゲルあるいはキヤリア−アンフオライトなど
を用いる電気泳動法、適当なリガンド化合物を化
学結合させた親水性担体を用いるアフイニテイク
ロマトグラフイー法、分子篩膜あるいは中空糸膜
等を用いる分子量分画法等を適宜選択し、これら
の方法を組み合わせて行なうことにより、精製さ
れた本酵素を得ることができる。典型的な製造法としては、ストレプトコツカス
属の菌株、例えばストレプトコツカス・フアエカ
リスを培地に培養し、培養液から得た菌体を中性
PHの緩衝液中で破壊し、その抽出液を塩析し、塩
析物を中性PHの緩衝液に溶解し、これと同じ緩衝
液で透析し、透析液を緩衝液でPH４〜５に調節し
て析出する沈澱を除いた後、中性PHで限外濾過
し、濃縮液を採取することにより行なう。得られ
た濃縮液は所望によりさらに精製を加えてもよ
い。精製はまず、上記濃縮液をアニオン交換性の
デキストランまたはセルロース誘導体を担体とし
て用いた液体クロマトグラフイーにより、Ｎ〓−
カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒドロラーゼ
を、適当な濃度勾配を有する無機塩溶液で直線グ
ラジエント溶出し、その活性画分を採取し、必要
ならば適当な有機溶媒を用いる分別沈澱法等によ
り、活性画分を濃縮し、さらにこれをゲル濾過ク
ロマトグラフイーにかけて、活性画分を分取して
もよい。この活性画分は必要ならば分別沈澱法等
により濃縮してもよい。より精製を要するときは
ゲル濾過クロマトグラフイーにかけ同様に濃縮
し、さらに必要ならば１ないし複数回吸着クロマ
トグラフイーで精製および濃縮を繰返す。精製濃
縮液は密度勾配等電点電気泳動法で処理してもよ
い。上記の方法は典型的な方法であり、特に好まし
いものであるが、他の代替手段を適宜採用しても
よく、また所望の精製度に応じて一部工程を省略
してもよい。上記の方法で得られた新規なＮ〓−カルボベン
ゾキシアミノ酸アミドヒドロラーゼは下記の特徴
を有し、微生物または哺乳動物の組識あるいは植
物種子等から採取される公知のアミノアシラーゼ
とは明確に区別される。すなわち、これら公知の
酵素はアミノ酸のα−アミノ基がアシル化された
Ｎ〓−アシルアミノ酸に作用し、そのアシル基部
分に相当する脂肪酸とアミノ酸を生成する反応を
触媒するが、アミノ酸のα−アミノ基がカルボベ
ンゾキシ化されたＮ〓−カルボベンゾキシアミノ
酸類には全く作用しない。これに反し、本発明の
Ｎ〓−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒドロラ
ーゼはＮ〓−カルボベンゾキシアミノ酸に極めて
高い分解作用を示し、更に本発明のＮ〓−カルボ
ベンゾキシアミノ酸アミドヒドロラーゼはアミノ
アシラーゼ類一般の好適な基質であるＮ〓−アシ
ルアミノ酸にほとんど分解作用を示さない事実よ
り、本発明のＮ〓−カルボベンゾキシアミノ酸ア
ミドヒドロラーゼは公知の何れのアミノアシラー
ゼとも明確に区別することができ、新規な酵素と
認められる。以下に本発明の酵素Ｎ〓−カルボベンゾキシア
ミノ酸アミドヒドロラーゼの理化学的性質を記載
する。 (1) 作用Ｎ〓−カルボベンゾキシグリシンに作用し、
その反応産物としてベンジルアルコールとグリ
シンを生成する。Ｎ〓−カルボベンゾキシ−Ｌ
−アラニンを基質化した場合にはベンジルアル
コールとアラニンを生成する。グリシンまたはアラニンのα−アミノ基がベ
ンゾイル化された化合物、即ち、Ｎ〓−ベンゾ
イルグリシンまたはＮ〓−ベンゾイル−Ｌ−ア
ラニンにも分解作用を示し、その分解反応の産
物として安息香酸とグリシンまたはアラニンを
生成する。 (2) 基質特異性グリシンまたはＬ−アラニンのα−アミノ基
がカルボベンゾキシ基、ベンゾイル基（これら
の基は核置換基を有していてもよい）で保護さ
れた化合物に特異的作用を示す。グリシンあるいはＬ−アラニンのα−アミノ
基がアセチル化された化合物、即ち、Ｎ〓−ア
セチルグリシンまたはＮ〓−アセチル−Ｌ−ア
ラニンにはほとんど作用しない。Ｎ〓−カルボベンゾキシ−Ｄ−アラニン、ま
たはＮ〓−ベンゾイル−Ｄ−アラニンを基質と
して用い本酵素を作用させた時、該化合物がＬ
体の場合と異なつて、全く分解作用が認められ
ない、このことは本酵素が基質化合物のアミノ
酸部分の光学対掌性を識別し、その分解作用が
Ｌ体アミノ酸誘導体に特異的であることを示
す。グリシンのα−アミノ基が上記以外の基で保
護された化合物、例えばＮ〓−ホルミルグリシ
ン、Ｎ〓−フエニルアセチルグリシン、Ｎ〓−
ｐ−ニトロフエニルアセチルグリシン、Ｎ〓−
２，４−ジニトロフエニルグリシン、Ｎ〓−ト
リフエニルグリシン、Ｎ〓−フタリルグリシ
ン、Ｎ〓−トリルスルホニルグリシン、あるい
はＮ〓−ｔ−ブトキシカルボニルグリシン等に
は全く作用せず、Ｌ−アラニンおよびＤ−アラ
ニンの場合においても同様の基で保護された化
合物に対し全く作用しない。Ｎ〓−カルボベンゾキシグリシンのα−カル
ボキシル基がアミノ酸残基以外で保護された化
合物、例えばＮ〓−カルボベンゾキシグリシ
ン、メチルエステル、Ｎ〓−カルボベンゾキシ
グリシンアミド等にほとんど作用しない。またグリシンをアミノ末端位に含むペプチド
であり、そのグリシン残基のα−アミノ基がカ
ルボベンゾキシ基で保護された化合物、例えば
Ｎ〓−カルボベンゾキシグリシルグリシンに対
して若干の分解作用を示すが、その他の化合
物、例えばＮ〓−カルボベンゾキシグリシル−
Ｌ−ロイシン、Ｎ〓−カルボベンゾキシグリシ
ル−Ｌ−フエニルアラニン、Ｎ〓−カルボベン
ゾキシグリシル−Ｌ−プロリン、Ｎ〓−カルボ
ベンゾキシグリシルグリシルグリシン、Ｎ〓−
カルボベンゾキシグリシルグリシル−Ｌ−ロイ
シン、Ｎ〓−カルボベンゾキシグリシルグリシ
ル−Ｌ−フエニルアラニンあるいはＮ〓−カル
ボベンゾキシグリシルグリシル−Ｌ−セリン
等、またはグリシンをアミノ末端位に含むペプ
チドであり、そのグリシン残基のα−アミノ基
がベンゾイル基で保護された化合物のうち、Ｎ
〓−ベンゾイルグリシルグリシンに分解作用を
示すが、他の化合物、例えばＮ〓−ベンゾイル
グリシル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシン等に
は全く作用しない。またグリシンをカルボキシ末端位に含むジペ
プチド、例えばＬ−アラニル−グリシン、グリ
シルグリシン、Ｌ−チロシル−グリシンあるい
はＬ−フエニルアラニル−グリシン等にはほと
んど作用しない。グリシンまたはアラニン以外のアミノ酸のα
−アミノ基がカルボベンゾキシ基、ベンゾイル
基、またはアセチル基で保護された化合物に対
し全く分解作用を示さない。本酵素の種々な基質に対する活性を第１表に
示す。なお、第１表中の相対活性はＮ〓−カル
ボベンゾキシグリシンに対する分解活性を100
とした時の活性比で示したものである。

【表】

【表】 (3) 力価の測定法酵素活性の測定法は以下に示すごとくであ
る。 0.05Mリン酸緩衝液（PH6.0）0.85mlと0.01M
Ｎ〓−カルボベンゾキシグリシン0.05mlおよび
0.02M CoCl₂0.05mlより成る基質溶液0.95mlに
酵素溶液0.05mlを加え、35℃で10〜30分間反応
せしめた後、酵素反応の結果、生成遊離される
グリシンをニンヒドリン比色法〔E.W.Yemm
＆E.C.Cocking.，Analyst.，80，209（1955）〕
で定量した。上記反応系でグリシン1mMを１時間で生成
する酵素活性を１単位（unit）とした。また比
活性は上記の方法により測定した酵素活性の酵
素蛋白１mg当りの酵素単位で表示した。なお蛋
白の定量は紫外部の吸光度を特定することによ
つて行なつた。 (4) 作用至適PHおよび作用適温の範囲第１図に示されるように作用至適PHの範囲は
５〜７であり、作用最適PHは6.0付近である。第２図に示されるように作用適温の範囲は30
〜45℃であり、最適温度は35℃である。 (5) 安定PHおよび安定温度範囲安定PH範囲は５〜７にあり、第３図に示され
るようにPH6.5、４℃、16時間後の活性残存率
は70％である。安定温度範囲は25℃までであり、第４図に示
されるようにPH6.5、30℃、１時間後の活性残
存率は65％である。 (6) 酵素活性に及ぼす金属イオンの影響各種金属イオンを最終濃度が第２表に示す濃
度になるように酵素溶液に添加し、35℃、10分
間反応せしめた後、Ｎ〓−カルボベンゾキシグ
リシンを基質として用いて酵素活性を測定した
結果を第２表に示す。なお第２表中の相対活性はCoCl₂1mM存在下
での分解活性を100とした時の活性比で示した
ものである。

【表】 (7) 酵素活性に及ぼす金属キレート化合物、SH
試薬、または蛋白修飾試薬の影響各種の金属キレート化合物、SH試薬、有機
水銀化合物、または蛋白修飾試薬を最終濃度が
第３表に示す濃度になるように酵素溶液
（1mM CoCl₂を含有）に添加し、35℃、10分間
反応せしめた後、Ｎ〓−カルボベンゾキシグリ
シンを基質として用いて残存酵素活性を測定し
た結果を第３表に示す。なお第３表中の相対活性は上記の薬剤を添加
しないで測定した時の酵素活性を100とし、そ
の活性比で示したものである。

【表】 (8) 分子量 0.1M NaClを含有する0.01Mリン酸緩衝液
（PH6.8）で平衝化したセフアロース6B（フアル
マシア・フアインケミカルズ社製）を用いたゲ
ル濾過クロマトグラフイーにより分子量を測定
した。標準蛋白質としてはチログロブリン、カ
タラーゼ、アルドラーゼを用いた。その結果本
酵素の分子量は220000であることが解つた。 (9) 等電点キヤリアーアンフオライトとしてPH3.5〜10
のアンフオライン（LKB Produkter，AB社
製）を用いる密度勾配等電点分離法により等電
点を測定した。その結果、本酵素の等電点は
4.48であることが解つた。 (10) デイスク電気泳動ポリアクリルアミドを担体とし7.0％ゲル濃
度、PH8.0のトリス・バルビタール緩衝液を用
いデイスク電気泳動を行なつた。カラム１本あ
たり3mAの電流を通じ、４℃で１時間泳動を
行なつた後、クマシブリリアントブルーＲ−
250で染色した。その結果、マーカー（ブロム
フエノールブルー）に対する本酵素の比泳動距
離Rm_BPB＝0.47であつた。本発明の新規な酵素Ｎ〓−カルボベンゾキシ
アミノ酸アミドヒドロラーゼは以上の性質を有
する酵素である。以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれにより制限されるものではな
い。実施例１水１につきカザミノ酸（デイフコ社製）５
ｇ、バクトトリプトン（デイフコ社製）５ｇ、Ｌ
−システイン0.2ｇ、Ｌ−アスパラギン酸0.1ｇ、
DL−アラニン0.5ｇ、DL−トリプトフアン0.2
ｇ、グルコース20ｇ、酢酸ナトリウム10ｇ、コハ
ク酸ナトリウム20ｇ、KH₂PO₄0.5ｇ、K₂HPO₄0.5
ｇ、FeSO₄・7H₂O10mg、MnSO₄・H₂O10mg、
MgSO₄・7H₂O10mg、NaCl10mg、チアミン１mg、
リポフラビン１mg、ピリドキシン２mg、ピリドキ
サール0.25mg、ナイアシン１mg、パントテン酸カ
ルシウム１mg、葉酸0.25mg、ｐ−アミノ安息香酸
0.5mg、ビオチン５μｇ、アデニン硫酸塩５mg、
グアニン塩酸塩５mg、ウラシル５mg、Tween801
mlを含有する培養量をPH6.8に調整後、100ml容三
角フラスコ10本にそれぞれ100mlずつ分注し、120
℃で10分間殺菌した。この殺菌培地にストレプト
コツカス・フアエカリスATCC8043株の穿刺培地
より、それぞれ３白金耳を接種し、37℃、24時間
静置培養を行なつた。この前培養液200mlを前培養に用いた培地と全
く同じ組成の培地20の入つた30容ステンレス
製ジヤーフアーメンターに移し、37℃で毎分45回
転の撹拌で本培養を行なつた。 16時間で本培養を終了し、培養液を遠心分離
し、菌体を集めた。同様に３度の培養を行ない合
計60の培養液から湿重量で139ｇの菌体を得
た。このようにして得られた菌体を0.01Mリン酸緩
衝液（PH6.8）約100mlに懸濁し、約1.5Kgの0.1mm
径ガラスビーズを添加した後、ビブローゲン・セ
ルミル（エドムント・ビユーラー社製）を用いて
15分間振盪破壊した後、さらに同じ緩衝液でガラ
スビーズを洗浄した。この洗浄液を合して、遠心
分離によつて不溶物を除至し、細胞抽出液5095ml
を得た。実施例２実施例１で得られた粗酵素液5095mlに固形硫安
1236ｇを氷冷下、撹拌しながら少量ずつ添加し、
40％飽和とする。このものは氷室に30分放置後、
生じた沈澱を遠心分離にて除去し、その上澄液に
更に固形硫安1045ｇを氷冷下、撹拌しながら少量
ずつ添加し70％飽和とする。このものは一夜氷室
に放置した後、生じた沈澱を遠心分離にて回収し
た。得られた硫安沈澱物は0.01Mリン酸緩衝液
（PH6.8）に溶解し、同緩衝液に対して16時間透析
を行ない、600mlの透析溶液を得た。この溶液の
Ｎ〓−カルボベンゾキシグリシン分解活性は1.0
単位／mlであつた。上記酵素溶液に氷冷下、撹拌しながら、ブリツ
トン・ロビンソン緩衝液（PH2.0）を添加し、PH
4.5に調整した後、30分間、０℃に放置した。遠
心分離にて、生じた沈澱を除去し、上澄液は、直
ちにブリツトン・ロビンソン緩衝液（PH7.0）を
加えて、PH6.8に調整した後、メンブラン濃縮器
（米国アミコン社、PM−10）で限外濾過を行な
い、66mlの酵素溶液を得た。この溶液の活性は
9.8単位／ml、蛋白濃度は18.4mg／mlであつた。実施例３実施例２で得られた酵素液66mlを、予め0.01M
リン酸緩衝液（PH6.8）で平衡化したDEAE−セ
フアデツクスＡ−50（フアルマシア・フアインケ
ミカルズ社製）の3.3cm×76cmのカラムに注ぎ、
カラムを同じ緩衝液で十分に洗浄した後、同じ緩
衝液を用い、０〜1M NaClの直線グラジエント
溶出を行ない、Ｎ〓−カルボベンゾキシアミノ酸
アミドヒドロラーゼ活性画分420mlを得、これを
ポリエチレングリコールで濃縮して38mlとした。
この酵素液の活性は128単位／mlであつた。実施例４実施例３で得られた酵素液38mlを、予め0.01M
リン酸緩衝液（PH6.8）で平衡化したセフアデツ
クスＧ−150（フアルマシア・フアインケミカル
ズ社製）の５cm×100cmのカラムに注ぎ、同緩衝
液により、20ml／hrの流速で溶出を行ない、Ｎ〓
−Ｎ〓−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒドロ
ラーゼ活性画分434mlを得、これをポリエチレン
グリコールで濃縮して12.8mlとした。この酵素液
の活性は861単位／mlであつた。実施例５実施例４で得られた酵素液12.8mlを、予め
0.01Mリン酸緩衝液（PH6.8）で平衡化したAH−
セフアロース4B（フアルマシア・フアイルケミ
カルズ社製）の2.7cm×91cmのカラムに注ぎ、カ
ラムを0.1MのNaClを含む同緩衝液で十分洗浄し
た後、同緩衝液を用い0.1〜1M NaClの直線グラ
ジエント溶出を行ない、Ｎ〓−カルボベンゾキシ
アミノ酸アミドヒドロラーゼ活性画分310mlを
得、これをポリエチレングリコールで濃縮して
31.5mlとした。この酵素液の活性は380単位／ml
であつた。実施例６実施例５で得られた酵素液31.5mlを、予め
0.01Mリン酸緩衝液（PH6.8）で平衡化したAH−
セフアロース4B（フアルマシア・フアインケミ
カルズ社製）の2.7cm×91cmのカラムに注ぎ、カ
ラムを同緩衝液で十分洗浄した後、同緩衝液を用
い、０〜1M NaClの直線グラジエント溶出を行
ない、Ｎ〓−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒ
ドロラーゼ活性画分225mlを得、これをポリエチ
レングリコールで濃縮して、15.0とした。この
酵素液の活性は354単位／mlであつた。実施例７実施例６で得られた酵素液15.0mlを予め、
0.01Mリン酸緩衝液（PH6.8）で平衡化したセフ
アロース6B（フアルマシア・フアインケミカル
ズ社製）の2.6cm×70cmのカラムに注ぎ、カラム
を同緩衝液で十分洗浄した後、0.05MのNaClを加
えた同緩衝液を用いて溶出を行ない、Ｎ〓−カル
ボベンゾキシアミノ酸アミドヒドロラーゼ88mlを
得、これをポリエチレングリコールで濃縮して、
9.4mlとした。この酵素液の活性は479単位／mlで
あつた。実施例８実施例７で得られた酵素液9.4mlを、予め
0.001Mリン酸緩衝液（PH6.8）で平衡化したヒド
ロキシアパタイト（BIO−RADラボラトリーズ社
製）の２cm×54cmのカラムに注ぎ、カラムを同緩
衝液で十分洗浄した後、0.001〜0.3Mの濃度勾配
のリン酸緩衝液（PH6.8）で溶出する。Ｎ〓−カ
ルボベンゾキシグリシン活性画分80mlを得、これ
をポリエチレングリコールで濃縮して、8.9mlと
した。この酵素液の活性は230単位／mlであつ
た。実施例９実施例８で得られた酵素液8.9mlを、LKBプロ
ダクト（AB社製）110mlのカラムによるPH3.5〜
5.0のアンフオラインを用いた密度勾配等電点電
気泳動を行なつた。泳動は０〜1.5゜で行ない、
各フラクシヨンを2.5mlずつ集めた。酵素活性画
分10mlを集め、0.01Mリン酸緩衝液（PH6.8）に
対して透析した後、ポリエチレングリコールで濃
縮して、11.2mlとした。この酵素液の活性は144
単位／mlであつた。実施例 10 実施例９で得られた酵素液11.2mlを予め、
0.001Mリン酸緩衝液（PH6.8）で平衡化したヒド
ロキシアパタイト（BIO−RADラボラトリーズ社
製）の1.6cm×30cmのカラムに注ぎ、カラムを同
緩衝液で十分洗浄した後、0.001〜0.25Mの濃度
勾配のリン酸緩衝液（PH6.8）で溶出する。Ｎ〓
−カルボベンゾキシグリシン活性画分27mlを得、
これをポリエチレングリコールで濃縮して、6.6
mlとした。この酵素液の活性は107単位／mlであ
つた。この様にして得た精製酵素は、蛋白１mgあたり
2831単位の活性を示した。上記精製工程における全活性、比活性、収率を
第４表に示す。

【表】参考例１Ｎ〓−カルボベンゾキシグリシンを0.05Mリン
酸緩衝液（PH6.8）に溶かし、10μmol／mlの溶液
を調整し、その10mlに上記精製法で得られた酵素
液１mlおよびＭ／10 CoCl₂水溶液0.1mlを加え、
37℃で１時間反応した後、この反応液をエーテル
20mlを用いて３回抽出を行なつた。このエーテル
層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を留
去し、残つた液体をIR，UV，TLCおよびMSで
検討した結果、エーテルに抽出されたものはベン
ジルアルコールであつた。また、エーテル抽出した後の水層をPH2.0に調
整したアンバーライトIR−120（ローム・アン
ド・ハース社製）にバツチ法で吸着させ、次に５
％NH₄OHを用いて溶出した。これを濃縮して析
出した結晶をTLC，mp，IR元素分析で検討した
結果、水層から得られた結晶はグリシンであつ
た。Ｎ〓−カルボベンゾキシアラニンを全く同じ方
法で処理した結果、エーテル層からベンジルアル
コール、水層からアラニンを検出した。参考例２Ｎ〓−ベンゾイルグリシンを0.05Mリン酸緩衝
液（PH6.8）に溶かし、10μmol／mlの溶液を調整
し、この20mlに上記精製法で得られた酵素液１ml
を加え、37℃で１時間反応した後、この反応液を
エーテル20mlを用いて３回抽出を行なつた。この
エーテル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、
エーテルを留去すると白色の結晶が析出した。こ
の結晶をIR，MS，UV，TLCで検討した結果、
エーテル層から得られた白色結晶は安息香酸であ
つた。また、エーテル抽出した後の水層を濃縮した
後、シリカゲル60のPre−Coated PLC plate（メ
ルク社製）に塗布し、溶媒、MeOH：H₂O60：40
で展開した後、グリシン展開部分のシリカゲルを
かきとり、ビーカー中で水で抽出を行なつた。シ
リカゲルを濾過して取除いた後、水溶液を濃縮し
析出した白色結晶をMeOHと水の混液から再結晶
した。この結晶はIR，mp，TLC元素分析の結
果、グリシンであつた。Ｎ〓−ベンゾイルアラニンを全く同じ方法で処
理した結果、エーテル層から安息香酸、水層から
アラニンを検出した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｎ〓−カルボベンゾキシアミノ酸ア
ミドヒドロラーゼの最適PHを示す図である。第２
図は、Ｎ〓−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒ
ドロラーゼの作用温度を示す図である。第３図
は、Ｎ〓−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒド
ロラーゼの25℃におけるPH安定性を示す図であ
る。第４図は、Ｎ〓−カルボベンゾキシアミノ酸
アミドヒドロラーゼの熱安定性を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式：〔式中、R₁はカルボベンゾキシ基またはベン
ゾイル基およびR₂は水素またはメチル基を表わ
す〕で示される化合物に作用し（但し、R₂がヒドロ
キシメチル基である化合物には作用しない）、グ
リシンまたはアラニンとベンジルアルコールまた
は安息香酸とに分解する、以下の特性を有するＮ
〓−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒドロラー
ゼ：基質特異性：グリシンまたはＬ−アラニンのα−アミノ基が
カルボベンゾキシ基、ベンゾイル基（これらの基
は核置換基を有していてもよい）で保護された化
合物およびＮ〓−ベンゾイルグリシルグリシンに
特異的に活性を示す至適PH：５〜７作用適温：30〜45℃ 分子量：約220000 活性化：Coイオンで活性化される等電点：4.48 ２ストレプトコツカス属から得られる第１項記
載のＮ〓−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒド
ロラーゼ。３ DISC電気泳動がRm＝0.47である第１項記載
のＮ〓−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒドロ
ラーゼ。４ストレプトコツカス属に属し、一般式：〔式中、R₁はカルボベンゾキシ基またはベン
ゾイル基およびR₂は水素またはメチル基を表わ
す〕で示される化合物に作用し（但し、R₂がヒドロ
キシメチル基である化合物には作用しない）、グ
リシンまたはアラニンとベンジルアルコールまた
は安息香酸とに分解する、以下の特性を有するＮ
〓−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒドロラー
ゼ生産能を有する菌株を培地に培養し、培養物よ
りＮ〓−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒドロ
ラーゼを採取することを特徴とするＮ〓−カルボ
ベンゾキシアミノ酸アミドヒドロラーゼの製造
法：基質特異性：グリシンまたはＬ−アラニンのα−アミノ基が
カルボベンゾキシ基、ベンゾイル基（これらの基
は核置換基を有していてもよい）で保護された化
合物およびＮ〓−ベンゾイルグリシルグリシンに
特異的に活性を示す至適PH：５〜７作用適温：30〜45℃ 分子量：約220000 活性化：Coイオンで活性化される等電点：4.48 ５菌株がストレプトコツカス・フアエカリスで
ある第４項記載の製造法。６採取を、培養液から得た菌株を、中性PHの緩
衝液中で破壊し、その抽出液を塩析し、塩析物を
中性PHの緩衝液に溶解し、これと同じ緩衝液で透
析し、透析液を緩衝液でPH４〜５に調節して析出
する沈澱を除いた後、中性PHで限外濾過し、濃縮
液を採取することにより行う第４項記載の製造
法。７採取を、第６項記載の限外濾過濃縮液をされ
にアニオン交換液体クロマトグラフイーで処理
し、その活性画分を採取するか、所望によりこれ
を更に濃縮することにより行う第４項記載の製造
法。８採取を、第７項記載の活性画分またはその濃
縮液をさらにゲル濾過クロマトグラフイーにか
け、所望によりその活性画分をさらに濃縮するこ
とにより行う第４項記載の製造法。９採取を、第８項記載のゲル濾過クロマトグラ
フイー活性画分またはその濃縮液を吸着クロマト
グラフイーにかけ、所望によりその活性画分を濃
縮することにより行う第４項記載の製造法。１０採取を、第９項記載のその活性画分または
濃縮液を密度勾配等電点電気泳動法で処理し、そ
の活性画分を透析し、所望によりこれを濃縮する
ことにより行う第４項記載の製造法。