JPS61225651A - 多層分析素子およびそれを用いた生体由来の試料分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、多層分析素子、特に支持体と展開層との間に
液体不透過性フィルムを設けた多層分析素子およびそれ
を用いた生体由来の試料分析法に関する。

（従来の技術） 血液や尿などの生体由来の液体試料の定量分析には、フ
ロ一方式およびディスクリート方式などの自動定量分析
装置が用いられている。この装置は分析処理能力が高い
ものの使用前のウオーミングアツプおよび使用後の洗浄
が必要である。洗浄廃液の処理には環境汚染上の問題も
ある。装置が高価であるうえにその操作に熟練を要する
という問題もある。

これら欠点を解決するために、多層分析素子を用いた光
学的方法による生体由来の液体試料の定量分析法が提案
されている。多層分析素子とは。

生体由来の液体試料中の特定化学成分を、乾式で。

迅速かつ簡便に定量する材料であり２例えば、特開昭４
９−５３８８８号公報、特開昭５０−１３７１９２号公
報。

特開昭５１−４０１９１号公報、特開昭５２−１３１７
８６号公報、特開昭５３−８９７９６号公報および特開
昭５５−２６４２８号公報に開示されている。

この多層分析素子に生体由来の液体試料を点着し、その
色変化または濃度変化を肉眼判定または反射測光するこ
とにより、試料中の被検成分が定量分析される。

しかし、生体由来の試料と素子中の試薬との反応が、抗
原抗体反応のような反応速度の遅い反応および多段階反
応である場合２反応が完結しない状態の反応液が次の試
薬層または抽出層に移動するときがあり、そのために２
分析精度が低下し。

試料の定量が不正確となる。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の問題点を解決するものであり、その
目的とするところは、被検成分と試薬との反応が抗原抗
体反応のような反応速度の遅い反応および多段階反応の
場、合においても、各反応を完結させてのち所定の分析
に供する多層分析素子を提供するところにある。本発明
の他の目的は。

上記多層分析素子を用いた生体由来の試料分析法を提供
するところにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明の多層分析素子は、光透過性支持体上に試薬層と
展開層とを順次積層しかつ該支持体と該展開層との間に
、少なくとも一枚の液体不透過性フィルムが取りはずし
可能に挿入された構成でなり、そのことにより上記目的
が達成される。本発明の多層分析素子を用いた生体由来
の試料分析法は、光透過性支持体上に試薬層と展開層と
が順次積層されかつ該支持体と該展開層との間に少なく
とも一枚の液体不透過性フィルムが取りはずし可能に挿
入された構成でなる多層分析素子の該展開層上に生体由
来の試料を点着し、試薬層に浸透した該点着試料を試薬
層中の試薬と反応させ１反応が完結したのち該液体不透
過性フィルムを取りはずすことにより１反応液を次の試
薬層または抽出層に供給することを包含し、そのことに
より上記目的が達成される。

本発明の多層分析素子の光透過性支持体は０例えば１分
光光度測定器からの照射光を透過させ。

その反射光を適当な手段により検知し試薬層の呈色変化
を測定するための媒体である。この支持体には光透過性
でかつ液体不浸透性のあらゆる材料が使用できる。その
例にはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、三酢酸
セルロース、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリ
スチレン、ポリメチルメタクリレート、ガラスがある。

支持体の厚さは５０，１７１１１〜２０００μｍが好適
である。しかし。

螢光測定用の素子に用いられる支持体には、ポリカーボ
ネート、三酢酸セルロース、ポリスチレンのような低螢
光放射線透過の材料が好ましい。

試薬層は、被検試料を２例えば、呈色変化させる試薬を
含有する層であり、ｖｌ水性重合体に試薬および酵素の
少なくとも一方を混合して作製される。親水性重合体に
は、ゼラチン、プルラン、アガロースアルギン酸ナトリ
ウム、水溶性ヒドロキシエチルセルロース類、ポリアク
リルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリ
ドン、アクリル系コポリマーなどが挙げられる。

展開層は９点着された試料を均一に拡散して試薬層へ供
給するための層である。それには１例えば、メンブラン
フィルタ−９布、濾紙、不織布。

ガラス繊維などが用いられる。しかし、蛋白質定量の場
合は、ニトロセルロースのような蛋白質吸着性の素材は
好ましくない。

上記支持体と展開層との間に配置される液体不透過性フ
ィルムは１例えば、多段階反応において。

各反応あるいは反応と抽出とを完全に遮断するための層
であり、取りはずし可能である。このフィルムには、液
体不透過性のあらゆる材料が使用でき、その例には前記
支持体に用いられた重合体およびガラスがある。フィル
ムの厚さは、可能なかぎり薄い方が好ましい。一般に、
１０〜２００μｍである。このフィルムは薄膜であるた
め、これを取りはずした後も９通常、フィルム設置箇所
に空隙が生じることはなく９分析に支障をきたさない。

上記フィルム設置箇所の取りはずし口に接着層を設ける
ことにより、空隙の発生を効果的に防ぐことができる。

上記多層分析素子の支持体と展開層との間には。

試薬層のほかに、各反応に応じて、抽出層および光遮断
層が適宜設けられうる。抽出層は９例えば。

抗原抗体反応において反応物を抽出するための層であり
、その例には、上記試薬層に用いられた親水性重合体が
ある。光遮断層は９分光光度計から照射され光透過性支
持体を透過した光を遮断する層であり、それは前記親水
性重合体に酸化チタンおよび／もしくは硫酸バリウムを
９例えば１〜３０重量％（重合体に対し）配合して作製
される。

上記多層分析素子には、必要に応じて、界面活性剤が添
加されうる。界面活性剤は、素子中での試料成分の移動
を促進する。その例には、ポリオキシエチレン、ポリグ
リセリンのアルキルアリルエーテル、ソルビタンエステ
ル、脂肪酸エステルなどのノニオン性界面活性剤がある
。

（実施例） 以下に本発明を実施例について述べる。

尖豊斑上 本発明の多層分析素子は、第１図に示すように。

光透過性支持体１上に抽出層６．光遮断層５．液体不透
過性フィルム４．試薬層２および展開層３を、公知の方
法により順次積層して作製される。

フィルム４には取りはずし用把手４０が適宜設けられる
。各層には以下の材料が用いられた。

光透過性支持体：ポリカーボネート。

抽出層：ポリアクリルアミドおよびＰ−ノニルフェノキ
シグリセリン。

光遮断層：水、　ＴｉＯ２粉末およびＰ−ノニルフェノ
キシグリセリン。

液体不透過性フィルム：ポリエチレンテレフタレート（
ＰＥＴ）フィルム。

試薬層：変性ヒ）　ＩｇＧを固定化したミクロフィルタ
ー。

展開層：再生セルロース膜（平均孔径３μｍ）この多層
分析素子を用いて、ヒト血清中のリウマチ因子の定量が
９次のようにして行われた。

（１）フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）
で標識した一定量の抗ヒトＩｇＧとヒト血清（被検試料
）との混合溶液を、上記多層分析素子の展開層上に点着
した。溶液は展開層で均一に拡散されたのち、試薬層に
供給される。

（２）このようにして試薬層に供給された標識抗ヒ）　
ＩｇＧおよび血清中のリウマチ因子が、試薬層中にあら
かじめ固定された変性ヒトＩｇＧと、３７℃で３０分間
競争反応する。この反応は液体不透過性フィルム上で行
われる。

（３）反応後、液体不透過性フィルムを取りはずした。

反応物は試薬層中に残留し、未反応物（標識抗ヒトＩｇ
Ｇおよび血清中のリウマチ因子を含む）だけが抽出層に
移動した。

（４）螢光分光光度計を用いて、標識抗し）　ＩｇＧの
反射螢光強度を測定した。螢光強度測定値は未反応の標
識抗ヒ）　ＩｇＧの存在量に依存する。

他方、既知量のリウマチ因子を含むヒト血清を用いて、
上記と同様の反応を行わせ、螢光強度値と標識抗ヒ）　
ＩｇＧ量との関係を求めて検量線を作成した。

被検試料の上記反射螢光強度測定値を用いて。

検量線から、被検試料中のリウマチ因子を定量した。

ス１１引ム 本発明の他の多層分析素子は、第２図に示すように、光
透過性支持体１上に試薬層２．光遮断層５、液体不透過
性フィルム４．媒体層７および展開層３を、公知の方法
により順次積層して作製される。フィルム４には取りは
ずし用把手４０が適宜設けられる。各層には以下の材料
が用いられた。

光透過性支持体：ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ
） 試薬層：ゼラチン、グルコース　グルコースオキシダー
ゼ、４−アミノアンチピリンおよび１゜７−シヒドロキ
シナフタレン 光遮断層：水、　ＴｉＯ□粉末およびＰ−ノニルフェノ
キシグリセリン 液体不透過性フィルム：　ＰＥＴフィルム媒体層：抗イ
ンシュリン抗体を固定化した再生セルロース（平均孔径
３μｓ＋） 展開層：オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（
Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０（Ｌ　ロームアンドハース社製
）により親水化した再生セルロース（平均孔径３μｒａ
）この多層分析素子を用いて、ヒト血清中のインシュリ
ンの定量が１次のようにして行われた。

（１）パーオキシダーゼで標識した一定量のインシュリ
ンと希釈したヒト血清（被検試料）との混合溶液を、上
記多層分析素子の展開層上に点着した。溶液は展開層で
拡散されたのち、媒体層に供給される。

（２）このように媒体層に供給された標識インシュリン
および血清中のインシュリンが、媒体層中にあらかじめ
固定された抗インシュリン抗体と、３７℃で１時間競争
反応する。この反応は液体不透過性フィルム上で行われ
る。

（３）反応後、液体不透過性フィルムを取りはずした。

反応物は媒体層中に残留し、未反応物（標識インシュリ
ンおよび血清中のインシュリンを含む）だけが次の試薬
層に移動する。

（４）試薬層中のグルコースは、グルコースオキシダー
ゼの触媒により、試料中の水と反応して過酸化水素を生
成する。この過酸化水素がパーオキシダーゼ（上記イン
シュリンの標識物質）の存在下。

４−アミノアンチピリンと１．７−シヒドロキシナフタ
レンとの発色反応に関与する。この発色レベルを分光光
度計にて測定した。光度測定値はパーオキシダーゼ標識
インシュリンの存在量に依存する。

他方既知量のインシュリンを含むヒト血清を用いて上記
と同様の反応を行わせ９分光光度値と標識インシュリン
量との関係を求めて検量線を作成した。

被検試料の上記分光光度値を用いて、検量線から、被検
試料中のインシュリン量を定量した。

１施炭主 液体不透過性フィルムと光遮断層との間に新たにＢ／Ｆ
分離層を設けたほかは、実施例１と同様の層構成でなる
多層分析素子を作製した。各層には以下の材料が用いら
れた。

光透過性支持体：ポリエチレンテレフタレートＣＰＥＴ
）フィルム 抽出層：ポリアクリルアミドおよびＰ−ノニルフェノキ
シグリセリン 光速断層二酸化チタン、アガロースおよびＰ−ノニルフ
ェノキシグリセリン Ｂ／Ｆ分離層：ポリアクリルアミド（厚さ０．５μｍ） 液体不透過性フィルム：ＰＥＴフィルム試薬層：抗チロ
キシン血清を含むメンブランフィルタ− 展開層：メンブランフィルター ここでＢ／Ｆ分離層とは、特開昭５９−７７３５６号公
報に開示されているように、抗原抗体反応において１反
応物と未反応物とを分離するための層である。

この多層分析素子を用いて、ヒト血清中のチロキシンの
定量が次のようにして行われた。

（１）フルオレセインイソチオシアネー）（ＦＩＴＣ）
で標識した一定量のチロキシンとヒト血清（被検試料）
との混合溶液を上記多層分析素子の展開層上に点着した
。溶液は展開層上で均一に拡散されたのち、試薬層に供
給される。

（２）このように試薬層に供給された標識チロキシンお
よび血清中のチロキシンが、試薬層中にあらかじめ固定
された抗チロキシン血清と、３７℃で３０分間競争反応
する。反応は液体不透過性フィルム上で行われる。

（３）反応後、液体不透過性フィルムを取りはずした０
反応物はＢ／Ｆ分離層により、抗原抗体反応物と未反応
物（標識チロキシンおよび血清中のチロキシンを含む）
とに分離され、未反応物だけが抽出層に移動する。

（４）螢光分光光度計を用いて、標識チロキシンの反射
螢光強度を測定した。実施例１と同様の検量線法により
、被検試料中のチロキシン量を定量した。

（発明の効果） 本発明の多層分析素子は、このように、支持体と展開層
との間に、少なくとも一枚の液体不透過性フィルムが取
りはずし可能に挿入されている。

そのため、生体由来の試料中の被検成分と試薬との反応
が抗原抗体反応のような反応速度の遅い反応および多段
階反応の場合でも、各反応を完結させてのち被検試料中
の被検成分が分析されうる。

その結果１分析精度が向上し、被検成分の定量が正確に
なされる。

４、　　　　の　　　な量 第１図は本発明の多層分析素子の一実施例を示す斜視図
、第２図は本発明の多層分析素子の他の実施例を示す斜
視図である。

１・・・光透過性支持体、２・・・試薬層、３・・・展
開層。

４・・・液体不透過性フィルム、５・・・光遮断層、６
・・・抽出層、７・・・媒体層、４０・・・フィルム取
りはずし用把手。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、光透過性支持体上に試薬層と展開層とを順次積層し
   かつ該支持体と該展開層との間に、少なくとも一枚の液
   体不透過性フィルムが取りはずし可能に挿入された構成
   でなる多層分析素子。 ２、前記液体不透過性フィルムがポリエチレンテレフタ
   レート、三酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリ塩
   化ビニル、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートお
   よびガラスのうちの少なくとも一種からなる特許請求の
   範囲第１項に記載の多層分析素子。 ３、前記液体不透過性フィルムの厚さが１０〜２００μ
   ｍである特許請求の範囲第１項に記載の多層分析素子。 ４、光透過性支持体上に試薬層と展開層とが順次積層さ
   れかつ該支持体と該展開層との間に少なくとも一枚の液
   体不透過性フィルムが取りはずし可能に挿入された構成
   でなる多層分析素子の該展開層上に生体由来の試料を点
   着し、試薬層に浸透した該点着試料を試薬層中の試薬と
   反応させ、反応が完結したのち該液体不透過性フィルム
   を取りはずすことにより、反応液を次の試薬層または抽
   出層に供給することを包含する生体由来の試料分析法。 ５、前記液体不透過性フィルムがポリエチレンテレフタ
   レート、三酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリ塩
   化ビニル、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートお
   よびガラスのうちの少なくとも一種からなる特許請求の
   範囲第４項に記載の生体由来の試料分析法。 ６、前記液体不透過性フィルムの厚さが１０〜２００μ
   ｍである特許請求の範囲第４項に記載の生体由来の試料
   分析法。