JPS62269065A - 多層分析素子およびそれを用いた生体由来の試料分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 主−λ肌■圧豊呈脱貝 （産業上の利用分野） 本発明は、多層分析素子、特に試薬層内に液体不１性フ
イルムを設けた多層分析素子およびそれを用いた生体由
来の試料分析法に関する。

（従来の技術） 血液や尿などの生体由来の液体試料の定量分析には、フ
ロ一方式およびディスクリート方式などの自動定量分析
装置が用いられている。この装置は分析処理能力が高い
ものの使用前のウオーミングアツプおよび使用後の洗浄
が必要である。洗浄廃液の処理には環境汚染上の問題も
ある。装置が高価であるうえにその操作に熟練を要する
という問題もある。

これら欠点を解決するために、多層分析素子を用いた光
学的方法による生体由来の液体試料の定量分析法が提案
されている。多層分析素子とは。

生体由来の液体試料中の特定化学成分を、乾式で。

迅速かつ簡便に定量する材料であり１例えば、特開昭４
９−５３８８８号公報、特開昭５０−１３７１９２号公
報。

特開昭５１−４０１９１号公報、特開昭５２−１３１７
８６号公報、特開昭５３−８９７９６号公報および特開
昭５５−２６４２８号公報に開示されている。

この多層分析素子に生体由来の液体試料を点着し、その
色変化または濃度変化を肉眼判定または反射測光するこ
とにより、試料中の被検成分が定量分析される。

しかし、生体由来の試料と素子中の試薬との反応が、抗
原抗体反応のような反応速度の遅い反応および多段階反
応である場合１反応が完結しない状態の反応液が次の試
薬層または抽出層に移動するときがあり、そのために１
分析績度が低下し。

試料の定量が不正確となる。しかも、定量方法が。

支持体側から照射した光を反射層により反射させて検出
する反射測光であるため、透過光による測定に比べて分
析精度が低い。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の問題点を解決するものであり、その
目的とするところは、被検成分と試薬との反応が抗原抗
体反応のような反応速度の遅い反応および多段階反応の
場合においても、各反応を完結させてのち所定の分析に
供する多層分析素子を提供することにある。本発明の他
の目的は１透過光による測定が可能な多層分析素子を提
供することにある。本発明のさらに他の目的は、上記多
層分析素子を用いた生体由来の試料分析法を提供するこ
とにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明の多層分析素子は、光透過性支持体上に光透過性
の試薬層が積層されかつ該試薬層内に。

少なくとも一枚の液体不透過性フィルムが取りはずし可
能に挿入され、該液体不透過性フィルムにより、該光透
過性試薬層が上下方向に少なくとも２層に区画されてな
り、そのことにより上記目的が達成される。本発明の多
層分析素子を用いた生体由来の試料分析法は、光透過性
支持体上に光透過性の試薬層が積層されかつ該試薬層内
に少なくとも一枚の液体不透過性フィルムが取りはずし
可能に挿入され、該液体不透過性フィルムにより。

該光透過性試薬層が上下方向に少なくとも２層に区画さ
れてなる多層分析素子の該試薬層上に生体由来の試料を
点着し、試薬層に浸透した該点着試料を試薬層中の試薬
と反応させ２反応が完結したのち該液体不透過性フィル
ムを取りはずすことにより１反応液を下方の試薬層に供
給する工程および反応終了後、該多層分析素子に光を照
射して透過光の吸光度を測定する工程、を包含してなり
。

そのことにより上記目的が達成される。

本発明の多層分析素子の光透過性支持体は１例えば２分
光光度測定器からの照射光を透過させ。

その透過光を適当な手段により検知し試薬層の呈色変化
を測定するための媒体である。この支持体には光透過性
でかつ液体不浸透性のあらゆる材料が使用できる。その
例にはポリエチレンテレフタレート　（ＰＥＴ）、三酢
酸セルロース、ポリカーボネートポリ塩化ビニル、ポリ
スチレン、ポリメチルメタクリレート、ガラスがある。

支持体の厚さは５０μｍ〜２０００μｍが好適である。

しかし。

螢光測定用の素子に用いられる支持体には、ポリカーボ
ネート、三酢酸セルロース、ポリスチレンのような低螢
光放射線透過の材料が好ましい。

試薬層は、被検試料を８例えば、呈色変化させる試薬を
含有する層であり、親水性重合体に試薬および酵素の少
なくとも一方を混合して作製される。親水性重合体には
、ゼラチン、プルラン、アガロースアルギン酸ナトリウ
ム、水溶性ヒドロキシエチルセルロース類、ポリアクリ
ルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリド
ン、アクリル系コポリマーなどが挙げられる。

試薬および酵素の少なくとも一方を含有する親水性重合
体は９通常、適当な溶媒に溶解させた後。

支持体上に塗布される。しかし、この方法では。

塗布後の乾燥により試薬層の厚みが薄くなり１層厚の調
節が困難となる。そこで、ゲル化させた親水性重合体を
溶媒に分散させ、これを塗布すれば１乾燥後も試薬層の
厚みが変わらず好ましい。

上記試薬層内に配置される液体不透過性フィルムは１例
えば、多段階反応において、各反応あるいは反応と抽出
とを完全に遮断するための層であり、取りはずし可能で
ある。このフィルムには。

液体不透過性のあらゆる材料が使用でき、その例には前
記支持体に用いられた重合体およびガラスがある。フィ
ルムの厚さは、可能なかぎり薄い方が好ましい。一般に
、５〜２００μｍである。このフィルムは薄膜であるた
め、これを取りはずした後も２通常、フィルム設置箇所
に空隙が生じることはなく１分析に支障をきたさない。

上記フィルム設置箇所の取りはずし口に接着層を設ける
ことにより、空隙の発生を効果的に防ぐことができる。

上記多層分析素子には、必要に応じて、界面活性剤が添
加されうる。界面活性剤は、素子中での試料成分の移動
を促進する。その例には、ポリオキシエチレン、ポリグ
リセリンのアルキルアリルエーテル、ソルビタンエステ
ル、脂肪酸エステルなどのノニオン性界面活性剤がある
。長時間（３０分〜２時間）インキュベートするとき、
水分の蒸発が測定値に誤差を生じさせる。この蒸発をふ
せぐため、界面活性剤を用いて２滴下面にカバーをする
こともできる。

（実施例） 以下に本発明を実施例について述べる。

実韮Ｖ土 本発明の多層分析索子は７第１図に示すように。

光透過性支持体１上に第１の試薬層２．液体不透過性フ
ィルム３．第２の試薬層４を、公知の方法により順次積
層して作製される。フィルム３には取りはずし用把手３
０が適宜設けられる。各層には以下の材料を用いた。

光透過性支持体：ポリカーボネート。

第１の試薬層：ポリアクリルアミドおよびｐ−ノニルフ
ェノキシグリセリン中に４−アミノアンチピリン、フェ
ノール、グルコースおよびグルコースオキシダーゼを含
有させた混合物。

液体不透過性フィルム：ポリエチレンテレフタレート　
（ＰＥＴ）フィルム。

第２の試薬層：変性ヒ）　ＩｇＧを固定化した透明性多
孔性フィルム織布。

この多層分析素子を用いて、ヒト血清中のリウマチ因子
の定量が１次のようにして行われた。

（１）パーオキシダーゼで標識した一定量の抗ヒトＩｇ
Ｇとヒト血清（被検試料）との混合溶液を、上記多層分
析素子の第２の試薬層上に点着した。溶液は拡散された
のち、第２の試薬層全体に供給される。

（２）このようにして第２の試薬層に供給された標識抗
ヒｌ−ＩｇＧおよび血清中のリウマチ因子が、第２の試
薬層中にあらかじめ固定された変性ヒトＩｇＧと、３７
’ｃで３０分間競争反応する。この反応は液体不透過性
フィルム上で行われる。

（３）反応後、液体不透過性フィルムを取りはずした。

反応物は第２の試薬層中に残留し、未反応物（標識抗ヒ
ｌ−ＩｇＧおよび血清中のりウマチ因子を含む）だけが
第１の試薬層に移動した。

（４）分光光度計を用いて、標識抗ヒトＩｇＧの吸光度
を透過光により測定した。測定値は未反応の標識抗ヒト
ＩｇＧの存在量に依存する。

他方、既知量のりウマチ因子を含むヒト血清を用いて、
上記と同様の反応を行わせ、吸光度と標識抗ヒトＩｇＧ
ｆｉとの関係を求めて検量線を作成した。

被検試料の上記測定値を用いて、検量線から。

被検試料中のりウマチ因子を定量した。

ス施貫１ 光透過性支持体、第１の試薬層および第２の試薬層に以
下の材料を用いたこと以外は、実施例１と同様の方法に
より多層分析素子を作製した。

光透過性支持体：ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ
）　フィルム。

第１の試薬層：ゼラチン、グルコース　グルコースオキ
シダーゼ、４−アミノアンチピリンおよび１．７−シヒ
ドロキシナフタレン。

第２の試薬層：抗インシュリン抗体を固定化した透明性
多孔性フィルム織布。

この多層分析素子を用いて、ヒト血清中のインシュリン
の定量が１次のようにして行われた。

（１１パーオキシダーゼで標識した一定量のインシュリ
ンと希釈したヒト血清（被検試料）との混合溶液を、上
記多層分析素子の第２の試薬層上に点着した。溶液は拡
散されたのち、第２の試薬層全体に供給される。

（２）このように第２の試薬層に供給された標識インシ
ュリンおよび血清中のインシュリンが、第２の試薬層中
にあらかじめ固定された抗インシュリン抗体と、３７℃
で１時間競争反応する。この反応は液体不透過性フィル
ム上で行われる。

（３）反応後、液体不透過性フィルムを取りはずした。

反応物は第２の試薬層中に残留し、未反応物（標識イン
シュリンおよび血清中のインシュリンを含む）だけが第
１の試薬層に移動した。

（４）第１の試薬層中のグルコースは、グルコースオキ
シダーゼの触媒により、試料中の水と反応して過酸化水
素を生成する。、この過酸化水素がパーオキシダーゼ（
上記インシュリンの標識物質）の存在下、４−アミノア
ンチピリンと１．７−シヒドロキジナフタレンとの発色
反応に関与する。この発色レベルを分光光度計にて測定
した。発色レベルは透過光の吸光度により測定された。

光度測定値はパーオキシダーゼ標識インシュリンの存在
量に依存する。

他方、既知量のインシュリンを含むヒト血清を用いて上
記と同様の反応を行わせ１分光光度値と標識インシュリ
ン量との関係を求めて検量線を作成した。

被検試料の上記分光光度値を用いて、検量線から、被検
試料中のインシュリン量を定量した。

去旌勇ユ 液体不透過性フィルムと第１の試薬層との間に新たにＢ
／Ｆ分離層を設けたほかは、実施例１と同様の層構成で
なる多層分析素子を作製した。各層には以下の材料を用
いた。

光透過性支持体：ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ
）フィルム。

第２の試薬層：ポリアクリルアミドおよびｐ　−ノニル
フェノキシグリセリン中にグルコース、グルコースオキ
シダーゼ、４−アミノアンチピリンおよびフェノールを
含有させた混合物。

Ｂ／Ｆ分離層：ポリアクリルアミド（厚さ０．５μｍ）
ｅ 液体不透過性フィルム：ＰＥＴフィルム。

第１の試薬層：抗チロキシン血清を含む透明性ナイロン
フィルム織布。

ここでＢ／Ｆ分離層とは、特開昭５９−７７３５６号公
報に開示されているように、抗原抗体反応において１反
応物と未反応物とを分離するための層である。

この多層分析素子を用いて、ヒト血清中のチロキシンの
定量が次のようにして行われた。

（１１パーオキシダーゼで標識した一定量のチロキシン
とヒト血清（被検試料）との混合溶液を上記多層分析素
子の第２の試薬層上に点着した。溶液は拡散されたのち
、第２の試薬層全体に供給される。

（２）このように第２の試薬層に供給された標識チロキ
シンおよび血清中のチロキシンが、第２の試薬層中にあ
らかじめ固定された抗チロキシン血清と１３７℃で３０
分間競争反応する。反応は液体不透過性フィルム上で行
われる。

（３）反応後、液体不透過性フィルムを取りはずした。

反応物はＢ／Ｆ分離層により、抗原抗体反応物と未反応
物（標識チロキシンおよび血清中のチロキシンを含む）
とに分離され、未反応物だけが第１の試薬層に移動する
。

（４）分光光度計を用いて、標識チロキシンの吸光度を
透過光により測定した。実施例１と同様の検量線法によ
り、被検試料中のチロキシン量を定量し・た。

天Ｗ津工 本発明の他の多層分析素子は、第２図に示すように、光
透過性支持体１上に第１の試薬層２．液体不透過性フィ
ルム３．第２の試薬層４．液体不透過性フィルム５およ
び第３の試薬層６を、公知の方法により順次積層して作
製される。フィルム３および５には、それぞれ取りはず
し用把手３０および５０が適宜設けられる。各層には以
下の材料を用いた。

光透過性支持体：ポリエチレンテレフタレート（Ｐ　Ｉ
Ｅ−Ｔ）フィルム。

第１の試薬層（定着試薬層）：ポリビニルアルコール（
ＰＶＡ）および水酸化ナトリウム。

？ｉ体不透過性フィルム：ＰＥＴフィルム。

第２の試薬層（呈色試薬層）：ポリビニルアルコール（
ＰＶＡ）および２，４−ジニトロフェニルヒドラジン。

第３の試薬層（基質試薬層）：ポリビニルアルコール（
ＰＶＡ）、　　α−ケトグルタル酸およびＬ−アスパラ
ギン酸。

この多層分析素子を用いて、ヒト血清中のグルタミン酸
−オキザロ酢酸トランスフヱラーゼ（ＧＯＴ）の定量が
２次のようにして行われた。

（１１ヒト血清（被検試料）を、上記多層分析素子の第
３の試薬層上に点着した。溶液は拡散されたのち、第３
の試薬層全体に供給される。

（２）このように第３の試薬層に供給されたヒト血清中
のＧＯＴが、第３の試薬層中にあらかじめ固定された基
質（α−ケトグルタル酸およびＬ−アスパラギン酸）と
、３７℃で１時間反応する。この反応は液体不透過性フ
ィルム５上で行われる。

（３）反応後、液体不透過性フィルム５を取りはずした
。反応物は第２の試薬層に移動した。

（４）第２の試薬層中の２．４−ジニトロフェニルヒド
ラジンは上記反応物と呈色反応を起こす。呈色反応は、
液体不透過性フィルム３上にて室温で２５分間行われる
。

（５）反応後、液体不透過性フィルム３を取りはずした
。反応物は第１の試薬層に移動した。

（６）上記呈色反応物は、第１の試薬層中の水酸化ナト
リウムにより定着する。定着操作は、室温で３０分間行
われる。

（７）このように定着された呈色反応物の発色レベルを
分光光度計にて測定した。発色レベルは、透過光（波長
；　５４０ｎｍ）の吸光度により測定された。

他方、既知量のＧＯＴを含むヒト血清を用いて上記と同
様の反応を行わせ１分光光度値とＧＯＴ量との関係を求
めて検量線を作成した。

被検試料の上記分光光度値を用いて、検量線から、被検
試料中のＧＯＴ量を定量した。

（発明の効果） 本発明の多層分析素子は、このように、試薬層内に、少
なくとも一枚の液体不透過性フィルムが取りはずし可能
に挿入されている。そのため、生体由来の試料中の被検
成分と試薬との反応が抗原抗体反応のような反応速度の
遅い反応および多段階反応の場合でも、各反応を完結さ
せてのち被検試料中の被検成分が分析されうる。その結
果１分析端度が向上し、被検成分の定量が正確になされ
る。しかも、試薬層が光透過性であるため、透過光によ
る測定が可能であり、そのために分析精度がさらに向上
する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の多層分析素子の一実施例を示す斜視図
、第２図は本発明の多層分析素子の他の実施例を示す斜
視図である。 １・・・光透過性支持体、２・・・第１の試薬層、３゜
５・・・液体不透過性フィルム、４・・・第２の試薬層
。 ６・・・第３の試薬層、　３０．５０・・・フィルム取
りはずし用把手。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、光透過性支持体上に光透過性の試薬層が積層されか
   つ該試薬層内に、少なくとも一枚の液体不透過性フィル
   ムが取りはずし可能に挿入され、該液体不透過性フィル
   ムにより、該光透過性試薬層が上下方向に少なくとも２
   層に区画されてなる多層分析素子。 ２、前記区画された試薬層に２段階反応に用いる試薬が
   それぞれ含まれてなる特許請求の範囲第１項に記載の多
   層分析素子。 ３、前記液体不透過性フィルムがポリエチレンテレフタ
   レート、三酢酸セルロース、ポリカーボネート　ポリ塩
   化ビニル、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートお
   よびガラスのうちの少なくとも一種からなる特許請求の
   範囲第１項に記載の多層分析素子。 ４、前記液体不透過性フィルムの厚さが５〜２００μｍ
   である特許請求の範囲第１項に記載の多層分析素子。 ５、光透過性支持体上に光透過性の試薬層が積層されか
   つ該試薬層内に少なくとも一枚の液体不透過性フィルム
   が取りはずし可能に挿入され、該液体不透過性フィルム
   により、該光透過性試薬層が上下方向に少なくとも２層
   に区画されてなる多層分析素子の該試薬層上に生体由来
   の試料を点着し、試薬層に浸透した該点着試料を試薬層
   中の試薬と反応させ、反応が完結したのち該液体不透過
   性フィルムを取りはずすことにより、反応液を下方の試
   薬層に供給する工程および反応終了後、該多層分析素子
   に光を照射して透過光の吸光度を測定する工程、を包含
   する生体由来の試料分析法。 ６、前記区画された試薬層に２段階反応に用いる試薬が
   それぞれ含まれてなる特許請求の範囲第５項に記載の生
   体由来の試料分析法。 ７、前記液体不透過性フィルムがポリエチレンテレフタ
   レート、三酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリ塩
   化ビニル、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートお
   よびガラスのうちの少なくとも一種からなる特許請求の
   範囲第５項に記載の生体由来の試料分析法。 ８、前記液体不透過性フィルムの厚さが５〜２００μｍ
   である特許請求の範囲第５項に記載の生体由来の試料分
   析法。