JPS61115484A - 耐熱性α−アミラ−ゼを産生する好熱性嫌気性細菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、新規なα−アミラーゼの生産に用いる嫌気性
細菌に係り、特にぶどう糖等の殿粉加工ならびに繊維の
のり抜きなどにおける殿粉の液化反応に好適な耐熱性α
−アミラーゼを産生ずる好熱性嫌気性細菌に関する。

〔発明の背景〕

酵素は基質選択性が高く、常温、常圧下でも反応を触媒
できる特長を有するが、一般に加熱やｐＨに対し極めて
不安定である。最近、酵素を固定化してバイオリアクタ
に組み込み、異性化糖やＬ−アミノ酸が生産できるよう
になった。これらのリアクタの運転に際しては、雑菌の
９／Ｓ殖防］Ｆ、や反応速度をあげるため、常温より高
い６０℃以旧のＱ度域で行うことが望まれている。この
ため、旧来の常温性酵素にかわり、加熱やｐＨ変化にも
安定な、いわゆる耐熱性酵素の開発が進められてきた。

従来の耐熱性酵素は好気性細菌を起源として生産されて
いる。これまで、α−アミラーゼは主として、代表的な
好気性細菌であるバチルス属の細菌を培養することによ
り製造されてきた（Ｃａｍｐｂｅｌｌ　　ｅｔ　　ａｌ
、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ　　Ｃｈｅｗ、　　＋　　２３
６．　２９５Ｌ１９６１年）。そのうち、バチルス・ズ
ブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）及
びバチルス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１
ｉｃｈｅｎｉｆｏｒＩＩｉｓ）を起源とするα−アミラ
ーゼは、すでに工業生産され、異性化糖やぶどう糖等の
殿粉加工や繊維ののり抜き処理に使用されている。これ
ら公知のα−アミラーゼは、いずれも酵素の本体である
たん白質だけでは耐熱性を発揮できず、カルシウムイオ
ンの存在下ではじめて耐熱性を示す。少なくも１ｍＭ（
斉ａ：特開昭４８−３５０８３号公報）のカルシウム濃
度を必要とし、通常数ｍＭ〜２０ｍＭ（服部：特開昭５
１−７１４６５２号公報、特開昭５１−４４６９０号公
報）のカルシウム塩を添加して反応を行っている。した
がって、従来の耐熱性α−アミラーゼは、カルシウムが
ないか１ｍＭ未満の場合には、バチルス・リチェニホル
ミス起源のα−アミラーゼの１例を第２図中に示すよう
に、耐熱性が著しく低下する（曲線５；特開昭４６−１
２９４６号公報のもの、曲Ｍｃ６；特開昭４８−３５０
８３号公報のもの）。このため、水道水のカルシウム濃
度に相当する１００μＭ以下の極めて希薄な濃度では、
殿粉の液化反応中に失活がおこり、高価な酵素を多量に
消費する。したがって、通常は、数ｍＭの塩化カルシウ
ムや酢酸カルシウムなどの可溶性カルシウム塩を添加し
て反応している。しかし、カルシウム塩を添加すると殿
粉加工の製品である異性化糖やぶどう糖を製造する際、
後工程でカルシウムを除去することが必要となる。

一般に、α−アミラーゼの最適ｐＨは６以−ヒであり、
酸性域でも活性の高いものはごくわずかしか知られてい
ない。例えば、酸性α−アミラーゼとしては、バチルス
・リチニホルミスのα−アミラーゼが知られている（田
中等：特開昭５２−１５１９７０号公報、斉藤：特開昭
４８−３５８０８３号公報）。ところで、殿粉を液化す
る際、１０〜４０％９通常３０％の濃度に懸濁した、い
わゆる殿粉孔を原料に用いるが、原料殿粉中に含まれる
不純物の有機酸のためＰ　Ｉ（は５以ド、しばしば４以
下を呈する。

このため、上野；特開昭４９−１９０４９号公報ならび
に中動：特開昭４９−５５８５７号公報の例のように、
すべて消石灰もしくは炭酸カルシウムでＰ　Ｈを６〜７
に中１口し、しかるのちにｔ−アミラーゼを作用させて
いる。

〔発明のＥ１的〕 本発明の目的は、耐５腺性にすぐれ、かつカルシウム要
求性が極めて低く、酸性域でも高い活性を右ギる新規な
α−アミラーゼを産生ずる微生物を席供するにある。

〔発明の４１嬰〕 本発明ｉｆらは、耐熱性にすぐれ、酸性域でも高い活（
＋１：、　ｅ有し、かつカルシウム要求性の低いα−ア
ミラーゼを１：）ることを目的に酵素及び酵素生産用微
生物の探索を行った。その結果、クロスッリジウム属に
属する偏性嫌気性細菌（クロスッリジウム属細菌Ｒ３−
０００１，ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ　Ｒ５−００
０１゜微工研菌寄第７９１８号）が、酵素の特性、特に
カルシウム要求性ならびに作用Ｔ）Ｈ域について従来の
α−アミラーゼとことなる新規なα−アミラーゼを生成
することを見い出し、本発明に至った６本発明なるクロ
スッリジウムは、濃厚有機廃液の高温メタン発酵スラー
を起源として分離したものである０本菌の分離は次のよ
うにして行った。まず、メタン発酵スラリーを低速遠心
谷離（１０００ｒｐｍ　。

５分間）にかけ、粗大粒子を沈降除去した後、殺菌生理
食塩水で希釈した。これを菌液とし、殿粉粒を炭素源と
する寒天平板上に窒素雰囲気下で塗布し、６０℃で嫌気
的に殿粉粒をｆｆｉ＃Ｌ、て生育するコロニーを分離し
た。さらに、ヒ記コロニーの希釈液からマイクロマニュ
ピユレータ−により栄養細胞を単離した。寒天平板によ
る分離とマイクロマニュピユレータによる分離とをさら
に数回重ね。

本発明なる菌を得た。本発明なるクロスッリジウｂ　（
Ｃｌｏｓｔｒｊｄｉｕｍ　Ｓｐ　Ｉｔｓ−０００１）は
、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託している（受
託番号；微工研菌寄第７９１８号（ＦＥＲＭ　Ｐ−７９
１８）　）。以下、本菌の菌学的性質の詳細を説明する
。

Ａ。形態的性質 （１）栄養細胞の形態 下記の殿粉・ペプトン培地の寒天平板上。

嫌気性雰囲気中、６０℃で２日間培養した場合、栄養細
胞は０．４〜０．８　　Ｘ２〜５μｍの大きさの直状の
桿菌である。３日間以上の培養では、上記の形状の栄養
細胞が単独に存在する他、連鎖するものも生ずる。液体
培養でも同様な現象がａ祭される。液体培養による栄養
細胞の走査電子顕微鏡写真を第１図に示す。また、殿粉
・ペプトン培地、の組成を下記に示す。

殿粉・ペプトン培地の組成 可溶性殿粉　　　　　　　　　　１．５％ペプトン　　
　　　　　　　　０．５％酵母エキス　　　　　　　　
　　０．５％にＨ，Ｐｏ、　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．７％Ｎａ、１（ＰＯ４０、３５％ Ｍｇ５Ｏ，・７１（、ＯＯ，００１％ 寒天　　　　　　　　　　　　　２．０％チオグリコー
ル酸ナトリウム　　０．１％水道水 ｐＨ６，４ （２）胞子の有無 殿粉・ペプトン培地の寒天平板培養及び液体培養で胞子
の形成が認められる。

Ｂ、培養的特性 （１）コロニーの形態 殿粉・ペプトン培地の寒天平板培養でのコロニーは、中
心部がやや隆起した扁平な円形となり、周縁部は金縁で
ある。色素生成は見られず、表面に光沢を有し乳白色不
透明である。また、粘着性を有する。

（２）肉汁培地の寒天平板培養及び穿刺培養生育する。

殿粉・ペプトン培地と同様のコロニーを生ずる。

肉汁寒天培地組成 肉エキス　　　　　　　　　　　１．０％ペプトン　　
　　　　　　　　１．０％ＮａＣ０，０，２％ チオグリコール酸ナトリウム　　０．１％寒天　　　　
　　　　　　　　１．５％水ｉη水 ｐＨ６，０ （３）肉汁培地の穿刺培養 水素と炭酸ガスを含むガスの発生を伴って生育する７こ
のため、寒天培地が２〜３個所で分断される。

（４）肉汁液体培養 嫌気的雰囲気下でのみ生育する。

肉汁培地の組成 肉エキス　　　　　　　　　　１．０％ペプトン　　　
　　　　　　　１．０％ＮａＣＱ　　　　　　　　　　
　　　０　、２％チオグリコール酸ナトリウム　　０．
１　　％蒸溜水 ｐＨ６，０ （５）肉汁・ゼラチン培養 生育は認められない。

肉エキス　　　　　　　　　　　１．０％ペプトン　　
　　　　　　　　１．０％ＮａＣＱ　　　　　　　　　
　　　　０　、２％チオグリコール酸ナトリウム　　０
．１％ゼラチン　　　　　　　　　　１５％ 水道水 ｐＨ６，０ （６）リドマスミルク培養 ガス発生を伴い、固く凝固し、酸の生Ｉ戊により赤変す
る。

Ｃ１生理的性質 （１）生育の温度範囲 ４０〜６３℃で生育する。３０℃では生育が認められず
、６０℃付近で良好。

（２）生育のｐＨ範囲 ｐＨ５〜７で生育する。５．６　付近が良好。

（３）酸素に対する態度 偏性嫌気性。

（４）Ｏ−Ｆ試験（Ｈｕｓｈ　Ｌａ１ｆｓｏｎ変法）空
気′４囲気中では生育みられず陰性。流動パラフィン重
層による嫌気性条件下では菌が生育し、酸を生成して培
養物が黄変する。

培地の組成 ペプトン　　　　　　　　　　０．２％グルコース　　
　　　　　　　　　１．Ｏ％ＮａＣ９０、５％ に、ＨＰＯ４０，０３％ チオグリコール酸ナトリウム　　０．１％ブロムクレゾ
ールパープル　　　０．００２％寒天　　　　　　　　
　　　　　０．３％水道水 ｐＨ６，０ （５）硝酸塩の還元 陰性。

（６）ＶＰ試験 陰性。

（７）ＭＲ試験 陽性、赤変化する７ （８）インドール生成 ペプトン水に生育しないため測定できない。

（９）硫化水素の生成 Ｋｌｉｇｒｅｒ培地使用において陰性。

（１０）殿粉の加水分解 陽性。可溶性殿粉だけでなく、馬鈴薯殿粉などの粒状殿
粉も分解する６ （１１）クエン酸の利用 Ｓｉｍｍｏｎｓ培地使用において陰性。

（１２）アンモニウム塩の利用 ペプトン水に生育しないため測定できない。

（１３）色素の菌体外生成 陰性。

（１４）オキシダーゼ活性 陰性。

（１５）カタラーゼ活性 陰性。

（１６）ウレアーゼ活性 陰性。

（１７）糖の資化性 糖の資化性及びＤｕｒｈａｍ管を用いたガス発生有無の
ａＷＡ結果を下表に示す。

第　　１　　表 （１８）無機塩培地への生育 生育認められず。

（１９）有機酸の生成 各種培地から生成する有機酸組成を第２表に示す。

第　　２　　表 供試液体培地の組成 炭素源　　　　　　　　　　　１．０％ペプトン　　　
　　　　　　　１．０％食塩　　　　　　　　　　　　
　００２％チオグリコール酸ナトリウム　　０゜１蒸留
水 ｐＨ６，４ これらの結果よりＨｏｌｄｅｍａｎの嫌気性細菌分類マ
ニュアルに基づき、クロスツリジウム属に属する細菌と
同定した。

次に、本発明の細菌で得られる耐熱性α−アミラーゼの
静粛的特性について記す。

尚、α−アミラーゼ活性の測定方法は次のように行った
。

Ｂｌｕｅ　ｖａｌｕｅ法（日本化学会編：実験化学講座
２４力、生物化学■、ｐ２７９、丸善書店、　１９６９
）による糊精化力を測定した６本法は、殿粉の分子が加
水分解されるのに伴い、殿粉−より素ｃｏｍｐｌａｘに
基づく青色の発色量が１分子量の低下に比例して減少す
る原理を応用したものである。まず、２■／ｍΩの殿粉
溶液２ｍＱ及び０．１　　Ｍ＜えん酸緩衝液（ｐＨ４，
０）１ｍＱを試験管に取り、６０℃水浴中で５分間振盪
した０次いで、粗酸素液として培養炉液１ｍＡを加え、
３０分間反応させた０反応後１反応液０．４　　ｍＱを
採取し、直ちに０．５　Ｍ酢酸溶液２　ｍ　Ｑと混合し
て酵素反応を停止させた０次のその１ｍＡを１０ｍＱの
１／３０００　Ｎよう濃溶液中に加え、６８０ｎｍでの
吸光度を分光光度計を用いて測定した。一方、酵素液を
加えた直後の反応液を採取して同様に発色させ。

吸光度を測定した。なお、殿粉としては重合度約２００
０のアミロースを用いた。

α−アミラーゼ活性は次式により算出した。

α−アミラーゼ活性（単位　＝　　　　　　　　　　　
　　ＩＱ　ｔｉ＋ｗｅ反応液の吸光度 （１）作用及び基質特異性 本発明の細菌が産生ずる酵素は、馬鈴しよ。

とうもろこし、甘しょ等の殿粉を加水分解する液体型α
−アミラーゼである。

（２）至′ｉｐ！ｉｐ　Ｈ 第２図に、従来公知の代表的なα−アミラーゼの作用ｐ
Ｈ曲線を示す０曲線４で示した小笠原等のバチルス・ズ
ブチリス（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、　６７゜６５、
１９７０年）及び曲線６で示した斉藤等のバチルス・リ
チェニホルミス（特開昭４８−３５０８３号公報）を起
源とするα−アミラーゼは、ｐＨ４〜１１に好適域を有
する（最適ｐＨでの活性の８０％を有するｐＨ域とする
）。従来公知の酸性α−アミラーゼのうち、最も酸性側
で活性の高い山中等によるバチルス・リチェニホルミス
起源α−アミラーゼ（特開昭５２−１５１９７０号公報
。

曲線３）では、好適域が３．５〜６．３　にあり、ｐＨ
２で全く活性を示さないに れに対し１本発明に係る菌により産生されるα−アζラ
ーゼ■　（曲線１）ならびにα−アミラーゼ■（曲線２
）の６０℃における最適ｐＨ域は、いずれも４付近にあ
り、かつ好適ｐＨはそれぞれ２〜５．７　．２〜６．３
　にあって、従来の酸性α−アミラーゼにくらべ、さら
に酸性側でも高い活性を有する。すなわち、ｐＨ２では
、従来の酸性α−アミラーゼが全く活性を示さないのに
対し、本発明細菌によるα−アミラーゼはそれぞれ９５
％、８１％の高い活性を示す。

なお、酵素反応は次の反応系を用いた。

酵素液：０．６〜，１．３　　ｐｇ／ｍＱ基　質：アミ
ロース１■／ｍＱ クエン酸緩衝液：０．０２５Ｍ 上述したように、本発明細菌によるα−アミラーゼは従
来の酸性α−アミラーゼと作用ｐＨ域を異にすることか
ら、新しいα−アミラーゼであることは明らかである。

（３）ｐＨ安定性 本発明細菌によるα−アミラーゼ！及び■を。

ｐＨ２，４，６，７の各ｐＨ（０，０２５Ｍりエン酸緩
衝液）下で、６０℃、３０分間インキュベートした。反
応液を稀釈してｐＨを４．０に調整し、アミロースを基
質として残存活性を測定した。その結果面α−アミラー
ゼは、上記のｐＨ処理で完全に活性が保持されていた。

したがって、本α−アミラーゼは酸性域でも安定性が高
い特徴を有している。

（４）至適温度 第３図に示す如く、本発明細菌によるα−アミラーゼ［
（曲線１１）及び■（曲線１２）の至適Ｐ）（１０にお
ける至適温度は、いずれも８０℃付近である。好適温度
（最適温度での活性の８０％を有する温度域とする）は
６５〜８７℃である。なお、反応にはくえん酸緩衝液０
．０２５Ｍを用いた。

（５）熱安定性 本発゛明細菌によるα−アミラーゼ■をＴ）Ｈ６，０で
２０μＭ塩化カルシウムの存在下に６０〜９７℃に加熱
処理し、残存活性を測定した。これをもとに各温度にお
ける活性半減期を求め、その結果を第４図に示す。８０
℃及び９０℃における活性半減期（基質無添加）はそれ
ぞれ８時間、０．５時間であり、熱安定性にすぐれてい
る。α−アミラーゼＩについても９０℃における活性半
減期は約００５時間と、α−アミラーゼ［と同等の耐熱
性をイイする。一方、従来のα−アミラーゼの例とし、
バチルス・リチェニホルミスに属するα−アミラーゼ生
産菌、及びバチルス・ズブチリスに属するα−アミラー
ゼ生産菌の培養液から調製した部分精製α−アミラーゼ
標品を用い、カルシウム濃度２０ｍＭにおいて半減期を
実測した。その結果を第４図に付記する０反応は、クエ
ン酸緩衝液を用いて１両α−アミラーゼの最適ｐＨであ
る６゜０で行った。前者の８０℃における半減期は０．
６時間、後者の７０℃における半減期は０°６　Ｒｒｌ
ｆｉＣ’＆６．　＊ｌ＠８１４８＠Ｌ：ｊ：、？ａ°−
７４１ラーゼの耐熱性（曲線２１）は、従来公知のサー
マス属の耐熱性α−アミラーゼには及ばないが、バチル
ス属のα−アミラーゼ（バチルス・リチェニホルシスＳ
Ｐ、を起源とする耐熱性α−アミラーゼ、曲線２２）と
くらべ遜色ない。

（６）液熱性に及ぼす金属塩の影響 本発明ＩＲ菌によるα−アミラーゼ１の耐熱性に及ぼす
金属塩の影響を第３表に示す。α−アミラーゼｎの水溶
液に各種の金属塩を５ｍＭ濃度になる様に添加し、加熱
処理を行って活性を測定した、そして、加熱処理前に対
する加熱処理後の活性、すなわち残存活性を％で表示し
た。加熱処理及び活性測定は以下の条件で行った、 加熱処理条件 ｐＨ６，０ 加熱温度　：８０℃ 保持時ｆｌｕ：３０分 第　　３　　表 活性測定は、試料液を希釈後、以下の条件下で行った。

なお、各金属塩を本添加濃度で添加しても、活性測定に
影響のないことを確認している。

活性測定条件 ｐＨ４，０（０，０２５Ｍクエン酸ａ衝液）活性測定温
度：６０℃ 第１表から明らかに、カルシウムイオンに保護効果が認
められるのに対し、ナトリウム、カリウム及びマグネシ
ウムの各イオンについては。

さしたる保護効果は認められない。一方、ニッケル、コ
バルト、亜鉛及びマンガンの各イオンは耐熱性を低下さ
せる。また、本α−アミラーゼは０．５　　μＭのＥＤ
ＴＡで耐熱性を失うことも確認している。

本α−アミラーゼのカルシウム要求濃度は第５図曲線３
１に示すように、１００μＭ　（４ｐｐｍ　）であり、
水道水中のカルシウム濃度で十分安定化される。さらに
本酵素は１μＭ以下のカルシウム濃度においても６５％
の活性を保持している。また、α−アミラーゼ！もα−
アミラーゼ■と同等のカルシウム要求性を有している。

これに対し、バチルス・リチェニホルミスに属するα−
アミラーゼ生産菌から部分精製したα−アミラーゼは、
第５図曲線３２に示すように、３０ｍＭのカルシウムイ
オンを必要とする。

なお、加熱処理は両酵素ともｐＨ６，８，０”Ｃで３０
分間加熱し、活性測定は各々の最適にて６０℃で行った
。

一方、バチルス・ズブチリスの耐熱性α−アミラーゼで
は、カルシウム必要濃度は３〜１０ｍＭである（特開昭
５１−／１４６９０％公報、特開昭５８−３４１１７号
公報）。

したがって、本発明α−アミラーゼは、従来公知の耐熱
性α−アミラーゼに比べ著しくカルシウム要求性が低い
。

（７）精製方法 実施例において詳述するので、ここでは簡単な説明にと
どめる。

本発明細菌によるαニアミラーゼ生産菌を、殿粉、ペプ
トン及び酵母エキスを含有する液体培地に接種し、嫌気
条件下で６０℃に１〜３日間培養する。培養液を遠心分
離等により菌体及びそれ以外の不溶物質を除したいわゆ
る培養済液を得る０次いで、培ｉｌｌ＞７３液を、モレ
キュラシーブ膜濾過、イオン交換クロマト、ゲルが過ク
ロマト、塩析等の公知の方法を適宜利用して、本発明細
菌によるα−アミラーゼを濃縮するとともにそれ以外の
不純物を除く。

（８）分子量　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　ｉ本発明細菌によるα−アミラーゼの分子量は未
確認であるが、モレキュラシーブ膜濾過における挙動か
ら、分子量は２０，０００以上と推定される。

以上、本発明細菌により産生される新しい耐熱性α−ア
ミラーゼは、特に作用ｐＨ並びにカルシウム要求性にお
いて、従来の好気性細菌の生産する耐熱性酵素と著しく
異なる。

しかるに、ぶどう糖や異性化糖等を製造するには、まず
原料の殿粉をα−アミラーゼで液化し、そのあとグルコ
アミラーゼで糖化している。

液化の際、Ｋ＋料！粉をを数十％の高濃廣に仕込むため
、液のｐ　Ｈは酸性を呈する。このため、従来のα−ア
ミラーゼを使うには１ｍ粉液をアルカリで中和してから
液化している。液化処理したあと、９来公知のグルコア
ミラーゼは１作用ｐ　１−１が酸性域にあるため、酸を
加えて再度ｐＨを耐性側に調整しなければならない。

しかｌ、で、本発明なる偏性嫌気性細菌を起源とする新
しい耐熱性α−アミラーゼを用いれば、水道水なみのカ
ルシウムを含む仕込水を用いるのみで、カルシウム剤の
添加も不要となる７さらに、液化、糖化両工程のｐＨ＠
整も不要となり、ひいとは反応後の脱塩工程への負荷を
大巾に軽減できる。　　　　　　　　　ゝゝ〔発明の実
施例〕 以下１本発明の実施例を示し、さらに詳しく説明する。

実施例１゜ 可溶性殿粉１．５　％、ポリペプトン０．５　％。

酵母エキス０．５　％、りん酸第１カリウム０．７％、
りん酸第２ソーダ０．３５　％、硫酸マグネジ　“ラム
・り水和物０．０１　％、チオグリコール酸ナナトリウ
ム０１　　％及び水道水を含む液体培地（ｐＨ６，４）
４．５．６−を、内容積５Ｑの培養槽３基に１．５２ｋ
ｇずつ分注し、１２０℃で２０分間殺菌する。これに同
上培地で嫌気的に培養した本発明者等により分離せるク
ロスツリジウム属の菌体懸濁液８０ｇを各槽毎に添加し
た。次いで。

ガス出口に水封トラップを付し、発酵槽内気相部をアル
ゴンガスで十分置換後、嫌気条件下で培養する。培養液
のｐＨは６．０　　に自動調整し、温度も６０℃に自動
調整する。４６時間培養後、培養物を合せ６．０００　
ｒｐｍで遠心分離し、菌体を除去する。この上澄液は４
９単位／ｇの比活性を示した。

次に、上記上澄液３．５瞳をモレキュラシーブ膜（分画
分子量：　２００００　）で濾過し、１．５　ｋｇに濃
縮した。濃縮液を２分し、０．７５ｋｇ分を架橋デキス
トランゲル（分画分子量：　２５００．ファルマシア社
製）を充填したカラム（直径Ｌｏｏｍ、長さ４５０ｍｍ
）にチャージし、モレキュラシーブ液体クロマトグラフ
ィを実施した。その際のα−アミラーゼ活性の溶出パタ
ーンを第６図に示す、溶出は脱イオン水で行い、１００
ｍｊｌずつ分画した。

図中に示すように、溶出液量１．２〜２Ｑのフラクショ
ンにα−アミラーゼ活性がみとめられた。

上記の液体クロマトグラフィーをのこりの上澄液につい
ても実施し１両α−アミラーゼフラクションを合せた。

これを４Ｑｔｏｒｒの減圧下で凍結乾燥し、乾燥粗粉末
２．７　ｇを得た６ 本粗酵素乾燥標品の比活性は３９０００単位／ｇで、上
澄液の比活性に比べ約８００倍に向トした。活性収率は
約６０％である６上清液から粗酵素乾燥標品調製におけ
る比活性、活性収量及び活性回収率の変化を第４表に示
した。

第　　４　　表 上記の粗酵素乾燥標品をジエチルアミノエチル化架橋デ
キストランゲル（ＤＥＡＥセファデックス。

ファルマシア社製）を用いたイオン交換クロマト（カラ
ムサイズ：直径２５　ｍｍ　、長さ４００ｍｍ）により
精製した。粗酵素乾燥標品２．４ｇを０．０５　　　　
　　　　ｉＭトリス・塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，５）に７
８解した。

不溶物を清適して除いた液を、同じ緩衝液で緩衝化した
ゲルカラムにチャージし、洗滌した。次いで、緩衝液中
の塩化ナトリウム濃度を直線勾配（曲線４３）で上昇し
つつ展開した。α−アミラーゼ活性の溶出パターンを第
７図に示す。塩化ナトリウム濃度０．０４　　Ｍと０．
０８Ｍでの溶出位置にα−アミラーゼ活性を有する２つ
のピークが認められ、前者がα−アミラーゼＩ　（曲線
４１）、後者がα−アミラーゼ■（曲線４２）である。

α−アミラーゼ■の活性層は吸着全活性の３０％、α−
アミラーゼＨのそれは６０％である。両フラクションを
個々に凍結乾燥して得たα−アミラーゼｌ及びα−アミ
ラーゼ■の比活性は、それぞれ３９０単位／ｍｇ、８８
０単位／■と、粗酵素乾燥標品に比べ、それぞれ１０倍
、２３倍に向上した。

また２培養物の遠心上澄液基準の活性回収率は、それぞ
れ１９％、３５％である。

実施例２゜ ぶどう糖１゜５　％、ポリペプトン０．５　％、すＡ、
酸第１カリウム０．７　％、りん酸第２ソーダＱ、３５
％、硫酸マグネシウム・り水和物０．０１％。

チオグリコール酸ナトリウム０．１　　％及び水ｉｎ水
を含む液体培地（ｐＨ６，４）２５ｍＱを内容積４０ｍ
Ｑの七ノー型試験管に入れ、＋２０でで２０分間殺菌す
る。これに同上培地で嫌気的に培養した本発明なるクロ
スツリジウム属の培養液１ｍＱを添加した０次いで、ガ
ス出［１に水封トラップを付し、発酵槽内気相部をアル
ゴンで十分置換後、嫌気条件下に６０℃で４６時間培養
する。

培養物を６．０００　ｒｐｍで遠心分離し、菌体を除去
する。この上澄液は１０単位／ｇの比活性を示した。

実施例３゜ しよ糖１．５％、ポリペプトン０．５　％、りん酸第１
カリウム０．７　　％、りん酸第２ソーダ０．３５　％
、硫酸マグネシウム・り水和物０．０１％。

チオグリコール酸ナトリウム０．１　％及び水道水を含
む液体培地（ｐ　Ｈ６、４）　２５　ｍ　？、を内容棺
４０ｍＱのモノー型試験管に入れ、１２０℃で２０分間
殺菌する。これに同一ヒ培地でｌ：ニ気的に培養した本
発明なるクロスツリジウ、’＝　Ｉ、：もの層４Ｔ液１
ｍＱを添加した。次いで、ガス出口に水ｊ・］トラツプ
を付し、発酵槽内気相部をアルゴンで十分置換後、嫌気
条件下に６０°Ｃで４６時間培養する。培養物を６．０
００　ｒｐｍで遠心分離し、菌体を除去する。

この上澄液は１５単位／ｇの比活性を示した。実施例４
゜ トレハロース１．５　　％、ポリペプトン０．５　　％
。

りん酸第１カリウム０．７　　％、りん酸第２ソーダ０
．３５　％、硫酸マグネシウム・り水和物０．０１％。

チオグリコール酸ナトリウム０．１　％及び水道水を含
む液体培地（ｐＨ６，３）２５ｍＡを内容積４０　ｍ　
Ｑのモノー型試験管に入れ、１２０℃で２０分間殺菌す
る。これに同上培地で嫌気的に培養した本発明なるクロ
スツリジウム属に属する細菌の培養液１ｍＱを添加した
。次いで、ガス出口に水封トラップを付し、発酵槽内気
相部をアルゴンで十分置換後、嫌気条件下に６０℃で４
６時間培養する。培養物を６，０００　ｒｐ＋ｏで遠心
分離し、菌体を除去する。このと澄液は１１単位／ｇの
比活性を示した。

実施例５゜ マルトース２．０　　％、ポリペプトン０．５　　％。

りん酸第１カリウム０．７　％、りん酸第２ソーダ０゜
３５　％、硫酸マグネシウム・り水和物０．０１％。

チオグリコール酸ナトリウム０．１　％及び水道水を含
む液体培地（ｐＨ６，２）２５ｍＱを内容積４０ｍＡの
モノー型試験管に入れ、１２０℃で２０分間加熱処理し
て殺菌する。これに、同上培地で嫌気的に培養した本発
明なるクロスツリジウム属に属する細菌の培養液１　ｍ
　Ｑを添加した６次いで、ガス出口に水封トラップを付
し、発酵槽内気相部を高純度窒素ガスで十分置換後、嫌
気的条件下に６０℃で４６時間培養する。培養物を６．
０００　ｒｐｍで遠心分離し、菌体を除去する。この上
澄液は１５単位／ｇの比活性を示した。

実施例６゜ ローキシロース１．５　％、りん酸第１カリウム０゜７
　％、りん酸第２ソーダ０．３５　％、硫酸マグネシウ
ム・り水和物０．０１％、ポリペプトン　　　　　　　
ｊｏ、５　％、チオグリコール酸ナナトリウム０１　　
％及び水道水を含む液体培地（ｐＨ６，３）２５ｍＱを
内容Ｍ４０ｍＱの七ノー型試験管に入れ。

１２０°Ｃで２０分間加熱処理して殺菌する。これに、
同上培地で嫌気的に培養した本発明なるクロスツリジウ
ム屈に属する細菌の培養液１　ｍ　Ｑを添加した。次い
で、ガス出口に水封トラップを付し、発酵槽内気相部を
高純度窒素ガスで十分置換後、嫌気的に６０℃で４６時
間培養する。培養物を６．０００　ｒｐｌｌｌで遠心分
離し、菌体を除去する。この上澄液はｌ　２　Ｑｊ−位
／ｇのα−アミラーゼ活性を示した。

〔発明の効果〕

本発明なるクロスツリジウム屈に属する好熱性嫌気性細
菌を培養して製造せる新しい耐熱性α−アミラーゼを、
殿粉の加水分解（液化）に用いれば、水道水なみのカル
シウムを含む仕込水を用いることができ、従来行ってき
たカルシウムの添加も不要となる。さらに、殿粉の液化
、糖化両工程での中和も不要となり、その結果、反応後
の脱塩工程への負荷を大巾に軽減できる。

図面の簡！１１な説明 第１図は本発明細菌（クロスツリジウム属細１＃ＲＳ−
０００１）の生物形態を示す走査電子顕微鏡写真、第２
図は本発明細菌の産生ずる耐熱性α−アミラーゼと従来
の耐熱性α−アミラーゼとのσ−アミラーゼ活性（糊精
化力）に及ぼす、Ｈの影響を示す特性図、第３図は本発
明細菌の産生ずる耐熱性α−アミラーゼのα−アミラー
ゼ活性に及ぼす温度の影響を示す特性図、第４図は本発
明細菌の産生ずる耐熱性α−アミラーゼと従来の耐熱性
α−アミラーゼの各側における耐熱性を示す特性図、第
５図は本発明細菌の産生ずる耐熱性α−アミラーゼと従
来の耐熱性α−アミラーゼの各側における加熱処理によ
るα−アミラーゼ活性に対するカルシウム濃度の影響を
示す特性図、第６図は本発明細菌の産生ずる耐熱性α−
アミラーゼの架橋デキストランゲルを用いたモレキュラ
シーブ液体クロマトグラフィのα−アミラーゼ活性溶出
パターン図、第７図は本発明細菌の産生ずる耐熱性α−
アミラーゼのジエチルアミノエチル化架措デキストラン
ゲルを用いたイオン交換液体クロマトグラフィによ句α
−アミラーゼ活性溶出パターン図である。

も　（口 的　２　目 Ｈ も　３　口 温　演　（°Ｃ） 纂　４　口 温　彦　（°Ｃ） η　５　ｚ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、クロスツリジウム属に属し、耐熱性α−アミラーゼ
   を生産する好熱性嫌気性細菌。 ２、作用好適ｐＨが２〜６、最適ｐＨが３〜５、作用至
   適温度が６０〜８５℃にある耐熱性α−アミラーゼを産
   生することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の耐
   熱性α−アミラーゼを産生する好熱性嫌気性細菌。 ３、基質無添加で８０℃、３０分間加熱処理した際に、
   ０．１ｍＭ以下のカルシウム塩濃度下で、少なくとも７
   ０％以上のα−アミラーゼ活性を有する耐熱性α−アミ
   ラーゼを産生し、３５〜６５％で生育することができ、
   ５７〜６３℃に増殖の至適温度域を有することを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の耐熱性α−アミラーゼ
   を産生する好熱性嫌気性細菌。 ４、基質無添加で８０℃、３０分間加熱処理した際に、
   ０．１ｍＭ〜０．１Ｍのカルシウム塩存在下で１００％
   のα−アミラーゼ活性を有するα−アミラーゼを産生す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の耐熱性
   α−アミラーゼを産生する好熱性嫌気性細菌。