JPS6098994A - オリゴペプチド混合物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は栄養価に優れたオリゴペプチド混合物の製造法
に関する。更に具体的には栄養不良者のみならず正常者
に対しても優れた栄養改善効果を有するオリゴペプチド
混合物を提供するものである。

（従来技術） 蛋白質の栄養価はその蛋白質の制限アミノ酸により制限
される。

その為、従来、蛋白質へ制限アミノ酸或いはその制限ア
ミノ酸を含む他の蛋白質を添加することによる栄養価の
改善が図られてきた。

しかし、制限アミノ酸の中には風味の悪いもの、着色の
原因となるもの、それ自体不安定なもの等があり、単な
る添加では不都合な場合が多い。又制限アミノ酸を含む
他の蛋白質を加えると制限アミノ酸以外のアミノ酸組成
の変動を伴う。

そこで、本発明者は、先に蛋白質を特殊条件下で酵素処
理しその際発現する逆反応を利用して制限アミノ酸を共
有結合状に導入した酵素修飾蛋白質を開裂することによ
り、かかる不都合を解消し栄養価の改善を図ることに成
功した。これらは、本発明者等による■Ｊ、＾ｇｒｉｃ
、Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ、＋２７゜５２−５６　（１９７
９）　、■＾ｇｒｉｃ、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ、＋　４３
．１０６５−１０６８　（１９７９）　＋■同誌同巻第
１０６９−１０７４頁に、その手段を開示している。

その後、同手段の発明が特開昭５７−５０９００に開示
されている。

又、従来から、酵素の種類を変えたり或いは組合せたり
して蛋白質を加水分解しオリゴペプチドを得る方法は知
られているが、収率が悪かったり、アミノ酸組成が原料
蛋白質のそれと異なったり、遊離アミノ酸やポリペプチ
ドを多く含んだものであったり、分子量が揃っていない
等の問題があった。

一方、本発明のオリゴペプチドとは異なるもので、ディ
又はトリペプチドを高収率で得る発明として例えば、特
公昭５７−４５５６０には、蛋白質原料（５〜２０Ｗ　
／Ｖ　）をｐＨ１〜４で２種以上のプロテアーゼを作用
させることにより平均分子量７００以下の低分子ペプチ
ド（遊離アミノ酸及び分子量７００以上のペプチド２０
％以下）を８０％以上の収率で得る方法が開示されてい
る。又、同趣旨で、原料蛋白質を先の特開昭５７−５０
９００に限定した発明に特開昭５８−１５２４９８があ
る。

そして、先の特公昭５７−４５５６０にも開示されてい
るように、蛋白質をトリプシンやアルカリプロテアーゼ
を用いて加水分解しても分子量８２０や９５０のオリゴ
ペプチドは１６６５％や２００％の収率でしか得られな
いのである。

本発明のように分子量が揃い且つ制限アミノ酸レベルの
高いオリゴペプチド混合物を高収率で得る方法は知られ
ていない。同時にこのようなオリゴペプチド混合物が栄
養改善効果に優れていることも知られていない。

（目的） 本発明者は、消化器で多くの酵素を必要とする高分子の
蛋白質や消化酵素を殆ど必要としない食餌としてはやや
不自然なアミノ酸やディ又はトリペプチドとは区別され
るオリゴペプチドの栄養価について研究した。又、その
制限アミノ酸の効果について同時に研究を進めた。

その結果、次の表−１に示すように、制限アミノ酸を共
有付加（Ｃｏｖａｌｅｎｔ　Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）　
Ｌ／た分子量５０Ｑ乃至１５００ダルトンのオリゴペプ
チド混合物が、同レベルの制限アミノ酸を単に添加した
蛋白質やアミノ酸混合物に比べ、栄養不良者のみならず
、正常者に対して特に優れた栄養改善効果を有する知見
を得た。

そこで、かかるオリゴペプチド混合物を高収率で得るこ
とを目的として研究を進めた結果、まず第一段階として
、水系下に蛋白質及びアミノ酸工修飾蛋白質を調製し、
第二段階として、この酵素修飾蛋白質を特異的加水分解
することにより、従来知られなかった高収率で目的のオ
リゴペプチド混合物を得ることができる知見を得て本発
明を完成するに到った。

正常　５　５ＰＩ※　０．３　２．９６±０．２４５　
０ＰＭ※　０．３　３．１２±０，０２５Ａ＾　※　０
．３　２．７２±０．１４栄養不足　５　５ＰＩ※　０
．３　３．８８±０．７２５　０ＰＭ※　０．３　３．
９７±０．１５５　＾Ａ　※　０．３３゜４９±０．１
３（構成） 本発明は（１）分子量５００乃至１５００ダルトンのオ
リゴペプチド混合物を製造するに際し、＋８１水系下に
蛋白質及びアミノ酸エステルをチオールプロテアーゼを
用いてｐ１１７乃至１１でアミノ分解し酵素修飾蛋白質
を得る工程と（ｂｌ得られた酵素修飾蛋白質をトリプシ
ン又はプロリン特異性ペプチダーゼで特異的加水分解す
る工程を含むことを特徴とするオリゴペプチド混合物の
製造法である。

本発明において使用する蛋白質は、卵白、ラクトアルブ
ミン、魚肉又は畜肉、カゼイン等の動物性蛋白質、大豆
蛋白質、小麦蛋白質、油糧種子蛋白質、リーフ蛋白質等
の植物性蛋白質、酵母、藻菌類等の微生物蛋白質等を用
いることができる。

通常、蛋白質の制限アミノ酸レベルは高い程好ましいが
、本発明に用いる蛋白質はその制限アミノ酸レベルの高
低を問わない。

本発明の第（ａ）工程において使用する酵素は、水系下
にアミノ酸の存在下でアミノ分解 （Ａｍｉｎｏｌｙｓｉｓ）を起こすような酵素を用いる
ことができ、例えばパパイン、プロメライン、フィシン
等のチオールプロテアーゼ等を用いることができる。

酵素の作用条件は、アミノ分解が起こるような条件にす
ることが重要である。この為には■基質濃度は、通常の
加水分解条件に比し比較的高い濃度、通常　５〜４０ｗ
　／ｗ％とすることができる。

基質濃度が５％未満ではアミノ分解が起こり雌く、単な
る加水分解（ｌｌｙｄｒｏｌｙｓｉｓ＞が起こるのみで
好ましくない。４０％を超えると基質である蛋白質を均
一に水系中に熔解することが困難になる。又■本発明に
おいて用いる酵素の加水分解至適ｐｌ＋は殆どが５であ
るが、本発明においてアミノ分解するためにはｐＨ７乃
至１１、好ましくは８乃至１０とすることが適当である
。ｐＨ７未満ではアミノ分解が起こり難く、加水分解が
起こり好ましくない。又、　ｐＨが１１を超えるとアミ
ノ分解が起こり難く好ましくない。

温度、酵素／基質比等は通常の加水分解の条件と同様に
することができる。

本発明において使用するチオールプロテアーゼは還元型
酵素である為、還元剤（例えば、Ｌ−システィン）を併
用することが好ましい。

本発明の第（ａｌ工程において原料蛋白質制限アミノ酸
のレベルに応じて必要量或いはそれ以上の制限アミノ酸
をエステルの形で用いることが適当である。即ち、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等
のエステルの形で用いることができる。

更に、本発明においてはＬ−型のアミノ酸やＬ−型のア
ミノ酸エステルに限定せずに、これらのラセミ体として
用いることができることを特徴とする。

このことについて、詳しく説明する。

一般に、天然にはＬ−型のアミノ酸しか存在しない。天
然に存在しないＤ−型のアミノ酸は有害であり、好まし
くない。従って、アミノ分解により共有付加されるアミ
ノ酸はＬ−型である必要がある。

ところが、市販のアミノ酸はＤ−型とＬ−型のラセミ体
である。これからし−型のみを分割することは、工業的
にも困難であるばかりでなく高価なものになる。又、醗
酵法等により得られたし一型アミノ酸は高価である。

この点、本発明においては経済的にも安いラセミ体の市
販アミノ酸を用い、公知の方法（例えばＢｏｉｓｓｏｎ
ａｓ等の方法：　Ｈｅ１ｖ、Ｃｈｅｍ、Ａｃｔａ、３９
＋　１４２１（１９５６）　）により得られるこれらＤ
−、Ｌ−型アミノ酸エステルを用い、Ｌ−型のみを優先
的且つ選択的に蛋白質に共有付加することができる。

即ち、本発明者は、アミン分解について、深く研究を進
めた結果、本発明において用いるアミノ分解反応は他方
においてＤ−、Ｌ−ラセミ分割反応を伴うことを見いだ
した。従って、Ｄ−、Ｌ−アミノ酸エステルは、Ｌ−型
アミノ酸エステルのみが大部分アミノ酸として優先的に
蛋白質に共有付加し、Ｄ−型アミノ酸エステルは系内に
残存する（分割される）のである。この様子を模式的に
第１図に示した。従って、Ｌ−型のアミノ酸或いはし一
型のアミノ酸エステルのみを用いる必要がないものであ
る。

本発明の第＋ａｌ工程において、未反応のアミノ酸エス
テル及び酵素修飾蛋白質中のアミノ酸エステル（約１５
％程度存在する）をケン化分解させる為、通常アルカリ
分解することができる。ケン化物は例えば膜分離等の分
別手段を用いて他の低分子物質と共に除去することがで
きる。特にラセミ体アミノ酸エステルを用いた場合、残
存するＤ−型アミノ酸を除去する必要がある。膜分離の
場合、膜の分子サイズは１０００程度が好ましい。その
他、酸や有機溶剤等による公知の分別手段を用いること
ができる このようにして、第（ａ）工程により酵素修飾蛋白質を
高収率（９５％以上）で得ることができる。

酵素修飾蛋白質は、通常１０００乃至９０００ダルトン
の分子量を中心とし、原料蛋白質に比し■制限アミノ酸
含量のみをレベルアップしその他のアミノ酸組成は殆ど
変化していない酵素修飾蛋白質とすることができ、その
まま、希釈、濃縮或いは乾燥することもできる。一般の
加水分解と異なり遊離アミノ酸の生成は皆無に近い。

本発明の第（ｂｌ工程において、先に得られた酵素修飾
蛋白質をトリプシン又はプロリン特Ｘ性ペプチダーゼを
用いて特異的加水分解することができる。

特異的加水分解とは、ランダムでなく特定の部位を特異
的に加水分解することである。

特異的加水分解の条件は、通常の加水分解と同様、酵素
／基質比は０．０１〜５、蛋白質濃度は１乃至１０％、
温度１０乃至６０℃で、酵素の力価にもよるが、時間を
１〜３００分、好ましくは３乃至１２０分とすることが
でき、時間を短（できることも本発明の特徴である。

本発明において第ｔａ＋工程と第（ｂｌ工程を組み合わ
せることによりはしめて目的とするオリゴペプチドを高
収率で得ることができる。先の特公昭５７−４５５６０
に開示されるようにトリプシンのみによる加水分解では
平均分子量８２０のオリゴペプチドが１６．５％しか得
られないものを、本発明の方法によれば、例えば第（ｂ
３工程においてトリプシンを用いた場合、分子量５００
乃至１５００　（平均分子量９００）のオリゴペプチド
混合物を５５％以上の収率で、更に所望により次に述べ
る分解−分別の操作を繰り返す方法を用いれれば８０％
以上の高収率でオリゴペプチド混合物を得ることができ
るのである。

本発明の第（ｂｌ工程において、特異的加水分解後、所
望により酵素失活（例えば９０〜１００℃なら１０分程
度の加熱処理）し、分子量５００乃至１５００のオリゴ
ペプチド混合物と非オリゴペプチド混合物に分別するこ
とができる。

分別の方法としては、膜分離、沈澱法等公知の方法を用
いることができるが、工業的観点より有機溶剤による分
別が好ましい。この場合、有機溶剤（例えばエタノール
等の極性有機溶剤）を、系全体の濃度が５０〜８０賀／
−％となるように加えた後、遠心分離蔓の分離手段を用
いて、沈澱物と上澄に分離し、上澄は脱溶剤（例えばエ
バポレーション）し、所望により濃縮或いは乾燥等して
オリゴペプチド混合物とすることができる。

更に、所望により沈澱物を再度酵素修飾蛋白質の場合と
同様にして特異的加水分解物する操作を繰り返すことに
より、沈澱物は減少し、上澄即ちオリゴペプチド混合物
の収率を上げることができる。

即ち、第（ｂｌ工程において、得られた酵素修飾蛋白質
をトリプシン又は、プロリン特異性ペプチダーゼで特異
的加水分解し、オリゴペプチド混合物と非オリゴペプチ
ド混合物に分別し、非オリゴペプチド混合物を再度トリ
プシン又は、プロリン特異性ペプチダーゼで特異的加水
分解するという特異的加水分解と分別操作を１回又は２
回以上繰り返すことにより、遊離アミノ酸生成が少なく
　（５％以下）、ポリペプチドも含まれない、分子量の
揃ったオリゴペプチド混合物を高収率で得ることができ
る。

このようにして得られたオリゴペプチド混合物は、原料
蛋白質より高い、希望のレベルの制限アミノ酸を含むこ
とができる。

そして、このオリゴペプチド混合物は、制限アミノ酸が
オリゴペプチド混合物と同レベルになるように制限アミ
ノ酸を単に添加した原料蛋白質或いはそのオリゴペプチ
ド混合物と同レベルのアミ２ノ酸組成のアミノ酸混合物
に比べ、栄養不良の動物のみならず正常の動物に対する
栄養改善効果が大きく認められる。

（実施例） 以下実施例により本発明の実施態様を説明する。

実施例１ 分離大豆蛋白質（ＳＰＩ　と略す）として不二製油株式
会社製フジプローＲを用い、以下に示す製造工程により
良好な収率（８７％／ＳＰＩ　）でオリゴペプチド混合
物を得た。

尚、本実施例で、パパインは（１，１６ｘ　１Ｏ−２Ｂ
ＡＰ＾単位）、　５ｐｅｃｔｒａ−ｐｏｒ　ｔｕｂｅ　
（ＳｐｅｃｔｒｕｍＭｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ
、Ｉｎｃ、製）は分子サイズ１０００、トリプシンは再
結晶トリプシン（Ｓｉｇｍａ社製９２００　ＢＡＩＺＥ
単位）、メチオニンは市販Ｄ−、Ｌ−ラセミ体を用いた
。

以下、■大豆蛋白質の第一制限アミノ酸であるメチオニ
ンを共有付加する第Ｔａ）工程、■次ぎに、これを特異
的加水分解する（ｂ）工程に分けて説明し、最後に得ら
れたオリゴペプチド混合物の栄養改善効果について説明
していく。尚、ロー、Ｌ−メチオニンエステルはＢｏｉ
ｓｓｏｎａｓ等の方法により、Ｄ−、Ｌ−メチオニンを
塩酸、エタノール中で煮沸して調製した。塩酸は乾燥に
より容易に飛散しＤ−、Ｌ−メチオニンエステル中には
残存しなかった。

■（１）第（ａｌ工程 ↓ インキュベーション（３７℃で２時間）１−０．５Ｎ　
ＮａＯＨ（２５０ｍｌ　）■ ケン化（２０℃で３時間） ↓ 凍結乾燥 ■ パパイン修飾蛋白質（９，５ｇ） このようにして得られたオリゴペプチド混合物（ＯＰＭ
※１とする）はし−メチオニンのみが選択的に共有付加
されており、これをＢｉｏｇｅｌ　Ｐ−２クロマトグラ
フイーにかけて分子量分布をめたところ第２図に示すよ
うに分子量９００ダルトン付近にピークを持つペプチド
混合物であり、遊離のアミノ酸は４％にすぎないことが
わかった。

このＯＰＭ※ｌの構成アミノ酸組成を原料ＳＰＩのそれ
と比較すると、表−２に示すようにメチオニン含有量の
点を除いで互いに極めて良く一致していた。

（ｉｌ」」引１に験） ＯＰＭ※ｌ　、ＳＰＩ＋Ｌ−メチオニン、＾＾＋Ｌ−メ
チオニンを用いＮ水準１．５％のｌ１ａｒｐｅｒ型飼料
（メチオニン水準的０．３％）を調製した。（以上を表
−１ではＯＰＭ※、ＳＰＩ　※、ＡＡ※と表した。）被
検ラットとして、最大発育期（５週齢）の正常ラット及
び蛋白質栄養不足ラット（いずれもＷｉｓｔａｒ系雄性
）を用いた。後者は６週齢のラットに無蛋白食を４週間
投与したもので完全に貧血状態に達していた。

これらのラットに温度２２±１℃、湿度５０〜５５％、
人工照明（６ａｍ〜６ｐｍ点灯）の条件で各飼料を３週
間自由摂取させ、体重増加、Ｎ摂取及び排泄を測定し、
ＰＥＲ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｒａ
ｔｉｏ　）をめた。

ＰＥＲは、一定の飼育期間内の体重増加と摂取蛋白質の
比率で示され、摂取蛋白質の利用効率の指標の−である
。

結果は、表−１に示した通りである。即ち、本発明のオ
リゴペプチド混合物を含む食餌は、栄養不足のラットの
みならず正常ラットに対しても優れた栄養改善効果を示
した。

Ｌｙｓ　６．１６　５．４２　６．１６Ｈｉｓ　２．７
２　２．０２　３．０７＾ｒｇ　７．３２　７．５２　
Ｂ、８６Ａｓｐ　１１．７３　１２．１２　１２．２６
Ｔｈｒ　３．６８　３．６９　３．０８Ｓｅｒ　５．０
５　４．９１　４．４０Ｇｌｕ　１９．４２　２３．９
４　２０．６４Ｐｒｏ　５．７６　５．４３　５．０３
Ｇｌｙ　４．０２　４．４５　４．０２Ａｌａ　４．３
８　４．６２　３．６４Ｖａｌ　５．０９　５．２２　
３．Ｂ６Ｃｙｓ　１．１４　１．１０　１．１０Ｍｅｔ
　１．０７　３．１６　３．０７１１ｅ　４．８３　５
．５２　４．３４Ｌｅｕ　８．２０　？、５９　６．２
３Ｔｙｒ　３．８４　３．５７　２．９５Ｐｈｅ　５．
３５　６．０５　４．６１Ｔｒｐ　Ｏ，９８１，００１
，００ 実施例２ 実施例１と同様にして、第（ａ）工程で得たパパイン修
飾蛋白質１００ｇを水５Ｉｌに懸濁し、プロリン特異性
ペプチダーゼ（２０００ＩＩＬ位量）を加え、３７℃で
３０分インキュベートした後、実施例１の第（ｂｌ工程
と同様に処理して６９％の収率でオリゴペプチド混合物
（ＯＰＭ※２とする）を得た。これは第２図のＢｉｏｇ
ｅｉ　Ｐ−２クロマトグラフに示すように、分子量約７
５０ダルトンを中心とするもので、遊離アミノ酸含量は
０．１５％にすぎず、表−２に示すようにメチオニン含
量が３％であった。

実施例１と同様にして動物実験に供した結果、実施例１
の場合と同様、栄養不足のラットのみならず正常ラット
に対しても優れた栄養改善効果を示した。

（効果） 以上詳述したように本発明により栄養価に優れたオリゴ
ペプチド混合物の製造が可能になったものである。即ち
、栄養不良の者のみならず正常の者に対する優れた栄養
改善効果を有するオリゴペプチド混合物が容易に得られ
、これらのオリゴペプチド混合物を任意に配合すること
により、病人のような栄養不良の者から日常生活者まで
、各栄養状態に応じて、それぞれ適したオリゴペプチド
混合物若しくはこれを用いた食餌（Ｄｉｅｔ）　、健康
食品、栄養食品等を提供することが容易になったもので
あり、人々の栄養改善に貢献すると共に、産業の発達に
多いに寄与するものである。

【図面の簡単な説明】

第２図は、ＢｉｏｇＪ　Ｐ−２クロマトグラフを示し、
それぞれ（１・・・トリプシン特異的加水分解によるオ
リゴペプチド混合物。２・・・プロリン特異性ペプチダ
ーゼ特異的加水分解によるオリゴペプチド混合物。）を
指す。 特許出願人　不二製油株式会社 代理人　弁理士　門脇　清 ＤＬ ○０ ミノ百（エステル ○

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）分子量５００乃至１５００ダルトンのオリゴペプ
   チド混合物を製造するに際し、（ａ）水系下に蛋白質及
   びアミノ酸エステルをチオールプロテアーゼを用いてｐ
   Ｈ７乃至１１でアミノ分解し酵素修飾蛋白質を得る工程
   と（ｂ）得られた酵素修飾蛋白質をトリプシン又はプロ
   リン特異性ペプチダーゼで特異的加水分解する工程を含
   むことを特徴とするオリゴペプチド混合物の製造法。
2. （２）第（ａｌ工程において、未反応アミノ酸エステル
   及び酵素修飾蛋白質中の一部のアミノ酸エステルをケン
   化分解し、アミノ酸及び低分子物質を除去する特許請求
   の範囲第（１）項記載の製造法。
3. （３）第（ｂ）工程において、第１８）工程で得られた
   酵素修飾蛋白質をトリプシン又はプロリン特異性ペプチ
   ダーゼで特異的加水分解し、要すればオリゴペプチド混
   合物と非オリゴペプチド混合物に分別し、非オリゴペプ
   チド混合物を再度トリプシン又はプロリン特異性ペプチ
   ダーゼで特異的加水分解するという特異的加水分解と分
   別操作を１回又は２回以上繰り返す特許請求の範囲第＋
   １１項記載の製造法。