JPS60501441A

JPS60501441A - Ｄｎａ配列

Info

Publication number: JPS60501441A
Application number: JP59502319A
Authority: JP
Inventors: キングズマン，アラン　ジヨン; キングスマン，スーザン　メアリ
Original assignee: セルテク　リミテッド
Priority date: 1983-05-31
Filing date: 1984-05-31
Publication date: 1985-09-05
Also published as: GB8502503D0; EP0144408B1; GB8314961D0; WO1984004757A1; GB2150577B; US4898823A; EP0144408B2; DE3479322D1; GB2150577A; EP0144408A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡ配列技術分野本発明は、ＤＮＡ配列に関する。より詳しく言うと、本発明は、酵母のホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）ｉ３！ｉ伝子の上流の活性化配列、上流の活性化配列を含むベクター及び上流の活性化配列を使用して酵母のベクターから発現レベルを増加させる方法に関する。

背景技術組換えＤＮＡ技術における最近の進歩により、今日宿主生物による異種の遺伝子産物の発現例が数多く見られる。このような産物の商業的な実施可能性は、遺伝子発現のし・＼ルによって制御Ｖされており、このため発現レベルを増加させるだめの多大の研究努力がなされている。

同時係属中の本出願人の欧州特許出願［１Ｐ−Ａ２−００７３６３５において、酵母中の遺伝物質を発現させるための適当なブラスミｉヘクターが数多く記載されている。この中に記載されている特定のベクターは、酵母のＰＧＫＩ伝子のプロモータを団用するものごあり、酵母中の商業的に亜要なポリペプチドを合成するために有用である。酵母のＰＧＫ遺伝子は、それ自体酵母細胞によって効率良く発現されるものであり、実際にＰＧＫプロモークは、異種の逓伝物質が発現するように効果的に作用する。。

ＣＹＣ１やＨＩ３３のような、他の酵母遺伝子の５′領域の分析により、酵母遺伝子のプロモータ配列の効率を増強することができるＤＮＡの配列を発見することができた。これらの配列は、上流の活性化配列として知られている（フェイ　（Ｆａｙｅ）他、工９８１ＰＮＡＳ　７８　２２５８・ロウ９−（Ｌｏｗｒｙ　）他、］！１１８３　ＰＮＡＳ　８０　１５］：ストルール（Ｓｔｒｕｈｌ）　１９８２　ＰＮＡＳ　７！Ｌ　７３８５）　、しかしながら、今日までに分析された全ての遺伝子は、酵母中に低レベルでしか発現されず、この結果それらのプロモータ領域は、異種の遺伝子物質を高レベルで産生させるように作用する酵母ヘクターの調整のためには限られた用途しか持っていない。

オ゛発明以前には、ＰＧＫのような効率良く発現された遺伝子は１−流の活性化配列を含んでいるかどうが、また実際にもしこのような配列が存在するのであれば、それらは多量の産物をコートする遺伝子の発現の効率に主として影響を与えているのかどうがということがわからなかった。更に、もし効率良く発現された遺伝子からの上流の活性化配列が単離された場合、それが異種のブし１モークを活性化３ることができる、重環生物の″増強゛配列に対して同様に作用するかどうかわからなかった（ワノリク（Ｗａｓｙｌｙｋ　）他、１９８３　セル　３２．５０３　）。

発　明　の　開　丞本発明においては、酵母のＰＣＫ遺伝子に由来する、上流の活性化配列を提供する。この上流の活性化配列は、酵母のＰＧＫ遺伝子の５′領域にあるポリペプチド−３２４と−４５５の間に含まれている。上流の活性化配列は、ＤＮＡの′かセット“中で如何なる酵母ブロモ−りでも活性化するために使用することがごきる。

このように使用する場合、上流の活性化配列は、・＼フタ−へ結合し易くするため、いずれかの終端に付いた合成のリンカ−配列を侍っているのが良い。

本発明においては、更に酵母のＰＧＫ遺伝子の上流の活性化配列を含む、酵母の発現ヘクターを提供する。この酵母の発現・＼フタ−は、ＰＧＫ遺伝子に対して異種であるブＯＴ：−タ配列を含んでいることが好ましい一本発明においては、更に酵母のＰＧＫ遺伝子の上流の活性化配列をヘクター（ベクター中の異種のプロモータ配列の上流）に挿入することより成る、酵母の発現ヘククーの発現レベルを増加させる方法を提供する。

この異種のプロモータ配列は、ＰＧＫプロモータ配列でなければ、当該技術分野において知られている如何なるプロモータ配列であってもよい。例えば、このプロモータは、ＴＲＰｌ、ＡＤＩ（１、ＵＲＡ３．ＨＩＳ３又はＣＹＣＩ遺伝子配列に由来するものであっても良い。

図面の簡単な説明次に示す添付の図面を参照して本発明の詳細な説明する。

第１図は、プラスミドｐＭＡ２１３の略図である。

第、２図は、ブラスミｌ”　ｐＭＡ３１８−３２５の構造を示す略図である。

第３図は、酵母のｐ　ｃ　Ｋ遺伝子の５′領域部分におけるヌクレオチドー８２０から−２２０（ごれも含む）ま−このヌクレ」ナト配列を示すものである。

第４図は、ｐＭＡ２２ａの欠失終点についてのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示すものである。

第５図は、プラスミドｐＭ’Ａ３３５．３３６．３３７．３３９．３４０及び９７ａを用いて形質転換した酵母のβ−ガラクトソダーゼ活性により生した青色を本発明者達が主観的に評価したものである。

発明を実施するための最良の形態制限酵素Ｂａｌ　３１の使用法と一般的な技術は、欧州特許出願ＥＰ−八２〜００７３６３５に記載されている。β−ガラクトノグーゼ／、！ｌｉ（斗は、×Ｇプレート上で検定した（ローズ（Ｒｏｓｅ）他、Ｈ］８１　ＰＮＡＳ　７８゜２．１６０）。ＳＣ−ロイシン培地で生長させた後、酵母の細胞抽出液を調整した（ホーソー゛ン（Ｈａｗ　ｔｈｏｒｎｅ　）とモーティマ（Ｍｏｒｔｉｍｅｒ）１９６０　シネティックス　４５．１０８５　）。ローズ等の前記文献に記載されているように、細胞は、半対数的な生長を示し、次に生長が停止した。タンパク質は、プラノ１フオート（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の方法を使用して＾り定しく１９７６　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２．２４８　）　、試薬はバイオラド’ 　（３ｉｏｒａｄ）のものを使った。β−ガラクトノダーゼは、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）に従って測定した（１９７２ｒ分子遺伝学実験」コールド・スプリング　ハーバ　ラボラトリ、Ｎ、Ｙ、）酵母のＰＧＫ遺伝子の５′領域を分析するための出発分子は、ｐ門Ａ２］３であった（第１図）。プラスミドｐｌ’１Ａ２１３は欧州特許出願ＥＰ−Ａ２−００７３６３５に記載されているｐＭＡ２２ａ欠失群の中の１つである。

ｐＭＡ２１３の欠失終点は、次のようなものである。即ぢ、大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）のｌａｃ　Ｚ　？ｃ含む３．１　ｋｂのＲａｍ　ＩＩ＋断片をＢａｍ　ＩＩ＋発現部位に挿入したとき、ＰＧＫ−β−ガラクトノダーゼ融合クンバク質は、ＰＧＫ　’“プロモータ゛の調節の下に産生される。この融合タンパク質は、β−ガラクトノダーゼ活性を持っているが、酵母（ザ。

力［Ｊミセス・セレビシ、：ｌ二、　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は−詐１１１この酵母活性を持っていないものである。Ｉａｃ　Ｚ遺伝子が挿入されたごのヅラスミ１を含む酵母の形質転換物は、ＸＧプレート− １にダークブルーのコロニーを作るが、形質転換されていない菌株では白のコロニーを１乍る。

Ｐ　ＣＫ遺伝子の５′領域が多量に欠如している１絹の欠失を作り、また−２２０から−８２＋１までのヌクレオチド配列を決定するため、次のような構成に係る操作を行った（第２図）。プラスミドｐ？１Ａ２１３をＣｌａ　ｌ　′？：切断し、次に連結してｐＭ６２１３から２個のより小さなＣ１ａ　Ｉ断片を取り除き、プラスミドｐＭＡ９４を作った。次に、プラスミドｐＭＡ９４をＣ１ａ　Ｉで切断した後、エキソヌクレアーゼＢａｔ　３１で何回も水解した。次に、Ｅｃｏ　Ｒ１リンカ−（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）の存在で、得られた欠失分子を連結した後、これを大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株へＤＥ０２８　（欧州特許出願Ｅ’Ｐ−４２−００７３６３５）を形質転換してロイノン１衣７？性とアンピシリン白０１目こする丸めに使用した。コロニーに列して２１１＋ｌのＦ、ｃｏ　Ｒ１部位を持っているプラスミドのスクリーニングを行った後、より小さなＥｃｏ　Ｒ１− Ｂａｍ旧断片の長さを基準にして分類した。このプラスミドの集合物は、ｐＭＡ９４欠先群として知られている。これらのうちの８つを選び出し、ＰＧＫ遺伝子の５′領域の向う側に終点が均等に分布するようにした。これらをそれぞれＥｃｏ　Ｒ［で切断した後、２μ・ｆ、Ｅ　Ｕ　２酵母の選択と複製モジコ、−ル（欧州特許出願ＥＰ−Ａ２−００７３６３５　）で連結した。これにより、酵母中で複製することができ、またＰＧＫ遺伝子の５′領域が多量に含まれている分子群、（ｐＭＡ３１８−３２５　）が得られた。次に、これらの誘導体は、Ｂａｍ　ＩＩＩを用いてそれぞれ切断した後、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のβ−ガラクトノダーゼ（Ｉａｃ　Ｚ　）　遺伝子を持つプラスミドｐＭＣ１８７］−（カザダハン（Ｃａｓａｄａｂａｎ　）　ｔＱＪ士によって作りれたもの）からの３．ｌＫｂ　Ｂａｍ旧断片の存在下で連結した。Ｒａｍ旧部位に正しい配置で挿入されたＩａｃ　Ｚ遺伝子を含むブラスミ［、を選び出して、８（固のプラスミｆ”　ｐＭＡ３３４−３４］より成る１組を作った。

更に、ｐ門Ａ９４欠失群のうらの選択した８　ｆｌｌｌｌのブラスミ］かりの小さなＥｃｏ　Ｒ１−Ｂａｍ旧断片をＥｃｏ　Ｒ１とＢａｍ　ＩＩＩで切断されたＭ１３ｍｐ　８に挿入しくメソング（１１ｅｓｓｉＢ　）とヒーラ（ν１ｅｉｒａ）　、１９８３　シー７１９．２６９　）　、次にディデオキシ（ｄｉｄｅｏｘｙ　）　ＦＱ佳作法配列させた（号ンガー（Ｓａｎｇｅｒ）他　１．９７７　ＰＮ＋〜Ｓ　７４．５４６３　）　。（これにより−８２０から−２２０までの重複している配列情報か得られ、また選択されたｐ）ＩＡ９４欠失の正確な終点かわかった。その配列Ｉ１１報を第３図に汀（す。また、ｐＭＡ２１３中のｐ　Ｍ　Ａ　２２　ａ欠失の終点を第４図に不す。プラスミドｐＭＡ３３４−３４１におりる５　’　−ＰＧＫｉａｃ　Ｚ融合物の構成及び欠失終点の位置を第５図に示す。

これらの欠失した５′領域の発現能力を検定するため、酵母菌株ＭＤ４（１−４Ｃ（欧州特許出願ＥＰ−Ａ２−００７３６３５　）をプラスミドル旧３３５．３３６．３３７．３３９．３４０及び９７ｄで形質転換した後、これらの形質転換物をＸＧプレー１・上で培養した。第５図は、コロニ−−における青色の強度、従ってガラクトシダーゼ活性の強度を本発明考達が主観的に評価したものである。このような評価は、形’Ｒ転換物の抽出液におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を正６’Ｆ　＆、：定’１４することにより確かめられた（表］）。

表　１各種のプラスミドで形質転換したＭＤ４０−４Ｃの抽出液におけるβ−ガラクトシダーゼ活性プラスミド　β−ガラクトシダーゼｌ占１生ｐＭ八へ３５　１４３ｐＭ＾３３６　１２．５ｐＭ八３３７　１２．５ｐＨＡ３３９　４２６６ｐＭＡ９７ａ　３３０９活性は、ｎモル　０−ニトロフェノール／　ｍｉｎ　／　ｍｇタンパク質のように表す。

これらの情報は、酵母ＰＧＫの５′領域におりる一３２４位と一１１５６位間にある上流の活１１１化配列の存在を明確にボしている。

これが、効率良く発現された酵母遺伝子におけるこのような配列の最初の証明である。この配列を第３し１のヌクレオチド配列に一ト線を引いて示す（−８２０から−２２０まで）。この上流の活性化配列は、少なくとも３００倍もの発現刺激の原因となっており、従ってこれはＰＧＫ”ブロモーク”及びＰ　ＣＫ発現シグナルに依存する各種の発現ベクターを効率的に機能させるためには必須である。

本発明は、上述した通り、純粋に実施例によって説明されており、また、本発明の範囲と趣旨内で部分的な変更をなし得ることが当然理解されるであろう。

浄書（内容に変更なし）ＦＩＧ、　１手続補正書　動却昭和６ｏ年　５月３ｏ　日＠特許庁長官　志　賀　学　殿１、事件の表示Ｐ　ＣＴ／ＧＢ　８４１００１８９３、補正をする者事件との関係　特許出願人ＩｎｔａｒｎｍＩＩａ−＾−””Ｎ０ＰＣＴ／ＧＢ　８４１００１８９ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴｈＬ＋　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲＴ　Ｏｒ＼第１頁の続き＠発明者　キンゲスマン、スーザン　メアリ ■出願　人　キングズマン、スーザン　メアリイギリス国　オックスフォードシャ　オーエックス　５２　エスエフイズリップ　ミドル　ストリートグレイ　ストーンズ　（番地なし）イギリス国　オックスフォードシャ　オーエックス　５２　エスエフイズリップ　ミドル　ストリートグレイ　ストーンズ　（番地なし）

Claims

【特許請求の範囲】１、酵母のＰＧＫ遺伝子に由来する上流の活性化配列。２、酵母のＰＧＫ遺伝子の５′領域にあるヌクレオチド−３２４と一４５５間に含まれている請求の範囲第１項記載の上流の活性化配列。３、　ベクターへの付着を容易にするようにどちらかの終端に付いている合成のリンカ−配列を持っている請求の範囲第１項又は第２項記載の上流の活性化配列。１１、請求の範囲第１項に基づく上流の活性化配列を含む酵母の発現ベクター。５、Ｐ（７，に遺伝子とは異種であるプロモータ配列を含む請求の範囲第４項記載の酵母の発現ベクター。６、請求の範囲第１項、第２項又は第３項に基づく上流の活性化配列をベクター、即らベクター中の異種のブｒＪモータ配列の上流、に挿入することより成る酵母の発現ベクターの発現レベルを増加させる方法。７、　異種のプロモータ配列は、ＰＧＫプロモータ配列とは異なるプロモータ配列である、請求の範囲第６項記載の方法又は請求の範囲第５項記載のベクター。８、）゛ロモークは、ＴＲＰｌ、ＡＤ＋−１１，ＵＲ八へ、ＨＩ　Ｓ　３及びＣＹＣ１遺伝子配列より成るグループから選ばれたものである、請求の範囲第７項記載の方法又は・ベクター。