JPS6038B2 - リフアマイシンｓの製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は培養液からリフアマィシンを抽出分離する方法
に関する。

ｌｉフアマィシン群は抗生物活性をもつよく知られた一
群の物質で、その若干は発酵法により直接生産される。

薬理効果の高いリフアマィシン譲導体の多くは発酵法に
より生産されたりフアマィシンの化学的変換によって製
造される。これら物質の一つはリフアマィシンＢであり
微生物により生産される。リフアマイシンＢからリフア
マイシン○，Ｓ，ＳＶが誘導される。当初リフアマィシ
ンＳＶが開発されたが、最近では更に医薬品として優れ
た性質をもつ各種リフアマィシン誘導体が開発されてい
る。リフアマイシンＳはこれらリフアマィシン譲導体製
造の重要な中間原料である。リフアマィシンＳの製法は
、リフアマイシンＢを発酵法により生産して、培養液よ
り抽出分離した後、一連の化学操作によりリフアマィシ
ソ○を経てリフアマイシンＳに変換する方法（特公昭３
７一８５５０号、特公昭３８一１５３５２号、特公昭３
８一２２１３１号）が一般的である。しかし同法は操作
が煩雑であるので、時間及び費用がか）る上に回収率が
低く得策ではない。そこで同操作の一部を省略する目的
で発酵法により生産されたりフアマイシンＢ含有培養液
を炉過して炉液に酸化剤を添加してリフアマィシン○と
して回収する方法（特関昭４９一１１７６９２号）及び
発酵法によりリフアマィシン○を生産して回収する方法
（特公昭４１一１５５１８号）、発酵法によりリフアマ
ィシンＳＶを生産して回収する方法（特公昭４７−１０
０３７号）等があるが、リフアマィシンＳを製造するに
は更に１回以上の化学操作が必要である。か）る実情に
鑑み発明者等は簡単な操作で収率よくリファマィシンＳ
を製造する目的で、発酵生産された各種リフアマイシン
含有培養液を培養液中で処理してリフアマイシンＳとし
て回収する方法を種々研究した結果、リフアマィシンＳ
Ｖ含有培養液に処理を施し、通気することにより培養液
中でリフアマイシンＳＶをリフアマイシンＳに容易に変
換できることを発見した。

本発明によれば培養液中のＩＪフアマイシンＳＶをリフ
アマイシンＳに９０％以上の高収率で変換できる。リフ
アマィシンＳ（弱酸性物質）はリフアマィシンＳＶ（強
１塩基性酸）に比較して安定性に優れ、結晶しやすいの
で抽出、精製上も有利である。医薬品として優れた性質
を持つ各種リフアマイシン誘導体の多くは、主としてリ
フアマィシンＳを原料としており「直接培養液からリフ
アマィシンＳを抽出回収できることは工業的に有利であ
る。

本発明に用いられる培養液は、発酵法により生産された
りファマィシンＳＶ含有培養液であれば何れでもよい。

先ずこれらの培養液に処理を施す。培養液処理の目的は
リフアマィシンＳＶを分解することなく培養液中のＩＪ
フアマィシンＳＶ生産微生物が保有するりフアマィシン
ＳをリフアマィシンＳＶ‘こ変換する性質を微弱又は皆
無にすることである。培養液処理には、物理的方法（培
養液の温度、ｐＨ浸透圧等を変化させる）と化学的方法
（培養液に抗生物質類、重金属類、界面活性剤類、酸化
剤類、殺菌性薬剤類等を添加すること及びオゾン又は塩
素ガス等を通気すること）がある。これらの方法は単独
でも、また併用でもよい。培養液処理効果は、物理的又
は化学的処理した培養液を用い次の培養液処理効果テス
ト法を実施して判定する。

各条件で処理したりフアマイシンＳＶ含有培養液１００
の‘をフラスコに採取した水酸化ナトリウム又は硫酸で
ｐＨ７．０に調整した後、リファマィシンＳナトリウム
塩１００ｍｇを添加する。ゆるく婿拝しながら２８００
、ｐＨ７．０〜７．５の条件で１時間保持した後、培養
液中のＩＪフアマィシンＳを測定する。添加量に対して
５０％以上残存していた場合に培養液処理を実施したと
定義する。次に、培養液への通気であるが、前記培養液
処理を実施した培養液に通気してもよく、また培養液処
理を実施しながら通気してもよい。

この目的は通気により培養液中のりフアマィシンＳＶを
酸化してリファマィシンＳに変換することにある。培養
液処理「通気等の簡単な操作で培養液中のりフアマイシ
ンＳＶはリフアマイシンＳに９０％以上の高収率で容易
に変換できる。この様にして得られるリフアマイシンＳ
含有培養液からリフアマイシンＳを採取するには、培養
液のま）又は炉過して、この様な代謝産物を採取するの
に通常用いられる手段を適宜利用しうる。

本発明の方法を用いて得られたりフアマィシンＳは公知
のものと同一であることは、後記実施例３により確認さ
れた。次に、本発明の方法につき詳しく説明する。

リフアマィシンＳＶ含有培養液を処理する場合、先ず培
養液の温度を５〜４０℃程度好ましくは２０〜３０℃、
ｐＨ２〜９好ましくは７．０〜７．５に硫酸又は水酸化
ナトリウムで調整する。次に同条件を保持しながら物理
的およびまたは化学的方法で処理する。処理法は培養液
の種類（菌株、堵地、培養条件等）により異なるので、
下記の処理法より適宜選択すればよい。選択の基準とし
て、培養液中のりフアマィシンＳＶ分解が少なく処理効
果の高い処理法を採用すればよい。物理的処理法として
「｛１｝温度処理は培養液を５０〜１００ｑｏ、好まし
くは６０〜７０００に加溢して１〜６０分間保持する。

■ｐＨ処理は培養液ｐＨを１〜３又は８〜１政守まし〈
はｐＨ２〜３に硫酸又は水酸化ナトリウムで調整し１〜
６０分間保持する。｛３｝浸透圧処理は食塩、塩化カル
シウム、、塩化カリウム、硫安等を培養液に１〜３０％
程度好ましくは３〜１０％添加する。化学的処理法とし
て、‘１｝抗生物質処理はリフアマィシンＳＶ生産菌に
抗菌力を有する抗生物質類例えばクロロマイセチン、ス
トレプトマイシン、ペニシリン等を１〜１００蛇ｐｍ程
度培養液に添加する。

（２三重金属塩処理は銅、亜鉛、鉛、錫等の重金属塩類
を金属として１〜１００岬ｐｍ程度培養液に添加する。
（３｝界面活性剤処理はリフアマイシンＳＶ生産菌に殺
菌効果がある界面活性剤例えば陽イオン界面活性剤（オ
スバン、セチルピリジニウムクロリド、臭化セチルトリ
メチルアンモニウム等）、両性イオン界面活性剤（アル
キルイミダゾールカーボネィト等）、陰イオン界面活性
剤（ソジゥムラゥリルァルコールサルフヱィト等）を１
０〜１０００ｐｐ■程度培養液に添加する。｛４）酸化
剤処理は酸化剤例えば過酸化水素、過硫酸ナトリウム、
硝酸ナトリウム等を１０〜１０００ｐｐｍ程度培養液に
添加する。｛５’その他殺菌性薬剤処理はリフアマィシ
ンＳＶ生産菌に殺菌力を有する薬剤であれば何れでもよ
いが例えば次亜塩素酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウ
ム、プロピオン酸ナトリウム等を１０〜１，０００ｐｐ
ｍ程度培養液に添加する。‘６’ガス処理は殺菌性のオ
ゾン又は塩素ガスを通気空気中に０．１ｐｐｍ以上混合
して０．１〜２．仇ｖｍ程度の通気量で１〜６畔う間培
養液に通気する。培養液処理を実施する場合、処理効果
の有無を培養液処理効果テスト法により測定して処理法
又は処理条件等を適宜選択すればよい。

これら各種培養液処理法は単用又は併用してもよい。処
理を実施した培養液は温度５〜７０００、好ましくは１
０〜３０ｑｏ程度、ｐＨ５〜９、好ましくは７．０〜８
．晩 塁度に保持しながら通気する。

通気ガスは空気又は酸素及び酸素混合空気を使用できる
。通気は培養液中ＩＪフアマィシンＳＶと酸素の接触を
よくするため、下部より多孔管又はノズル等で実施し蝿
拝すれば更に効果がある。通気量は、培養液の種類及び
温度、通気ガス中の酸素分圧等により鼻るが、０．１〜
沙ｖｍの範囲で１〜１０時間程度通気するご通気中は培
養液中のりフアマイシンＳＶ及びリフアマィシンＳを常
時測定して、リファマイシンＳＶがなくなりリフアマィ
シンＳ濃度が最高になった時点で通気を停止する。以上
の操作により、培養液中のＩＪフアマィシンＳＶはリフ
ァマィシンＳに高収率で変換できる。

この培養液からリフアマィシンＳを回収するには、培養
液のま）又は炉遇して抽出できる。リフアマィシンＳ含
有培養液の温度を５〜４０午０好まし〈は１０〜２００
０、ｐＨ７．０〜７．５に調整し、有機溶媒例えば酢酸
エチル、酢酸ブチル等の有機脂肪酸ェステル類、ｎ−ブ
タノール、アミルアルコール等のアルコール類、ベンゼ
ン、トルェン等の芳香族炭化水素類、クロロホルム、ジ
クロロメタン等で抽出できる。抽出有機溶媒量は培養液
の０．１〜５倍量で１回又は数回抽出する。この様にし
て得られた有機溶媒層は、そのま入又はｐＨ７．０燐酸
バッハで洗液して脱水後、減圧濃縮して結晶化する。結
晶の純度が低い場合には適当な有機溶媒を用いて分画沈
澱を行ない更に精製することができる。

例えば、濃縮液にｎ−へキサンを添加してリフアマィシ
ンＳを沈澱させる方法及び粗結晶をエチルアルコール又
はプロピルアルコール等に加温溶解後、除々に冷却して
再結する方法等が使用できる。吸着剤を用いて精製する
場合には、吸着剤に有効成分を吸着させた後、適宜の溶
媒を用いて脱着させる。吸着剤としては例えばシリカゲ
ル、アルミナ等が用いられる。溶媒は吸着剤の種類によ
って異なるが、例えばシリカゲルのカラムクロマトの場
合にはクロロホルム、メタノール混液を使用する。薄層
クロマトグラフィーの場合は展開後、活性帯から抽出す
る。以下実施例をもって本発明を更に具体的に詳述する
。

但し本発明は決してこれに限定されるものではない。実
施例 １ ２，２５び／の‘の力価のりフアマィシンＳＶを含有す
る培養液を水酸化ナトリウムでｐＨ７．３に調整した。

同液を使用して各種処理法を試験した。処理中は培養液
をよく縄拝しながら温度２８ｑｏ、ｐＨ７．３に保持し
た。薬剤添加の場合は添加後１時間保持した。各培養処
理液につき培養液処理効果テスト法を実施した。次に処
理した培養液を２８℃、ｐＨ７．５に保持、櫨拝しなが
ら下部よりノズルで空気をＩｖｖｍ、５時間通気した。
第１表にその結果を示す。培養液処理効果テストでリフ
アマイシンＳ残存率５０％以上の処理法（培養液処理を
実施したと定義）は「すべて収率よくリフアマィシンＳ
が培養液中に生成された。第１表 実施例 ２ １，９８の／机上の力価のＩＪフアマィシンＳＶを含有
する培養液を硫酸でｐＨ６．５に調整した。

燈拝しながら同液２０夕に３０％過酸化水素溶液４０の
‘添加後、２５ｑ０、ｐＨ７．０の条件で１時間酸化剤
処理した。この処理液を用い培養液処理効果テスト法を
実施した結果、リフアマィシンＳ残存率は６８％であっ
た。又処理培養液中のりフアマイシンＳＶは１，５７の
／似、リフアマイシンＳは３１の／仇【であった。この
培養液１そを欄拝しながら下部よりノズルで空気又は酸
素及び酸素混合空気を通気しつつ３０ｏｏ、ｐＨ７．５
に保持した。培養液中のりフアマィシンＳＶ及びリフア
マィシンＳを１時間毎に測定してリフアマイシンＳＶが
２の／私以下となり、リファマィシンＳが最高濃度に達
した時点で通気を停止した。通気条件とＩＪフアマィシ
ンＳ生成量を第２表に示す。第２表 実施例 ３ ２，５０の仇‘の力価のＩＪフアマィシンＳＶを含有す
る培養液２０そを水酸化ナトリウムでｐＨ７．５に調整
した。

この液を鷹拝しながら除々に加溢して７０℃で１０分間
ｐＨ７．５で保持し温度処理した。直ちに３０ｑｏに冷
却した。同液を用いて培養液処理効果テスト法を実施し
た結果、リフアマィシンＳ残存率は８２％であった。又
培養処理液のりフアマィシンＳＶは２，４５の／桝【で
あった。同液を３０℃、ｐＨ７．５に保持しながら下部
よりノズルで５０％酸素含有空気をＩＷｍ、２時間通気
すると培養液中のりフアマィシンＳＶは５０ｙ／の‘以
下、リフアマイシンＳは２，３０の′のＺとなったので
通気を停止した。

同液を水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整し２０その
トルェンを加えて、リフアマィシンＳを抽出した。分離
した水層を再び２０そのトルェンで抽出した。抽出液を
合わし、４０そのｐＨ７．館岡整水で１回水洗し「脱水
「濃縮乾洞すると純度７１％のりフアマィシンＳ粗物質
６１夕が得られた。これにインプロピルアルコール１〆
を加え、６０ｑＣ加温溶解後、燈拝しながら除々に冷却
すると純度９５％のＩＪフアマィシンＳ粗結晶３７夕が
得られた。粗結晶１０９を用いてシリカゲルカラムクロ
マトを行ない、純度９９．１％のｌｊフアマィシンＳの
燈黄色結晶８．５夕が得られた。

この結晶の元素分析値、比旋光度、紫外部及び可視部吸
収スペクトル、赤外線吸収スペクトル等を測定したとこ
ろ公知のリファマィシンＳと一致することが認められた
。実施例 ４ リフアマィシンＳＶを含有する培養液を炉遇して「１，
５８の′似の力価のＩＪフアマィシンＳＶを含有する炉
液２０夕を水酸化ナトリウムでｐＨ７．３に調整した。

この液を磯拝しながら３０ｏｏ、ｐＨ６．８の条件で、
下部より多孔管でオゾンｌｐｐｍ含有空気をＩｖｖｍ、
１０分間通気してガス処理を実施した。同液を用い培養
液処理効果テスト法を実施した結果、リフアマィシンＳ
残存率は９８％であった。次に、通気ガスを空気に変更
して更に２時間通気した培養炉液中のりフアマィシンＳ
Ｖは３妙ｐｍ以下、リフアマイシンＳは１，４５のｐｍ
となったので通気を停止した。ガス処理を実施せず同条
件で空気を２時間通気した炉液中のりフアマイシンＳＶ
は１２５ゆｐｍリフアマィシンＳは３１岬ｐｍであった
。

同液を用いて培養処理効果テストを実施した結果、リフ
アマイシンＳ残存率は１８％であった。次に、ガス処理
を実施し通気したりフアマィシンＳＩ，４５０′の‘含
有炉液１そを硫酸でｐＨ６．５に調整して、１その酢酸
ブチルでリファマィシンＳを抽出した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ リフアマイシンＳＶ含有培養液からリフアマイシン
   を抽出する方法において、培養液を物理的処理およびま
   たは化学的処理を施すとともに通気することによりリフ
   アマイシンＳＶをリフアマイシンＳに変換して、これを
   抽出分離することを特徴とするリフアマイシンＳの製法
   。 ２ 物理的処理が、温度、ｐＨおよび浸透圧からなる培
   養液の物理的性質の１種または２種以上を調節すること
   である特許請求の範囲第１項記載のリフアマイシンＳの
   製法。 ３ 化学的処理が、抗生物質、重金属塩、界面活性剤、
   酸化剤および殺菌性薬剤並びに殺菌性ガスからなる群か
   ら選ばれる処理物質の１種または２種以上で培養液を処
   理することである特許請求の範囲第１項記載のリフアマ
   イシンＳの製法。 ４ 通気が、空気、酸素および酸素混合空気からなる群
   から選ばれるガスを通気することである特許請求の範囲
   第１項記載のリフアマイシンＳの製法。