JPS6028989A - ブレオマイシンの蛋白またはポリペプチド結合体の新規製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプレオマイシンの蛋白又はポリペプチド結合体
の製法に関する。プレオマイシンは１９６６年本発明者
の一人である梅沢らにより発見された制癌性抗生物質で
（梅沢ら：ジャーナル・オプ・アンチピオチクス、２０
０頁、１９６６年）放線菌ストレプトミセス・バーチシ
ラスによシ生産される１原子の２価の銅を容易にキレー
トする塩基性水溶性糖ペプチドで、通常の培養法では１
６種の含銅体が生産され、単離されている。（例えば、
梅沢ら：ジャーナルＯオプーアンチビオチクスＺ９Ａ、
２１０ｉ１９６６年）。これらプレオマイシンのうち、
Ａ１、　Ａ２．　Ａ５．　Ｂ２．デメチルＡ２等は、そ
の混合物の脱銅体（以下「プレオマイシン・コンフレッ
クス」という。）が現在すでに癌治療の臨床面で広く使
用されており、とくに偏平上皮癌を中心に、食潰ｊ」臼
珪ヨｂ、−皮膚癌、頭頚部癌、肺癌、悪性リンパ腫など
の優れた成績をあげている。

また、米国特許第３９２２２６２号及び米国特許第Ｒｅ
　３０４５１号には種々のプレオマイシン類が開示され
ている。

本発明者らはプレオマイシン類およびその誘導体のラジ
オイムノアッセイ（以下ＲＩＡ）及びエンザイ詣イムノ
アッセイ（以下ＥＩＡ）の必要から、プレオマイシンを
蛋白質またはポリペプチドと結合する方法を検討した。

プレオマイシン類を蛋白質と結合させた例は過去３°例
−文献に見出される。Ａ、　ＢｒｏｕＬｏｎ及びＪ、　
Ｅ、　Ｓｔｒｏｎｇ　は脱銅プレオマイシン・コンプレ
ックスを牛血清アルブミン（以下ＢＳＡ）をリン酸緩衝
液中で水溶性カルボジイミドを用いて反応させプレオマ
イシン−ＢＳＡ結合体を得て、これをプレオマイシンの
ＲＩＡに用いている（　ｃａｎｓｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ
３６　１４１９〜１４２，１．１９７６年）。

またに、　Ｆｕｊｉｗａｒａ、　Ｍ、　Ｙａｓｕｎｏ、
　Ｋ、　ＫｉｔａｇａｗａらはＧＭＢＳ（Ｎ　−γ　−
（ｍａｌｅｉｍｉｄｏ−ｂｕｔｌｏｘｙ）　−ｓｕｃｃ
ｉｎｉ−ｍｉｄｅ　）でペプロマイシンをアシル化し、
マレイミド基を導入し、これをＳ　Ｈ基を導入したＢＳ
Ａと反応させ、ペプロマイシン−ＢＳＡ結合体を合成し
ている。また同時にＭＢ　Ｓ　（Ｎ−ｍ　−（ｍａｌｅ
ｉｍｉ−ｄｏｂｅｎｚｏｙｌｏｘｙ　ｓｕｃｃｉｎｉｍ
ｉｄｅ）で脱銅ペプロマイシンをアシル化することによ
り、マレイミド基を導入し、これを、β−ガラクトシダ
ーゼのＳＨ基と反応させることにより、ペプロマイシン
−β−ガラクトシダーゼ結合体を合成している。

（Ｃａｎｓｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４１　４１２１−
４１２６　。

１９８１年） しかしながら上記のいずれの方法で作られたプレオマイ
シン（またはその誘導体）−蛋白の結合体はプレオマイ
シン類のもつ生物活性をもつことは記載されておらず、
脱銅体をアシル化するか、アミド結合を生成する反応条
件にさらしているので、当然得られた結合体は、プレオ
マイシンの活性発現に必須であるジアミノプロピオン酸
アミド部分の一級アミノ基が結合反応に使われプレオマ
イシンの生物活性を失っていると考えられる。

また、上記結合方法で得られた結合体はプレオマイシン
、ペプロマイシンの末端アミン部分が遊離であるので、
これらを用いて作られた抗血清はプレオマイシン、ペプ
ロマイシンの末端アミンをも認識し、両者を区別すると
考えられる。したがって、上記方法ではプレオマイシン
、ペプロマイシンの夫々について、別の抗血清を調製し
なければならないと考えられるｄそこで本発明者らプレ
オマイシンの活性を保持し、かつ種々のプレオマイシン
類を認識する抗血清を作りうるプレオマイシンの蛋白ま
たはペプチド結合体の農法について種々検討した結果、
末端に遊離−級又は二級アミノ基を有するプレオマイシ
ン誘導体の活性部位を銅錯体として保護したのち、末端
アミン基にカルボン酸又はその反応性誘導体を有する基
を導入して得られるプレオマイシンを蛋白またはペプチ
ドと縮合させることにより、プレオマイシン−蛋白捷た
はペプチド結合体が得られることを見い出した。

即ち本発明は下記一般式〔Ｉ〕 （ＢＸ：）−ＮＨ−Ａ−ＮＲ２−ｏ（ＣＨ２ＣＯＹ）、
ＣＩ’：］〔式中［ＢＸ］は次式 で表わせる（含銅体の場合はキレート銅を省略）プレオ
マイシン酸のカルボキシル基から水酸基を除いた残基を
示し、Ａはアミノ基をつなぐ結合鎖を示し、低級アルキ
レン、又はＮ原子を介して結合したアルキレン、たとえ
ば （ｍ、及びｍ′は２〜６好ましくは、３または４の整数
）を示し、Ｒは水素、又はアルキル基、又はフェニルで
置換されたアルキル基、例えば−〇Ｈｓ、（ＣＨ２）３
ｃＨ３，−ＣＨ（ＣＨｓ）＠を示し、ｎは１又は２であ
り、Ｙはカルボキシル基又はその反応性誘導体を示す。

〕で表わされる新規プレオマイシン誘導体に蛋白または
ポリペプチドを結合させることを特徴とするプレオマイ
シン類の蛋白またはポリペプチド結合体の製造に関する
ものである。

本発明で得られるプレオマイシンの蛋白又はポリペプチ
ド結合体は反応の方法又は蛋白の種類などにより、蛋白
１分子に対して、結合するプレオマイシンの数は種々異
なるが、一般的には１〜数十個の範囲である。本発明で
使用される一般式〔■〕のプレオマイシン誘導体は含銅
体および脱銅体のいずれでも使用できる。

上記の一般式〔Ｉ〕のプレオマイシン誘導体と蛋白又は
ポリペプチドとの縮合は、通常ペプチドの縮合に使用さ
れる方法が使用でき、例えばＹがカルボキシル基である
場合には、通常使用される縮合剤の存在下に蛋白または
ポリペプチドを縮合するか、または、Ｙが反応性誘導体
のときはそのまま、必要ならば縮合剤を加えて、蛋白筒
たはポリペプチドと縮合させればよい。

上記一般式〔■〕で表わされる化合物のうち、製造上の
容易なことから好ましいものとしてはＡが−（ＣＨ２）
３−、−（ＣＨ２）３−ＮＣＨ３（ＣＨ２）３　。

−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）３−２（ＣＨ２）３
　ＮＨ（ＣＨ４）４−２Ｒが水素−又は、１−フェニル
エチルである化合物があげられる。上記一般式〔Ｉ〕に
おけるＹで示されるカルボキシル基の反応性誘導体は、
蛋白またはポリペプチドのアミノ基と反応しウルもので
あれば特に制限はないが、通常ペプチド結合の形成に使
用される活性エステル誘導体が使用される。

な 一般式ＣＩ）の化合物のうち代表的ゆものとしては第−
表の化合物が挙げられる。なお表中ＸはＹからカルボニ
ルを除いた基を示す。

表　１ 化合物 番号　Ａ　Ｒｎ　Ｘ 、７Ｈ３ （ＣＨ２）３−Ｎ−（ＣＨ，）、−Ｈｌ　−ＯＮ＜神上
記一般式〔ｌ〕で示される化合物は次のように製造する
ことが出来る。

一般式ＣＩＩＩ ［ＢＸ　〕−〕ＮＩ−１−Ａ−ＮＨ−Ｒ［ｆＤ〔式中［
ＢＸ］、Ａ、Ｒは前記に同じ。〕で示されルフレオマイ
シン誘導体に、カルボニル化合物として、０ＨＣ−Ｃｏ
ｏｎ又はその塩を還元的に縮合することにょシ、前記一
般式（ＤにおいてＹがカルボキシル基である化合物を得
ることが出来る。

縮合に用いる還元剤としては、シアノ水素化ホウ素ナー
トリウムなどの水素化ホウ素化合物などがあげられる。

またパラジウム炭素など）触媒をもちいて接触還元をお
こなっても′よい。カルボニル化合物は、ＲがＨの場合
、１〜１．５モルを用いれば主としてｎ　＝　１の誘導
体、３モル以上用いればロー２の誘導体が主として得ら
れる。ＲがＨ以外の場合は、１モル以上用いれば良い。

反応は溶媒として、メタノール、水、ジメチルホルムア
ミド、アセトニトリル、それらの混合液が用いられる。

又、これらに、例えば酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、
リン酸ナトリウムなどの塩及び、酢酸を単独に、又は適
当な割合で混合して用いても良い。

温度は、０〜５０℃が良い。

以上のようにして得られた誘導体を単離するには、水素
化ホウ素化合物を用いた場合には、塩酸で反応液のｐ）
ｌを１に合わせ室温で５〜１゜分攪拌し過剰の還元剤を
分解したのち中和し、メタノールを減圧で溜去した後、
過剰のアルデヒド、ケトンをエーテル又はブタノールで
抽出除去し、続いて次の脱塩操作を行なった。即ち吸着
樹脂たとえばアルバーライ）’ＸＡＤ−２（ローム・ア
ンド・ハース社製）を蒸留水を用いて充填したカラムに
注入して、目的物を吸着する。蒸留水で塩類を洗い流し
た後、酸性の含水メタノール、たとえば１１５０規定塩
酸水溶液−メタノール（１：　４　Ｖ／Ｖ　）で溶出し
、青色のプレオマイシン誘導体の分画を集め必要なら■ げ、陰イオン交換樹脂、ダウエックス４４（ＯＨ型；ザ
・ダウ・ケミカル社製）で中和したのち減圧下で濃縮し
て凍結乾燥すると、誘導体の青色粗粉末がえられる。

さらに純度をあげるためつぎの操作を行なう。

上記の粉末を蒸留水に溶解し、あらかじめｐＨ６，８，
１／２０リン酸−リン酸ナトリウム緩衝液■ で平衡化したＣＭセファデックスＣ−２５（Ｎａ＋型：
ファルマシア、ファインケミカル社製）を充填したカラ
ムに注入し吸着する。上記の緩衝液に連続的に塩化ナト
リウムを加えることによシナトーリウム濃度を１．０モ
ルまで徐々に上昇させる直線濃度勾配法によシ溶出する
。Ｙがカルボキシル基の場合は、このクロマトグラフィ
ーで、ｎ　＝　２の誘導体が最も速く、ついで０＝１の
誘導体が溶出し、未１反応の原料が最後に溶出する性質
があるので、紫外線吸収モニターを用いることにより分
離することが可能である。

もし目的物の分画に不純物の混入が認められれば、上記
クロマトグラフィーを再度行なうか、１）Ｈ６，８の緩
衝液のかわシにｐＨ４，５のｌ／２０モル酢酸−酢酸ナ
トリウム緩衝液を用いて、クロマトグラフィーを再度行
ない、完全除去をはかればよい。

このようにして得られる目的物の分画を、先■ に用いたアンバーライ）ＸＡＤ−２脱塩法で脱塩したの
ち、凍結乾燥すると、プレオマイシン誘導体の含銅体が
青色の無定形粉末で得られる。

以上に説明した方法によシ製造されるプレオマイシン誘
導体を６規定塩酸水中で、１０５℃、２０時間加水分解
Ｋかけると、ＢＬＭ類に共通する分解生成物、Ｃ’Ｌ−
トレオニン、β−アミノ−β−（４−アミノ−６−カル
ボキシ−５−メチル−ピリミジン−２−イル）プロピオ
ン酸、４−アミノ−３−オキシ−２−メチル−〇−ペン
タン酸、β−オキシ−Ｌ−ヒスチジン、β−アミノ−Ｌ
−アラニン、２’　−（２−アミノエチル）〜２．４′
−ピチアゾールー４−カルボン酸〕及び一般式（ＩＩ）
の原料プレオマイシンに対応したカルボキシル基を含む
一般弐圃で表わされるアミン ＮＲ２−Ａ−ＮＲ２，−ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＨ）。　ｌ］
ｌｌ：］〔式中Ａ、Ｒは前記に同じ。〕 が検出された。又アンバーリスト■１５を用いたメタツ
リシスでは、プレオマイシンと同じＬ−グロース、３−
０−カルバモイル−Ｄ−マンノースのメチルグリコシド
がガスクロマトグラフィーで検出された。

以上の事実−は本発明の方法によって製造されたプレオ
マイシン誘導体が前記式〔ＩＪで表わされる化学構造を
有することを裏づけでいる。

また、一般式〔ＩＪにおいてＹがカルボキシル基の反応
性誘導体である化合物は例えば次の様にして製造するこ
とが出来る。

一般式〔■〕においてＹがカルボキシル基である化合物
と一般式瀾 ＨＸ　囚 〔式中Ｘは前記に同じ〕で示される化合物を縮合剤で縮
合することによシ製造できる。

縮合剤としては、ジシクロへキシルカルボジイミド、１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド、ｌ−シクロへキシル−３−（２−モルホリノ
エチル）カルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミ
ド、ジフェニルホスホルアジディ）　（ＤＰＰＡ）、ジ
エチルホスホロシアニブイト（ＤＥＰＣ）などがあげら
れる。

一般式眼〕で示される化合物としては、ｐ−ニトロフェ
ノール、０．ｐ−ジニトロフェノール、ペンタクロロフ
ェノール、２．４．５−）　ＩＪりｏ。

フェノール、ペンタフルオロフェノール、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン
−２，３−ジカルボキシイミド等があげられる。

との縮合に用いられる溶媒は、反応に影響をあたえな、
いものであれば何でも良いが、通常一般式〔■〕及び囚
で示される原料化合物を溶解する極性溶媒がよく、水、
ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセト
ニトリル、それらの混合溶媒である。一般式〔■〕の化
合物に対して、一般式囚の化合物及び縮合剤の割合は０
．５〜２０当量、好ましくは１〜１０当量である。

このようＫして得られた縮合物が望む活性エステルであ
ることは、ＩＲ吸収スペクトルで１７８０．１７４０ｃ
ｍ　付近に吸収帯を示すこと後にのべるように蛋白と結
合物を作ること、冷アルカリ水で加水分解すると容易に
もとのカルボキシル基をもつ化合物にもどることがら明
らかである。

このようにして得られた一般式〔ＩＪの化合物は、Ｙが
功ルボキシル基の反応性誘導体である場合には、単に中
性又は微アルカリ性の緩衝液中で蛋白又はポリペプチド
と反応させることにより、Ｙがカルボキシル基である化
合物の場合には、通常使用しうる縮合剤たとえば前記縮
合剤、好ましくは１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を用いて、蛋白又は
ポリペプチドと反応させることによシブレオマイシン−
蛋白又はポリペプチド結合体を得ることができる。反応
温度は通常−５°〜６０℃この捷しくは００〜３０℃で
ある。

本発明において蛋白又はポリペプチドと一般式ＣＩＯ］
の化合物の割合は、特に制限はないが、通常蛋白又はポ
リペプチドに対して一般式ＣＤの化合物を過剰に用いる
のが好ましく、一般式０．１］の化合物の量を多くする
ことにより蛋白又はポリペプチドに結合するプレオマイ
シンの量を多くすることが出来る。上記の蛋白又はポリ
ペプチドとし、ては、アルブミン、グロブリン、酵素、
及びポリリジンなどが挙げられる。上記反応液から目的
物であるプレオマイシン−蛋白又はポリペプチド結合体
を単離するには、通常蛋白又はポリペプチドの精製に用
いられる方法、たとえばゲル濾過、限外濾過、塩析、透
析等の方法がすべて用いられる。

一例をあげると、上記活性エステル（含銅体）を用いて
調製したプレオマイシン−ＢＳＡ結合体は、反応液を必
要なら限外濾過して濃縮しｐＨ７，５のリン酸緩衝液で
平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ＠Ｇ５０のカラムに注入し
て、クロマトグラフィーを行なうと、青色の２つの分画
に分れる。先に溶出される分子量の大きい青色物質が目
的物（含銅体）であり、後から溶出する青色分画には、
原料の活性エステル及びその加水分解物が含１れる。目
的分画を水に対して透析したのち凍結乾燥するとプレオ
マイシン−ＢＳＡ結合体（含銅体）が青色粉末として得
られる。このものはＥＩＡ、ＲＩＡに用いる抗血清を作
成するための免疫用抗原として有用である。

生成物の構造はゲルクロマトグラフィーにおいて目的物
の分子量範囲にあること、プレオマイシン−銅錯体に由
来する青色を示すこと、６Ｎ塩酸１１０℃、１８時間の
加水分解により蛋白又はポリペプチド由来の通常アミノ
酸と同時にプレオマイシン由来の上記の特異アミノ酸テ
するβ−ヒドロキシヒスチジン等が検出されることから
、蛋白又はポリペプチド及びプレオマイシンの側構造を
持っていることが確かめられる。

さらに驚くべきことに本物質、例えば、３−（＋Ｓ）　
−１−フェニルエチルアミノ）プロピルアミノプレオマ
イシン−ＢＳＡ結合体（含銅体）はＨｅ　Ｌａ　８３細
胞の増殖を阻害した。そのＩ　Ｄ、Ｏ値は５７μｇ／ｍ
＋であった。この事実は、蛋白部分に癌に特異性をもつ
キャリヤーを選んでやれば、プレオマイシンを選択的に
癌組織に運び、癌細胞をたたくことが出来ると考えられ
る。

また一般式〔Ｉ〕の化合物のうち活性エステルであるも
のは、中性かつ室温以下という緩和な条件で蛋白と結合
出来るので、蛋白として酵素を用いた場合に酵素活性の
消失も少ないため、この方法で調製されたプレオマイシ
ン−酵素結合体は、ＥＩＡにおける標識抗原として使用
出来る。結合させる酵素は活性に関与しないアミノ基を
有するものであれば良く、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ゲルコ
ールオキシダーゼ、リゾチームなどがある。

次に本発明を実施例によシ具体的に説明する。

実施例 １）一般式〔■〕で表わされる化合物の合成イ）３−（
（Ｓ）−１−フェニルエチルアミノ）プロピルアミノプ
レオマイシン２塩酸塩（含銅体）　５００１Ｑを５’Ｏ
ｄのメタノールに溶解しグリオキシル酸ナトリウム・水
和物６６Ｉｎｇを添加し、ついで２０ダのシアン水素化
ホウ素ナトリウムを添加した。４０℃、２０時間反応し
た後、６規定塩酸水溶液で反応液のｐＨを１．０に下げ
、１０分間放置して反応を止めた。

１規定水酸化ナトリウムで中和したのち、減圧下でメタ
ノールを溶去し、残渣に蒸留水を加えて一１０ｍとした
。これをあらかじめｐＨ６，８，１／２０モルリン酸緩
衝液で平衡化した■ ０Ｍセフ７デツクスｃ−２５（Ｎａ＋型：ファルマシア
、ファインケミカル社製）を充填したカラム（１００ｄ
容）に注入し吸着した。

上記の緩衝液に連続的に塩化ナトリウムを加えることに
よりナトリウム濃度を１．０モルまで徐々に上昇させる
直線濃度勾配法によシ溶出し０．１〜０，１５モル前後
で溶出する青色の分画５０ｍ１を集め、予め蒸留水で充
填したア■ ンバーライト　ＸＡＤ　−２（ローム・アンド・ハース
社製）のカラムに（１００ｍｌ容）に注入して、目的物
を吸着した。蒸留水１５０ｍＪでカラムをあらった後、
１１５０Ｍ塩酸水溶液−メタノール（１：　４　ｖ／ｖ
　）で溶出した。

青色の分画を集め、陰イオン交換樹脂、ダウ■ エックス　４４（ＯＨ型：ザ・ダウ・ケミカル社製）で
中和したのち、減圧下で濃縮して凍結乾燥することによ
り化合物番号１の化合物の青色粉末２７０■を得た。

本島の融点、は２１０〜２１２℃（分解）で、蒸留水で
測定した紫外吸収極太は２９２ｍμ。

Ｅ１％／１ｃｒｎは１１８．７であった。臭化カリ錠剤
法で測定した赤外吸収極大波数（ｄｌ）は３４００．１
７２０．１６４０，１５５０，１４６０゜１３７０，１
３３０，１１３０，１，１００，１０６０゜１０１０．
９８０．９２０．７６０であった。

その他の理化学的性状は第２表に示した通シである。

口）３−（：、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−アミノプロピル
）アミノコプロピルアミノプレオマイシン３塩酸塩（含
銅体）１１を１００ｍ１の０．ＩＮＮ酢酸カリメンノー
ル溶液０．ＩＮ酢酸メタノール溶液（２：　１　ｖ／ｖ
　）に溶解し、グリオキシル酸５７Ｉｎ９を添加し、つ
いで２６〜のシアン水素化ホウ素ナトリウムを添加した
。

４０℃２４時間反応した後、６規定塩酸水溶液で反応液
のｐＨを１．０に下げ、１ｏ分間放置して反応を止めた
。ｌ規定水酸化ナトリウムで中和したのち、減圧下でメ
タノールを溶去し、°残−渣に蒸留水を加えて２０ｄと
した。これをあらかじめｐＨ６，８，１／ｊＯモルリン
］１衝液で平衡化したＣＭ七フ・デ・り、＄）ｃ−２ｓ
　（Ｎａ＋Ｗ　：ファルマシア、ファインクミカル社製
）を充填したカラム（１００ｍＡ！容）に注入し吸着し
た。上記の緩衝液に連続的に塩化ナトリウムを加えるこ
とによりナトリウム濃度を１．０モルまで徐々に上昇さ
せる直線濃度勾配法によシ溶出し０．３モル前後で溶出
する青色の分画１２０　ｍｌを集め、予め蒸留水■ で充填したアンバーライト　ＸＡＤ−２（ローム拳アン
ド・ハース社製）のカラム（１００ｍｌ容）に注入して
、目的物を吸着した。蒸留水１５０ｍ／！でカラムをあ
らった後、１１５０Ｍ塩酸水溶液−メタノール（１：　
４　ｖ／ｖ　）で溶出した。青色の分画を集め、陰イオ
ン交換樹■ 脂、ダウエンクス４４（ＯＨ型；ザ・ダウ・ケミカル社
製）で中和したのち、減圧下で濃縮して凍結乾燥するこ
とによシ化合物先５の化合物の青色粉末６３０ｍｇを得
た。

水晶の融点は２０７℃（分解）で、蒸留水で測定した紫
外吸収極太は２９２ｍμ、Ｅ１％／１ｃｒｎは１００で
あった。臭化カリ錠剤法で測定した赤外吸収極太波数（
ｃｔｎ）は３４００゜１４００．１３８０，１３３０．
１１４０．１１００゜１０７０．１０２０，９９０，９
３０であった。

その他の理化学的性状は第２表に示した通シである。

上記の反応で３−〔Ｎ−メチル−Ｎ−（３−アミノプロ
ピル）アミノコプロピルアミノプレオマイシン３塩酸塩
（含銅体）１１グリオキシル酸１４０■、シアノ水素化
ホウ素ナトリウム５２ダを用いた結果、５１０１ｎ９の
化合物Ｎ１１６の化合物（表１）が得られた。

水晶の融点は２０２〜２０４℃（分解）、蒸留水で測定
した紫外吸収極大は２９２ｍμ、Ｅ１％／ＩＣｒｎは１
０７．３であった。臭化カリ錠剤法で測定した赤外吸収
極大波数（σ）は３４３０．２９５０．１７２０．１６
４０．１５５０゜１４６０．１３９０，１３７０．１３
２０．１２５０゜１０９０．１１３０，１０５０．１０
１０．９９０であった。

その他の理化学的性状は第２表に示した通シである。

表　２ 番　号　Ｒｆ値＊１　１とする）＊２ １　０．１８　０．８１ ５　．０．５８　０．８８ ６　０．５７　０．８５ ＊１ニジリカゲル６０Ｆ２５４’、シラナイ■ ズド（メルク社）、２０％酢酸アン モンーメタノール（７５：　２５　ｖ／ｖ％）＊２：ア
ビセルＳＦ’■（ＦＭＣ社）、ギ酸−酢酸一水（２４：
　７５二９００　ｖ／ｖ％）８００■、１５分 ・・）イ）で得られた化合物ＮＱｌの化合物５０ｍｇを
１　ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、Ｎ　−ヒド
ロキシゴハク酸イミド３６〜を添加し、ついでジシクロ
へキシルカルボジイミド３１七トンで洗った後乾燥し、
水に溶解、不溶物をろ側抜、ろ液を凍結乾燥することに
より、化合物１１＆ｘ２の化合物（表１）の青色粉末４
６〜を得た。臭化カリ錠剤法で測定した本品の赤外吸収
極太波数（ｃｒｎ）は３４００，２９５０゜１８２０、
．１７８０，１７３０，１６４０，１５５０゜１４６０
．１３７０．１２４０，１２１０，１１００゜１０６０
．１０１０．９２０，８８０．８１０であった。

その他の理化学的性状は第３表に示した通シである。

上記の方法でＮ−ヒドロキシコノ・り酸イミドのかわり
に、ｐ−ニトロフェノール又はＮ−ヒドロキシ５−ノル
ボルネン−２，３−ジカルボキシイミドを用いて反応す
ることによシ、夫々化合物Ｎ３の化合物、化合物ｒｌｈ
４の化合物を合成した。

これらの理化学的性状は第３表に示した通りである。

二）口）で得られた化合物Ｎ５の化合物３０ｍ９を１　
ｍｌのジメチルホルムアミドと０．０５ａｌｌ！の蒸留
水の混合液に溶解し、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネ
ン−２，３−ジカルボキシイミド３３ｍｇを添加し、つ
いでジシクロへキシルカルボジイミド１９〜を添加した
。室温１５時間攪拌し反応した後、２０ｍ１ｌのアセト
ンを加え生じた沈澱を濾取した。沈澱をアセトンで洗っ
た後乾燥し、水罠溶解、不溶物をろ側抜ろ液を凍結乾燥
することにより化合物Ｎ９の化合物の青色粉末３０ｍｆ
Ｉを得た。臭化カリ錠剤法で測定した本品の赤外吸収極
太波数（Ｃｒｎ）は３４３０．２９５０．．１７８０．
１７４０．１７２０゜１６５０、　１５８０．　１５６
０．　１４６０．　１３８０゜１３２０、　１２４０．
　１１４０．　１１００．　１０６０゜１０１０、であ
った。

その他の理化学的性状は第３表に示した通シある。

上記の方法で、Ｎ−ヒドロキシ５−ノルボルネン−２，
３−ジカルボキシイミドのかわりに、Ｎ−ヒドロキシコ
ハク酸イミドを用いて反応することによシ、化合物Ｎ７
の化合物を合成した。

これらの理化学的性状は第３表に示した通シである。

又、さらに、上記の方法において、化合物翫５の化合物
のかわりに化合物Ｎ６の化合物を用いて、Ｎ−ヒドロキ
シコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシ５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミドの夫々と反応させることに
より夫々化合物１４８　、１０の化合物を得た。

これらの理化学的性状は第３表に示した通シである。

表　３ ２、’　０．４６ ３　０．１５ ４　０、．４５ ７　０．８９ ８　０．８６ ９　０．８２ １０　０．８１ ＊１ニジリカゲル６（ｌＦ２５４．シラナイズド（メル
ク社）、２０係酢酸アンモ ンーメタノール（５０：　５０　ｖ／ｖ％）但し、化合
物６）では（）内に２０係 酢酸アンモンーメタノール（７０： ３０　ｖ／ｖ％）での値を示す。

２）ブレオマイシンと蛋白結合体の合成イ）牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）５３ｍ９を２．５　ｒｎｌの０．０５
Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し前記１）−口
）で得た化合物２を１９８ｒｎｇ（プレオマイシン／Ｂ
ＳＡモル比＝１：１７５）添加した。室温−夜反応後、
あらかじめ上記の緩衝液で平衡化した１５０ｍ１容のセ
ファデックス”Ｇ＝５０を充填したカラムに注入し、同
じ緩衝液でクロマトグラフィーを行ない、溶出液を２．
５　ｍｌづつ分画した。ブレオマイシン銅による青色バ
ンドが、分画１８〜２４と分画４８〜６５に夫々溶出さ
れた。分画１８〜２４は同時に蛋白に由来する２８０　
ｎｍの吸収を示したことから、結合体の生成が認められ
た。分画１８〜２４を水に対して一夜透析後凍結乾燥し
、４３ｍ９のプレオマイシン−ＢＡＡ結合体の青色粉末
を得た。

このものの２８０　ｎｍにおけるＥ１％／１ｃＴｎは２
３．９であった。ＢＳＡ、及びプレオマイシンの２８０
１ｍにおける夫々の８１％値、６６゜ＩＯ２，６を用い
て結合数を計算すると、Ｂ５Ａｌ分子当シブレオマイシ
ン８．４分子が結合していた。

又、Ｂ５Ａ３３■に対して、化合物２を３２〜（プレオ
マイシン／ＢＳＡモル比＝１　＋　２５）用いて反応を
行なわせ４０〜の結合体を得た。

このものの２８０　ｎｍにおけるＥ１％／　ｌ　Ｃ’Ｉ
ｎ　は１２．６１であシ、Ｂ５Ａｌ分子あたり、２．６
分子のプレオマイシンを結合していた。

口）２）−イ）と同様にして、Ｂ５Ａ２３ｍｇと化合物
９を２３ｍ９反応させ、精製した結果、２１〜の結合体
を得た。このものの２８０口ｍにおける８１％７１ｃｍ
は３３１を示し、イ）と同様な計算により、Ｂ５Ａｌ分
子あだ１１１５．１分子のプレオマイシンを結合してい
た。

特許出願人　日本化薬株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式 ％式％） 〔式中（ＢＸ）はプレオマイシン酸のカルボキシル基か
   ら水酸基を除いた残基を示し、Ａは結合鎖を、ＲはＨ又
   はアルキル又はフェニルで置換されたアルキルを、Ｙは
   カルボキシル基またはその反応性誘導体を示し、口は１
   または２である〕 で表わされるプレオマイシン誘導体と蛋白またはポリペ
   プチドを縮合させることを特徴とするプレオマイシンの
   蛋白またはポリペプチド結合体の製造方法
2. （２）一般式 ％式％） 〔式中〔ＢＸ〕はプレオマイシン酸のカルボキシル基か
   ら水酸基を除いた残基を示し、Ａは結合鎖を、Ｒは水素
   又はアルキル又はフェニルで置換されたアルキルを、Ｙ
   はカルボキシル基またはその反応性誘導体を示し、ｎは
   １または２である〕 で表わされるプレオマイシン誘導体及びその塩