JPH046716B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明はブレオマイシンの蛋白又はポリペプチ
ド結合体の合成に有用なブレオマイシン誘導体に
関する。 〔従来の技術〕 ブレオマイシンは1966年本発明者の一人である
梅沢らにより発見された制癌性抗生物質で、梅沢
ら：ジヤーナル・オブ・アンチビオチクス、200
頁、1966年）放線菌ストレプトミス・バーチシラ
スにより生産される１原子の２価の銅を容易にキ
レートする塩基性水溶性糖ペプチドで、通常の培
養法では16種の含銅体が生産され、単離されてい
る。（例えば、梅沢ら：ジヤーナル・オブ・アン
チビオチクス19A、210頁、1966年）。これらブレ
オマイシンのうち、A1，A2，A5，B2，デメチ
ルA2等は、その混合物の脱銅体（以下「ブレオ
マイシン・コンプレツクス」という。）が現在す
でに癌治療の臨床面で広く使用されており、とく
に偏平上皮癌を中心に、皮膚癌、頭頚部癌、肺
癌、悪性リンパ腫などの優れた成績をあげてい
る。 また、米国特許第3922262号及び米国特許第
Re30451号には種々のブレオマイシン類が開示さ
れている。 本発明者らはブレオマイシン類およびその誘導
体のラジオイムノアツセイ（以下RIA）及びエン
ザイムイムノアツセイ（以下EIA）の必要から、
ブレオマイシンを蛋白質またはポリペプチドと結
する方法を検討した。 ブレオマイシン類を蛋白質と結合させた例は過
去３例文献に見出される。A.Brouton及びJ.E.
Strongは脱銅ブレオマイシン・コンプレツクス
を牛血清アルブミン（以下BSA）をリン酸緩衝
液中で水溶性カルボジイミドを用いて反応させブ
レオマイシン−BSA結合体を得て、これをブレ
オマイシンのRIAに用いている（Canser
Research 36 1419〜1421.1976年）。またK.
Fujiwara，M.Yasuno，K.KitagawaらはGMBS
（Ｎ−γ−（maleimido−butloxy）−
Succinimide）でペプロマイシンをアシル化し、
マレイミド基を導入し、これをSH基を導入した
BSAと反応させ、ペプロマイシン−BSA結合体
を合成している。また同時にMBS（Ｎ−ｍ−
（male−imidobenzoyloxy succinimide）で脱銅
ペプロマイシンをアシル化することにより、マレ
イミド基を導入し、これを、β−ガラクトシダー
ゼのSH基と反応させることにより、ペプロマイ
シン−β−ガラクトシダーゼ結合体を合成してい
る。（Canser Research 41 4121−4126，1981
年） 〔発明が解決しようとする課題〕 しかしながら上記のいずれの方法で作られたブ
レオマイシン（またはその誘導体）−蛋白の結合
体はブレオマイシン類のもつ生物活性をもつこと
は記載されておらず、脱銅体をアシル化するか、
アミド結合を生成する反応条件にさらしているの
で、当然得れた結合体は、ブレオマイシンの活性
発現に必須であるジアミノプロピオン酸アミド部
分の一級アミノ基が結合反応に使われブレオマイ
シンの生物活性を失つていると考えられる。 また、上記結合方法で得られた結合体はブレオ
マイシン、ペプロマイシンの末端アミン部分が遊
離であるので、これらを用いて作られた抗血清は
ブレオマイシン、ペプロマイシンの末端アミンを
も認識し、両者を区別すると考えられる。したが
つて、上記方法ではブレオマイシン、ペプロマイ
シンの夫々について、別の抗血清を調製しなけれ
ばならないと考えられる。 〔課題を解決するための手段〕 そこで本発明者らブレオマイシンの活性を保持
し、かつ種々のブレオマイシン類を認識する抗血
清を作りうるブレオマイシンの蛋白またはペプチ
ド結合体の製法について種々検討した結果、末端
に遊離一級又は二級アミノ基を有するブレオマイ
シン誘導体の活性部位を銅錯体として保護したの
ち、末端アミノ基にカルボン酸又はその反応性誘
導体を有する基を導入して得られるブレオマイシ
ンを蛋白またはペプチドと縮合させることによ
り、ブレオマイシン−蛋白またはペプチド結合体
が得られることを見い出した。 即ち本発明はブレオマイシンの蛋白またはペプ
チド結合体の合成に有用な下記一般式〔〕 〔BX〕NH−Ａ−NR_2-o（CH₂Y）_o 〔〕 〔式中〔BX〕は次式 で表わせる（含銅体の場合はキレート銅を省略）
ブレオマイシン酸のカルボキシル基から水酸基を
除いた残基を示し、Ａはアミノ基をつなぐ低級ア
ルキレン、又はＮ原子を介して結合したアルキレ
ン、たとえば −（CH₂）_n−NCH₃−（CH₂）_n′−，−（CH₂）_n−
NH− （CH₂）_n′−，

【式】 （ｍ、及びm′は２〜６好ましくは、３または
４の整数）を示し、Ｒは水素、又はアルキル基、
又はフエニルで置換されたアルキル基、例えば −CH₃，−（CH₂）₃CH₃，

【式】を示し、ｎは１又は２ であり、Ｙは−COOH、

【式】（ここでR¹はニトロ基 ｍは１又は２の整数である）、

【式】（ここでR²はハロゲ ン、ｌは３又は４の整数である）、 を示す。〕で表わされる新規ブレオマイシン誘導
体に関するものである。 上記一般的〔〕で表わされる化合物のうち、
製造上の容易なことから好ましいものとしてはＡ
が−（CH₂）₃−，−（CH₂）₃−NCH₃−（CH₂）₃−， −（CH₂）₃−NH−（CH₂）₃−，−（CH₂）₃−NH−
（CH₂）₄−， Ｒが水素又は、−フエニルエチルである化合物
があげられる。上記一般式〔〕のＹにおける

【式】としては例えばｐ−ニ トロフエニルオキシカルボニル、ｏ，ｐ−ジニト
ロフエニルオキシカルボニルなどがあげられ、

【式】としては、例えばペン タクロロフエニルオキシカルボニル、２，４，５
−トリクロロフエニルオキシカルボニル、ペンタ
フルオロフエニルオキシカルボニルなどがあげら
れる。 一般式〔〕の化合物のうち代表的なものとし
ては第一表の化合物が挙げられる。なお表中Ｘは
Ｙからカルボニルを除いた基を示す。

【表】

【表】 上記一般式〔〕で示される化合物は次のよう
に製造することが出来る。 一般式〔〕 〔BX〕−NH−Ａ−NH−Ｒ 〔〕 〔式中〔BX〕，Ａ，Ｒは前記に同じ。〕で示さ
れるブレオマイシン誘導体に、カルボル化合物と
して、OHC−COOH又はその塩を還元的に縮合
することにより、前記一般式〔〕においてＹが
カルボキシル基である化合物を得ることが出来
る。 縮合に用いる還元剤としては、シアノ水素化ホ
ウ素ナトリウムなどの水素化ホウ素化合物などが
あげられる。またパラジウム炭素などの触媒をも
ちいて接触還元をおこなつてもよい。カルボニル
化合物は、ＲがＨの場合、１〜1.5モルを用いれ
ば主としてｎ＝１の誘導体、３モル以上用いれば
ｎ＝２の誘導体が主として得られる。ＲがＨ以外
の場合は、１モル以上用いれば良い。 反応は溶媒として、メタノール、水、ジメチル
ホルムアミド、アセトニトリル、それらの混合液
が用いられる。又、これらに、例えば酢酸ナトリ
ウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウムなどの塩
及び、酢酸を単独に、又は適当な割合で混合して
用いても良い。 温度は、０〜50℃が良い。 以上のようにして得られた誘導体を単離するに
は、水素化ホウ素化合物を用いた場合には、塩酸
で反応液のPHを１に合わせ室温で５〜10分撹拌し
過剰の還元剤を分解したのち中和し、メタノール
を減圧で溜去した後、過剰のアルデヒド、ケトン
をエーテル又はブタノールで抽出除去し、続いて
次の脱塩操作を行なつた。即ち吸着樹脂たとえば
アンバーライト XAD−２（ローム・アンド・ハ
ース社製）を蒸留水を用いて充填したカラムに注
入して、目的物を吸着する。蒸留水で塩類を洗い
流した後、酸性の含水メタノール、たとえば１／
50規定塩酸水溶液−メタノール（１：4v／ｖ）
で溶出し、青色のブレオマイシン誘導体の分画を
集め必要ならば、陰イオン交換樹脂、ダウエツク
ス 44（OH型；ザ・ダウ・ケミカル社製）で中
和したのち減圧下で濃縮して凍結乾燥すると、誘
導体の青色粗粉末がえられる。 さらに純度をあげるためつぎの操作を行なう。 上記の粉末を蒸留水に溶解し、あらかじめPH
6.8，１／20も10リン酸−リン酸ナトリウム緩衝
液で平衡化したCMセフアデツクス Ｃ−25（Na
＋型：フアルマシア、フアインケミカル社製）を
充填したカラムに注入し吸着する。上記の緩衝液
に連続的に塩化ナトリウムを加えることによりナ
トリウム濃度を1.0モルまで徐々に上昇させる直
線濃度勾配法により溶出する。Ｙがカルボキシル
基の場合は、このクロマトグラフイーで、ｎ＝２
の誘導体が最も速く、ついでｎ＝１の誘導体が溶
出し、末反応の原料が最後に溶出する性質がある
ので、紫外線吸収モニターをを用いることにより
分離することが可能である。もし目的物の分画が
不純物の混入が認められれば、上記クロマトグラ
フイーを再度行なうか、PH6.8の緩衝液のかわり
にPH4.5の１／20モル酢酸−酢酸ナトリリウム緩
衝液を用いてクロマトグラフイーを再度行ない、
完全除去をはかればよい。 このようにして得られる目的物の分画を、先に
用いたアンバーライト XAD−２脱塩法で脱塩
したのち、凍結乾燥すると、ブレオマイシン誘導
体の含銅体が青色の無定形粉末で得られる。 以上に説明した方法により製造されるブレオマ
イシン誘導体を６規定塩酸水中で、105℃、20時
間加水分解にかけると、BLM類に共通する分解
生成物〔Ｌ−トレオニン、β−アミノ−β−（４
−アミノ−６−カルボキシ−５−メチル−ピリミ
ジン−２−イル）プロピオン酸、４−アミノ−３
−オキシ−２−メチル−ｎ−ペンタン酸、β−オ
キシ−Ｌ−ヒスチジン、β−アミノ−Ｌ−アラニ
ン、2′−（２−アミノエチル）−２，4′−ビチアゾ
ール−４−カルボン酸〕及び一般式〔〕の原料
ブレオマイシンに対応したカルボキシル基を含む
一般式〔〕 で表わされるアミン NH₂−Ａ−NR_2-o（CH₂COOH）_o 〔〕 〔式中Ａ，Ｒは前記に同じ。〕 が検出された。又アンバーリスト 15を用いたメ
タノリシスでは、ブレオマイシンと同じＬ−グロ
ース、３−０−カルバモイル−Ｄ−マンノースの
メチルグリコシドがガスクロマトグラフイーで検
出された。 以上の事実は本発明の方法によつて製造された
ブレオマイシン誘導体が前記式〔〕で表わされ
る化学構造を有することを裏づけている。 また、一般式〔〕においてＹがカルボキシル
基以外の基である化合物は例えば次の様にして製
造することが出来る。 一般式〔〕においてＹがカルボキシル基であ
る化合物と一般式〔〕 HX 〔〕 〔式中Ｘは前記に同じ〕で示される化合物を縮
合剤で縮合することにより製造できる。 縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド、１−シクロヘキシル−
３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド、
ジイソプロピルカルボジイミド、ジフエニルホス
ホルアジデイト（DPPA）、ジエチルホスホロシ
アニデイト（DEPC）などがあげられる。 一般式〔〕で示される化合物としては、ｐ−
ニトロフエノール、o.p−ジニトロフエノール、
ペンタクロロフエノール、２，４，５−トリクロ
ロフエノール、ベンタフルオロフエノール、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−５
−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等
があげられる。 この縮合に用いられる溶媒は、反応に影響をあ
たえないものであれば何でも良いが、通常一般式
〔〕及び〔〕で示される原料化合物と溶解す
る極性溶媒がよく、水、ジメチルホルムアミド、
ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、それら
の混合溶媒である。一般式〔〕の化合物に対し
て、一般式〔〕の化合物及び縮合剤の割合は
0.5〜20当量、好ましくは１〜10当量である。 このようにして得られた縮合物が望む活性エス
テルであることは、IR吸収スペクトルで
1780.1740cm^-1付近に吸収帯を示すこと後にのべ
るように蛋白と結合物を作ること、冷アルカリ水
で加水分解すると容易にもとのカルボキシル基を
もつ化合物にもどることから明らかである。 このようにして得られた一般式〔〕の化合物
は、Ｙがカルボキシル基以外の基である場合に
は、単に中性又は微アルカリ性の緩衝液中で蛋白
又はポリペプチド反応させることにより、Ｙがカ
ルボキシル基である化合物の場合には、通常使用
しうる縮合剤たとえば前記縮合剤、好ましくは１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩を用いて、蛋白又はポリペ
プチドと反応させることによりブレオマイシン−
蛋白又はポリペプチド結合体を得ることができ
る。反応温度は通常−５℃〜60℃このましくは０
〜30℃である。 次に本発明を実施例により具体的に説明する。 実施例 一般式〔〕で表わされる化合物の合成 イ） ３−（（Ｓ）−１−フエニルエチルアミノ）
プロピルアミノブレオマイシン２塩酸塩（含銅
体）500mgを50mlのメタノールに溶解しグリオ
キシル酸ナトリウム・水和物66mg添加し、つい
で20mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加
した。40℃、20時間反応した後、６規定塩酸水
溶液で反応液のPHを1.0に下げ、10分間放置し
て反応を止めた。１規定水酸化ナトリウムで中
和したのち、減圧下でメタノールを溜去し、残
渣に蒸留水を加えて10mlとした。これをあらか
じめPH6.8，１／20モルリン酸緩衝液で平衡化
したCMセフアデツクス Ｃ−25（Na＋型：フ
アルマシア、フアインケミカル社製）を充填し
たカラム（100ml容）に注入し吸着した。上記
の緩衝液に連続的に塩化ナトリウムを加えるこ
とによりナトリウム濃度を1.0モルまで徐々に
上昇させる直線濃度勾配法により溶出し0.1〜
0.15モル前後で溶出する青色の分画50mlを集
め、予め蒸留水で充填したアンバーライト
XAD−２−（ローム・アンド・ハース社製）の
カラム（100ml容）に注入して、目的物を吸着
した。蒸留水150mlでカムをあらつた後、１／
50M塩酸水溶液−メタノール（１：4v／ｖ）
で溶出した。青色の分画を集め、陰イオン交換
樹脂、ダウエツクス 44（OH型；ザ・ダウ・
ケミカル社製）で中和したのち、減圧下で濃縮
して凍結乾燥することにより化合物番号１の化
合物の青色粉末270mgを得た。 本品の融点は210〜212℃（分解）で、蒸留水
で測定した紫外吸収極大は292mμ，E1％／１
cmは118.7であつた。臭化カリ錠剤法で測定し
た赤外吸収極大波数（cm^-1）は3400，1720，
1640，1550，1460，1370，1330，1130，1100，
1060，1010，980，920，760であつた。 その他の理化学的性状は第２表に示した通り
である。 ロ） ３−〔Ｎ−メチル−Ｎ−（３−アミノプロピ
ル）アミノ〕プロピルアミノブレオマイシン３
塩酸塩（含銅体）１ｇを100mlの0.1N酢酸カリ
メタノール溶液−0.1N酢酸メタノール溶液
（２：1v／ｖ）に溶解し、グリオキシル酸57mg
を添加し、ついで26mgシアノ水素化ホウ素ナト
リウムを添加した。40℃24時間反応した後、６
規定塩酸水溶液で反応液のPHを1.0に下げ、10
分間放置して反応を止めた。１規定水酸化ナト
リウムで中和したのち、減圧下でメタノールを
溜去し、残渣に蒸留水を加えて20mlとした。こ
れをあらかじめPH6.8，１／20モルリン酸緩衝
液で平衡化したCMセフアデツクス Ｃ−25
（Na＋型：フアルマシア、フアインケミカル社
製）を充填したカラム（100ml容）に注入し吸
着した。上記の緩衝液に連続的に塩化ナトリウ
ムム加えることによりナトリウム濃度を1.0モ
ルまで徐々に上昇させる直線濃度勾配法により
溶出し0.3モル前後で溶出する青色の分画120ml
を集め、予め蒸留水で充填したアンバーライト
XAD−２（ローム・アンド・ハース社）のカ
ラム（100ml容）に注入して、目的物を吸着し
た。蒸留水150mlでカラムをあらつた後、１／
50M塩酸水溶液−メタノール（１：4v／ｖ）
で溶出した。青色の分画を集め、陰イオン交換
樹脂、ダウエツクス 44（OH型；ザ・ダウ・
ケミカル社製）で中和したのち、減圧下で濃縮
して凍結乾燥することにより化合物No.５の化合
物の青色粉末630mgを得た。 本品の融点は207℃（分解）で、蒸留水で測
定した紫外吸収極大は292mμ，E1％／１cmは
100であつた。臭化カリ錠剤法で測定した赤外
吸収極大波数（cm^-1）は3400，2950，1730，
1640，1580，1560，1460，1400，1380，1330，
1140，1100，1070，1020，990，930であつた。 その他の理化学的性状は第２表に示した通り
である。 上記の反応で３−〔Ｎ−メチル−Ｎ−（３−ア
ミノプロピル）アミノ〕プロピルアミノブレオ
マイシン３塩酸塩（含銅体）１ｇグリオキシル
酸140mg、シアノ水素化ホウ素ナトリウム52mg
用いた結果、510mgの化合物No.６の化合物（表
１）が得られた。 本品の融点は202〜204℃（分解）、蒸留水で
測定した紫外吸収極大は292mμ、E1％／１cm
で107.3であつた。臭化カリ錠剤法で測定した
赤外吸収極大波数（cm^-1）は3430，2950，
1720，1640，1550，1460，1390，1370，1320，
1250，1090，1130，1050，1010，990であつた。 その他の理化学的性状は第２表に示した通り
である。

【表】 ハ） イ）で得られた化合物１の化合物50mgを１
mlのジメチルホルムアミドに溶解し、Ｎ−ヒド
ロキシコハク酸イミド36mg添加し、ついでジシ
クロヘキシルカルボジイミド31mgを添加した。
室温20時間撹拌し反応した後、20mlのアセトン
を加え生じた沈澱を濾取した。沈澱をアセトン
で洗つた後乾燥し、水に溶解、不溶物をろ別
後、ろ液を凍結乾燥することにより、化合物No.
２の化合物（表１）の青色粉末46mgを得た。臭
化カリ錠剤法で測定した本品の赤外吸収極大波
数（cm^-1）は3400，2950，1820，1780，1730，
1640，1550，1460，1370，1240，1210，1100，
1060，1010，920，880，810であつた。 その他の理化学的性状は第３表に示した通り
である。 上記の方法でＮ−ヒドロキシコハク酸イミド
のかわりに、ｐ−ニトロフエノール又はＮ−ヒ
ドロキシ５−ノルボルネン−２，３−ジカルボ
キシイミドを用いて反応することにより、夫々
化合物No.３の化合物、化合物No.４の化合物を合
成した。 これらの理化学的性状は第３表に示した通り
である。 ニ） ロ）で得られた化合物No.５の化合物30mgを
１mlのジメチルホルムアミドと0.05mlの蒸留水
の混合液に溶解し、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノル
ボルネン−２，３−ジカルボキシイミド33mgを
添加し、ついでジシクロヘキシルカルボジイミ
ド19mgを添加した。室温15時間撹拌し反応した
後、20mlのアセトンを加え生じた沈澱を濾取し
た。沈澱をアセトンで洗つた後乾燥し、水に溶
解、不溶物をろ別後ろ液を凍結乾燥することに
より化合物No.９の化合物の青色粉末30mgを得
た。臭化カリ錠剤法で測定した本品の赤外吸収
極大波数（cm^-1）は3430，2950，1780，1740，
1720，1650，1580，1560，1460，1380，1320，
1240，1140，1100，1060，1010、であつた。 その他の理化学的性状は第３表に示した通りで
ある。 上記の方法で、Ｎ−ヒドロキシ５−ノルボルネ
ン−２，３−ジカルボキシイミドのかわりに、Ｎ
−ヒドロキシコハク酸イミドを用いて反応するこ
とにより、化合物No.７の化合物を合成した。 これらの理化学的性状は第３表に示した通りで
ある。 又、さらに、上記の方法において、化合物No.５
の化合物のかわりに化合物No.６の化合物を用い
て、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロ
キシ５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイ
ミドの夫々反応させることにより夫々化合物No.
８，10の化合物を得た。 これらの理化学的性状は第３表に示した通りで
ある。

【表】 参考例 ブレオマイシン蛋白結合体の合成 イ） 牛血清アルブミン（BSA）53mgを2.5mlの
0.05Mリン酸緩衝液（PH7.5）に溶解し前記１）
−ロ）で得た化合物２を198mg（ブレオマイシ
ン／BSAモル比＝１：175）添加した。室温一
夜反応後、あらかじめ上記の緩衝液で平衡化し
た150ml容のセフアデツクス Ｇ−50を充填し
たカラムに注入し、同じ緩衝液でクロマトグラ
フイーを行ない、溶出液を2.5mlづつ分画した。
ブレオマイシン銅による青色バンドが、分画18
〜24と分画48〜65に夫々に溶出された。分画18
〜24は同時に蛋白に由来する280nmの吸収を示
したことから、結合体の生成が認められた。分
画18〜24を水に対して一夜透析後凍結乾燥し、
43mgのブレオマイシン−BSA結合体の青色粉
末を得た。 このものの280nmにおけるE1％／１cmは23.9
であつた。BSA，及びブレオマイシンの
280nmにおける夫々のE1％値、6.6，105.6を用
いて結合数を計算すると、BSA1分子当りブレ
オマイシン8.4分子が結合していた。 又、BSA53mgに対して、化合物２を32mg
（ブレオマイシン／BSAモル比＝１：25）用い
て反応を行なわせ40mgの結合体を得た。このも
のの280nmにおけるE1％／１cmは12.61でああ
り、BSA1分子あたり、2.6分子のブレオマイシ
ンを結合していた。 ロ） イ）と同様にして、BSA23mg化合物を９
を23mg反応させ、精製した結果、21mgの結合体
を得た。このものの280nmにおけるE1％／１
cmは33.1を示し、イ）と同様な計算により、
BSA1分子あたり15.1分子のブレオマイシンを
結合していた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 〔BX〕−NH−Ａ−NR_2-o（CH₂Y）_o 〔式中〔BX〕はブレオマイシン酸のカルボキ
   シル基から水酸基を除いた残基を示し、Ａは低級
   アルキレン又は窒素を介して結合したアルキレン
   を、Ｒは水素又はアルキル又はフエニルで置換さ
   れたアルキルを、Ｙは−COOH、
   【式】（ここでR¹はニトロ基 ｍは１又は２の整数である）、
   【式】（ここでR²はハロゲ ン、ｌは３又は４の整数である） を示し、ｎは１または２である〕 で表わされるブレオマイシン誘導体及びその塩。