JPS60232087A - Ｌ−セリンデアミナ−ゼ活性欠損突然変異株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は２−セリンヒドロリアーゼ（脱アミノ化）−以
後Ｌ−セリンデアミナーゼと称し、Ｃｌｏｓｒｉｄｉｕ
ｍ　ａｃｉｄｓ−ｕｒｉｃｉ　１り単離された酵素（Ｅ
Ｃ４，２，１，１４）と同様の活性（以後「Ｌ−セリン
デアミナーゼ活性」と称する）を有する酵素−活性欠損
細菌突然変異株に関する（　Ｊ、Ｆ、　Ｃａｒｔｅｒ及
びＲ，Ｄ、　５ａｙｅｒｓ、”（：Ｉｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｎａｃｉｄｓ−ｕｒｉｃｉ　（ＥＣ４，２，１，１４）
“、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１０９　：　７５７−７６３．
１９７２年参照〕。

より詳細にいえば、本発明はＬ−セリンデアミナーゼ（
Ｌ−８Ｄ）活性を欠く大腸菌（Ｆ、　Ｃｏ１１）Ｋ１２
の数種の突然変異株に関する。

先行技術における微生物を利用した炭水化物からのＬ−
）リグトファンの製造方法には、二種類のアプローチが
なされてきた。第一のアプローチとしては、トリプトフ
ァンならびにその同族体に対するフィードバック耐性を
有する野生型微生物の突然変異株の選択が挙げられる。

こうしたアプローチの例には、５−フルオロトリシトフ
ァン耐性を有する枯草菌株（米国特許明細書簡４．３６
３．８７５号）、５−メチルトリットファン耐性を有す
るＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（米国特許明細書簡
３．７００．５３９号）、ならびにフェニルアラニンお
よびチロシンを要求し４−メチルトリットファン、６−
フルオロドリプトフ７７．４−７ミ／フエニルアラニン
、４−フルオロトリプトファン、チロシンーヒドロキサ
メ　゛−トおよびフェニルアラニンヒドロキサメートに
対する耐性を有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇ
ｌｕｔａｍｉｃｕｓ　ＡＴＣＣ２１８５１が含まれる。

後者の株は１５　ｔ／ｄｔの砂糖キビ廃糖みつから得た
砂糖より１６．８ｍ／ｌのトリプトファｙ’ｌ生産する
ことができる。

トリプトファンの生産増大をはかる第二・のアプローチ
としては、プラスミドに組み込まれた遺伝情報を有する
宿主微生物を供給してトリプトファン生合成を制御する
方法が挙けられる。

後者の方法の例としてはトリプトファン合成にｃｏｌｉ
宿主の形質転換について述べた米国特許明細書箱４．３
７１．６１４号が挙げられる。

トリプトファン合成に使用する微生物が突然変異株であ
れ形質転換株であれ、トリシトファンの合成経路は以下
のとおりである。

チャート１ 糖 ↓（少なくとも１５段階） コリスミ酸 ５−ホスフェート 尤 Ｌ−）リットファン ↓トリプトファナーゼ 分解生成物（インドール） アントラニル酸はトリプトファン生合成経路における最
初の主要前駆体である。トリプトファン生産経路の最終
段階では、トリプトファン　゛シンターゼの介在により
インドール−３−グリセロール−ホスフェート分子とセ
リン分子トが縮会してトリプトファンとグリセルアルデ
ヒド−３−ホスフェートを形成する。

インドール−３−グリセロールホスフェートまでのトリ
シトファン前駆体が豊富にブールされている微生物にお
いては、セリンの供給がトリシトファンの生産速度を決
定することがわがっている。セリン生合成経路は一般に
以下のとおりである。

チャート２ ↓ アセチルＣｏＡ セリンは多数の経路において分解される。−例を挙げれ
ば、テトラヒドロ葉酸の作用に１つてセリンはグリシン
に変化する。もうひとつの主要な分解経路では、Ｌ−８
Ｄがセリンに作用してビリビン酸塩およびアセチルＣＯ
Ａが生シる。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｃｉｄｓ−ｕｒｉｃｉにお
いては、Ｌ、−８Ｄは尿酸醗酵経路における酵素のひと
つであると考えられ、一般にセリンが形成し主要炭素経
路の一部としてさらに代謝される多数の経路に関与して
いるものと思われる。Ｌ−８Ｄレベルは窒素栄養、炭素
源およびアミノ酸利用の関数として変化する。Ｌ−８Ｄ
活性の誘引要因は工くわかつており、窒素の欠落、グリ
シンお工びロイシンの存在（セリンは含まれないが、グ
リシンお工びロイシンによる誘引はセリンに影響されな
い）ならびに最小グルコース培地中での培養が挙げられ
る。

たとえばグルコース培地の場仕、Ｌ−８Ｄが高レベルで
ある培地がアミノ酸生産用として最も経済的である（　
Ｅ、　Ｂ、　Ｎｅｗｍａｎおよび■、Ｋａｐｐｏｒ。

“Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　５ｔｕｃＨｅｓ　ｏｎ　Ｌ−ｓｅ
ｒｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ
　ｇｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　”、
　（ｌｅａｎ。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、５８．１２９２−１２９７．１９
８０年参照）。なぜならこのような培地では脱アミノ化
によって細胞中のセリンレベルが低下し、セリンゾール
が低レベルに保たれるため、Ｌ−スレオニンデアミナー
ゼに対するし一セリンの阻害作用を避けられると考えら
れる（　Ｓ、　■ｓｅｎｂａｒｇお工びＥ、　Ｂ、　Ｎ
ｅｗｍａｎ　Ｂｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ
ｄｅａｍｉｎａｓｅ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ　Ｋ１２“、Ｊ＋Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．１１８
．５３−５８．１９７４）。Ｌ　−ＳＤの存在下におい
てに、　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２がＬ−セリンをピルビン酸
塩もしくはピルビン酸塩と同じ酸化レベルの化合物に非
可逆的に変換することはまちがいない。これはすなわち
、Ｌ−セリンはＬ−８Ｄの本来の基質ではないにせより
、−８Ｄによ“って生理学的に重要な反応でもって分解
されうることを意味している（　Ｅ、Ｂ、Ｎｅｗｍａｎ
およびＣ，ＷａＩｋｅｒ　Ｌ−８ｅｒｉｎｅ　ｄｅｇｒ
ａｄａｔｉｏｎ　１ｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ　Ｋ　１２　：　ａ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ
Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ　、　ｇｌｙｃｉｎｅ　ａｎｄ　１ｅ
ｕｃｉｎｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　
ｃａｒｂｏｎ“、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５１
　ニア７７−７８２．１９８２年参照）。

トリプトファン生合成もしくはセリンの醗酵生産におけ
るセリンの利用価値を、セリン分解酵素欠損微生物の利
用によって高めることが可能である。葉酸塩欠損微生物
は一般に培養を続行するには代謝的にひずみ（５ｔｒｅ
ｓｓ　）　ｆ受けすぎている。しかしＬ−８Ｄ欠損微生
物は培養を続行することができるため、トリプトファン
生合成の促進に利用できる。

トリプトファン生産におけるＬ−８Ｄ活性欠損微生物の
有用性は、トリブトファン生産増加用に改変された微生
物において特に顕著である。

たとえば米国特許明細書箱４．３７１．６１４号中に開
示されているところのトリプトファン生合成に対する遺
伝情報を有するグラスミドによって形質転換された酵素
トリノトファナーゼ欠損Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２株は、
こうした改変を受けてぃな　゛いＥ、　ｃｏｌｉ株と比
較してより多量のトリプトファンを生産することが判明
している。このような株におけるトリプトファン生産に
対する制限要素の中で、Ｌ−８ＤにょるＬ−セリン（微
生物自体が合成し友もＯＫせよ外部から供給されｔもの
にせよ）の分解が特記できる。

米国特許明細書箱４．３７１．１６４号に記載の株およ
びトリットファン−生産増大用に改変されたその他の株
におけるトリプトファン生産をさらに増加させるには、
Ｌ−８Ｄ欠損株上にファージＰ、全発育させ、ファージ
Ｐｌヲ用いてトリプトファン生産株の形質導入をはかり
、Ｌ−８Ｄ活性低下もしくはトリプトファン生産増大あ
るいはその両方について被形質導入体をスクリーニング
すればよい。

発明者らはＬ−８Ｄ活性欠損もしくはこれを欠く多数の
微生物株（とくにＥ、ｃｏｌｉの工うなグラム陰性微生
物の株ンを作成ならびに単離した。本明細書において用
いるｒｘ、−ｓＤ欠損」という表現は、野生型親株と比
べてよシ低いＬ−８Ｄ活性（後記実施例中に記載の方法
に率って測定する）を有することを意味する。またＬ−
８Ｄ活性を欠く株とは、５ミリユニツト以下の範囲のＬ
−８Ｄ活性を示すものを意味する（後記実施例において
定める。）。Ｌ−８Ｄ活性欠損もしくはこれを欠（Ｅ、
ｃｏｌｉ株は、セリン、グリシンおよびロイシン含有培
地中では生育不能であシ、またグルコース最小培地中で
成長した場合はＬ−８Ｄ活性を欠く。本発明によるＥ。

ｃｏｌｉ株ｔｉ、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２株に紫外線
（ＵＶ　）照射を施すか、もしくはＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　
１２株にＭｌｌ　！！Ｘ挿入を用いたトランスポゾン突
然変異誘発を施した後に、Ｌ−８Ｄ欠損突然変異株を適
当な培地上でスクリーニングすることにより単離した。

本発明に記載の方法は、Ｅ、ｃｏｌｉの工うなグラム陰
性菌を含む広範囲に利用しうる微生物中からＬ−８Ｄ活
性欠損突然変異株を作成ならびに単離する方法を与える
ものである。

以下の実施例によって本発明をさらに説明す　゛る。

実施例Ｉ Ａ、ＭＥＷ１２８株の単離 ワシントン大学医学部（米国ミズーリ州セントルイス）
Ｌ、ｓ、Ｗ目１　ｉ　ａｍｓ氏よシ、ＣＵ１００８株（
虫Ａに欠失を有する野生型Ｂ、ｃｏｌ　ｉ　Ｋ１２）を
得た。

ＭＥＷ　１２８株：ＣＵ１００８株にＵＶ照射を施し、
グルコース最小培地にて継代培養し、２確／ｍ／のセリ
ン、２００μｆ　／ｍｌのグリシンお工び５０　ｆｉｔ
７１！１１のロイシンを補足した培地にてペニシリン存
在下で３７℃において培養した（　Ｂ。

Ｉ）、　Ｄａｖｉｓら、”　Ｔｈｅ　１ｓｏｌａｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｙｄｅｆｉｃｉｅ
ｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｂｙ
　ｍｅａｎｓ　ｏｆｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　／／　Ｊ、
ＡＩＴｌｅｒ、　Ｃｈｅｍ　、　ＳＯＣ、７０：　４２
６７゜１９４８年の方法による）。生存菌をグルコース
最小培地に移し、上記の如くセリン、グリシンおよびロ
イシンを補足したＢ　ａｃ、ｔｏ−Ａｇａｒ　（登録商
標）培地（５ＧＬ−グレート）上においてレプリカ平板
法によってスクリーニングした。ＭＥＷ１２８株は５Ｑ
Ｌ−グレート上では発育できなやものとして選択された
。また同株は液体グルコ−）　′最小１３Ｋ＞″″″′
育不能″″′Ｑが１明した。ＭＥＷ　１２８株はまたチ
アミン要求性である。同株は１９８４年１月１２日付け
でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ
ＴＣＣ：　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｉ）ｒｉｖ
ｅ、　Ｒｏｃｋｖｉ　Ｉｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　２０８５２
　）に供託された（認可番号３９５７７）。

ＭＥＷ　１２８株は最初は上記の方法によって単離され
たが、上記のようにセリン、グリクンおよびロイシンを
補足し、８Ｐ／ｌのｒルライト（登録商標ＫｅｌｃＯ６
３００２Ａ　）　ｋ用いて固化し、さらにｔｏｍｑ７ｔ
のチアミン、ｓｍｑ／ｌの塩化第二鉄、０．１呼／ｌの
モリブデン酸ナトリウムおよび０．１２〜／ｌの塩化マ
ンガンを加えたグルコース最小培地上におけるレプリカ
平板スクリーニング法金用いれば、ＭＥＷ１２８株？無
理なく選択することができる。ＭＥＷ　１２８株は上記
培地では発育しなかった。

Ｂ、酵素アッセイ 本明細書の参考文献であるＳ、ｌｓｅｎｂｅｒｇおよび
Ｅ、　Ｂ、　Ｎｅｗｍａｎ、　”　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏ
ｎ　Ｌ−ｓｅｒｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅ　ｉｎ　Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ目に１２“、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１１８　：５３−５８．１９７
４匁にしたがつて、トルエン処理全細胞中においてＬ−
８Ｄ活性をアッセイした。結果を下記第１表に示す。

表中の数値はミリュニッ）（ｍυン、すなわち０．１ｍ
ｌの１００クレツト単位細胞サスペンションが３５分間
に生産するケト酸のナノモル数で表示されている。

本アッセイにおける最低信頼値は５ｍｕである。

第１表 ＭＥＷ　１２８株ならびに関連株におけるＬ−１、グル
コース最ｌＪ吻　１９　５　７２、り１シンおよびロイ
シン　１１０　６　３１３、　ＵＶ照射　１３０　５　
３８ ４、　４２　℃　３４　５　２５ ５、　Ｌｌｌ培地”　２３０　３０　５１＊ＬＢ培地は
１０　？／ｌのｍ　ｎａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ（登録
商標）、５ｆ／ｌのＢａｃｔｏｙｅａｓｔＢｘｔｒａｃ
ｔ　（登録商標）および１０９／ｌのＮａＣｔｉ含む（
Ｊ、　Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ、　”　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”、（
：ｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　、　ｌ　９７
３年、以後Ｎ１１１１ｅｒと称する）。

グルコース最小培地において３７℃にて発育中の指数増
殖期の菌をつぎの５条件下で継代培養した。３７℃にお
いて同−培地中（実験ｌ）、４２℃において同−培地中
（実＠４）、アミノ酸を添加した同−培地中（実験２）
およびＬＢ培地中（実験５）。一部の菌には６０秒間紫
外線を照射し、ついでグルコース最小培地中において培
養した（実験３）。特に記さないかぎり培養温度は３７
℃とした。継代培養の１時間後Ｋ　Ｌ　−ＳＤ活性を測
定した。実験法の詳細は、Ｅ、Ｂ、Ｎｅｗｍａｎ　ら、
”、［、−５ｅｒｉｎｅ　ｄｅａｍｊｎａｓｅ　ａｃｔ
ｉｖｉｔｙｉｓ　１ｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｅｙｐｏｓｑ
ｒｅ　ｏｆ　ｌ：５ｃｂｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏＪｉ　９
Ｋ　１２　ｔｏ　ＤＩ（Ａ−ａａｍａｇｉｎｇ　ａｇｅ
ｌｌｆｓ“、　Ｊ、　ＢａｃｔｅｒｆｏＬ。

１５２ニア０２−７０５．１９８２年に記載されている
。

Ｃ，ＭＥＷｌ　２８株の特性 １、発育要求性 ＭＥＷ　１２８株は、セリン、グリシンおよび口ィシン
を上記の濃度で補足したグルコース最小が、液体グルコ
ース最小培地の場合は１／２０’Ｃ（容量／容量）のＬ
Ｂ培地を補足する必要がある。ＬＢ培地に対する要求性
は、３μｍ／１のチアミンでもって代替することができ
る。また液体グルコース最小培地にそれぞれ３００μＶ
／ｍ１２上まわる濃度のコハク酸塩および酢酸塩もしく
は５μＰ／ｍＡ’のリジンおよび１ｏμｆ／ｍのメチオ
ニンを補足すること１工って＼チアミン要求性を代替す
ることも可能である。真のチアミン依存株は機能乳酸デ
ヒドロゲナーゼを欠′く。なぜならこの酵素は補助因子
としてチアミンを必要とするためである。したがって微
生物のチアミン欧存株はピルビン酸塩を排泄する。

ＭＥＷ　１２８株が排泄したケト酸は、非酸性化培養上
澄み液を市販のＬＤＨ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｒ伯ｎ
ｎｈｅｉｍＣＯ１）と反応させ、ＮＡＤＨ酸化忙つぃて
アッセイすることにより同定した（　Ｈ，Ｊ、　Ｈｏｈ
ｏｒｓ　ｔ、”Ｌ　−（→１ａｃｔａｔｅ　ｄｅｔｅｒ
ｒｎｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＬＤＨａｎｄ　ＴＰＮ
“。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｃｌｔｉｃ　Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ、　Ｈ，Ｖ。

Ｂｅｒｇｍ）ｒｅｒ編、　Ｖｅｒｌａｇ　（！ｈｅｍｉ
ｅ、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　、第２版、１９５
６年参照）。この結果、実質上すべてのケト酸がピルビ
ン酸塩であることが判明した。

２、　Ｌ　−ＳＤ活性 ＬＢ培地１１５０　？含むグルコース最小培地で３７℃
ニオイテ発育Ｌ７’ｃＭＥＷ１２８株ノＬ−８Ｄ活性は
わずか（５ｍｕ）もしくは皆無であった。

（第１表参照）。しかしＬＢ培地中で発育した場合は、
同一条件下における親株の活性（２３゜ｍｕ）にははる
かに及ばないとはいえ、かなりの活性を示した（　３０
　ｍｕ　）。その他の既知のＬ　−ＳＤ活性誘引要因〜
すなわちＵｖ、グリシンおよびロイシン、温度上昇（４
２℃）−ハ目立った効果を上けなかった（すべて約５ｍ
ｕ）。

ＭＥＷ　１２８株が若干のＬ−８Ｄ活性生産能を保持し
ていることは明らかであるが、これは大部分の慣用の誘
引条件には反応しなかった。

チアミンを添加し友グルコース最小培地中で発育した菌
についても同様の実験を行ったが、結果は同じであった
。過剰量のチアミンを添加してもＬ−８Ｄ活性は復元さ
れなかった。チアミンが通常Ｌ−８Ｄ活性に影響を及は
さないことを確認するため、チアミンの存在下および非
存在下において発育し之親株ＣＵ１００８細胞における
Ｌ−８Ｄｉ上記の方法でアッセイしたところ、活性間に
差異は見られなかった（データは記載せず）。

要するにＭＫＷ１２８株は次の２点において親株と異な
る。■発育にチアミンを必要とする。

■Ｌ−８Ｄ誘引条件下においてさえもＬ−８Ｄ活性が欠
損している。

３、ＭＫＷ１２８のチアミン独立後帰休チアミンを含ま
ないグルコース最小培地中で発育しうるＮＥＷ　１２８
株の復帰体が単離された。ＭＥＷ　１２８株の単一コロ
ニー単離体を液体グルコース最小培地に接種し、良好に
発育するまで培養した。グルコース最小培地プレート上
にブレーティングすることによす、単一コロニーを液体
培地から単離した。ＭＥＷ１２８株はグルコース最小培
地プレート上で発育するため、液体培地のみがチアミン
独立性を選択することが明らかである。

２５種類の自然に単離されたチアミン独立株を、上記の
方法を用いてグルコース最小培地中におけるＬ−８Ｄ活
性についてアッセイしたところ、すべて若干の活性を示
した。このうち５種類の株について、グルコース最小培
地中お工び２５０μｆ／１ｒＬｌのグリシンならびに５
０ｔｔ？／プのロイシンを含有する培地中におけるＬ−
８Ｄ活性金アツセイした。未誘引条件下でのＬ−８Ｄ値
は９ないし１８ｍｕであり、誘引条件下では２７ないし
４７　ｍｕであった。野生型への復帰　゛は一切見られ
なかった。第１ｆｆに示す復帰体にライて、すべての誘
引条件下でアツセイヲ行った。全条件について部分的な
誘引が見られたのみであった。

実施例■ Ａ、　ＭＥＷ　１９１株の単離 ゾロリン要求性栄養要求株をベニ７リン選択によって単
離し、月ヒオイロン欠失を有するドナーを用いてプロリ
ン独立株を形質転換することにより、主オペロン欠失を
有するＣＵ１００８株の誘導体（以下ＣＵ１００８Δ畢
と称する）を作成した。ドナー株であるＣＡＧ５０５０
　（ＭｕｑＸＣＡＭ　ＣＡｌ）　ｌａｃ　）ヱ伊倶ゾｙ
８嬰巳里煕ｎａｌｒ／　Ｆ’　ｐｒｏ　１ａｃｚ８３０
５　：　：　Ｍｕ　Ｃ１５６２）ｕ、米１１ウィスコン
州マジソンのライスコンシン大学Ｍ、　Ｈｏｗｅ氏よシ
得た。同株はＭｕｄｌＢ：：）Ｔｎ９−　Ｍｕ　ｄｌ　
７アーツ。突然＊ＪＨｔＣ（Ｍ、　、ｒ。

Ｃａ５ａｄａｂａｎおよびＳ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ　”
　Ｌａｃｔｏｓｅ　ｇｅｎｅｓｆｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｘ
−ｏｇｅｎｏｕｓ　ｐｒｏｍｏｔｏｒｓ　ｉｎ　ｏｎｅ
　ｓｔｅｐｕｓｉｎｇ　ａ　Ｍｕ−ｌａｃ　ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｐｈａｇｅ　：　ｉｎ　ｖｉｖ。

ｐｒｏｂｅ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓ−ｃｒｉｐｔｉｏｎａ
ｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ”。

ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｕｓ、Ａ
、　７６　：４５３０−４５３３゜１９７９年）、Ｂ遺
伝子へのＴｎ９挿入によって得られたもの［Ｔ、　Ａ、
　Ｂａｋｅｒら、”ＭｕｄＸ、ａｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ
　ｏｆ　Ｍｕ　ｄｉ　（ｌａｃ　Ａｐ　）　ｗｈｉｃｈ
　ｍａｋｅｓｓｔａｂｌｅ　ｌａｃ　Ｚ　ｆｕｓｉｏｎ
ｓ　ａｔ　ｈｉｇｈ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ”。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５６　：９７０−９７
４．１９８３年参照〕−に対して溶原性である。

７７一ジＭｕ　！！Ｘ　を用いてＣＵ　１００８△ｌａ
ｃ株を形質転換してクロラムフェニコールならびにアン
ピシリン耐性となし、高温度における。す些２融会の安
定化をはかった。形質転換を施された株（ＭＥＷ１９１
と称する）を、５ＧＬ−グレート上で発育不能のアンピ
シリンおよびクロラムフェニコール耐性株として単離し
た。同株は１９８４年１月１２日付けでＡＴＣＣに供託
されている（認可番号３５５７５　）。

Ｂ、酵素的方法 実施例■においても実施例Ｉで用いたものと同じ方法を
採用した。

ＣｏＭＥＷ　１９１株の特性 発育要求性：　ＭＥＷ　１９１株はクロラムフェニコー
ルおよびアンピシリン耐性を示し、セリン、グリシンお
よびロイシンの存在下では発育不、能であり、ＭＥＷ１
２８株と同様の表現型を示した。すなわちチアミン要求
性であり、グルコース最小培地においてＬ−８Ｄ活性金
示さず、誘引要因によって改変され７ｔ（第■表参照）
。

ＭＥＷ　１９１株におけるＬ　−ＳＤ活性は、ＭＥＷ１
２８株のＬ　−ＳＤ活性と実質上同様であった。

ＭＥＷ　１９１株は′！たチアミンの非存在下において
ピルビン酸塩を排泄した。

第１表 ＭＥＷ　１９１および関連株におけるＬ−８Ｄ活グルコ
ース最小培地　５２３１５１２ グリシンおよびロイシン　５　１０１　５０　４６ＵＶ
照射　５　１０３　ｎｄ　ｎｄ ４２　℃　５　３７　ｎｄ　ｎｄ ＬＢ培地　１２　１７３　ｎｄ　ｎｄ 、！、 ｎｄ　＝未測定。実験は第１表と同様に実施。

Ｄ、ＭＥＷ　１９１株のチアミン独立後帰休つぎにセリ
ン、グリシンおよびロイシンの存在下において発育しう
るＭＥＷ１９１株の復帰棒全単離した。これらの復帰棒
の一部はクロラムフェニコールおよびアンピシリンに対
する耐性数 を示したが、こうした耐性をも友ないものも赤種類あっ
た。４種類の抗生物質感受性コロニー金さらにテストし
た結果、これらのコロニーはチアミン独立性であシ、親
株と同レベルのＬ−８Ｄ活性を有することが判明した。

グリシンおよびロイシンの存在下で発育させるとより高
レベルに達するが、ＣＵ１００８株のレベルには及ばな
かった。

実施例■ Ａ、ｌＫ１５−５株（Ｌ−８Ｄ欠欠損チアミン製要求）
の単離 実施例■では実施例Ｉにおいて使用したものと同一の方
法ならびに同一の親株（すなわちＣＵ　１００８△−レ
匹工）を用いて、ＳＧＩ、−プレート上で発育しないｌ
Ｋ１５株を単離した。ｌＫ１５株上で発育するファージ
Ｐｓ　’に用いて、慣用のファージ形質導入法（Ｍ目Ｊ
ａｒ参照）によって、ＣＵ　１００８△υ氏株をアンピ
シリンおよびクロラムフェニコール耐性に形質導入した
。こうしてＬ−８Ｄ活性を欠きアンピシリンおよびクロ
ラムフェニコールに対して耐性を示し５ＱＬ−プレート
上で発育できないＣＵ１００８△ｌａｃの被形質導入体
として、ｌＫ１５−５株を単離した。

同株は１９８４年１月１２日付けでＡＴＣＣに供託され
ている（認可番号３９５７６　）。

Ｂ、酵素的方法 実施例■では実施例Ｉにおいて使用したものと同様の方
法を採用した。

Ｃ，ｌＫ１５−５株の特性 １、発育要求性 ｘｘｌｓ−ｓ株はクロラムフェニコールおよびアンピシ
リンに対する耐性を有し、８ＧＬ−’７’レート上では
発育不能であった。ｌＫ１５−５は実質上チアミン要求
性をもたない。

２、Ｌ−８Ｄ活性 ｌＫ１５−５株はグルコース最小培地中ではＬ−８Ｄ活
性を示さず、また第■我に示す誘引条件下において改変
Ｌ　−ＳＤ活性を□呈した。

ｌＫ１５−５株におけるＬ−８Ｄ活性は、ＭＥＷ１２８
株におけるＬ　−ＳＤ活性と実質上同じであった。発育
ならびにアッセイ条件は実施例■で用いたもの（第１表
参照）と同様にしｔ０第■表 培養条件　ｌＫ１５−５株のＬ　−８Ｄ活性（劃）グル
コース最小培地　２ クリシンおよびロイシン　９ ＵＶ照射　３ ４２℃　４ ＬＢ培地　７５ 実施例■ Ｌ　−ＳＤ活性低下を示す株における遺伝的欠損の特性 Ａ、Ｌ−８Ｄに対する構造遺伝子中の欠損Ｍｉｌｌｅｒ
記載の方法を用い＊ｌＫ１５−５株の突然変異遺伝子に
おける挿入によるβ−ガラクトシダーゼの転写に関する
研究の結果、挿入はＬ　−ＳＤに対する構造遺伝子中に
生じることが判明した。第■表に示すように、Ｌ−８Ｄ
ｔ−誘引することが知られている条件下においては、β
−ガラクトシダーゼ転写が増加する。ただし親株と比較
して同株のＬ−８０活性には有意の上昇は見られなかっ
た。発育ならびにアッセイ条件は、実施例■と同様とし
た。

番■表 Ｌ−８Ｄ誘引　ｌＫ１５−５株 条件　β−ガラクトシダーゼ活性　Ｌ−８Ｄ活性（ユニ
ット、４９を伺ばく質）　（ｍｕ）グルコース最？Ｊ−
にｌ！ａ　６０　２グリシンおよびロイシン　１２２　
９ ＵＶ照射　９９３ ４２　℃　５７　４ ＬＢ培地　２２５　７５ に１５−５株の突然変異遺伝子における挿入によるβ−
ガラクトシダーゼの転写は、野生型Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　
１２株におけるＩ、−８Ｄ活性を増大させるものとして
知られる突然変異によって増大する。

野生型Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２株におけるｓｓｄ突然変
異は多形質発現性である。その効果のなかでとくに顕著
であるのは、Ｌ−８Ｄ活性表現の著しい増大と炭素源と
してコハク酸塩を利用できなくなる点である（　Ｊ、　
Ｆ、　ＭｏｒｒｉｓおよびＥ、　Ｂ、Ｎｅｗｍａｎ。

“Ｍａｐ　１ｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｓｄ　
ｍｕｔａｔｉｏｎ　１ｎＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ　Ｋｌ　２“、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４３：
１５０４−１５０５．１９８０年参照）。柑突然変異体
の単離方法は、Ｅ　、　ｆ３　、　Ｎｅｗｍａｎら、／
／　Ｌ　−５ｅｒｉｎｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｉ
ｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＫｌ　２　：　
ｄｉｒｅｃｔｌｙ　１ｓｏｌａｔｅｄ　ｓｓｄ　ｍｕｔ
ａｎｔｓ　ａｎｄｔｈｅｉｒ　ｉｎｔｒａｇｅｎｉｃ　
ｒｅｖｅｒｔａｎｔｓ“、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１５０ニア１０−７１５．１９８２年に記載されている
。

ＣＵ　１００８のｓｓｄ突然変異体は、２ｍ／ゴのＬ−
セリンを含有する培地上で発育しうる点を利用して単離
する。慣用の技法を用いたファージＰ１形質導入によっ
て世突然変異体ヲＣＵ１００８ｍｅｔＢ−受容体となし
、メチオニン独立性について被形質導入体を選択し、Ｌ
−セリンを用いて発育しう神口二一をスクリーニングす
る。

ＣＵ１００８Σ型と称するこのような株を、つぎにＩＫ
　１５−５株上で発育するファージＰｔ　ｆｉ”用いて
形質導入する。セリン、グリシンおよびロイシン上にお
いて発育不能でありメチオニン独立性であるクロラムフ
ェニコールならびにアンピシリン耐性コロニーを単離す
る。この表現型を有する株はさらにコハク酸塩を炭素源
として利用することができない。この株１■ｘ／ｓｓｄ
と称する。

ＩＫ／μ刈株をβ−ガラクトシダーゼ活性について前述
のようにアッセイしたところ、ｌＫ１５−５と比較して
３倍のβ−ガラクトシダーゼ活性を有するがＬ−８Ｄ活
性については有意の増大がみとめられないことが判明し
た。第ｖ表はＩＫ／柑株およびＩＫ　１５−５株のβ−
ガラクトシダーゼ活性とＬ−８Ｄ活性とを比較したもの
である。第Ｖ表から、ｙゆはｌＫ１５誘導体のＬ−８Ｄ
構造遺伝子中に存在するβ−ガラクトシダーゼ配列の転
写と増大させる効果をもつことがわかる。

第Ｖ表 ［（／ｓｓ、ｄ株　ｌＫ１５−５株 グリ′ン及０５イシ”　４２５　４　’１２２　９ＬＢ
培地　６４５　５３　２２５　７５Ｂ、Ｌ−８Ｄ構造遺
伝子の転写に影響するＭＥＷ１２８株の調節遺伝子中の
欠損 ＭＥＷ　１２８にみられる突然変異とｌＫ１５株にみら
れる突然変異とを有する二重突然変異体を以下の方法に
よって単離した。慣用の技法を用いてＣＵ１００８のＭ
ｕ溶原株１ＩＫ１５株上にて発育するファージＰｔ　を
用いて形質導入しクロラムフェニコールおよびアンピシ
リン耐性となした。これらの抗生物質に対する耐性を有
しＬ−８Ｄを欠損するＭｕ溶原株（５ＱＬ−グレート上
で発育不能である点によって決定）を単離しｌＫ１５−
３と称した。ｌＫ１５−３上において発育するファージ
Ｐｓ　ｋ用いて、ＭＥＷ１２８株を慣用の方法にて形質
導入した。抗生物質耐性、Ｌ−８Ｄ欠損（５ＱＬ−プレ
ート上で発育不能である点によって決定）および発育に
チアミン要求性を有する１　２８／ＩＫＩ　５−３と称
する株を単離した。

Ｌ−８Ｄ誘引条件下において前述の方法により、１２８
／ｌＫ１５−３株のβ−ガラクトシダーゼ活性ならびに
Ｌ−８Ｄ活性をアッセイした。同一条件下においてｌＫ
１５−３株のアッセイもおこなった。結果を第■表に示
す。第■表から、ＭＫＷ１２８突然変異をも有する株に
おいてはＩＫＩ　５−３プロモーターに由来するβ−ガ
ラクトシダーゼの転写が阻害され、ま友ＭＥＷ　１２８
突然変異はＬ−８Ｄに対する構造遺伝子の転写を防止す
る調節遺伝子中に生じるこ第■表 刀刃−壜ｌＪ湘地　４４　検出不能　２１グツシンおよ
びロイシン　１５０　同　上　１３　４ＬＢ培地　２２
５　同上　７５５０ 実施例■ Ｌ−８Ｄ活性欠損Ｅ、ｃｏｌｉ株によるセリンの還元分
解 Ａ５　セリンおよび／またはグリシン栄養要求性Ｌ−８
Ｄ欠損Ｅ、ｃｏｌｉの発育における制限セリン利用性の
効果 ＣＵ　１００８Δ−呻工株よυ、グルコース最小培地中
において発育にセリンまたはグリシンを要求する３種類
の栄養要求株を単離した。このうち２種類の栄養要求株
は、実施例■記載のＭｕ些Ｘ　′を用いた挿入突然変異
によって単離した。

この栄養要求株をセリン要求性についてスクリーニング
したところ、ＤＲＩおよびＤＲ４と称される２株が単離
された。１８１−３４と称される３番目の栄養要求株は
、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｍａｌ　１０３　：Ｆ　、　Ｍｕ　４
１　（Ａｐ’　ｌａｃ　）　ａｒａ　Ｂ　：　：　Ｍｕ
　ｃ　ｔｓ、ａｒａＤＩ　３９．　Δｃ　ｌａｃ　ＩＰ
ＯＺＹＡ　）　Ｕｌ　６９．　ｓｔｒ　Ａ株の細胞融解
物をドナーに用いてＣＵ１００８△Ｉａｃ　１シ形成し
た。同株は米国ニューヨーク州ニューヨークのニューヨ
ーク大学医学部Ｅ、　ＭｃＦａ１１氏ニジ得た。アンピ
シリン耐性についてのスクリーニングおよびセリン要求
性についてのスクリーニングによって、１８１−３４株
を単離した。

ＤＲＩ株、ＤＲ４株お工び１８１−３４株上において発
育するファージＰＩｔ用いて慣用の技法によりＭＥＷ　
１２８質を形質導入して抗生物質耐性となした。抗生物
質耐性を有し、セリン、グリシンおよびロイシンを炭素
源としては発育不能であるセリンお工び／またはグリシ
ン栄養要求株である二重突然変異株を同足し、１２８／
ＤＲ１，１２８／ＤＲ４お工び１２８／１８に３４と称
した。

３種類の栄養要求株ＤＲＩ、ＤＲ４および１８１−３４
ならびに３種類の二重突然変異株１２８／ＤＲＩ、１２
８／ＤＲ４および１２８／１８１−’３４＊１セリン要
求株の必要とする量をすべて供給するには不充分な量（
あらかじめ３００μｆ／ｌｎｌときめておかれた）のＬ
−セリンを補足したグルコース（２ｍｇ／ｍｌ）最小培
地中ご培養した。明条件下において接種された６種項の
株を定常期（比色計を用いて濁度で決定）まで３７℃に
て上記培地中で培養し、各棟の最終収量を培地１　ｍｌ
あたりのたＡ７ばく質のｑ数を単位として測定し之（ロ
ーリ−測定）。また前述の方法を用いて各棟のＬ−８Ｄ
活性會も測定した。第■表に示すように、Ｌ−８Ｄ活性
を欠損するセリン／グリシン栄養要求株である二重突然
変異株は、すべてのケースにおいて相当するセリン／グ
リシン栄養要求株をうわまわる収第■表 株　Ｌ−ｓＤ澱（ｍｕ）　ｌＩＫｔ（ｍｒｕ、ばくＴし
４＃１ｋ）ＤＲＩ　９０　３０ １２８／ＤＲ１６３８ ＤＲｄ　未測定　３１ １２８／Ｔ）Ｒ４６４０ １８１−３４９６２７ ｉ２８／１８１−３４　５　４６ Ｂ、Ｔ、−８Ｄ誘引条件下におけるセリン／グリシン栄
養要求性Ｅ、ｃｏｌｉ株の発育に対する制限セリン利用
性の効果 セリン／グリシン栄養要求性ではあるがＬ−８Ｄ欠損で
はたい１８１−３４株をあらかじめ定められたＬ−８Ｄ
誘引条件下において制限セリン（３００μｐ／ｄ培地）
の存在下にて培養し、定常期における１８１−３４の収
量（μｍたんばく質／　ｍｌ培地）を測定した。第１表
に示すように低収量がみられた。

第１表 発育条件　収量 （−麩ｄくル旬培地） ３００μｆ／Ｉ＃）Ｌ−セリンを含む グルコース最小培地（３７℃）２７ ３００に―のセリンお工び５０μｆ／ｆｔｔｌのロイシ
ンを含むグルコース最Ｊ４１１ｋ（３７℃）１６３００
μｒ／ｍ／１７）セリンを含む グルコース最小培地（４２℃）１９ Ｃ，セリン／グリシン栄養要求性Ｅ、ＣＯＩ　Ａ株の収
量に対する外因性セリン濃度増大の影響１８１−３４株
を明条件下においてグルコース最小培地に接種し、外因
性セリン濃度を増大させながら３７℃にて培養し、定常
期における収量を前述の方法で測定した。比較のため、
グ　″リシンの添加濃度を増大させる以外は同一の条件
下において同株を培養した。結果を第■表に示す。また
第１図は同様の最終発育はセリンもしくはグリシンのい
ずれの初濃度とも直線関係にはないことを示す。グリシ
ン濃度が約２００μｆ／ｗｔ１以上の場合、収量はほぼ
横ばい状態となるが、セリンについてはいかなる濃度に
おいてもこのような横ばい状態はみられない。セリンに
ついて収量の横ばい状態がみられないという事実は、高
濃度においても初期のセリン量が発育制限因子として作
用していることを示す。すなわちＥ、ｃｏｌｔ　（Ｄ　
Ｌ　−ＳＤ生産株の発育期間を通、じてセリンは発育制
限濃度まで消費されるのである。

第■表 １８１−３４株 補足アミノ酸濃度　収量（〜ｔんばくＶ　収量（ダたん
ばく質／（μｉ／＋７りｄセリン含有培地）　プグリジ
含有培地Ｑ　’ＯＯ ５０４０、１４０ １００７０１９２ ２００１３５２５０ ２５０１６６２６０ ３００１７９２８０ ４００２１１２５０ ５００２３０２６０ ６００２４５２６０ ９００２９０２８０ １０００３００未測定 実施例■ トリプトファン過剰生産株の形成におけるＬ−８Ｄ欠損
Ｅ、ｃｏｌｉ株の利用 Ａ、Ｃ５３４株の形成 り１２３８株はＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２株（米国カリ
フォルニア州バロアルトのスタッフォード大学Ａ、　Ｃ
ａｍｐｂｅｌｌ　研究室！Ｊｌ１手）　’ｔ’ｓり、Ｇ
ａ１　１３ｉｏ　Ｔｒｐ−である。Ｂ１２３ＢＧＢ株は
Ｂ１２３８（ドナー株：Ｗ３１１０　）のＧａ１＋Ｂｉ
ｏ”　ｐｍ被形質導入体であシ、ＡｌＯ３株はＥＭＳ突
然変異後に選択されたＢ１２３８ＧＢのアントラニル酸
塩耐性誘導体である。Ｃ５３４株は、ドナー株Ｃ５３７
上において発育するＰＩ　ｔ”用い１ｔＢａｌ＋Ｔｎａ
　（）　’）　７’　）　７７　ｆ＝ゼ陰性）の形質導
入に工ってＡｌＯ３工り誘導したものである。

Ｂ、Ｃ５３４ＳＤ株の形成 Ｌ−８Ｄ隙性ＭＥＷ　１９１株上において発育するＰ、
ファージｔ−ｃ５３４株のＡｐ　Ｃｍｒへの形質導入に
使用することができる。被形質導入体のひとつｔ−Ｃ５
３４ＳＤと命名する。

Ｃ５３４株とは異なシ、Ｃ５３４ＳＤ株はグルコース最
小培地中においてＬ−８Ｄ活性を欠き、チアミン要求性
である。

Ｃ，Ｃ５３４お工びＣ５３４ＳＤのプラスミド保有誘導
体の形成 ｔｒｐＢ　ｔｒｐｃお工びｔｒｐｌ）遺伝子を有するｐ
ＢＲｍ　−□ ３２２の誘導体であシ、テトラサイクリンに対する耐性
をもつ（第２図参照）。このプラスミドＩＣ５３４株中
に導入した。またこのグラスミドを前述のようにＴＣｒ
への形質転換によって０５３４　ＳＤ中に導入すること
もできる。

Ｃ５３４（１）Ｄ２６４３　）お工びＣ５３４ＳＤ（ｐ
Ｄ２６４３）は代表的な被形質転換体である。

Ｄ、Ｃ５３４（１）Ｄ２６４３　）株およびＣ５３４Ｓ
Ｄ　（ｐｎ　２６３４）株によるアントラニル酸塩のト
リプトファンへの醗酵 回転振とう機（３０℃、２ｓｏｒｐｍ）上の２５０Ｍ容
量の振とりフラスコ中の２０１のボーグル・ボナー最小
培地（２，０％のデキストロース、０．４　％　（Ｄ　
ＮＺ　−７ミｙ、Ｉ　Ａｔ／ｄ（Ｄｆチアミン２０μｆ
／１４のテトラサイクリン、１０００μｆ／ｄのアント
ラエン酸を補足）中においてこれらの株を培養する。

振とりフラスコから定期的托サンプルを採取し、トリプ
トファンおよびインドールの規格標準に対してトリプト
ファンおよびインドールをアッセイする。Ｃ５３４ＳＤ
　（１）Ｄ２６４３　）のトリブトファン収量はＣ５３
４（Ｊ）Ｄ２６４３＞のトリプトファン収量を終始上ま
わる。

【図面の簡単な説明】

第１図は各種アミノ酸濃度と１８１−３４株の収量との
関係金示す図である。 第２図はグラスミドｐＤ２６４３０図解制限マツプであ
る。 代理人　弁理士　桑　原　英　明 アミノら女１＆ （鼾９／ｍ１　土色上Ｌ） 第２図 ７６ヲスミドρＤ２６４３ （’［０心゛−スマアス表示Ｊ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示　髪。 ′　特願昭６０−２６５３号 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代　理　人〒１０５ ６、補正の対象　明細書の発明の詳細な説明の欄７、補
正の内容　別紙のとおり 明細書の発明の詳細な説明の欄を次のように補正する。 （１）明細書第５頁第９〜１９行目： ｒ本発明は・・・大腸菌（Ｆ−Ｃｏ目月を１本発明は、
２−セリンヒドロリアーゼ（２−５ｅｒｉｎｅｈｙｄｒ
ｏ−１ｙａｓａ）、（脱アミノ化）−以後Ｌ−セリンデ
アミナーゼ（Ｌ−ｓ＋ｅｒｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａａｅ
）と称し、クロストリジュム　アシツズーウリチ（Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｃｉｄａ−ｕｒｉｃｉ）より単
離された酵素（ＥＣ４−２・ｌ・１４）と同様の活性（
以後Ｌ−セリンデアミナーゼ活性」と称するンを有する
酵素−活性欠損細菌突然変異株に関する。〔ジエー・エ
フ・カーター（Ｊ。 Ｆ、カーター）及びアール・ディ・セイヤーズ（Ｒ＊　
Ｄ−８ａｙ＠ｒａ）の［クロストリジュム　。 アシツズーウリチ（ＥＣ４・２・１・１４）」、ジャー
ナル　バクチリオール　（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ）
、１０９；７５７−７６３．１９７２年参照〕。 より詳ｌ１ｌＢＫいえば、本発明はＬ−セリンデアミナ
ーゼ（Ｌ−８Ｄ）活性を欠く大腸菌（Ｅ、Ｃ０１１）Ｊ
と補正する。 （２）　同書第１０頁第１６〜２０行目：「・・・（Ｅ
、Ｂ、Ｎｅｗａｎ・・・・・・１９８０年参照）をハ 「・・・〔イー・ビー　ノイマン（Ｅ、　Ｂ、　Ｎ＠ｖ
ｎｎａｎ）及びグイ・カッゾール（Ｖ−Ｋａｐｐｏｒ）
の［イン　ビトロ　スタブイス　オン　し−セリン　デ
ィアミナーゼ　アクティビテイオプ　ニジエリチア　コ
リーＫ　１２　（Ｉｎ　ｖｉｔｒ。 ５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ　ｄｓａｍｉ
ｎａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆＥａｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２）Ｊ、カナディアン　ジャー
ナル　ビオケミストリー（Ｃａｎ、　Ｊ、　ＢＩｏｃｈ
ｓｍ、１５８；１２９２−１２９７．１９８０年参照１
「（Ｓ、　Ｉｓｅｎｂａｒｇ・−”　１９７４　）　ｏ
　Ｊを「ニス・アイゼンペルグ（Ｓ、　Ｉ＋ｅｎｂｅｒ
ｇ）及びイー・ビー・ノイマン（Ｅ、　Ｂ、　Ｎｅｗｍ
ａｎ）の１スタデイス　オン　Ｌ−セリンディアミナー
ゼ　イン　ニジエリチア　コリー　Ｋ１２」 （Ｓｔａｄｉｅｓ　ｏｎ　Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ　ｄｅａｍ
ｉｎａｓｅ　１ｎＥｓａｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ負に
１２月、ジャーナルバクチリオール（Ｊ、　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ）、１１８；５３−５８．１９７４゜」と補正
する。 （４）　同勢同頁第１４〜１９行目： １・・（Ｅ、Ｂ　、　Ｎｅｖｍａｎ”−・１９８２年参
照」を「〔イー・ビー・ノイマン（Ｅ、　Ｂ、　Ｎｅｗ
ｍａｎ及びシー・ウォーカー（Ｃ−Ｗａｌｋｅｒ）の「
Ｌ−セリン　デグラデーション　イン　ニジエリチアコ
リーＫ　１２　（Ｌ−８ｅｒｉｎｅ　ｄｅｇｒａｄａｔ
ｉｏｎ　１ｎＥｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　Ｋ１
２）、ジャーナル　バクチリオール（Ｊ、　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ）、１５１　ｉ　７７７−７８２．１９８２年
参照）〕。」と補正する。 （５）同賽第１４頁第８行目： 「・・・トランスポゾン突然変異誘発」の後に［（ｔｒ
ａｎｓｐｏａｏｎ　ｍｕｔａｇａｎｉｓ月を挿入する。 （６）　間歇同頁第１９〜２０行目： 「ワシントン大学・・・ｗｉ　ｌ　１　ｉ　ａｍｇＪを
［ワシントン　ユニパーシティ　スクール　オプ　メデ
イスン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
　５ｃｈｏｏｌｏｆ　Ｍｅｄｉａｉｎｓ−米国ミズリー
州、セントルイス−のエル・ニス・ウイリャムス （Ｌ、Ｓ、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　）氏より、」と補正す
る。 （７）　同書第１５頁第７〜１１行目：ｊ　（Ｂ、Ｄ、
Ｄａｖｉｇ　・”方法による。」を「〔ビー・ディー・
デビス（Ｂ、１１Ｄａｖｉｓ）　らの「ザアイソレーシ
ョン　オプ　ビオケミカリーデフイシエント　ムタンツ
　オブ　バクテリア　バイ　ミーンズ　オブ　ペニシリ
ン（Ｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｏｃｈｅｍ
ｌｃａｌｌｙ　ｄｅｆｌｃｉｅｎｔｍｕｔａｎｔｓ　ｏ
ｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｂｙ　ｍｅａｎｓ　ｏｆ　ｐｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｎＪジャーナル　アメリカン　ケミカル
　ソサイテイ（Ｊ、　Ａｍ５ｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏａ
、）　７０　：　４２６７．１９４８年に記載の方法に
よる。〕と補正する。 （８）同書第１６頁第１７〜２０行目：「・・・Ｓ、工
８ｅｎｂｅｒｇ・・・１９７４年」を１・・・ニス、ア
イゼンペルグ（Ｓ、　Ｉｓｅｎｂｅｒｇ）及びイー［相
］ビー拳ノイマン（Ｅ、　Ｂ、　Ｎｅｗｍａｎ）の「ス
タブイス　オン　Ｌ−セリン　ディアミナーゼイン　ニ
ジエリチア　コリー　Ｋ１２ （８ｔｕｄｉｓ＋ｓ　ｏｎ　Ｌ−ａ＠ｒｉｎｓ　ｄｓａ
ｍｉｎａｓｅ　１ｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ
　Ｋｌ　２　）Ｊ　、ジャーナル　／々クテリオール（
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ）、１１８；５３−５８．１９
７４年」と補正する。 （９）　同書第１８頁第１〜３行目： ｒ”　（Ｊ、　Ｈ，Ｍｉｌｌｓｒ−・・１９７３年、」
を「・・・ジエー・エッチ・ミラー（Ｊ、Ｈ，Ｍｉｌｌ
ｅｒ）の［エキスペリメンツ　イン　モレキュラージエ
ネテイツクス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　Ｇｅｎ＠ｔｉｃｓＪ、コールド　スプ゛す
／グ　ハーバ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｕｒ）、１９７３年、」と補正する。 （１０）同書同頁第１４〜１７行目： 「Ｅ、　Ｂ、　Ｎｅｗｍａｎ・・・・・・記載されてい
る。」を　。 「イー・ビー・ノイマン（Ｂ、　Ｂ、　Ｎｅｖｍａｎ）
らの［Ｌ−セリン　ディアミナーゼ　アクティビティ　
イズ　インドニースト　パイ　エキスポージャー　オブ
　エセエリチア　コリーに１２　トウ　ＤＮＡ−ダメー
ジング　エージエノン（Ｌ　−５ｅｒｉｎｅ　ｄｅａｍ
ｉｎａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙｉｓ　１ｎｄｕｃｅｄ　
ｂｙ　ｅｘｐｏ＠ＩＨ＠　ｏｆ　Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｔ　Ｋｌ　２　ｔｏ　ＤＮＡ−ｄａｍａｇｉｎ
ｇ　ａｇｅｎｔｓ）Ｊ、ジャーナル　バクチリオール（
Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　）、１５２；’７０２−７
０５．１９８２年に記載されている。」と補正する。 （１１）同書箱２３頁第会２〜１８行目：、ｊ　（Ｍ　
Ｊ、　Ｃａ５ａｄａｂａｎ　＝　１９７９年）」をエキ
ソゼナウス　ゾロモータース　イン　ワン　ステップ　
ニースイング　ア　Ｍｕ−ラフバクテリオファージ：イ
ン　グイグオ　グローブ　フォア　トラｙスークリノシ
ョナルコントロール　セフウニ／セス（Ｌａｃｔｏｓ＠
ｇａｎｅｓ　ｆｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ＋
　ｐｒｏｍｏｔｓｏｒｓ’ｆｎｏｎｅ　５ｔｅｐ　ｕｓ
ｉｎｇ　ａ　Ｍｕ−１ａｃ　ｂａｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ
：ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｐｒｏｂｅ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓ−
ｃｒｉｐｔｌｏｎａｌｃｏｎｔｒｏｌ　５ｅｑｕｅｎｃ
ｅｓ）Ｊ、グロン１デイングナシヨナル　アカデミ−サ
イエンス　米国、（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｅｔ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）　７６　；４５３０−４
５３３．１９７９年）、」と補正する。 （１２）同書第２３頁第１９〜第２４頁第３行目：ｊ　
（Ｔ、Ａ、　Ｂａｋｅｒら・・・参照〕」を「〔ティー
・ニー・ペイカー（Ｔ、　Ａ、　Ｂａｋｓｒ）らの「Ｍ
ｕｄｘアプリバチイブ　オブ　Ｍｕ　ｄｌ　（５１Ａｐ
　ｒ）ウィッチ　メークス　ステイブル　５１　Ｚフ二
一ジョン　アト　ノ１イ　テンペレーチアズ（Ｍｕ　ｄ
ｘ　ａ　ｄｅｒｉｖａｔｌｖｅ　ｏｆ　Ｍｕ　！ｌ！１
（ｌａｃ　Ａｐ　）ｖｒｈｌｃｈ　ｍａｋｅｓ　５ｔａ
ｂｌｅ　ｌａｃ　Ｚ　ｆｕｓｉｏｎｓ　ａｔ　ｈｉｇｈ
ｔａｍｐａｒａｔｕｒ＠ｓ）Ｊ、ジャーナル　バクチリ
オール（Ｊ、Ｂａｅｔ＠ｒｉｏｌ）、　１５６　：　９
７０　９７４．１９８３年参照〕」と補正する。 （１３）同書第３０頁第４〜１２行目：ｆ　（Ｊ、　Ｆ
、　Ｍｏｒｒｉｓ・・・　記載されている。」を「シエ
ー・エフ・モリス（Ｊ、　Ｆ、　Ｍｏｒｒｉｍ）およヒ
イーーヒーーノイ−ｑ　ｙ　（Ｅ、　Ｂ、　Ｎｓｗｍａ
ｎ）の［マツプ　ロケーション　オブ　ザ　μエミュテ
ーション　イン　ニジエリチア　コリー　Ｋ　１２　（
Ｍａｐ　１ｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｓｄｍｕ
ｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｅ＋５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｔ　Ｋ１２）Ｊ　、ジャーナル　バクチリオール（Ｊ
、　Ｂａｅｔ＋ｒｉｏｌ。 １４３；１５０４−１５０５．１９８０年参照）。１す
突然変異体の単離方法は、イー・ビーノイマン（Ｅ、　
Ｂ、　Ｎｅｗｍａｎ）らの「Ｌ−セリン　デグラデーシ
ョン　イン　ニジエリチアコリー　Ｋ１２：ダイレフト
リー　アイソレーテイツド　坦　ムタンツ　アンド　ゼ
ヤー　イントラゼニツク　リノぐ一タンツ（Ｌ　−５ｓ
ｒｌｎｓ　ｄｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｅｅｈｅｒ
ｉｃｈｉｍｃｏｌｉ　Ｋ　１２　；　ｄｉｒｅｅｔｌｙ
　１ａｏｌａｔｅｄ　ａｓｄｍｕｔａｎｔｓ＋　ａｎｄ
　ｔｈｅｉｒ　ｉｎｔｒａｇｓｎｉｃ　ｒｅｖｅｒｔａ
ｎｔｓ月、ジャーナル　バクチリオール（Ｊ　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏ１１５０；７１０−７１５．１９８２年に記載
されている。」と補正する。

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｌ−セリンデアミナーゼ活性欠損細菌の突然変異
   株。
2. （２）Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を欠くことを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の突然変異株。
3. （３）Ｌ−セリンデアミナーゼ活性に対する構造遺伝子
   中に突然変異を有することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の突然変異株。
4. （４）Ｌ−セリンデアミナーゼ活性に対する構造） 遺′伝子中の前記突然変異が挿入変異であること全特徴
   とする特許請求の範囲第３項記載の突然変異株。
5. （５）前記挿入変異がＭｕ　！！Ｘ　ＣＡＭ　（Ａｐ’
   　ｌａｃ　）挿入であることを特徴とする特許請求の範
   囲第４項記載の突然変異株。
6. （６）Ｌ−セリンデアミナーゼ活性に対する調節遺伝子
   中に突然変異を有することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の突然変異株。
7. （７）Ｌ−セリンデアミナーゼ活性に対する前記調節遺
   伝子中の前記突然変異が挿入変異であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第６項記載の突然変異株。
8. （８）前記挿入変異がＭｕ　！Ｘ　ＣＡＭ　（Ａｐ’　
   ｌａｃ　）挿入であることを特徴とする特許請求の範囲
   第７項記載の突然変異株。
9. （９）Ｌ−セリンデアミナーゼ活性に対する構造遺伝子
   中に突然変異を有し、かつＬ−セリンデアミナーゼ活性
   に対する調節遺伝子中に突然変異を有することを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の突然変異株。
10. （１０）　Ｌ−セリンデアミナーゼ活性に対する構造遺
    伝子中の前記突然変異が挿入変異であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第９項記載の突然変異株。
11. （１１）前記構造遺伝子中の前記挿入変異がＭｕ　ｃｊ
    ｘＣＡＭ　（Ａｐ　ハ且）挿入であることを特徴とする
    特許請求の範囲第１０項記載の突然変異株。
12. （１２）　Ｌ−セリンデアミナーゼ活性に対する前記調
    節遺伝子中の前記突然変異が挿入変異であることを特徴
    とする特許請求の範囲第９項記載の突然変異株。
13. （１３）前記調節遺伝子中の前記挿入変異がＭｕ　！Ｘ
    ＣＡＭ　（Ａｐ　力巴）であることを特徴とする特許請
    −求の範囲第９項記載の突然変異株。
14. （１４）前記細菌が大腸菌種に属することを特徴とする
    特許請求の範囲第１項記載の細菌の突然変異株。
15. （１５）前記大腸菌種かに１２株であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１４項記載の突然変異株。
16. （１６）　前記株がチアミンを要求することを特徴とす
    る特許請求の範−囲第１項記載の細菌の突然変異株。
17. （１７）　１９８４年１　月１２日付でアメリカン・タ
    イプ・カルチャー・コレクションに供託されたＭＥＷｌ
    　２８株（認可番号３９　５７７）のＬ−セリンデアミ
    ナーゼ活性特性を有することを特徴とする細菌の突然変
    異株。
18. （１８）前記細菌が大腸菌であることを特徴とする特許
    請求の範囲第１７項記載の突然変異株。
19. （１９）１９８４年１月１２日付でアメリカン・タイプ
    ・カルチャー・コレクションに供託されたＭＥＷｌ　９
    １株（認可番号３９　５７５）のＬ−セリンデアミナー
    ゼ活性特性を有することを特徴とする細菌の突然変異株
    。
20. （２０）前記細菌が大腸菌であることを特徴とする特許
    請求の範囲第１９項記載の突然変異株。
21. （２１）１９８４年１　月１２日付けでアメリカン・タ
    イプ・カルチャー・コレクションに供託されたｌＫ１５
    −５株（認可番号３９　５７６）のし−セリンデアミナ
    ーゼ活性特性音、有する　゛ことを特徴とする細菌の突
    然変異株。
22. （２２）前記細菌が大腸菌であることを特徴とする特許
    請求の範囲第２１項記載の突然変異株。
23. （２３）１９８４年１月１２日付けでアメリカン・タイ
    プ・カルチャー・コレクションに供託された大腸菌ＭＥ
    Ｗ１２８株（認可番号３９５７７）。
24. （２４）１９８４年１月１２日付けでアメリカン・タイ
    プ・カルチャー・コレクションに供託すれた大腸菌ＭＥ
    Ｗ　１９１株（認可番号３９５７５）。
25. （２５）１９８４年１　月１２日付けでアメリカン・タ
    イプ・カルチャー・コレクションに供託された大腸菌ｌ
    Ｋ１５−５株（〜認可番号３９５７６）。