JPS6022916B2 - 微生物細胞壁溶解酵素の製造方法 - Google Patents

微生物細胞壁溶解酵素の製造方法

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JPS6022916B2
JPS6022916B2 JP51112913A JP11291376A JPS6022916B2 JP S6022916 B2 JPS6022916 B2 JP S6022916B2 JP 51112913 A JP51112913 A JP 51112913A JP 11291376 A JP11291376 A JP 11291376A JP S6022916 B2 JPS6022916 B2 JP S6022916B2
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弘毅 横塚
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【発明の詳細な説明】 本発明は、ストレプトミセス・ムリナス (Streptomycesmminus)に属する微
生物細胞壁溶解酵素生産菌を培養して微生物細胞壁溶解
酵素を製造する方法に関する。
従来、微生物、特に酵母細胞壁溶解方法としては、カタ
ツムリ(Helixpomatia)の消化管内に含ま
れる消イ掠酵素、ブレビバクテリウム・リチクム(Br
evi礎cterjuml〆icmmnov.sp.)
の生産する細胞壁溶解酵素(袴公昭38−9935)、
ストレブトミセス・アルプス(Streptomyce
salbus)、ストレプトミセス・オリバセウス(S
treptomycesolivaceus)、ストレ
プトミセス・グリセオフラブス(Streptomyc
esgriseoflav船)等のストレプトミセス属
に属する菌株の生産する細胞壁溶解酵素(特公昭38−
9933)などを使用する方法が知られている。
しかしながら、これらは作用範囲が限定されていて、い
かなる種類の細胞でも十分に溶解できるものは知られて
いない。特に酵母の場合には加熱処理した酵母の細胞壁
を溶解する酵素は知られているが、生細砲撃を溶解する
ことは困難で、実用化できるものはほとんどない。本発
明者は、より細胞壁溶解活性の高い酵素を製造すべく研
究した結果、今までに、グリオクラジウム(G1ioc
ladi山m)属に属する菌株より微生物細胞壁溶解酵
素を製造する方法(特開昭50−4292)、およびス
トレブトミセス・ヤツガタケンシス(Streptom
yces匁tsugatakensis)より微生物細
胞壁熔解酵素を製造する方法(特関昭50−13217
5)を確立したが、今回、ストレプトミセス・ムリナス
が更に溶解活性の高い微生物細胞壁溶解酵素を生産する
事を見し、出し本発明を完成したものである。
酵母が比較的高い栄養価を有することは知られており、
食品としてまた動物用の飼料として使用できる。
しかしながら、そのかたい酵母細胞壁が酵母を比較的不
消化かつ非同化しているという事実のため、酵母成分、
特に蛋白質成分の効率的な利用は未だ実現していない。
この意味で本発明は極めて意義の深いものである。本発
明において使用したストレプトミセス・ムリナスsp.
No.1014菌株(工業技術院微生物工業技術研究所
、徴工研菌寄第371び号)の特性を列挙すれば次の通
りである。
(i} 形態的特徴 {aー 気菌系:酵母エキス・麦芽エキス寒天培地上で
観察すると本菌は、幅約0.8山の気菌系で、長鎖状で
分枝していた。
しかし、輪生分枝は見られず、また、胞子のうも持たな
かった。‘b} 胞子:デンプン寒天培地上で生育した
本菌の函子顕微鏡写真より、胞子は0.5×0.5〜0
.3仏の円形あるいは長円形で、表面は平滑、直径5〜
6一のらせん状に連鎖していた。
(ii) 培養的特徴 各種寒天培地上での培養的特徴を表1に示した。
表1 この結果より、‘ィ漠落気菌系の特徴は、灰色ないし赤
色のシリーズに属す。
仰集落裏面は黄色。し一培地中に黄色の水溶性色素を生
成し、水酸化ナトリウムあるいは塩酸でpHを変化させ
ても色調は変わらない。(iii) 生理学的特徴 表2 (i),(ii),側の結果から、本菌は、ストレプト
ミセス・グリセオインカルナツス(Sueptomyc
es餌lseolncar雌tus)〔インターナショ
ナル・ジャーナル・オブ・システム・バクテリオロジー
(lntJ.S災temBacteriol.)第1袋
蓋第328頁(1968年)〕「 ストレプトミセス・
カナリゥス(Sけeptomycescanarius
)〔同上、第22巻第281頁(1972王)〕、スト
レプトミセス・/ガラテル(S0eptomycesn
o餌later)〔同上、第22巻第284頁(197
2王)〕、ストレプトミセス・クリセウス(Suept
omyceschひse瓜)〔同上、第22巻第284
頁(1972年)〕、ストレプトミセス・ムリナス(S
treptomycesmmin聡)〔同上、第18巻
第148頁(19磯年)〕に類似している。
しかし、【11ストレプトミセス・グリセオィンカルナ
ッスは胞子表面がとげ状であるのに対し、本菌は平滑で
ある。‘2)ストレプトミセス・カナリウスはLーアラ
ビノース、Lーラムノース、Dーガラクトース、ラフィ
ノース、1−イノシトール、シュクロースを資化し、ま
た、ツアベック培地で生育良好なのに対し、本菌はこれ
らの糖を殆んどかあるいは全〈資化せず、ツアベック塔
地で生育しない。‘3}ストレプトミセス・ノガラテル
はLーアラビノース、Lーラムノース、Dーガラクトー
ス、ラフイノース、1ーィノシトールを良〈資化するの
に対し、本菌はこれらの糖を殆んどか全く資化しない。
■ストレプトミセス・クリセウスはLーアラビノース、
D−ガラクトースを資化し、Dーマンニトールを資化せ
ず、また、ッアベツク塔地で生育するのに対し、本菌は
Lーアラビノース、Dーガラクトースを資化せず、D−
マンニトールを資化し、ッアベック培地で生育しない。
以上の点から、これらの4菌は本菌と明らかに異なる。
一方、ストレプトミセス・ムリナスは本菌と非常に良く
一致した。従って本菌をストレプトミセス・ムリナスS
.P.No.1014と同定した。本発明の微生物細胞
壁溶解酵素は、常法により、ストレプトミセス・ムリナ
スに属する微生物細胞壁溶解酵素生産菌を培地に培養し
、培養物より微生物細胞壁溶解酵素を採取する事により
得られる。
上記の微生物細胞壁溶解酵素を製造する際において、溶
解活性の高いものを得るための好ましい条件をあげると
次のようになる。
培地の炭素源としては酵母グルカンおよび細胞壁粗製品
、窒素源としてはカゼイン、ベプトン、酵母エキス、無
機塩としてはMが04・7日20,K2HP04などを
配合する事が好ましい。培地のpHは6〜8、培養温度
は約30℃、培養時間は30〜7q時間が好ましい。培
養の経過とともに培地中に本酵素が蓄積されるので、こ
れを通常の方法により分離する。例えば、液体塔地の場
合は、培養液を炉過あるし、は遠心分離などの手段によ
り除菌して酵素液を得ることができる。この酵素液より
、等電点沈澱、有機溶媒沈澱、塩析、減圧濃縮、イオン
交換体による方法など通常の酵素精製法により本酵素を
濃縮あるし、は精製できる。培養液10そを用いて培養
して酵素液を得、これを0.が飽和の硫安で塩析し、沈
澱物を凍結乾燥すると約12の粗酵素が得られる。本発
明方法によって得られる微生物細胞墜落鱗酵素の溶解活
性は次のようにして測定される。
酵母懸濁液(0.D.66o=0.7)0.5M,1/
19Mリン酸緩衝液(pH6.0)2.0の上、酵素液
(タンパク濃度20〜200仏タノ泌)0.5の【より
なる反応液を用い、37℃で90分間ゆるやかに振溢し
ながら反応を行なう。反応前後の蟹度を66瓜mで測定
し、反応前後の濁度減少を10%生じさせる酵素量を1
単位とする。本発明の微生物細胞墜落解酵素の性状を、
対数増殖期生細胞に対して100単位の溶解活性を有す
る粗酵素を用いて調べた。
{1)反応至適pHおよび餌安定性 溶解活性はpH6.の付近で最高、また、pH6.0で
最も安定であった。
‘2)反応至適温度および熱安定性 溶解活性は3700付近で最高で、温度がそれより高く
ても、また低くても、溶解活性は低下した。
安定性は、40℃以下では安定であるが、それ以上では
急激に失活した。{3’酵素活性に及ぼす金属塩の影響 硫酸マグネシウムと塩化マンガンは、加熱酵母および対
数増殖期生細胞に対する溶解活性をいく分増加させ、硫
酸鉄および塩化水銀は加熱酵母に対する活性を阻害した
塩化カルシウムは対数増殖期生細胞に対する活性を阻害
した。硫酸亜鉛、塩化ニッケル、塩化コバルト、硫酸鋼
、酢酸鉛は対数増殖期生細胞および加熱酵母の両基質に
対する活性を阻害した。特に硫酸銅(10‐3M)では
完全に失活した。【4)酵素活性に及ぼす還元剤の影響 硫酸アンモニウム、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫
酸水素ナトリウム、2一メルカプトェタノール、チオグ
リコール酸などの還元剤に対し本酵素は安定である。
これら還元剤の存在下で酵素反応を行なわせた場合には
、その溶解活性がやや上昇する傾向がある。【5} 基
質特異性 8一1,3グルカナーゼ活性、8一1,6グルカナーゼ
活性およびプロテアーゼ活性を有する。
キチナーゼ活性およびマンナナーゼ活性は認められない
。■ 各種酵母に対する溶解活性 本発明酵素の各種定常期生細胞および加熱酒酵母に対す
る溶解活性を調べた。
比較のためストレプトミセス・ャツガタケンシスの生産
する酵素およびチモリアーゼ(商品名、キリンビール■
製、アースロバクター・ルテウス生産酵素)の溶解活性
をあげる。酵素(タンパク質)濃度は200ムタ/泌で
ある。なお、ストレプトミセス・ヤツガタケンシスおよ
びチモリアーゼの溶解活性は、前記の本発明酵素の溶解
活性測定法と同じ方法で行なった。表3 表4 次に実施例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。
なお以下の実施例では、溶解活性測定の基質としてサッ
カロミセス・セレビシアェOC一2を用いた。実施例
1 グルコース0.5%、酵母エキス0.2%、ベブトン0
.2%、酵母細胞壁粗製品0.3%、MgS04・7比
00.1%、K2HP040.2%を含むpH7.0の
培地を調整し、121℃,15分間オートクレープで殺
菌した。
前培養として、坂口フラスコ中、上記培地50の【にス
トレプトミセス・ムリナスs.p.No.1014菌株
1白金耳を植え、30qo,3凪寿間振糧培養した。
この前培養液5泌を、ジャーフアメンター中の上記渚地
500の‘に接種し、30qoで3既時間通気櫨梓培養
した。培養後、培養液にセラィトを加えてブフナーロー
ト上で炉過し、培養上燈液を得た。次いで、この培養上
燈液を硫安塩析または有機溶媒沈澱により精製した。す
なわち、硫安を0.8飽和に、またはアセトンを3倍量
、またはエタノールを3倍量加えて数時間放置後、遠心
して沈澱した粗酵素を採取した。それぞれの、溶解活性
を測定した。実施例 2実施例1と同様にして培養し、
培養上澄液を得た。
培養上燈液に硫安を0.8飽和に加え」生ずる沈澱を採
取して粗酵素を得た。この粗酵素を硫安0.2〜1.0
飽和の各画分に再分画した。各画分の対数期生細胞に対
する溶解活性を示す。実施例 3 実施例1と同様にして培養し、培養上澄液を得た。
培養上燈液に硫安を0.4飽和に加え、生ずる沈澱を採
取して粗酵素を得た。粗酵素を1/19 Mリン酸緩衝
液(pH6.0)に溶解し、塩酸でpHを4.5〜3肌
刊頃次調製し、各pHにおける沈澱をそれぞれ採取した
。各沈澱物の対数期生細胞に対する溶解活性を示す。実
施例 4 実施例1と同様にして培養し、培養上燈液を得た。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 ストレプトミセス・ムリナスに属する微生物細胞壁
    溶解酵素生産菌を培養し、培養物から微生物細胞壁溶解
    酵素を採取する事を特徴とする微生物細胞壁溶解酵素の
    製造法。
JP51112913A 1976-09-22 1976-09-22 微生物細胞壁溶解酵素の製造方法 Expired JPS6022916B2 (ja)

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