JPS6017511B2 - インベルタ−ゼの精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は庶糖等の分解酵素であるインベルターゼの精製
法に関するものである。

従来、ィンベルターゼを種々な原料から精製するために
は、塩折法、有機溶媒分画法、イオン交換クロマトグラ
フィー、分子節クロマトグラフィーのような複雑な連続
処理によらなければならない。そのため、得られるィン
ベルターゼの収率は低く、経済性にも問題があった。本
発明はかかる欠点を有する従来法に代わり、ィンベルタ
ーゼを収率よくかつ能率的に精製しうる方法を提供する
ものである。

すなわち、本発明は、ィンベルターゼを含む酵素液と庶
糖をェポキシ系架橋剤でデキストランに共有結合せしめ
た担体とを共存せしめ、該酵素液中のィンベルターゼの
みを該担体に捕捉させる第１工程と、該担体を水で洗浄
しィンベルターゼ以外の酵素液成分を除去する第２工程
と、次いで、上記担体を０．０９Ｍ（モル／１リットル
、以下同じ。）の塩を含む緩衝液で洗浄し、上記ィンベ
ルターゼを該担体から遊離せしめて該緩衝液に移行させ
る第３工程と、ィンベルターゼを含む上記緩衝液からィ
ンベルターゼを分離する第４工程とよりなることを特徴
とするィンベルターゼの精製法である。すなわち、本発
明の精製法は、ィンベルターゼの基質特異性を利用し、
多くの不純物を含む酵素液からインベルターゼのみを選
択的に迫体に捕捉させるものである。従って、本精製法
はィンベルターゼ原料の差異とか、酵素液に含まれる不
純物の差異に影響されずィンベルターゼのみを能率よく
捕捉し、精製することができる。この精製法で使用する
担体はデキストランに庶糖をェポキシ系架橋剤で共有結
合させたものである。

通常、庶糖等の基質を損体等に結合させた場合、結合さ
れた基質は立体障害等のために酵素に作用しなくなる。
本発明者等は庶糠とデキストランをェポキシ系架橋剤で
結合させた場合、庶糖の基質特異性に変化を与えること
がないことを発見したものである。なお、ェポキシ系架
橋剤としては１・４−ビスー（２・３ーエポキシ）ーブ
タン等が用いられ、デキストランに１・４ーピス−（２
・３−ェポキシ）−ブタンを結合したものが知られてい
る。従って本精製法で使用する損体は、デキストランに
スベーサ−としてェポキシ系架橋剤を結合させたものに
さらに庶糖をカップリングさせることにより調製するこ
とができる。本発明の第１工程はィンベルターゼを含む
酵素液と担体を共存させるものである。この工程は酵素
液に担体を投入するか、逆に担体に酵素液を注入するこ
とにより達成することができる。なお、酵素液と担体と
を特別に濃浮浪合する必要はない。酵素液と担体とを共
存させることにより、選択的に酵素中のィンベルターゼ
が担体の庶糖と結合し、ィンベルターゼのみが損体に捕
捉される。本発明の第２工程に当る酵素液と担体の共存
系よりィソベルターゼ以外の酵素成分を除去する方法は
、その系に水を加え、水にィンベルターゼ以外の酵素成
分を溶解移行せしめ、水と共に系より除去することによ
りなされる。なお、インベルターゼといえどもわずかず
つ担体より離れ水に移行するため過度の水洗は好ましく
ない。本発明の第３工程は、酵素液中の不純物を除去し
たのち、担体に０．０８Ｍ以上の塩を含む緩衝液を作用
させ、ィンベルターゼと担体に結合されている庶糖との
結合を解き、ィンベルターゼを緩衝液に移行させ、緩衝
液と共にィンベルターゼを担体より取り出すものである
。

これは緩衝液に含まれる塩に基因する一種の塩折効果お
よびｐＨが変化することに基因する効果によりィンベル
ターゼと坦体との結合が解かれるものと考えられる。従
って、緩衝液中の塩の濃度は０．０９ Ｍ以上である必
要がある。本発明の第４工程である緩衝液に含まれるィ
ンベルターゼを取り出す方法は、通常の分離法、例えば
カラムクロマトグラフィーとか、凍結乾燥法を適用する
ことができる。

以上の行程を能率よく順次実施するには、担体をカラム
につめ、通常のカラムクロマトグラフィーの操作をその
まま適用するのが好ましい。

すなわち、担体をカラムに充填したのち、ィンベルター
ゼを含む酵素液をカラムに注入し、ィンベルターゼのみ
を担体に捕捉させる。次に、水をカラムに注入し、担体
に捕捉されない酵素液の不純物をカラム下部より水と共
に流しさる。この後０．０８Ｍ以上の塩を緩衝液をカラ
ムに注入し、緩衝液の塩析と同様の効果により、ィンベ
ルターゼを但体より遊離せしめし緩衝液に移行せしめて
ィンベルターゼを緩衝液と共にカラムより取り出すもの
である。以下、担体の調製をも含めて実施例により本発
明を説明する。

‘１’挺体の調製 デキストランに１・４一（２・３ーエポキシ）−ブタン
を作用させ部分的にデキストランを架橋させた担体原料
２グラムを蒸留水１２．５凧【に懸濁させて膨潤せしめ
たのち、ガラスフィルター上に取り、２００のとの蒸留
水で洗浄し、さらに０．１規定の苛性ソーダ水溶液（ｐ
Ｈ１２．７）で洗浄した。

次に、この担体原料を５０の‘客の三角フラスコ中に移
し入れ、次いで１５０ｍ９（７３肌Ｍ）の庶糠を含有す
る０．１規定の過性ソーダ水溶液６の‘を加え、４５０
０で１朝時間シェーカー内で、庶糖と笹体原料を反応さ
せた。その後再び庶糖の反応した担体原料をガラスフィ
ルター上に移し、蒸留水で中性になるまで洗浄した。さ
らに、その後７３のＭ庶積水溶液、蒸留水、０．８Ｍ食
塩含有０．１Ｍ棚酸緩衝液（ｐＨ８．０）、蒸留水、０
．９Ｍ食塩含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）、蒸
留水で順次洗浄した。その後この麻糖の結合した担体原
料を過剰量の１モルェタノールアミン中に１晩冷却下（
４００）に放置し、安定化せしめて坦体を調製した。得
られた坦体を直径９側、高さ６劫吻のカラムに移し、そ
の後蒸留水で充分に洗浄した。

｛２１ 粗製の酵母ィンベルターゼの精製市販の不純物
として糖質の含まれている粗製の酵母ィンベルターゼを
上記の担体を使用したカラムで以下のようにィンベルタ
ーゼを精製した。

粗製の酵母インベルターゼ１０の９（シグマーグレード
６酵母ィンベルターゼ）を含む酵素液１叫を上記カラム
上部に注入し、酵素液と坦体とを接触せしめた。

次にカラム上部に約４０の‘の蒸留水を少しずつ注入し
、一方カラム下部より流出水を採取し、担体に捕捉され
ていない粗製の酵素成分をカラムより流出水とともに取
り出した。次に、ｐＨ４．８、５０ｍＭ酢酸緩衝液２５
机を力ラム上部より注入し、カラム下部よりその流出液
を得た。最後に、この流出液を減圧して蒸発濃縮したの
ち、通常の分子筋力ラムクロマトグラフィ一にかけて塩
類を除いたのち凍結乾燥して精製されたィンベルターゼ
を得た。原料として使用した粗製ィンベルターゼと得ら
れた精製ィンベルターゼとの両者について含有糖質をフ
ェノール硫酸法で測定した。その結果、粗製ィンベルタ
ーゼには約２５％の糖質、精製インベルターゼには約２
．５％の糖質が含まれていることがわかった。すなわち
、精製ィンベルターゼの糠質不純物は原料ィンベルター
ゼの１／１０となった。｛３｝ 細菌ィンベルターゼの
精製 細菌（Ｂａｄｌｌ聡 ｓｕｂｔｊｌｉｓ）を栄養塔地（
ｎｕｔｒｉｅｎｔｂｒｏｔｈ）１０の‘中で、３０ｑ０
の温度で２日間振濠培養した。

その後、培養液に１０地の蒸留水を加え超音波処理（６
０Ｗ、２０Ｋ比、５分）して細菌を破砕し、続いて遠心
分離（１７５０００回転／分、２０分）にかけて上燈液
を採取した。

次に、‘２）の粗製の酵母ィンベルターゼの精製と同様
に、庶糖をデキストランに共有結合させて作った担体を
充填剤としたカラムを使用し、まず上誌上燈液をカラム
上部に注入し、該上燈液と担体とを共存せしめた。

次に蒸留水をカラム上部より注入し、担体に保持されて
いない上記上燈液成分を蒸留水と共に流出せしめて除去
した。その後５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）をカラ
ム上部に注入し、担体に捕捉されているィンベルターゼ
をこの酢酸緩衝液中に遊離せしめＬ酢酸緩衝液と共にカ
ラム下部より流出せしめた。得られた緩衝液を減圧化で
水を除いて濃縮し、さらに分子筋力ラムクロマトグラフ
イ一にかけて塩分を除き、最後に凍結乾燥してィンベル
ターゼ粉末を得た。この実施例におけるィンベルターゼ
の精製程度を調べるため、原料として使用した上記水燈
液及び精製品であるィンベルタ−ゼ粉末の比活性をネル
ソンーソモーギー（Ｎｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙ）法で
測定した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ インベルターゼを含む酵素液と庶糖をエポキシ系架
   橋剤でデキストランに共有結合せしめた担体とを共存せ
   しめ、該酵素液中のインベルターゼのみを該担体に捕捉
   させる第１工程と、 該担体を水で洗浄しインベルター
   ゼ以外の酵素液を除去する第２工程と、 次いで、上記
   担体を０．０５Ｍ（モル／１リツトル）以上の塩を含む
   緩衝液で洗浄し、上記インベルターゼを該担体から遊離
   せしめて該緩衝液に移行させる第３工程と、 インベル
   ターゼを含む上記緩衝液からインベルターゼを分離する
   第４工程 とよりなることを特徴とするインベルターゼ
   の精製法。