JPS60149389A - テイ−・クルズイの表面たんぱくを発現する遺伝子工学で作られた有機体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はシャガス病をひきおこすティー。

クルズイ（Ｔ、ａｒｕｚｉ）の表面たんばくを発現する
遺伝子工学的に作られた生物に関する。このたんばくは
免疫原性であり、その病気の感染全検出したシ免疫的予
防に有用である。

背　景 Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ａｒｕｚｉ上の２つの主要な
素面抗原がすでに同定されている（　Ｎｏｇｕｅｉｒａ
　＋　Ｎ　、＋０ｈａｐｌａｎ、　ｓ、、　Ｔｙｄｉｎ
ｇｓ、　Ｊ、＋　Ｕｎｋｅｌｅｓｓ、　ｔｙ、　ａｎｄ
Ｏｏｈｎ、　Ｚ、、　Ｊ、Ｂｘｐ６Ｍ＠ｄ、　１５３　
、６２９　（１９８１））。

その１つ、分子量７５，０００の糖之んば＜　（ＧＰ）
は生物の培養型（昆虫が宿主の時期）−すなわちエビマ
スティボートとメタサイクリック　トリポマスティボー
ト期の生物−に％異的である。

もう１つは分子量９０，００００ＧＰでその生物のを椎
動物が宿主の時期（血流型のトリボマスティボート）に
特異的である。この２つのＧＰは無関係で免疫学的に交
叉反応はしない。このような特異性のために、表面たん
ばくはシャガス病の診断マーカーとなる可能性がある。

要　約 Ｔ、　ｃｒｕｚｉの昆虫時期に特異的な表面糖たんばく
をコードしている二重鎖のｅ　ＤＮＡのクローンを保持
している組換えプラスミドを作成した。

バクテリアに入れたクローンは診断用としても免疫予防
用としても大量の抗原をもたらすものとして有用な組換
えたんばく質を発現した。

詳細な説明 Ｔ、　ｅｒｕｚｉの分子ｉ７ｓ、ｏｏｏと９０，０００
の表面糖たんばくの単離と性質についての詳細はＮｏｇ
ｕｅｉｒａｅｔ　ａｌ、によるＪ、　Ｂｘｐ、　Ｍｅｄ
、　１５３　６２９（１９８１）とＮｏｇｕａｉｒａ　
ａｔ　ａｌ、によるＩ’ｒｏａ、　Ｎａｔ’ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７９　１２５９（１９
８２）の報告の中で記述されている。

プラスミドの不用性 この発明に記述されるプラスミドは寄託番号ｐｌＦＢと
してロックフェラー大学（１２３０ＹｏｒｋＡｖｅｎｕ
ｅ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１００
２１　）に寄託されている。この発明に望ましいシラス
ミドはま７ｊＡｍｏｒｌｅａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ　０ｏｌｌ＊ｅｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ＋　Ｍ
ａｒｙｌａｎｄ　）にも寄託されＡＴＯＯの寄託番−と
４００８２をもっている。

有能は単に発表全可能にする目的のためでおシ、この発
明の概念を寄託された特冗の物に限矩するものではない
。

プラスミドのが１製 ポリＡ”ＲＮＡ　全生後３週のエビマスティボート株か
ら単能しオリゴｄＴセルロース　クロマトグツフィーで
精製し、小麦胚芽の無細胞翻訳系中でｉｎ　ｖｉｔｒｏ
で翻訳した。翻訳された生成物は慢性のシャガス病患者
から採った血清のＩｇＧフラクションかエビマスティボ
ートの光面たんばくで感作したウサギの抗血清のいずれ
かで免疫的に沈殿させた。シャガス病の患者のＩｇＧフ
ラクションはｉｌ　ｖｌｔｒＯで翻訳されたものの４個
の主要なバンド金認識し、その中の１つ分子量３４，０
００ペプチドは分子量７５．ＯＱＯぺ　゛プチドの糖鎖
のついていない前駆体と思われる。

ポＩＪＡ＋ＲＮＡの全体が逆転写酵素でｃ　ＤＮＡに変
換した。二重鎖のｅＤＮＡｋゾ２スミドｐＵ０１３のＰ
ｓｔＩ部位にＧ−Ｏｔａｉｌｉｎｇによって挿入して組
換えたプ１２スミドをＢ、　Ｃｏ１１　ＪＭ　８３全形
質転換するために使った。コロニーをアンピシリン耐性
で選択し、Ｘ−ｇａｌ　’ｆｒ：添加し７’ｊＹＴ培地
に播くことによって先ず選別した。クローニング部分に
挿入する仁とはβ−ガンクトシダーゼのコードを破壊し
、その結果補填と同時に酵素活性を失うことになる。か
くして挿入部をもったプラスミドはＸ−ｇａｌ’を水解
しえず、従って白いコロニーヲもたらす。挿入部をもた
ないプラスミドあるいは壊されていない小さな挿入？ｉ
ｌＳ　ｔもつプラスミドは青いコロニーとなる０１３０
３の白いアンピシリン耐性のコロニーが、さらに次の芦
別のためにその場での放射性免疫測定法によって選択し
た。

ｌ行別なプラスミドの）弁択 細菌の細１１２１をニトロセ少ロースの截過膜に醪し、
−晩生前させ、その角に０解した。それがら瀞３Ｍ７ｔ
　ＩＩ’Ｊ＼を、ω者の血清とインキュベートし、十分
にｉ：ｉｌｙ、い、そしてＳ、　ａｕｒｅｕｓから採っ
た工１２′で標識しズζプロティンＡで染色した。患者
の血清で再近・；別したとき８つのコロニーが強い陽性
の信−υを与えた。しかし水から８つとも抗７５にモノ
クローナル抗体またはウサギの抗７５に抗血清と反応し
なかった。

これら８つのクローンから採ったシラスミドのＤ　Ｎ　
Ａの分析によって１００塩基対から６００塩基対の大き
さの挿入部分を示した。すなわち短かい挿入部分配列で
すら多価の血清で認識される抗原性部分を形成しうる。

ｐｌＦ８のクローンは、それが異常な培養上の形Ｂをも
つためにさらに研究のために選択された。他の免疫的に
活性なりローンやその親のＪＭ８３と違ってｐｌＦ８は
液作培養でｒｏｕｇｈ型の株として生育し、トリパノゾ
ーマのポリペ−ｆ’ｆドが細菌の細胞表面で発現されて
いること全示唆している。

ｐｌＦ８は６００塩基対のｃＤＮＡ挿入部をもつｐＵｏ
　１３ゾ２スミドを含′んでいる。そのトリパノゾーマ
由来を証明するために、”ｐで標識した挿入部ｔ　５ｏ
ｕｔｈｅｒｎ転写法でトリパノゾーマのＤＮＡと相補的
に結合させた。クローン化したＤＮＡは工ぎマスティボ
ートから分離した全ＤＮＡの川ｎｄ　Ｈ＋　Ｐｇ　ｔ　
Ｉ　ｇ　Ｓａｉ　Ｉ　、Ｂａｍ　ＨＩによる消化ででき
るいくつかの断片にあるトリパノゾーマＤＮＡと相補的
に結合した。これらの制限酵素は６００塩基対挿入部自
体は切断しない。この複数のノ々ンドを示すノターンは
介在配列または複数の遺伝子コピーが存在することに由
来する。

ａｌｐで標識した挿入部はまたエビマステイゴートの几
ＮＡのＮｏｒｔｈｅｒｎ転写法における検出剤としても
使われた。この検出剤は全ＲＮＡまたはｐｏｌｙ　Ａ”
ＲＮＡ標品の中の約１０００塩基のＲＮ　Ａに相補的結
合した。それはまた全ＲＮＡにおける約２１００塩基の
別の種類にも相補的結合した。

それに比べてを椎動物期の寄生虫（トリノトマステイゴ
ート）から採った全ＩＬＮＡ　−！たはｐｏｌｙ　Ａ＋
ＲＮへのＮｏｒｔｈｅｒｎ転写法においては殆んど相補
的結合をしない。２１００塩基種も全トリプトマスティ
ゴー）ＲＮＡに存在する。これらを転写実Ｆ；）シた結
果、世代期に特異的なｍＲＮＡの加工があることヲ弾く
示唆している。

１０００塩基のｍＲＮＡと６００塩基対のｃＤＮＡ押入
部分の間の大きさの違いはｐｌＦ８クローンが完全な長
さの遺伝子のためのコードではないことを示している。

しかし患者の血清はその細菌と反応しうるので、クロー
ンは少くとも１つのエピトープ金コードしておシ表現す
るにちがいない。Ｎｅｇｕｓ　ｌ　ｒａはテストした全
てのシャガス病患者血清が同じト１ル々ノソーマ抗厚ヲ
詔識することを示している。それ故ｐｌＦＢクローンは
慢性弱の診断に有用であると考えられる。

菌の溶解、洗滌ｔした後、樺過膜を室温で２詩間、１５
０ｍＭのＮｒｎＯｌ、３％Ｅ　Ｓ　Ａ　ｓ　１％ＮＰ−
４０゜０．２％ＳＤＳ　’ｉ５含む５０＋ｎＭ）ＩＪス
ス酸緩衝液で１／３００に希釈したシャガス病患者の血
清のＩｇＧ画分どインキュベートした。その血清は組の
細菌株ＪＭ８３から調製した消化液と予め吸収されてい
念。それから濾過膜をトリス−食塩水を数回換え又十分
に洗滌し次いで室温で１時間同じ緩極液でｌ　Ｏ’　（
ｐｍ　／ｍｌに希釈した１１！Ｉ′標識のプロティン人
（比活性的５　Ｘ　１０’　ｅｐｍ／ｍＡ　）とインキ
ュベルトしノζ。濾過膜を１ｔｌＰ−４０と８ＤＳを含
むトリス−食塩緩凸液で十分に洗った。プロティンＡは
ｉｏｄｏｇ＠ｎ　＠を使って標識した。エビマスディボ
ートの消化液全体が全ての濾過膜上の陽性対照として使
われた。ル２図がその結果を説明・している。

ヒトの血清中のＴ、　ｅｒｕｚｉの表面たんばくに対す
る抗体とクローンの間の相互作用がシャガス病のだめの
診Ｆフス法に対して必須の基本を成している。このＪ：
うなりローン化されたペプチドまたはその合成で作った
片われがこの方法に使われＪ二う。

Ｉｔ　Ｎ　Ａ試オ斗を１Ｍホルムアルデヒド−１％アガ
ロ−ススシブゲルで電気泳動し、ｎＡ３３ニトロセルｔ
ｊ　−スの紙（Ｓｃｈｅｉｃｌｕ＋ｒ　ａｎｄ　５ｃｈ
ｕｅｌｌ　）上に一晩転写した。イ）１紙は５０％ホル
ムアミド、５ＸＳＳＯ、４Ｘ　Ｄ＊ｎｈａｒｄｔの援彷
液、０．１％ＳＤ８％１０％デキストランＦｆ　ｉＲ中
で４２Ｃ４時間予めインキュベートされ念。それから１
２時間ｓｔｐ標コ、°へしたｐｌＦ８検出剤と１００μ
ｇ／ＴＬｌのＥ、　ｃｏｉｌのＤＮＡ１含む上記と同じ
液中でｔｒｔ補的に結合させた。（１０紙を３７ｔＺ’
で３０分間２Ｘ８ＳＰＥ＋０．１％Ｓ　Ｄ　Ｓで、次い
で３７Ｃ，３ｏ分間、０．ｌＸ５８ＰＥ十０．１％ＳＤ
Ｓで洗った。

第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号手続ネ１
０正書（方式） ％式％ ２、　発明の名称 テ、ｒ−，クルズイ（Ｔ、ｃｒｕｚｉ）の表面たんばく
を発現する遺伝子］、学で作られた有機体３、　補正を
する計 事件との関係　特？、Ｊ（出願人 化　所　アメリカ合衆国、　１００２１　ニューヨーク
、ニュー　ヨーク、ヨーク アヴエニュ　１２３０番地 名ｆｆＦ　ザ　ロソクフェラー　ユニバーシティ代表者
　ウィリアム　エイチ、グリーサー４、代理人 ５、　補正指令の日付 昭和６０年１月２９日 ６、補正の対象 （１）願書の「発明の名称」の欄 明細書の「発明の名称」の欄 （３）委任状訳文 ７、補正の内容 （１、発明の名称を「ティー、クルズイの表面たんばく
を発現する遺伝子工学で作られた有機体」と補正した願
書を別添の通り提出する。

（２）　明細書の発明の名称を「ティー、クルズイの表
面たんばくを発現する遺伝子工学で作られた有機体」と
補正する。

（３）　発明の名称を「「ティー、クルズイの表面たん
ばくを発現する遺伝子工学で作られた有機体」と補正し
た委任状訳文を別添の通り提する。

付置類の目録 願　書　１通 委任状訳文　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｔ、ｃｒｕｚｉの昆虫期の糖たんばくをコードして
   いるＤＮＡｅ含む遺伝子工学的に作られたシラスミド。 ２、　上述の嚢面糖たんばくが分子量７５，０００の砧
   たんばくである特許請求の範囲１のシラスミ　ド。 ３、　上述の］）ＮＡがＴ、　ｃｒｕｚｉから分離され
   る特許請求の範囲１のシラスミド。 ４、　上述のＩ）Ｎ　Ａが化学的に合成される特許請求
   の範囲１のシラスミド。 ５、Ｔ、ａｒｕｚｌの昆虫期の表面糖たんばくをコード
   するＤＮＡと相補的なりＮＡまたはＲＮＡ　を含む遺伝
   子工学的に作られよプラスミド。 ６、ｐｌＦＢを含む特許請求の範囲１のシラスミド。 ７、Ｔ、ａｒｕｚｌの昆虫期に特異的な分子量７５，０
   ００糖たんばくをコードしているＤＮＡ０ ８、　適切な宿主／ベクター系における特許請求の範囲
   ７のＤＮＡ　０ ９、　上述の宿主／ベクター系がＬｅｏｌｉ　Ｋ　１２
   のシラスミドｐＵＯ１３である特許請求の範ｌ！１８の
   ＤＮＡ　０ １０、Ｔ、　ａｒｕｚｌから分離したまたは化学的に合
   成された特許請求の範囲７のＤＮＡ０ １１、Ｔ、　ｅｒｕ＋ｃｉの昆虫期に特異的な分子量７
   ５，０００糖たんばく金コードしているＤＮＡに相補的
   なりＮＡｔたはＲＮＡ　０ １２、適切な宿主／ベクター系における特許請求の範囲
   １１のＤＮＡまたはＲＮＡｅ１ １３、Ｔ、　ｃｒｕｓｔの昆虫期の糖たんばくをコード
   しているＤＮＡを含む遺伝子工学的に作られたシラスミ
   ドによって発現されるたんばく。 １４、Ｔ、　ｅｒｕｉｉの昆虫期の糖たんばくをコード
   しているＤＮＡ０１１含む遺伝子工学的に作られたシラ
   スミドによって発現されるたんばくの全アミノ酸配列ｌ
   たは一部の配列を含む合成ペプチド。 １５、Ｔ、ｅｒｕｚｌの昆虫期の糖たんばくをコードし
   ているＤＮＡ　ｆｆｉ含む遺伝子工学的に作られたプラ
   スミドを適当な宿主−ベクター系で培養し、それから糖
   たんばくを採集することを含むＴ、　ｅｒｕｚｉの昆虫
   期に特異的な底面糖たんばくを作る方法。 １６、反応のために適当な条件下でＴ、　ｃｒｕｚｌの
   昆虫期に／Ｉｔ’具的な分子量７５，０００糖たんばく
   をコードしているＤＮＡ”、＋１−適当なアミンｒ’ｉ
   ＜と接触させることを含むペプチド金合成する方法。 １７、オリゴペプチド合成を含むＴ、　ｃｒｕｚｉの昆
   虫期の糖たんばくをコードしているＤＮＡ’、ｒ含む遺
   伝子工学的に作られたシラスミドによって発現されるた
   んばくの全アミノ酸配列または一部の配列を含む合成ペ
   プチドの配列をもつペプチドを合成する方法。 １Ｂ、Ｔ、　ｃｒｕｚｉの昆虫期に特異的な分子Ｒ７５
   ，０００糖た／しはくをコードしているＤＮＡのＤＮＡ
   によってコードされるたんばくのペプチド。 １９、Ｔ、　ａｒｕｚｉの昆虫期の糖たんばくをコード
   しているＤＮＡ１含む遺伝子工学的に作られたシラスミ
   ドを適当な宿主−ベクター系で培養し、それから糖たん
   ばくを採集すること金含むＴ。 ｅｒｕｇｉの昆虫期に特異的な樅面糖たんばくを作る方
   法によって生産されるたんばく。 ２０、クローン化された昆虫期弐面たんばくと咽乳類期
   の表面糖たんばくを別々にあるいは一緒に含むシャガス
   病に対するワクチン。 ２１、Ｔ、ｃｒｕｚｌの昆虫期の糖たんばくを＝−ドし
   ているＤＮＡ　ｆｆ、含む遺伝子工学的に作られたシラ
   スミドによって発現されるたんばくを含むシャガス病に
   対するワクチン。 ２２、Ｔ、　ａｒｕｚｉの昆虫期の糖たんばくをコード
   しているＤＮＡ’（（含む遺伝子工学的に作られたプラ
   スミドによって発現されるたんばくの全アミノ酸配列ま
   たは一部の配列を含む合成ペプチドを含むシャガス病に
   対するワクチン。 ２３、Ｔ、　ｅｒｕｚｌの昆虫期に特異的な分子量７５
   ，０００桔たんばくをコードしているＤＮＡの宿主−ベ
   クター系を含むシャガス病に対するワクチン０ ２４　上述のペプチドがオリゴペプチド合成で作られる
   侍許藺求の範囲２２のワクチン。 ２５、Ｔ、　ｃｒｕｚｉの表面糖たんばくを８識する抗
   体と免疫原的に反応するペプチドと患者の血清全接触さ
   せることを含む患者のシャガス病全診断する方法。